2-occlusione di vasi / Ipotensione: un modello di ratto di Global Ischemia cerebrale

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Summary

Occlusione carotidea bilaterale accoppiato con ipotensione sistemica produce ischemia cerebrale globale nel ratto, con conseguenti danni al dell'ippocampo con severità riproducibile. Soggetti animali sono compromesse con modelli prevedibili di danni cerebrali, si riprendono speditamente, ed i tassi di mortalità sono relativamente bassi.

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Sanderson, T. H., Wider, J. M. 2-Vessel Occlusion/Hypotension: A Rat Model of Global Brain Ischemia. J. Vis. Exp. (76), e50173, doi:10.3791/50173 (2013).

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Abstract

Seguita da arresto cardiaco rianimazione provoca spesso danni cerebrali causati da ischemia drammatico e successiva riperfusione del cervello. Ischemia globale cerebrale produce danni a regioni specifiche del cervello dimostrato di essere molto sensibile all'ischemia 1. Neuroni dell'ippocampo hanno una maggiore sensibilità agli insulti ischemici rispetto ad altre popolazioni cellulari, e in particolare, la regione CA1 dell'ippocampo è particolarmente vulnerabile ad ischemia / riperfusione 2.

La progettazione di interventi terapeutici, o studio dei meccanismi coinvolti nel danno cerebrale, richiede un modello che produce danni simile alla condizione clinica e in modo riproducibile. Carotidea bilaterale occlusione nave con ipotensione (2VOH) è un modello che produce ischemia reversibile prosencefalo, emulando gli eventi cerebrali che possono verificarsi durante l'arresto cardiaco e rianimazione. Descriviamo un modello modificato da Smith et al. (1984) 2, Come prima presentata nella sua forma attuale nel Sanderson et al. (2008) 3, che produce lesioni riproducibile per selettivamente regioni cerebrali vulnerabili 3-6. L'affidabilità di questo modello è dettata da un controllo preciso della pressione arteriosa sistemica durante ipotensione applicata, la durata dell'ischemia, controllo della temperatura, un regime specifico anestesia, e diligente cura post-operatoria. Un insulto ischemico 8 minuti produce la morte cellulare di neuroni CA1 dell'ippocampo che progredisce nel corso di 6-24 ore di riperfusione, mentre le regioni del cervello meno vulnerabili sono risparmiati. Questa progressiva morte cellulare è quantificato facilmente dopo 7-14 giorni di riperfusione, come una perdita completa presso neuroni CA1 è evidente in questo momento.

In aggiunta a questo modello di lesione cerebrale, presentiamo un metodo per la quantificazione CA1 danni utilizzando un semplice, ma approfondita, metodologia. Importante, quantificazione può essere realizzata utilizzando un microscopio semplice telecamera montata, unaDa Free ImageJ (NIH) software plugin, ovviando alla necessità di programmi software stereologia costo proibitivo e un palcoscenico microscopico motorizzato per la valutazione dei danni.

Introduction

Danni cerebrali a seguito di arresto cardiaco e di ictus è una delle principali cause di morte e disabilità a lungo termine. Mentre rianimazione cardiopolmonare per le vittime di arresto cardiaco riesce a ripristinare la circolazione spontanea in circa 70.000 pazienti all'anno negli Stati Uniti 7,8 per almeno il 60% di questi pazienti muore successivamente in ospedale a causa di gravi danni cerebrali e solo il 3-10% di pazienti rianimati possono riprendere la loro ex stili di vita 9,10. Chiaramente, la comprensione dei meccanismi che portano a danni cerebrali a seguito di ischemia cerebrale globale e la progettazione di interventi terapeutici per ridurre al minimo il trauma neurologico è di importanza critica.

Cervello ischemia può essere modellato utilizzando più metodi. Più comunemente, ischemia cerebrale è prodotto nel roditore occludendo un vaso sanguigno nel cervello, l'arteria cerebrale media, producendo così un ictus ischemico focale 11,12. Mentre clinicamente importante,ischemia cerebrale focale non è un metodo accurato per studiare i danni cerebrali prodotte da arresto cardiaco / rianimazione. Per modellare questo paradigma clinico l'intera testa deve essere fatta ischemica seguita da reintroduzione del flusso sanguigno. Per imitare da vicino questa presentazione clinica, gli investigatori sperimentalmente inducono arresto cardiaco seguito da rianimazione con RCP e defibrillazione 13,14. Questo modello è clinicamente rilevante, i tempi di rianimazione comunque imprevedibili possono aumentare la variabilità e possono rendere l'analisi dei dati di difficile interpretazione. Inoltre, questo modello è associata ad un alto tasso di mortalità, aumentando ulteriormente il numero degli animali necessari per verificare un'ipotesi. Indagare la risposta cerebrale a ischemia globale e / o di riperfusione in un insulto più riproducibile, coerente, e sopravvivere può essere preferito.

