2 vasos Oclusión / Hipotensión: un modelo de rata de isquemia cerebral global

Medicine

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Summary

Oclusión de la carótida bilateral junto con hipotensión sistémica produce isquemia cerebral global en la rata, lo que resulta en daños en el hipocampo con la gravedad reproducibles. Temas de animales se deterioran con patrones predecibles de daño cerebral, que se recuperan convenientemente, y las tasas de mortalidad son relativamente bajos.

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Sanderson, T. H., Wider, J. M. 2-Vessel Occlusion/Hypotension: A Rat Model of Global Brain Ischemia. J. Vis. Exp. (76), e50173, doi:10.3791/50173 (2013).

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Abstract

El paro cardiaco seguido de reanimación a menudo resulta en daño cerebral causado por la isquemia dramática y la posterior reperfusión del cerebro. Isquemia cerebral global produce daños en regiones específicas del cerebro que han demostrado ser altamente sensibles a la isquemia 1. Las neuronas del hipocampo tienen mayor sensibilidad a los insultos isquémicos en comparación con otras poblaciones de células, y específicamente, la región CA1 del hipocampo es particularmente vulnerable a la isquemia / reperfusión 2.

El diseño de las intervenciones terapéuticas, o el estudio de los mecanismos implicados en el daño cerebral, requiere un modelo que produce un daño similar a la condición clínica y de una manera reproducible. Bilateral oclusión vascular carotídeo con hipotensión (2VOH) es un modelo que produce isquemia reversible cerebro anterior, emulando los eventos cerebrales que pueden ocurrir durante el paro cardiaco y la reanimación. Se describe un modelo modificado de Smith et al. (1984) 2, Tal como se presenta por primera vez en su forma actual en Sanderson et al. (2008) 3, que produce lesiones reproducible de forma selectiva las regiones vulnerables del cerebro 3-6. La fiabilidad de este modelo es dictada por un control preciso de la presión arterial sistémica durante la hipotensión aplicada, la duración de la isquemia, control de la temperatura cerca, un régimen de anestesia específica, y el cuidado post-operatorio diligente. Un insulto isquémico-8 minutos produce la muerte celular de neuronas CA1 del hipocampo que progresa en el transcurso de 6 a 24 h de la reperfusión, mientras que las regiones cerebrales menos vulnerables están a salvo. Esta muerte celular progresiva se cuantifica fácilmente después de 7-14 días de reperfusión, como una pérdida casi completa de las neuronas CA1 es evidente en este momento.

Además de este modelo de lesión cerebral, se presenta un método para CA1 daños cuantificación usando una simple, pero completa, metodología. Es importante destacar que, la cuantificación puede llevarse a cabo usando un microscopio simple cámara montada, unada libre ImageJ (NIH) de software plugin, obviando la necesidad de programas de software estereología costos prohibitivos y una etapa microscópica motorizado para la evaluación de daños.

Introduction

El daño cerebral como consecuencia de un paro cardíaco y accidente cerebrovascular es la principal causa de muerte y discapacidad a largo plazo. Mientras que la reanimación cardiopulmonar a las víctimas de paro cardiaco éxito en la restauración de la circulación espontánea en unos 70.000 pacientes por año en los EE.UU. 7,8 al menos el 60% de estos pacientes posteriormente murió en el hospital a consecuencia de daño cerebral extenso y sólo el 3-10% de los pacientes reanimados puede reanudar sus antiguos estilos de vida 9,10. Evidentemente, la comprensión de los mecanismos que conducen a un daño cerebral después de isquemia cerebral global y el diseño de las intervenciones terapéuticas para minimizar el trauma neurológico es de importancia crítica.

Isquemia cerebral puede ser modelado utilizando varios métodos. Más comúnmente, la isquemia cerebral se produce en el roedor mediante la oclusión de un vaso sanguíneo importante en el cerebro, la arteria cerebral media, produciendo de este modo un accidente cerebrovascular isquémico focal 11,12. Aunque clínicamente importante,isquemia cerebral focal no es un método preciso para estudiar el daño cerebral producido por paro cardiaco / reanimación. Para modelar este paradigma clínica todo el cerebro se debe hacer isquémica seguida de la reintroducción del flujo de sangre. Para imitar de cerca esta presentación clínica, los investigadores inducen experimentalmente paro cardíaco seguido de reanimación con la RCP y desfibrilación 13,14. Este modelo es clínicamente relevante, los tiempos de reanimación sin embargo impredecibles pueden aumentar la variabilidad y puede hacer que el análisis de datos difíciles de interpretar. Adicionalmente, este modelo se asocia con una alta tasa de mortalidad, aumentando aún más el número de animales necesarios para probar una hipótesis. La investigación de la respuesta cerebral a la isquemia global y / o reperfusión en un insulto más reproducible, consistente y de supervivencia puede ser preferido.