Ischemia globale può essere indotta nel cervello preservando certo flusso sanguigno sistemicamente. Questo riduce la mortalità, pur consentendo investigation dei meccanismi di danno tissutale nel cervello 2. Per produrre ischemia cerebrale globale, è necessario interrompere o limitare notevolmente il flusso in tutte e quattro vasi che alimentano il cervello, le arterie carotidi interne e le arterie vertebrali. Queste navi forniscono il cervello con il flusso di sangue attraverso una struttura vascolare chiamata Circolo di Willis, che forma un loop anastomotica. Questa architettura vascolare permette al cervello di conservare perfusione in caso di occlusione vascolare prossimale. Pertanto, per indurre ischemia completa del cervello, flusso di sangue attraverso tutti i vasi contributiva deve avvenire. Occlusione dell'arteria carotide può essere realizzata utilizzando un mininvasiva collo ventrale cut-down e l'applicazione di clip aneurisma per un periodo desiderato. Interruzione del flusso sanguigno attraverso le arterie vertebrali può essere difficile, in quanto sono incased nella forami trasversale della colonna vertebrale. Gli investigatori hanno affrontato questo electrocauterizing le arterie vertebrali 24-48 ore prima della carotideocclusione e ischemia cerebrale (4VO modello) 15. In contrasto con questo approccio, Smith et al. Sviluppato un metodo per indurre ischemia cerebrale globale riducendo la pressione arteriosa media (MAP) sistemicamente a 40 mmHg per ridurre la perfusione attraverso le arterie vertebrali ad un punto in cui il flusso di sangue è perso o fortemente ridotta 2 . Quando accoppiato con occlusione carotidea, questo metodo produce ischemia tutto il proencefalo, risultante in un modello di danno cerebrale che imita da vicino quella di sopravvissuti arresto cardiaco. In un ulteriore perfezionamento di questo metodo, il modello che presentiamo qui necessita di regolamentazione MAPPA stretto a 30 mmHg ± 1mHg durante l'intero 8 min di ischemia. Abbiamo trovato questa alterazione migliora la riproducibilità del danno cerebrale indotto da questo modello, preservando il basso tasso di mortalità della tecnica originale disegnato da Smith et al.

Il fenotipo precisa della morte cellulare e l'entità complessiva del danno tissutale causato dail modello presentato qui sono direttamente dipendenti durata ischemica 16. Seguendo 8 minuti di ischemia, neuroni CA1 esibiscono ritardato morte cellulare, suggerendo che vi sia una finestra temporale di intervento terapeutico durante la fase di riperfusione 15,17. All'inizio della riperfusione, i neuroni riacquistano rapidamente la funzione e non la morte cellulare immediato è rilevabile 18. Tuttavia questo insulto provoca l'induzione di cascate di morte cellulare (apoptosi) che culminano nel rilascio di proteine ​​apoptogenica dai mitocondri, tra cui il citocromo c, tra 4-6 ore di riperfusione 3,19. Tra il 6 e 24 ore di riperfusione, i neuroni del CA1 dell'ippocampo sono impegnati a morte cellulare, e il programma di morte cellulare per apoptosi viene eseguito 19. Va notato che la morte delle cellule fenotipo responsabile del danno ischemico è molto controverso. I primi studi hanno suggerito la necrosi è il primario morte cellulare fenotipo 20,21, mentre altri altri riferiscono apoptOsis come il meccanismo principale 22,23. In totale, le prove attuali suggeriscono che le cellule muoiono di uno spettro di fenotipi di morte cellulare che vanno dal classico al apoptosi necrosi. Della specifica modalità di morte cellulare dipende da molti fattori, con il grado di contributo di ciascun fenotipo seconda della gravità dell'insulto, tra gli altri fattori 24,25. Con 24 ore di riperfusione, le cellule muoiono possiedono nuclei picnotici, citosol condensato con chiara evidenza di contenuti aggregati cellulari, e la perdita della morfologia funzionale mitocondriale. Le cellule morte sono ulteriormente suddivise, inghiottiti da cellule del sistema immunitario come i macrofagi e / o microglia, e liquidati dalla regione CA1 dell'ippocampo. Da 4-7 giorni di riperfusione, le cellule morte vengono rimosse, e tutto ciò che rimane sono le cellule infiammatorie e cellule gliali attivate 17,26. Pertanto, 7 giorni di riperfusione rappresenta un momento ottimale in cui CA1 dell'ippocampo morte neuronale può essere quantificato utilizzando semplici macchie di cellule non-specifici, including violetto cresolo o hemotoxylin-eosina e contato sulla base di criteri di inclusione morfologici. Le cellule rimanenti in questo intervallo di riperfusione tardiva possono essere considerate come cellule sopravvissute, fornendo così un indice di danno cerebrale.

Se questo modello deve essere utilizzato per testare gli interventi terapeutici, si suggerisce che il disegno sperimentale seguire criteri SCALE (Stroke Therapy Academic Industry Roundtable) 27. Queste linee guida dovrebbero essere seguite durante la progettazione e la realizzazione di uno studio, tuttavia, non sono discussi qui.

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Protocol

1. Preparazione

Tutti gli esperimenti sugli animali devono essere conformi alle linee guida istituzionali e ricevere l'approvazione da parte di una commissione di competenza la cura degli animali prima di iniziare. Tutte le procedure qui presentati sono stati approvati dalla Wayne State University Institutional Animal Care e uso Comitato e seguire le linee guida per il trattamento etico degli animali, come messo avanti nella Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio e di Governo degli Stati Uniti Principi per la Utilizzo e cura dei vertebrati animali utilizzati per prove, ricerca e formazione. Prima di iniziare la chirurgia, preparare materiale chirurgico necessario e una gabbia recupero di chirurgia. Questa procedura è un intervento chirurgico sopravvivenza ed è quindi necessario praticare tecnica sterile.

  1. Per fare un catetere vascolare, tagliare una lunghezza di 8 pollici di polietilene 50 (PE50) tubazione e inserire un ago calibro 23 in una estremità smussata. I cateteri possono essere acquistati singolarmente pre-sterilizzati o acquistati in bULK e quindi sterilizzati con glicole etilenico come necessario.
  2. Fissare questo ago su una porta di un rubinetto a tre vie e mettere un altro rubinetto di arresto a tre vie sulla porta opposta. Eparinizzare i rubinetti e il catetere eseguendo soluzione salina attraverso eparina. Collegare una siringa da 10 ml salina sulla perpendicolare rubinetto e distale al catetere. Collegare il rubinetto distale al catetere al tubo trasduttore di pressione, riempire il sistema con soluzione salina ed eliminare eventuali bolle d'aria.
  3. Impostare la gabbia di recupero in conformità alle norme di utilizzo degli animali. La stanza di recupero dovrebbe essere tranquillo e avere basso traffico. Svolta importante sul tavolo downdraft o simile sistema di evacuazione dei gas prima di un intervento chirurgico inizio di filtrare vaporizzato isoflurano.

2. Preparazione chirurgica

Sprague-Dawley (300-350 g) vengono utilizzati nel modello di ischemia 2VOH proencefalo globale. L'anestesia viene indotta e mantenuta con isofluorano e supsere realizzata con una dose sub-dissociativo della ketamina. Abbiamo osservato che l'anestesia gestito da isoflurano da solo provoca un aumento della comparsa di convulsioni durante il recupero post-operatorio. Convulsioni possono contribuire al danno neuronale e la mortalità, che avrà un impatto la riproducibilità di questo modello. Che completa anestesia con ketamina permette una dose molto più bassa di isoflurano per raggiungere un grado chirurgico di anestesia. Utilizzando una coperta termica omeostatico consente una rigorosa regolamentazione della temperatura interna. La procedura chirurgica prevede carotide cut-down e l'isolamento, e l'arteria femorale cut-down e incannulazione.

NOTA È importante tenere un registro dettagliato durante ogni procedura chirurgica individuale. Cambiamenti nella temperatura interna, pressione del sangue, o altre variabili fisiologiche che si verificano prima o durante l'intervento chirurgico possono alterare drasticamente i risultati, e le registrazioni possono essere analizzati al fine di garantire la coerenza procedurale tra individui e gruppi. Coerenzanei parametri fisiologici dell'animale può essere migliorata con il digiuno gli animali prima di un intervento chirurgico. Gli sperimentatori sono incoraggiati a stabilire il metodo che si traduce in più coerenti emodinamica pre-manuale e la concentrazione di glucosio nel siero per i loro studi.

  1. Indurre l'anestesia ponendo il ratto in una camera di induzione e riempire con un oxygen/70% miscela di ossido di azoto del 30% al 5% isoflurano. Intubare con un catetere di calibro 12, con un laringoscopio roditore e ventilare con il 30% oxygen/70% miscela protossido d'azoto con il 2,5% isoflurano. Tasso di ventilazione dovrebbe essere di 80 respiri al minuto a 2,5 ml per l'alito.
  2. Dare una iniezione intraperitoneale di ketamina (20 mg / kg) in soluzione salina e ridurre isoflurano al 1,5%. IMPORTANTE E 'indispensabile per monitorare il livello di anestesia durante tutta la procedura chirurgica per garantire un adeguato piano di anestesia. Per controllare la profondità di anestesia, pizzico tra le cifre degli arti posteriori, mentre il monitoraggio pedale riflesso. Se il riflesso èassente, l'anestesia è adeguata. Dopo incannulamento dell'arteria femorale, la pressione sanguigna può essere utilizzato come indicatore del livello di anestesia. Mantenere la dose di isoflurano più basso possibile, pur mantenendo un piano di anestesia chirurgica per minimizzare il potenziale di convulsioni post-ischemici.
  3. Le incisioni saranno effettuati sul collo e nella zona pelvica. Radere il collo e il bacino a destra, dove la coscia incontra l'addome. Orientare il ratto in posizione supina sul omeostatico termo-coperta e inserire il termometro rettale usando lubrificante chirurgica. Applicare lubrificante protettivo occhio. Una lampadina da 60 watt può aiutare a regolare la temperatura. La lampadina non dovrebbe mai trovarsi a meno di 8 centimetri dal animale. Temperature IMPORTANTI sopra o sotto la normale temperatura fisiologica (37 ° C) possono influenzare notevolmente i danni neurologici finale. Mantenere la temperatura a 37 ° C ± 0,5 ° C.
  4. Strofinare le zone di incisione con Betadine e risciacquare con etanolo al 70%. Ripetere questo twØ più volte. Posizionare un campo chirurgico sul ratto, e tagliare i fori per esporre le zone di incisione. IMPORTANTI arterie carotidi e femorali possono essere isolati senza causare traumi alla muscolatura circostante, che permetterà di migliorare il recupero e ridurre al minimo la successiva necessità di analgesia post-operatoria.
  5. In attesa di anestesia adeguata, usare un bisturi n ° 10 per fare una incisione mediana lungo il collo, poi, utilizzando hemostats senza mezzi termini sezionare tra le ghiandole salivari fino a raggiungere il muscolo sterno, il gruppo muscolare linea mediana prominente che copre la trachea. Sempre con attenta tecnica di scollamento, separare i principali gruppi muscolari del sterno dal sternocleidomastoideo, bilateralmente. Questi due gruppi muscolari formano una cavità triangolare che può essere utilizzato come punto di riferimento per individuare il fascio neurovascolare che contiene la carotide. I rami carotidi comuni nelle arterie carotidi interne ed esterne. Isolare l'arteria carotide comune prossimale al bibiforcazioni.
  6. Separare delicatamente questi due muscoli e localizzare la carotide. Per aiutare a identificare questo look vaso per un polso. Isolare le arterie carotidi su entrambi i lati, passando una lunghezza di ~ 5 pollici di 3-0 sutura di seta sotto il vaso. Sgombrare fascia dai vasi. ATTENZIONE Il nervo vago e catene simpatiche sono compresi nel fascio neurovascolare del collo dell'utero e la cura deve essere presa per evitare di causare danni ad esso quando isolando la carotide.
  7. Usare le forbici per fare una seconda incisione all'inguine, lungo la rientranza in cui i muscoli della coscia arti posteriori incontra l'addome. Sezionare sotto il muscolo addominale, lungo i muscoli della coscia fino a raggiungere il legamento inguinale. Questo esporrà il fascio neurovascolare femorale. Isolare con cura l'arteria femorale passando un 5 pollici di lunghezza ~ 3-0 sutura di seta sotto il vaso. Sgombrare fascia lasciando 5-7 mm di vaso esposto.
  8. Un nodo permanente all'estremità distale dell'arteria esposta.
  9. Applicare trazione sulla sutura all'estremità prossimale dell'arteria per occludere il flusso sanguigno, tirando le suture insegnate. Fare una piccola incisione attraverso la parte superiore del recipiente con le forbici oftalmiche. Trazione insufficiente sul vaso si tradurrà in sanguinamento, che può essere fermato applicando una trazione pesante. Chiudere il catetere al rubinetto di arresto.
  10. Utilizzando un introduttore vascolare, inserire il tubo del catetere nel vaso, 7-9 mm oltre l'incisione nave e verso la linea mediana. Una volta che il catetere è posizionato alla distanza desiderata, legare il nodo sciolto intorno alla nave e catetere per fissarlo in posizione. Rimuovere la trazione dal recipiente e lasciarlo giacere in modo naturale.
  11. Somministrare 0,3 ml di eparina (100U/ml in soluzione salina), per via endovenosa. Lavare ognisangue dal catetere con una piccola quantità di soluzione fisiologica per prevenire la coagulazione. Accendere il monitor della pressione e calibrare le apparecchiature. Aprire i rubinetti per permettere il trasduttore per rilevare la pressione arteriosa. Per ottenere misure precise di pressione sanguigna, il posizionamento del sistema non deve essere cambiato dopo la calibrazione.
  12. Isoflurano dosaggio deve essere regolato per produrre una pressione arteriosa media (MAP) di 110 mmHg a 130 mmHg. Questa mappa dovrebbe essere indicativo di piano chirurgica adeguata di anestetici.