Isquemia global puede ser inducida en el cerebro preservando al mismo tiempo el flujo de sangre sistémica. Esto reduce la mortalidad, al tiempo que permite investigation de los mecanismos de daño tisular en el cerebro 2. Para producir isquemia cerebral global, es necesario interrumpir o limitar en gran medida el flujo en todos los cuatro vasos que irrigan el cerebro, las arterias carótidas internas y las arterias vertebrales. Estos vasos suministran el cerebro con el flujo de sangre a través de una estructura vascular llamado el Círculo de Willis, que forma un bucle anastomosis. Esta arquitectura vascular permite que el cerebro para retener la perfusión en el caso de la oclusión vascular proximal. Por lo tanto, para inducir isquemia completa del cerebro, el flujo de sangre a través de todos los buques contributivas debe ocurrir. Oclusión de la arteria carótida se puede lograr usando un cuello ventral mínimamente invasiva corte hacia abajo y la aplicación de los clips de aneurisma durante un período deseado. La interrupción del flujo de sangre a través de las arterias vertebrales puede ser difícil, ya que es incluida de los forámenes transversal de la columna vertebral. Los investigadores han abordado este por electrocauterizing las arterias vertebrales 24-48 horas antes de la carótidala oclusión y la isquemia cerebral (4VO modelo) 15. En contraste con este enfoque, Smith et al. Desarrolló un método de inducción de isquemia cerebral global mediante la reducción de la presión arterial media (MAP) sistémicamente a 40 mm de Hg para reducir la perfusión a través de las arterias vertebrales a un punto en el que el flujo sanguíneo se pierde o se reduce en gran medida 2 . Cuando se combina con oclusión de la carótida, este método produce isquemia en todo el cerebro anterior, lo que resulta en un patrón de daño cerebral que imita la de los supervivientes de paro cardiaco. En un refinamiento adicional de este método, el modelo que aquí presentamos requiere una regulación MAPA ajustado a 30 mm de Hg ± 1mHg durante todo el 8 min de isquemia. Encontramos esta alteración mejora la reproducibilidad de daño cerebral inducido por este modelo, mientras que la preservación de la baja tasa de mortalidad de la técnica original diseñada por Smith et al.

El fenotipo preciso de la muerte celular y la extensión global de la lesión tisular causada porel modelo que aquí se presenta es directamente dependiente de la duración isquémica 16. Después de 8 minutos de isquemia, las neuronas CA1 exhiben la muerte celular retardada, lo que sugiere que hay una ventana temporal para la intervención terapéutica durante la fase de reperfusión 15,17. En el inicio de la reperfusión, las neuronas recuperar rápidamente la función y no la muerte celular inmediata es detectable 18. Sin embargo hace que este insulto inducción de la cascada de muerte celular (apoptosis) que culminan en la liberación de proteínas apoptogénicos de las mitocondrias, como citocromo c, entre las 4-6 horas de la reperfusión 3,19. Entre 6 y 24 horas de la reperfusión, las neuronas del hipocampo CA1 se han comprometido a muerte celular, y el programa de muerte celular por apoptosis se ejecuta 19. Cabe señalar que el fenotipo muerte celular responsable de la lesión isquémica es muy controvertida. Estudios anteriores han sugerido que la necrosis es el principal fenotipo muerte celular 20,21, mientras que otros que otros informan apoptosis como el principal mecanismo de 22,23. En total, la evidencia actual sugiere que las células mueren a causa de un espectro de fenotipos de muerte celular que van desde la apoptosis clásica a la necrosis. El modo específico de la muerte celular es dependiente de muchos factores, con el grado de contribución de cada fenotipo dependiendo de la gravedad de la lesión, entre otros factores 24,25. Por 24 h de la reperfusión, las células que mueren poseen núcleos picnóticos, citosol condensada con evidencia clara de los contenidos celulares agregados, y la pérdida de la morfología mitocondrial funcional. Las células muertas se desglosan, engullidas por las células inmunes como los macrófagos y / o microglia y borran de la región CA1 del hipocampo. Por 4-7 días de reperfusión, se eliminan las células muertas, y todo lo que queda son las células inflamatorias y las células gliales activadas 17,26. Por lo tanto, los 7 días de reperfusión representa un momento óptimo en CA1 del hipocampo muerte neuronal se puede cuantificar usando, las manchas de células no específicas simplesincluyendo violeta de cresilo o hematoxilina-eosina y se cuentan en base a criterios de inclusión morfológicas. Las células que quedan en este intervalo de reperfusión tardía se pueden contar como células supervivientes, lo que proporciona un índice de daño cerebral.

Si este modelo es para ser utilizado para probar las intervenciones terapéuticas, se sugiere que el diseño experimental sigue criterios ESCALERAS (Terapia Carrera Industria Académico mesa redonda) 27. Estas pautas se deben seguir en el diseño y la realización de un estudio, sin embargo, no se discuten aquí.

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Protocol

1. Preparación

Todos los experimentos con animales deben ajustarse a las directrices institucionales y recibir la aprobación de un comité respectivo cuidado de los animales antes de la iniciación. Todos los procedimientos que aquí se presentan han sido aprobados por la Wayne State University Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión y seguir las directrices sobre el tratamiento ético de los animales como presentado en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y de los principios del gobierno de Estados Unidos para el Utilización y cuidado de los animales vertebrados utilizados en las pruebas, investigación y capacitación. Antes de comenzar la cirugía, preparar el material quirúrgico necesario y una jaula de recuperación de la cirugía. Este procedimiento es una cirugía de la supervivencia y por lo tanto es necesario practicar una técnica estéril.

  1. Para hacer un catéter vascular, corte una longitud de 8 pulgadas de tubo de polietileno de 50 (PE50) e insertar una aguja de calibre 23 embotado en un extremo. Los catéteres se pueden comprar por separado previamente esterilizada o adquiridos en bulk y luego esterilizado con etilenglicol, según sea necesario.
  2. Asegure la aguja en un puerto de una manera llave tres y colocar de otra manera llave tres en el puerto opuesto. Heparinizar las llaves de paso y el catéter mediante la ejecución de solución salina a través de la heparina. Conectar una jeringa de 10 ml de solución salina en la perpendicular de llave de paso y distal al catéter. Conectar la llave de paso distal al catéter al tubo transductor de presión, llenar el sistema con solución salina y eliminar cualquier burbuja de aire.
  3. Configuración de la jaula de recuperación de acuerdo con regulaciones del uso de animales. La sala de recuperación debe ser tranquilo y tiene poco tráfico. Giro importante en la mesa de aspiración o el sistema de recogida de gases similar antes de la cirugía de inicio para filtrar isoflurano vaporizado.

2. Preparación quirúrgica

Ratas Sprague-Dawley (300-350 g) se utilizan en el modelo de isquemia 2VOH prosencéfalo global. La anestesia es inducida y mantenida con isoflurano y supcomplementado con una dosis sub-disociativo de la ketamina. Hemos observado que la anestesia isoflurano mantenido por sí sola causa una mayor incidencia de convulsiones durante la recuperación post-operatoria. Las convulsiones pueden contribuir al daño neuronal y la mortalidad, lo que afectará la reproducibilidad de este modelo. Como complemento de la anestesia con ketamina permite una dosis mucho menor de isoflurano para llegar a un grado quirúrgico de anestesia. Usando una manta térmica homeostático permite estricta regulación de la temperatura del núcleo. El procedimiento quirúrgico implica la arteria carótida corte hacia abajo y el aislamiento, y la arteria femoral corte hacia abajo y la canulación.

NOTA: Es importante mantener registros detallados durante cada procedimiento quirúrgico individual. Los cambios en la temperatura corporal, la presión arterial y otras variables fisiológicas que ocurren antes o durante la cirugía pueden alterar drásticamente los resultados, y los registros pueden ser analizados para garantizar la coherencia de procedimiento entre los individuos y los grupos. Consistenciaen los parámetros fisiológicos del animal puede ser mejorada por el ayuno a los animales antes de la cirugía. Se alienta a los experimentadores para determinar el método que se traduce en la hemodinámica pre-operados más consistentes y la concentración sérica de glucosa para sus estudios.