3. Protocollo Ischemia

Come accennato in precedenza, quattro navi da rifornimento perfusione al cervello. Occlusione prossimale delle due arterie carotidi non si tradurrà in ischemia cerebrale perché le arterie vertebrali compenseranno attraverso il circolo di Willis. E 'stato dimostrato che l'occlusione carotidea, accoppiato con ipotensione sistemica indotta, limiterà perfusione attraverso le arterie vertebrali conseguente ischemia cerebrale. Qui abbiamo descrIBE il protocollo per prelevare sangue per produrre ipotensione e bloccaggio delle arterie carotidi per produrre controllata, ischemia reversibile. Vedere la Figura 1.

Ossigeno e anidride carbonica nel sangue, la concentrazione di glucosio e il pH può variare tra individui nel gruppo campione e causare variazioni nel pregiudizio. Monitoraggio di queste variabili fisiologiche può ridurre la variabilità del miocardio. Come detto, la temperatura è un altro parametro che è importante per regolare, tuttavia temperatura del cervello non corrispondere alla temperatura centrale, come perfusione è fortemente limitato durante l'ischemia sperimentale 28. I nostri risultati specifici di impostazione chirurgici in variazioni di temperatura nel cervello che cambia specchio a temperatura interna durante l'ischemia. Tuttavia, è importante per poter stabilire questa empiricamente monitorando temperatura cervello con termocoppie o con altro mezzo standardizzazione della procedura. Se la temperatura interna non rispecchia tem cervelloperatura, è importante mantenere la temperatura normotermica cervello durante l'intera procedura, indipendentemente dalla temperatura interna.

Randomizzazione impone che il chirurgo casuale l'animale ad ischemia o gruppo di controllo sham-operated a questo punto. Ambulatorio finto seguirà tutte le procedure esattamente la stessa di animali ischemici esclusione di qualsiasi riduzione della pressione arteriosa e l'occlusione della carotide. È importante che i controlli sham essere sotto la stessa dose di anestesia per una durata corrispondente a quella degli animali ischemici. Se vi è un gruppo di trattamento compreso, che richiede l'anestesia prima o dopo ischemia, ischemia sham e gruppi non trattati dovrebbe corrispondere alla dose di anestesia e la durata del gruppo di trattamento.

  1. Clip emostatiche pronti e clip dell'applicatore. Clips dovrebbero completamente occludere il vaso senza causare alcun trauma. Ischemia può essere indotta quando emodinamica sono diventati coerente. Collegare un 10 ml di eparina SyriESN sul rubinetto perpendicolari e prossimale al catetere. Ci dovrebbe essere 0,3 ml (30 unità) di soluzione fisiologica eparinizzata all'interno della siringa per evitare la coagulazione del sangue prelevato.
  2. Impostare un timer per 1 min e aprire il rubinetto alla siringa eparina, così il sangue può essere prelevato.
  3. Prelevare il sangue tirando lo stantuffo della siringa. Se si applica troppo aspirazione, la nave collasserà o sigillare contro l'apertura del catetere e il sangue non viene disegnato. Dovrebbe essere possibile rimuovere 7-9 ml di sangue in 1 min. Se questo non è il caso, avanzato il catetere ulteriormente nell'arteria e riprovare. Troviamo che 7-9 ml di sangue deve essere rimosso per ridurre il MAP vicino 30 mmHg, il valore di pressione arteriosa di raggiungere ischemia. IMPORTANTE Assicurarsi che il sangue prelevato viene mantenuta a 37 ° C per evitare raffreddamento durante reinfusione del sangue.
  4. Dopo quella prelievo di sangue minuto (7-9 ml di sangue devono essere prelevati), applicare clip emostatiche alle arterie carotidi e iniziare unTimer per 8 min. Controllare immediatamente la pressione sanguigna. Se la mappa non è a 30 mmHg, infondere o ritirare il sangue lentamente per raggiungere 30 mmHg ± 1 mmHg. Continuate questa pratica in tutta l'ischemia per mantenere MAP del 30 mmHg. IMPORTANTE Record pressione sanguigna durante l'intero protocollo di ischemia. Mancata riduzione della pressione sanguigna a 30 mmHg può limitare ischemia. Monitor core e / o la temperatura del cervello da vicino durante la reinfusione di aumenti o diminuzioni di temperatura possono influenzare danni cerebrali.
  5. Al termine di 8 min, iniziare riperfusione rimuovendo le clip emostatiche e reinfusione del sangue lentamente, 2 ml al minuto.
  6. Quando il sangue è stato reinfuse la cannula può essere rimosso dalla arteria femorale. Per evitare qualsiasi sanguinamento durante la post-op, sicuri due nodi distinti prossimali alla incisione sull'arteria.
  7. Suturare le incisioni con un modello discontinuo usando un ago di taglio inverso, con 5-0 sutura VICRYL. Questa sutura si dissolvono, in modo da non rEquire rimozione. NOTA Durante la procedura, se l'anestesia sufficiente non può essere raggiunto con livelli più bassi di isoflurano, somministrare un'ulteriore dose di ketamina.