  1. Inducir la anestesia mediante la colocación de la rata en una cámara de inducción y rellenar con un oxygen/70% mezcla de óxido nitroso 30% a 5% de isoflurano. Intubar con un catéter de calibre 12, utilizando un laringoscopio roedores y ventilar con un 30% oxygen/70% mezcla de óxido nitroso con 2,5% de isoflurano. Tasa de ventilación debe ser de 80 respiraciones por minuto a 2,5 ml por respiración.
  2. Dale una inyección intra-peritoneal de ketamina (20 mg / kg) en solución salina y reducir isoflurano al 1,5%. IMPORTANTE Es imperativo para monitorear el nivel de anestesia durante todo el procedimiento para asegurar plano quirúrgico de anestesia adecuado. Para comprobar la profundidad de la anestesia, pellizco entre los dígitos de las extremidades posteriores, mientras que el control reflejo pedal. Si el reflejo estáausente, la anestesia es adecuada. Después de la canulación de la arteria femoral, la presión arterial se puede utilizar como un indicador del nivel de anestesia. Mantenga la dosis de isoflurano tan bajo como sea posible mientras se mantiene un plano quirúrgico de anestesia para reducir al mínimo el potencial de convulsiones post-isquémicas.
  3. Se realizarán incisiones en el cuello y en la zona pélvica. Afeitar el cuello y la pelvis derecha, donde el muslo se une el abdomen. Oriente la rata en una posición supina sobre la homeostático termo-manta e inserte el termómetro rectal usando lubricante quirúrgico. Aplicar lubricante de protección para los ojos. Una bombilla de 60 vatios puede ayudar a regular la temperatura. El bulbo nunca debe estar más cerca de 8 pulgadas del animal. IMPORTANTE Temperaturas por encima o por debajo de la temperatura fisiológica normal (37 ° C) pueden influir en gran medida el daño neurológico final. Mantener la temperatura central a 37 ° C ± 0,5 ° C.
  4. Frote las áreas de incisión con betadine y enjuague con etanol al 70%. Repita este two mas veces. Coloque un campo quirúrgico sobre la rata, y cortar los agujeros para exponer las áreas de incisión. Las arterias carótidas y femorales IMPORTANTE pueden aislarse sin causar ningún trauma a la musculatura circundante, lo que mejorará la recuperación y la consiguiente necesidad de reducir al mínimo para la analgesia postoperatoria.
  5. En espera de una anestesia adecuada, utilice un número 10 bisturí para realizar una incisión a lo largo del cuello, a continuación, utilizando pinzas hemostáticas rodeos diseccionar entre las glándulas salivales hasta llegar al músculo esternohioideo, el grupo de músculos prominentes línea media que cubre la tráquea. Una vez más utilizando la técnica de disección roma cuidadosa, separe los principales grupos musculares del esternohioideo del esternocleidomastoideo bilateralmente. Estos dos grupos de músculos forman una indentación triangular que se puede utilizar como un punto de referencia para localizar el haz neurovascular que contiene la arteria carótida. Las ramas carótidas comunes en las arterias carótidas internas y externas. Aislar la arteria carótida común proximal a la bifurca.
  6. Separar suavemente los dos músculos y localizar la arteria carótida. Para ayudar a identificar este aspecto buque el pulso. Aislar las arterias carótidas de ambos lados pasando una longitud de ~ 5 pulgadas de sutura de seda 3-0 debajo de la vasija. Despeja fascia de los vasos. PRECAUCIÓN El nervio vago y cadenas simpáticas se incluyen en el paquete neurovascular del cuello uterino y se debe tener cuidado para evitar causar daños a la misma, cuando el aislamiento de la arteria carótida.
  7. Use las tijeras para hacer una segunda incisión en la ingle, a lo largo de la hendidura donde los músculos del muslo del miembro trasero se encuentra con el abdomen. Diseccionar debajo del músculo abdominal, a lo largo de los músculos del muslo hasta llegar al ligamento inguinal. Esto expondrá el paquete neurovascular femoral. Aislar cuidadosamente la arteria femoral pasando una longitud 5 ~ pulgada de 3-0 sutura de seda debajo de la embarcación. Despeja fascia dejando 5-7 mm de vaso expuesto.
  8. Un nudo permanente en el extremo distal de la arteria expuesta.
  9. Aplicar la tracción en la sutura en el extremo proximal de la arteria para ocluir el flujo de sangre, tirando de las suturas se enseñan. Hacer una pequeña incisión a través de la parte superior del recipiente con las tijeras oftálmicas. Tracción inadecuada sobre el buque va a dar lugar a sangrado, que se puede detener mediante la aplicación de tracción más pesado. Cierre el catéter en la llave de paso.
  10. El uso de un introductor vascular, insertar el tubo de catéter en el vaso, 7-9 mm más allá de la incisión del vaso y hacia la línea media. Una vez que el catéter se coloca a la distancia deseada, atar el nudo flojo alrededor del vaso y el catéter para asegurarlo en su lugar. Retire la tracción del recipiente y deje que se encuentran de forma natural.
  11. Administrar 0,3 ml de heparina (100 U en solución salina), por vía intravenosa. Limpie cualquierla sangre fuera del catéter con una pequeña cantidad de solución salina para prevenir la coagulación. Encienda el monitor de presión y calibrar el equipo. Abrir las llaves de paso para permitir que el transductor para detectar la presión arterial. Para obtener mediciones precisas de la presión arterial, el posicionamiento del sistema no debe cambiarse después de la calibración.
  12. El isoflurano dosis debe ser ajustada para producir una presión arterial media (MAP) de 110 mmHg a 130 mmHg. Este mapa debe ser indicativo de plano quirúrgico de anestesia adecuado.

3. Protocolo de isquemia

Como se mencionó anteriormente, cuatro buques de suministro de perfusión en el cerebro. Oclusión proximal de las dos arterias carótidas no resultará en la isquemia cerebral debido a que las arterias vertebrales se compensan a través del Círculo de Willis. Se ha demostrado que la oclusión de la carótida, junto con hipotensión sistémica inducida, se limitará la perfusión a través de las arterias vertebrales resultantes en la isquemia cerebral. Aquí descrIbe el protocolo para la extracción de sangre para producir hipotensión y de sujeción de las arterias carótidas para producir, isquemia reversible controlado. Véase la Figura 1.

Oxígeno en la sangre y el dióxido de carbono, la concentración de glucosa y el pH pueden variar entre los individuos en el grupo de muestra y causar variación en la lesión. La supervisión de estas variables fisiológicas puede reducir la variabilidad del miocardio. Como se ha mencionado, la temperatura es otro parámetro que es importante para regular, sin embargo, la temperatura del cerebro puede no corresponder a la temperatura del núcleo, como la perfusión se limita en gran medida durante la isquemia experimental 28. Nuestros resultados específicos de configuración quirúrgicos en los cambios de temperatura en el cerebro que los cambios en la temperatura central del espejo durante la isquemia. Sin embargo, es importante que el experimentador para determinar esta empíricamente mediante el control de la temperatura del cerebro con termopares o por otros medios a estandarizar el procedimiento. Si la temperatura central no refleja tem cerebrotemperatura, es importante mantener la temperatura del cerebro normotérmica durante todo el procedimiento, independientemente de la temperatura central.

La asignación al azar dicta que el cirujano aleatoriza el animal a la isquemia o grupo de control operado de forma simulada en este punto. Cirugía simulada seguirá todos los procedimientos exactamente los mismos que los animales isquémicos exclusión de cualquier reducción de la presión arterial y la oclusión de la arteria carótida. Es importante que los controles con operación simulada estar bajo la misma dosis de anestesia durante un tiempo que coincide con el de los animales isquémicos. Si hay un grupo de tratamiento incluido, que requiere anestesia antes o después de la isquemia, isquemia simulada y grupos no tratados debe coincidir con la dosis de anestesia y la duración del grupo de tratamiento.

  1. Clips hemostáticos listo y aplicador del clip. Clips deben ocluir completamente el vaso sin causar ningún traumatismo. La isquemia puede ser inducida cuando la hemodinámica se han convertido consistente. Conecte un ml heparinizada Syri 10ESN en la llave de paso, perpendicular y proximal al catéter. No debe ser de 0,3 ml (30 unidades) de solución salina heparinizada en el interior de la jeringa para evitar la coagulación de la sangre extraída.
  2. Establecer un temporizador durante 1 min y abrir la llave de paso a la jeringa heparinizada, que la sangre pueda ser retirada.
  3. Retirar la sangre tirando del émbolo de la jeringa. Si se aplica demasiada succión, el barco se hundirá o sellar contra la abertura del catéter y se dibujará nada de sangre. Debería ser posible para eliminar 7-9 ml de sangre en 1 min. Si este no es el caso, avanzado el catéter más lejos en la arteria y vuelva a intentar. Nos encontramos con que debe ser eliminado 7-9 ml de sangre para reducir el MAP cerca de 30 mm Hg, la presión arterial deseada para lograr la isquemia. IMPORTANTE Asegúrese de que la sangre extraída se mantiene a 37 ° C para evitar la refrigeración durante la reinfusión de sangre.
  4. Después de la extracción de sangre minutos (7-9 ml de sangre deben ser retirados), se aplicarán clips hemostáticos de las arterias carótidas y comenzar atemporizador durante 8 min. Revise de inmediato la presión arterial. Si el mapa no es a 30 mmHg, infusión o retirar la sangre lentamente hasta alcanzar 30 mmHg ± 1 mmHg. Continuar esta práctica a lo largo de la isquemia para mantener MAPA de 30 mmHg. IMPORTANTE presión arterial Record durante todo el protocolo de isquemia. La falta de reducir la presión arterial a 30 mmHg puede limitar la isquemia. Monitor de núcleo y / o la temperatura del cerebro de cerca durante la reinfusión como aumentos o disminuciones de la temperatura puede influir en el daño cerebral.
  5. Al final de 8 min, comenzar la reperfusión mediante la eliminación de los clips hemostáticos y reinfusión de la sangre lentamente, 2 ml por minuto.
  6. Cuando la sangre ha sido reinfundidas la cánula puede ser retirado de la arteria femoral. Para evitar el sangrado durante el post-operatorio, seguras dos nudos separados proximal a la incisión en la arteria.
  7. Suturar las incisiones con un patrón discontinuo usando una aguja de corte inverso, con Vicryl 5-0. Esta sutura se disolverá, para que no se rEquire eliminación. NOTA Durante el procedimiento, si la anestesia suficiente no se puede alcanzar con niveles más bajos de isoflurano, administrar una dosis adicional de ketamina.

4. Analgesia y recuperación

El bienestar animal es la prioridad durante la recuperación, así como el procedimiento quirúrgico. El cuidado post-operatorio debe seguir las directrices específicas de la institución. Los animales que se someten a la isquemia cerebral global son susceptibles de sufrir ataques. Para minimizar la ocurrencia de crisis, es importante que la sala de recuperación tiene una mínima estimulación, es decir, ruidos y alteraciones visuales. En nuestro protocolo de uso animal, que casa de los animales después de la operación durante 72 horas en una habitación aislada para este fin.