4. Analgesia e ripristino

Il benessere degli animali è la priorità durante il recupero, così come la procedura chirurgica. Assistenza post-operatoria deve seguire le linee guida specifiche dell'istituzione. Gli animali che subiscono ischemia cerebrale globale è soggetti ad attacchi. Per ridurre al minimo il sequestro occorrenza è importante che la sala di risveglio hanno stimolazione minima, vale a dire i rumori e disturbi visivi. Sotto il nostro protocollo di utilizzo degli animali, abbiamo casa animali post-operatorie per 72 ore in una stanza appartata per questo scopo.

  1. Dopo che le incisioni sono state suturate il topo può essere svezzati dal ventilatore. Spegnere l'isoflurano e continuare la ventilazione al 30% oxygen/70% di ossido di azoto fino a quando il ratto inizia a respirare contro il ventilatore.
  2. Somministrare 0,5 mg / kg Butorfanolo in 5 ml di soluzione fisiologica, per via sottocutanea tra le scapole.
  3. Rapidamente reinfusione del sangue può aumentare il precarico del ventricolo destro. Questo aumenta la pressione polmonare e la circolazione potrebbe causare edema polmonare. I segni di questo includono respirazione difficoltosa e scoppiettante suoni durante la respirazione. L'applicazione di pressione positiva di fine espirazione contribuirà a migliorare l'edema polmonare.
  4. Quando il controllo volontario della respirazione è riconquistato, estubare, togliere il termometro e spegnere la termocoperta. A questo punto l'animale può essere collocato in una gabbia di recupero. La gabbia recupero deve essere posizionato in modo metà della gabbia è sulla cima di una coperta di circolazione dell'acqua (34 ° C) per il primo 24 ore di riperfusione. Posizionare l'animale sulla parte del pavimento della gabbia sopra la termocoperta per aiutare nel mantenimento della temperatura. Una volta che l'animale comincia a recuperare da anestesia e analgesia, si muoverà attorno alla gabbia di termoregolazione stessa. Gli animali saranno alloggiati separatamente durante la post-op.
  5. L'animale deve avere accesso illimitato all'acqua. Per due giorni post-op, questa acqua dovrebbe contenere 4 mg / kg di soluzione liquida Tylenol. Oltre a roditori Chow, zuccherato cereali colazione è fornita nella gabbia di stimolare mangiare ed evitare la perdita di peso.
  6. Coprire la metà della gabbia con un telo e monitorare attentamente il recupero post-operatorio.
  7. Come l'animale recupera dall'anestesia è importante valutare segni di sofferenza. Affannoso o la respirazione incoerente può essere un segno di disagio, forse causata da edema polmonare o di irritazione delle vie respiratorie durante l'intubazione. Butorphenol sarà sedare l'animale, riducendo l'attività, comunque lieve attività dovrebbe essere ripristinata entro 1 ora. Troviamo animali inizieranno a mangiare dolcetti e bere entro 4 ore di estubazione. Entro il 12 hr, il comportamento normale e attività di alimentazione dovrebbero essere ripresi. Un altro segno di disagio è la perdita di peso, un animale dovrebbe perdere non più del 20% del peso corporeo iniziale, in ogni 48 ore spanna, se eccessiva perdita di peso is ha osservato l'animale deve essere eutanasia.
  8. Intervento umano è necessario se si verificano attacchi epilettici. Questo tipo di attività di sequestro è generalmente visto 24 a 48 ore dopo la riperfusione. Le crisi epilettiche possono provocare una maggiore danno cerebrale che è indipendente l'insulto ischemico per sé, quindi attività di sequestro deve essere considerato un criterio di esclusione poste in essere prima dell'inizio dello studio 29. Convulsioni possono verificarsi quando nessuno è presente, per cui è importante riconoscere i segni. Biancheria da letto sarà disturbato e forse espulso dalla gabbia. Un ratto postictale avrà una disposizione languido con rapida, respiro affannoso e / o di avere un naso contuso o sanguinamento.

Nota Eventuali segni di dolore o di angoscia sono immediatamente alleviato con analgesici. Se sympotoms non vengono alleviati con una dose di analgesici o persistono dopo la quarta dose consecutivo di analgesia, l'animale sarà eutanasia ed esclusi dallo studio. Wo chirurgicaondi devono essere controllati per la corretta guarigione per otto giorni post-op.

5. Raccolta dei tessuti e delle

Il cervello è fissato per infusione transcardial di paraformaldeide. Dopo aver sezionato lordo e crioprotezione, abbiamo SNAP congelare il cervello e la sezione su un criostato. Queste sezioni cerebrali sono colorate con violetto cresolo e ripreso su un microscopio ottico.