  1. Después de que las incisiones se sutura la rata puede ser destetado del ventilador. Apague el isoflurano y continuar la ventilación en el 30% oxygen/70% de óxido nitroso hasta que la rata comienza a respirar contra el ventilador.
  2. Administrar 0,5 mg / kg butorfanol en 5 ml de solución salina por vía subcutánea entre los omoplatos.
  3. Rápidamente reinfusión sanguínea puede aumentar la precarga del ventrículo derecho. Esto aumenta la presión de la circulación pulmonar y puede provocar edema pulmonar. Signos de esto incluyen trabajaron sonidos de respiración y crepitante durante la respiración. La aplicación de presión espiratoria final positiva ayudará a mejorar el edema pulmonar.
  4. Cuando se recuperó el control voluntario de la respiración, retirar la intubación, retire el termómetro y apagar la manta eléctrica. En este punto, el animal puede ser colocado en una jaula de recuperación. La jaula de recuperación debe colocarse de manera media de la jaula es en la parte superior de una manta de circulación de agua (34 ° C) para la primera 24 h de reperfusión. Colocar el animal en la parte del suelo de la jaula sobre la manta de calefacción para ayudar en el mantenimiento de la temperatura. Una vez que el animal comienza a recuperarse de la anestesia y la analgesia, se moverá alrededor de la jaula para regular la temperatura en sí. Los animales serán alojados por separado durante el post-operatorio.
  5. El animal debe tener acceso ilimitado al agua. Durante dos días después de la operación, esta agua debe contener 4 mg / kg de solución de Tylenol líquido. Además de roedores, azucarado cereal de desayuno se proporciona en la jaula para estimular comer y prevenir la pérdida de peso.
  6. Cubra la mitad de la jaula con un paño y supervisar estrechamente la recuperación post-operatorio.
  7. Como el animal se recupere de la anestesia es importante vigilar los signos de angustia. Dificultosa o respiración incompatible puede ser un signo de sufrimiento, causado posiblemente por edema pulmonar o irritación de las vías respiratorias durante la intubación. Butorfenol se sedar al animal, la reducción de actividad, sin embargo, la actividad moderada se debe restaurar a 1 hr. Encontramos animales comenzarán a comer golosinas y beber dentro de las 4 horas de la extubación. Por 12 horas, la conducta normal y actividad de alimentación deben reanudarse. Otro signo de la angustia es la pérdida de peso, un animal no debe perder más del 20% del peso corporal inicial, en cualquier período de 48 horas, si la pérdida de peso excesiva is observar el animal debe ser sacrificado.
  8. Intervención humanitaria es necesaria si se presentan convulsiones. Este tipo de actividad de ataques es generalmente ocurren de 24 a 48 horas después de la reperfusión. Las convulsiones pueden causar aumento de daño cerebral que es independiente de la lesión isquémica per se, por lo que la actividad convulsiva se debe considerar un criterio de exclusión establecidas en el lugar antes de la iniciación del estudio 29. Las convulsiones pueden ocurrir cuando no hay nadie presente, por lo que es importante reconocer los signos. Ropa de cama se verá afectado y posiblemente expulsado de la jaula. Una rata postictal tendrá una actitud lánguida con una rápida, dificultad para respirar y / o tener una nariz magullada o sangrado.

Nota Los signos de dolor o angustia son aliviados de inmediato con analgésicos. Si sympotoms no se alivian con una dosis de analgésicos o persisten después de la cuarta dosis consecutivas de la analgesia, el animal será sacrificado y excluido del estudio. Wo quirúrgicaunds deben ser inspeccionados para la curación adecuada durante ocho días después de la operación.

5. Colección de Tejidos y Procesamiento

El cerebro se fija por infusión transcardial de paraformaldehído. Después de ser seccionados bruto y crioprotección, chasqueamos congelar el cerebro y la sección en un criostato. Estas secciones del cerebro se tiñeron con violeta de cresilo y imágenes en un microscopio de luz.