  1. Indurre l'anestesia ponendo l'animale nella camera di induzione e di riempimento con il 30% di ossigeno / ossido nitroso 70% con il 5% isoflurano. Intubare l'animale e ventilare al 30% di ossigeno / protossido di azoto del 70% con il 5% isoflurano.
  2. Preparare il materiale per la procedura di perfusione. Riempire un bicchiere con 100 ml di 1x tampone fosfato salino (PBS) a 4 ° C ed un becher con 100 ml di 4% paraformaldeide (PFA) a 4 ° C. Il cervello viene lavata con PBS seguita da PFA, tramite una pompa di perfusione. Tubo verrà inserito in ciascun becher e collegati da una valvola a tre vie per unLlow una transizione fluida dal PBS a PFA perfusione. Inserire un ago calibro 18 smussato sul tubo e riempire la linea con PBS. Verificare che non vi siano bolle nel ago e tubo come l'aria può formare una embolia, che potrebbe impedire la perfusione. Inoltre, pronto un piccolo contenitore con PFA per immersione fissazione del cervello.
  3. Utilizzare un vassoio di raccolta di liquido, con una capacità sufficiente per contenere almeno 200 ml di liquido. A questo punto l'animale avrebbe dovuto essere ventilato con isoflurano per un tempo sufficiente (almeno 3 minuti) per raggiungere anestesia profonda.
  4. IMPORTANTE Assicurarsi che si raggiunge piano chirurgico di anestesia.
  5. Procedere facendo un'incisione per accedere alla cavità toracica attraverso l'addome. Bloccare l'aorta discendente. Quando il cuore è esposto, inserire l'ago calibro 18 smussata attraverso l'apice del cuore in aorta. Fare un piccolo taglio nel padiglione auricolare destro per permettere perfusato per uscire l'animale.
  6. Accendere la pompa a 50 ml / min, cominciando con PBS. Dopo pumping 100 ml di PBS, passare il rubinetto di perfusione 100 ml di PFA.
  7. Rimuovere il cervello, facendo attenzione a non danneggiare il tessuto.
  8. Mettere il cervello in una matrice di tessuto e tagliare tra il cervelletto e il cervello. Sezione proencefalo; ~ 3 millimetri dalla parte anteriore e posteriore della corteccia cerebrale. Questo produrrà tre sezioni, la sezione centrale conterrà l'ippocampo.
  9. Posizionare le sezioni del cervello in un barattolo con sufficiente PFA per immersione completa. Immersion fissare il cervello esattamente per 2 ore.
  10. Per proteggere i tessuti da danni causati dal congelamento, il cervello è cryoproteced sostituendo il PFA con il 30% di saccarosio in PBS. Crioprotezione è completa con i campioni di tessuto affondano nella soluzione di saccarosio (~ 24-48).
  11. Per agganciare congelare le sezioni del cervello, mettere un bicchiere di ghiaccio secco e riempire con 2-methylbutanol per dieci minuti. Mettere le fette di cervello nella methylbutanol per 5 minuti, poi trasferire in un contenitore sigillato e conservare a -80 ° C fino a quando cryostal sezionamento.
  12. Sezione criostato il cervello a 20 micron, la raccolta di almeno 3 sezioni a 3 cervello atlante coordinate (Il cervello di ratto in Coordinate Stereotassica. Paxinos e Watson, parti di piastra 29, 31, 33 o Bregma -2.8 mm, -3.3 mm e -3.8 mm). Le sezioni sono posti su vetrini da microscopio cariche e lasciate asciugare prima di riporre a -80 ° C.
  13. Violetto cresolo (0,1% a pH 3.5) macchia di 9 sezioni di cervello, 3 ad ogni coordinata cervello atlante.
  14. Immagine della regione CA1 dell'ippocampo a 40x con un microscopio montato fotocamera e inserire una scala di 300 micron bar parallelo al piano neuronale CA1. Salvare immagini come file TIFF.

6. Brain Damage Quantificazione

ImageJ, un programma gratuito offerto dal National Institute of Health, può essere usato per contare e quantificare i neuroni vitali, che rappresenteranno l'estensione del danno cerebrale.

  1. Aperte microscopio immagini TIFF con il 'contatore di cellule' plug-in di ImageJ. Selezionare unmarcatura colore e neuroni conteggio entro i confini della barra di scala. I neuroni sono conteggiate in base a semplici criteri di inclusione basata sulla morfologia neuronale (grande, di forma piramidale) o criteri di esclusione dalla microglia / astrociti morfologia (piccolo tondo o lunghe forma tubolare).
    IMPORTANTE Essere coerente con inclusione / esclusione criteri tra le diapositive, e gli individui, quando il conteggio dei neuroni.
  2. Record neurone conta e salvare la finestra del contatore di cellule.
  3. Neuron conteggi dovrebbero essere completati da due persone diverse per raggiungere coerenti, neurone conteggi precisi.
  4. La media di tutti i 9 immagini da ogni animale fornirà una media singola "count neurone", che è la misura quantitativa di CA1 dell'ippocampo danni da utilizzare nelle analisi statistiche. I gruppi possono essere confrontati staticamente utilizzando una ANOVA a una via seguita da prova di una Tukey HSD per l'analisi post hoc, oppure, se fallisce test di normalità, un Kruskal-Wallis ANOVA sui ranghi seguito dal Po di Dunnanalisi st hoc per valutare statisticamente le differenze tra i gruppi. Analisi statistica specifica dovrebbe essere dettata dal design individuale di studio, quello qui presentato non può essere appropriato per le specifiche ipotesi in fase di test.

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Representative Results

Il modello 2VOH di ischemia cerebrale / riperfusione globale provoca la morte neuronale nella regione CA1 dell'ippocampo. Figura 2 rappresenta la lesione prodotta da 8 minuti di ischemia cerebrale globale, trasformati 14 giorni dopo la riperfusione. Figure 2A e 2B confronta ippocampi da sham e cervelli post-ischemica, colorate con violetto cresolo. Figura 2A mostra un ippocampo di un topo sham-operated che presenta normale morfologia, tra cui un CA1 intatto. figura 2B mostra l'ippocampo oggetto di ischemia / riperfusione, dove il giro dentato, CA2 e CA3 hanno minimamente influenzato la morfologia. I neuroni selettivamente vulnerabili della CA1 dell'ippocampo non sopravvivono ischemia / riperfusione e solo i neuroni sparsi rimangono. Tuttavia, gli aumenti drammatici nella infiltrazione dei macrofagi e / o microglia (cellule Iba-1-positivi), e astrociti reattivi (cellule GFAP-positive) sono evidenti nel CA1 hcampo ippocampal. Etichettatura immunofluorescenza specifica di neuroni con NeuN, macrofagi / microglia etichettatura con Iba-1, e di etichettatura con astrociti GFAP corroborare questi risultati.