  1. Inducir la anestesia mediante la colocación del animal en la cámara de inducción y de relleno con 30% de oxígeno / 70% de óxido nitroso con 5% de isoflurano. Intubar al animal y ventilar a 30% de oxígeno / 70% de óxido nitroso con un 5% de isoflurano.
  2. Preparar el material para el procedimiento de perfusión. Llenar un vaso de precipitados con 100 ml de 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 4 ° C y un vaso de precipitados con 100 ml de 4% de paraformaldehído (PFA) al 4 ° C. El cerebro se lava con PBS seguido de PFA, a través de una bomba de perfusión. Tubería será colocado en cada vaso de precipitados y se conecta por una llave de paso de tres vías a unllow una transición suave de PBS a PFA perfusión. Coloque una aguja roma de calibre 18 en el tubo y llenar la línea con PBS. Asegúrese de que no haya burbujas en la aguja y el tubo como el aire puede formar una embolia, lo que podría impedir que la perfusión. También, listo un pequeño recipiente con PFA para la fijación de inmersión del cerebro.
  3. Utilice una bandeja de recogida de fluido, con suficiente capacidad para albergar al menos 200 ml de líquido. En este punto el animal deberá haber sido ventilado con isoflurano durante el tiempo suficiente (por lo menos 3 minutos) para llegar a anestesia profunda.
  4. IMPORTANTE Asegúrese de que se alcance plano quirúrgico de anestesia.
  5. Proceder al hacer una incisión para acceder a la cavidad torácica a través del abdomen. Sujete la aorta descendente. Cuando el corazón está expuesto, insertar la aguja de calibre 18 roma a través del ápice del corazón a la aorta. Hacer un pequeño corte en la aurícula derecha para permitir perfusión para salir del animal.
  6. Encienda la bomba a 50 ml / min, empezando con PBS. Después Pumping 100 ml de PBS, cambiar la llave de paso para la perfusión de 100 ml de PFA.
  7. Retire el cerebro, teniendo cuidado de no dañar el tejido.
  8. Coloque el cerebro en una matriz de tejido y corte entre el cerebelo y el cerebro. Sección el cerebro anterior; ~ 3 milímetros de la parte frontal y la parte posterior de la corteza cerebral. Esto producirá tres secciones, la sección media contendrá el hipocampo.
  9. Coloque las secciones del cerebro en un frasco con suficiente PFA para la inmersión completa. Inmersión solucionar el cerebro durante exactamente 2 horas.
  10. Para proteger el tejido del daño causado por la congelación, el cerebro se cryoproteced mediante la sustitución de la PFA con 30% de sacarosa en PBS. Crioprotección se completa con las muestras de tejido se hunden en la solución de sacarosa (~ 24 a 48 h).
  11. Para ajustar congelar las secciones del cerebro, colocar un vaso de precipitados en hielo seco y se llenan de 2-metilbutanol durante diez minutos. Coloca las rodajas de cerebro en el metilbutanol durante 5 minutos, a continuación, transferir a un recipiente hermético y almacenar a -80 ° C hasta cryosta seccionar.
  12. Criostato sección del cerebro en 20 micras, la recogida de al menos 3 secciones en 3 coordenadas atlas del cerebro (el cerebro de rata en coordenadas estereotáxica. Paxinos y Watson, secciones de placa 29, 31, 33 o bregma -2,8 mm, -3,3 mm y -3,8 mm). Las secciones se colocan en portaobjetos de microscopio cargadas y se dejaron secar antes de almacenar a -80 ° C.
  13. Cresil violeta (0,1% a pH 3,5) mancha de 9 secciones cerebrales, 3 en cada cerebro atlas de coordenadas.
  14. Imagen de la región CA1 del hipocampo a 40x con un microscopio y cámara montada insertar una barra de escala de 300 micras en paralelo con el plano neuronal CA1. Guarde las imágenes como archivos TIFF.

6. Brain Damage Cuantificación

ImageJ, un programa gratuito que ofrece el Instituto Nacional de Salud, se puede utilizar para contar y cuantificar las neuronas viables, lo que representará la extensión del daño cerebral.

  1. Microscopio abrir imágenes TIFF con el "contador de células 'plug-in de ImageJ. Elige unmarcado color y recuento de las neuronas dentro de los límites de la barra de escala. Las neuronas se cuentan en base a criterios de inclusión simples basados ​​en la morfología neuronal (forma grande, piramidal) o criterios de exclusión para la morfología microglial / astrocito (pequeña y redonda o forma tubular de longitud).
    IMPORTANTE coherente con los criterios de inclusión / exclusión entre las diapositivas y las personas al contar las neuronas.
  2. Recuentos de neuronas grabar y guardar la ventana contador de células.
  3. Cuenta Neuron se terminen en dos personas distintas para alcanzar, recuentos de neuronas consistentes y precisos.
  4. La media de todos los 9 imágenes de cada animal proporcionará un medio sencillo "recuento de neurona", que es la medida cuantitativa de CA1 del hipocampo daños para ser utilizado en el análisis estadístico. Los grupos pueden ser comparados estadísticamente utilizando un ANOVA de una vía seguida por la prueba de Tukey HSD para el análisis post hoc, o, cuando no supera la prueba de normalidad, un Kruskal-Wallis ANOVA de una vía en filas seguido po de Dunnanálisis st hoc para evaluar estadísticamente las diferencias entre los grupos. Análisis estadístico específico debe ser dictado por el diseño individual de estudio, el que aquí se presenta no puede ser apropiado para las hipótesis específicas que se están probando.

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Representative Results

El modelo mundial 2VOH de isquemia / reperfusión cerebral causa la muerte neuronal en la región CA1 del hipocampo. Figura 2 representa la lesión producida por 8 minutos de isquemia global del cerebro, procesado 14 días después de la reperfusión. Figuras 2A y 2B comparan los hipocampos de farsa y cerebros post-isquémicas, teñidas con violeta de cresilo. Figura 2A muestra un hipocampo de una rata con operación simulada que exhibe morfología normal, incluyendo un CA1 intacta. Figura 2B muestra el hipocampo sujetos a isquemia / reperfusión, donde el giro dentado, CA2 y CA3 han afectado mínimamente morfología. Las neuronas selectivamente vulnerables de la CA1 del hipocampo no sobreviven por isquemia / reperfusión y sólo las neuronas permanecen dispersos. Sin embargo, los aumentos dramáticos en la infiltración de macrófagos y / o células de la microglía (IBA-1-positivas), y astrocitos reactivos (células positivas para GFAP) son evidentes en la CA1 hcampo ippocampal. Etiquetado inmunofluorescencia específica de las neuronas con NeuN, macrófagos / microglia etiquetado con IBA-1, y el etiquetado de astrocitos GFAP con corroborar estos hallazgos.

La figura 2C muestra presenta neurona contando ventanas de imágenes de microscopio de la CA1 con un aumento de 40x. El panel superior muestra CA1 de un simulacro de control que funciona y el panel inferior muestra la CA1 isquemia / reperfusión siguiente. Los heridos CA1 muestra una tinción que incluye microglia y astrocitos, que parecen pequeñas y tubulares o en forma de lágrima. Estos se pueden distinguir de las neuronas por su forma. Las neuronas del hipocampo intacto, ya sea en el giro dentado, CA2 o la CA1, son grandes, con una forma circular o piramidal.

La Figura 2D es un análisis gráfico de la lesión inducida por 2VOH cuantificado por CA1 recuentos neuronales. Se puede concluir que 8 min de isquemia producida por el modelo 2VOH puede causar una consistente y reproducibllesión de correo que está aislado principalmente a la CA1 del hipocampo.

Figura 1
Figura 1. Línea de tiempo experimental. La línea de tiempo experimental es una representación de los pasos quirúrgicos y de procesamiento de tejido.

La figura 2
Figura 2. Los resultados representativos. Daño del hipocampo en una rata no tratada sometidas a I / R (B) en comparación con una rata de control operado de forma simulada (A). Cresil violeta manchado hipocampo (10X) [Surround] aumentos 40X de la CA1, CA2, CA3, hilio y DG (arriba Lefta las agujas del reloj). (B) El daño se localiza en la CA1 hippocampus. (C) ventanas de recuento representativos utilizados para la neurona conteo y cuantificación de daños en un animal de control operado de forma simulada (arriba, de control) y un animal expuesto a la isquemia cerebral global (parte inferior, I / R). (D) Representante cuantificación de CA1 los recuentos de neuronas de hipocampo de un estudio no publicado (media + desviación estándar, n = 8, p <0,05).

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Discussion

El modelo descrito aquí produce un insulto isquémico al cerebro que puede ocurrir como resultado de un paro cardiaco y la reanimación, proporcionando una lesión similar a la encontrada en los seres humanos. Este método para la producción de isquemia cerebral global es uno de los múltiples protocolos. Utilizamos este protocolo más importante de su tasa comparativamente baja mortalidad, recuperación rápida, con resultados reproducibles. El modelo de detención / resucitación cardiaca es posiblemente el modelo más clínicamente relevante, sin embargo, técnicamente, el más difícil de reproducir constantemente. El modelo 4VO de isquemia cerebral global es otro protocolo habitual, la valiosa en el hecho de que todos los cuatro vasos contribuyen están ocluidos durante la isquemia. Este modelo también tiene sus desventajas, que incluyen cirugías múltiples y la posibilidad de precondicionamiento neuroprotector. El modelo 4VO ha sido adaptada, lo que permite la oclusión transitoria de los cuatro vasos durante un procedimiento para producir la isquemia, sin embargo, la técnica sigue siendo la cirugíaLY exigente 30.

Variaciones sobre 2VOH han demostrado que producen una serie de resultados 31,32. Duración de la isquemia y el grado de hipotensión son las principales variables que pueden afectar los resultados. Los informes han demostrado que si la presión arterial no se reduce lo suficiente el daño producido puede ser inconsistente o unilateral en ratas 30. Hemos encontrado 30 mmHg a ser un grado óptimo de hipotensión debido a que produce isquemia fiable sin causar lesión periférica notable. Este paradigma produce isquemia caracterizado como grave, sin embargo después de nuestro protocolo reducirá el aumento de lo contrario posibilidad de complicaciones. La naturaleza grave de la lesión puede ser la razón ligera variación en los parámetros fisiológicos entre los animales no afecta típicamente la consistencia lesión.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses financieros.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material Name
5-0 VICRYL suture, reverse cutting Ethicon J391H
Scalpel, No.10 Swann-Morton 6601
Gauze Sponges Fisher 22-362-178
18G x 1 ½ in needle BD 305201
23G x 1 in needle BD 305145
26 G x 3/8 in needle BD 305110
18 G x 1 ¼ catheter EXEL 26735
1 ml syringe BD 309659
10 ml syringe BD 309604
60 ml syringe BD 309653
Surgilube Henry Schein 1152666
.9% Saline, plastic IV bag Henry Schein 1537468
Suture 3-0 Silk Henry Schein 1007842
Puralube Ophthalmic Ointment Henry Schein 3390017
Betadine Henry Schein 6903564
Sterile Towel Drape Moore Medical 14170
Polyethylene Tubing, 50 Intramedic 427411
Stopcock, 3 way Smiths medical MX9311L
Drug Name
AERRANE (isoflurane) Henry Schein 2091966
Mapap Liquid (Tylenol) Major Pharmaceuticals 1556
Kedavet (ketamine) Ketathesia Butney NDC 50989-996-06
Butorphic (butorphanol) Lloyd Labs 4881
Heparin APP Pharmaceuticals 504011
Chemical Name
Paraformaldehyde prills Elecron Microscopy Sci. 19202
2-methylbutane Sigma 270342
Cresyl Violet Acetate Sigma C5042
Sucrose Sigma S9378
Software
ImageJ NIH

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