Figura 2C presenta campione neurone conteggio finestre di immagini al microscopio del CA1 con ingrandimento 40x. Il pannello superiore mostra CA1 da un controllo sham-operated e il pannello inferiore mostra il CA1 seguente ischemia / riperfusione. I feriti CA1 mostra una colorazione che comprende microglia e astrociti, che appaiono piccoli e tubolari oa forma di lacrima. Questi possono essere distinte da neuroni dalla loro forma. Neuroni dell'ippocampo intatti, se nel giro dentato, CA2 o il CA1, sono di grandi dimensioni con una forma circolare o piramidale.

Figura 2D è un'analisi grafica della lesione indotta 2VOH quantificato da CA1 conta neuronali. Si può concludere che 8 minuti di ischemia prodotta dal modello 2VOH può causare un consistente e reproducible infortunio che è in primo luogo isolato per il CA1 dell'ippocampo.

Figura 1
Figura 1. Timeline Sperimentale. La timeline sperimentale è una rappresentazione delle fasi chirurgiche e di lavorazione dei tessuti.

Figura 2
Figura 2. Risultati rappresentativi. Danno ippocampale in un ratto non trattato sottoposti a I / R (B) rispetto a un ratto di controllo sham-operated (A). Cresile viola macchiato ippocampo (10 volte) [Surround] ingrandimenti 40X del CA1, CA2, CA3, ilo, e DG (top LEFTA in senso orario). (B) Il danno è localizzato alla CA1 hippocampus. (C) Rappresentante finestre di conteggio utilizzati per il conteggio dei neuroni e danno quantificazione in un animale di controllo sham-operated (in alto, di controllo) e un animale esposto a ischemia cerebrale globale (in basso, I / R). (D) Rappresentante quantificazione di CA1 neurone conta ippocampo di uno studio non pubblicato (media + deviazione standard, n = 8, p <0.05).

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Discussion

Il modello qui descritto produce un insulto ischemico al cervello che può verificarsi come risultato di arresto cardiaco e rianimazione, fornendo un infortunio simile a quella trovata in esseri umani. Questo metodo per produrre ischemia cerebrale globale è una delle più protocolli. Utilizziamo questo protocollo soprattutto per il suo tasso relativamente basso di mortalità, recupero rapido e risultati riproducibili. Il modello di arresto / rianimazione cardiaca è probabilmente il modello più clinicamente rilevante, tuttavia tecnicamente più difficili da riprodurre in continuazione. Il modello 4VO di ischemia cerebrale globale è un altro protocollo comunemente usato, prezioso nel fatto che tutte e quattro le navi contribuiscono sono occluse durante l'ischemia. Questo modello ha anche degli inconvenienti, che comprendono interventi chirurgici multipli e possibilità di precondizionamento neuroprotettivo. Il modello 4VO è stato adattato, permettendo occlusione transitoria di tutte e quattro le navi durante una procedura per produrre ischemia, tuttavia la chirurgia resta tecnicoly esigente 30.

Variazioni su 2VOH hanno dimostrato di produrre una gamma di risultati 31,32. Durata dell'ischemia e del grado di ipotensione sono le principali variabili che possono influenzare il risultato. Le relazioni hanno dimostrato che se la pressione arteriosa non si riduce abbastanza la lesione prodotta può essere incoerenti o unilaterale nei ratti 30. Abbiamo trovato 30 mmHg per essere un grado ottimale di ipotensione perché produce ischemia affidabile senza causare notevoli danni periferico. Questo paradigma produce ischemia caratterizzato come grave, però seguendo il nostro protocollo ridurrà l'altrimenti maggiore probabilità di complicanze. La natura grave dell'insulto può essere il motivo leggera variazione nei parametri fisiologici tra gli animali in genere non influisce coerenza lesioni.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interessi finanziari.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material Name
5-0 VICRYL suture, reverse cutting Ethicon J391H
Scalpel, No.10 Swann-Morton 6601
Gauze Sponges Fisher 22-362-178
18G x 1 ½ in needle BD 305201
23G x 1 in needle BD 305145
26 G x 3/8 in needle BD 305110
18 G x 1 ¼ catheter EXEL 26735
1 ml syringe BD 309659
10 ml syringe BD 309604
60 ml syringe BD 309653
Surgilube Henry Schein 1152666
.9% Saline, plastic IV bag Henry Schein 1537468
Suture 3-0 Silk Henry Schein 1007842
Puralube Ophthalmic Ointment Henry Schein 3390017
Betadine Henry Schein 6903564
Sterile Towel Drape Moore Medical 14170
Polyethylene Tubing, 50 Intramedic 427411
Stopcock, 3 way Smiths medical MX9311L
Drug Name
AERRANE (isoflurane) Henry Schein 2091966
Mapap Liquid (Tylenol) Major Pharmaceuticals 1556
Kedavet (ketamine) Ketathesia Butney NDC 50989-996-06
Butorphic (butorphanol) Lloyd Labs 4881
Heparin APP Pharmaceuticals 504011
Chemical Name
Paraformaldehyde prills Elecron Microscopy Sci. 19202
2-methylbutane Sigma 270342
Cresyl Violet Acetate Sigma C5042
Sucrose Sigma S9378
Software
ImageJ NIH

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References

  1. Kirino, T., Sano, K. Selective vulnerability in the gerbil hippocampus following transient ischemia. Acta Neuropathologica. 62, 201-208 (1984).
  2. Smith, M. L., Auer, R. N., Siesjo, B. K. The density and distribution of ischemic brain injury in the rat following 2-10 min of forebrain ischemia. Acta Neuropathologica. 64, 319-332 (1984).
  3. Sanderson, T. H., Kumar, R., Sullivan, J. M., Krause, G. S. Insulin blocks cytochrome c release in the reperfused brain through PI3-K signaling and by promoting Bax/Bcl-XL binding. Journal of Neurochemistry. 106, 1248-1258 (2008).
  4. Sanderson, T. H., et al. Insulin activates the PI3K-Akt survival pathway in vulnerable neurons following global brain ischemia. Neurological Research. 31, 947-958 (2009).
  5. Sanderson, T. H., et al. PKR-like endoplasmic reticulum kinase (PERK) activation following brain ischemia is independent of unfolded nascent proteins. Neuroscience. 169, 1307-1314 (2010).
  6. Hazelton, J. L., et al. Hyperoxic reperfusion after global cerebral ischemia promotes inflammation and long-term hippocampal neuronal death. Journal of Neurotrauma. 27, 753-762 (2010).
  7. Lloyd-Jones, D., et al. Heart disease and stroke statistics--2010 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 121, e46-e215 (2010).
  8. Krause, G. S., Kumar, K., White, B. C., Aust, S. D., Wiegenstein, J. G. Ischemia, resuscitation, and reperfusion: mechanisms of tissue injury and prospects for protection. American Heart Journal. 111, 768-780 (1986).
  9. Krause, G. S., White, B. C., Aust, S. D., Nayini, N. R., Kumar, K. Brain cell death following ischemia and reperfusion: a proposed biochemical sequence. Critical Care Medicine. 16, 714-726 (1988).
  10. Bloom, H. L., et al. Long-term survival after successful inhospital cardiac arrest resuscitation. American Heart Journal. 153, 831-836 (2007).
  11. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke; a Journal of Cerebral Circulation. 20, 84-91 (1989).
  12. Uluc, K., Miranpuri, A., Kujoth, G. C., Akture, E., Baskaya, M. K. Focal cerebral ischemia model by endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in the rat. J. Vis. Exp. (48), e1978 (2011).
  13. Neumar, R. W., et al. Calpain mediates eukaryotic initiation factor 4G degradation during global brain ischemia. J. Cereb. Blood Flow Metab. 18, 876-881 (1998).
  14. Paine, M. G., Che, D., Li, L., Neumar, R. W. Cerebellar Purkinje Cell Neurodegeneration After Cardiac Arrest: Effect of Therapeutic Hypothermia. Resuscitation. (2012).
  15. Pulsinelli, W. A., Brierley, J. B., Plum, F. Temporal profile of neuronal damage in a model of transient forebrain ischemia. Annals of Neurology. 11, 491-498 (1982).
  16. Edinger, A. L., Thompson, C. B. Death by design: apoptosis, necrosis and autophagy. Current Opinion in Cell Biology. 16, 663-669 (2004).
  17. Kirino, T. Delayed neuronal death in the gerbil hippocampus following ischemia. Brain Research. 239, 57-69 (1982).
  18. Yager, J. Y., Brucklacher, R. M., Vannucci, R. C. Cerebral energy metabolism during hypoxia-ischemia and early recovery in immature rats. The American Journal of Physiology. 262, 672-677 (1992).
  19. Sugawara, T., Fujimura, M., Morita-Fujimura, Y., Kawase, M., Chan, P. H. Mitochondrial release of cytochrome c corresponds to the selective vulnerability of hippocampal CA1 neurons in rats after transient global cerebral ischemia. J. Neurosci. 19, RC39 (1999).
  20. Nishino, H., et al. Pathophysiological process after transient ischemia of the middle cerebral artery in the rat. Brain Research Bulletin. 35, 51-56 (1994).
  21. Ross, D. T., Ebner, F. F. Thalamic retrograde degeneration following cortical injury: an excitotoxic process. Neuroscience. 35, 525-550 (1990).
  22. Soriano, M. A., Ferrer, I., Rodriguez-Farre, E., Planas, A. M. Apoptosis and c-Jun in the thalamus of the rat following cortical infarction. Neuroreport. 7, 425-428 (1996).
  23. Watanabe, H., et al. Protein synthesis inhibitor transiently reduces neuronal death in the thalamus of spontaneously hypertensive rats following cortical infarction. Neuroscience Letters. 233, 25-28 (1997).
  24. Wei, L., Ying, D. J., Cui, L., Langsdorf, J., Yu, S. P. Necrosis, apoptosis and hybrid death in the cortex and thalamus after barrel cortex ischemia in rats. Brain Research. 1022, 54-61 (2004).
  25. Zong, W. X., Thompson, C. B. Necrotic death as a cell fate. Genes & Development. 20, 1-15 (2006).
  26. Ito, U., Spatz, M., Walker, J. T., Klatzo, I. Experimental cerebral ischemia in mongolian gerbils. I. Light microscopic observations. Acta Neuropathologica. 32, 209-223 (1975).
  27. Saver, J. L., Albers, G. W., Dunn, B., Johnston, K. C., Fisher, M. Stroke Therapy Academic Industry Roundtable (STAIR) recommendations for extended window acute stroke therapy trials. Stroke; a Journal of Cerebral Circulation. 40, 2594-2600 (2009).
  28. Busto, R., Dietrich, W. D., Globus, M. Y., Ginsberg, M. D. The importance of brain temperature in cerebral ischemic injury. Stroke; a Journal of Cerebral Circulation. 20, 1113-1114 (1989).
  29. Voll, C. L., Auer, R. N. Postischemic seizures and necrotizing ischemic brain damage: neuroprotective effect of postischemic diazepam and insulin. Neurology. 41, 423-428 (1991).
  30. Yamaguchi, M., Calvert, J. W., Kusaka, G., Zhang, J. H. One-stage anterior approach for four-vessel occlusion in rat. Stroke; a Journal of Cerebral Circulation. 36, 2212-2214 (2005).
  31. Gionet, T. X., Warner, D. S., Verhaegen, M., Thomas, J. D., Todd, M. M. Effects of intra-ischemic blood pressure on outcome from 2-vessel occlusion forebrain ischemia in the rat. Brain Research. 586, 188-194 (1992).
  32. Sugawara, T., et al. Effect of hypotension severity on hippocampal CA1 neurons in a rat global ischemia model. Brain Research. 877, 281-287 (2000).

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