2-Vessel Occlusie / Hypotensie: een rat model van Global Brain Ischemie

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bilaterale carotis occlusie combinatie met systemische hypotensie produceert wereldwijde hersenen ischemie in de rat, met schade aan de hippocampus met reproduceerbare ernst. Proefdieren worden verminderd met voorspelbare patronen van hersenbeschadiging, ze herstellen doelmatig en sterftecijfers zijn relatief laag.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sanderson, T. H., Wider, J. M. 2-Vessel Occlusion/Hypotension: A Rat Model of Global Brain Ischemia. J. Vis. Exp. (76), e50173, doi:10.3791/50173 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Hartstilstand gevolgd door reanimatie resulteert vaak in dramatische hersenschade veroorzaakt door ischemie en daaropvolgende reperfusie van de hersenen. Wereldbrein ischemie schade veroorzaakt specifieke hersengebieden getoond dat zeer gevoelig voor ischemie 1. Hippocampale neuronen hogere gevoeligheid voor ischemische beledigingen vergelijking met andere celpopulaties, en specifiek, het CA1 gebied van de hippocampus is bijzonder kwetsbaar voor ischemie / reperfusie 2.

Het ontwerp van therapeutische interventies of studie van mechanismen betrokken bij hersenschade vereist een model dat soortgelijke schade de klinische toestand en reproduceerbare wijze produceert. Bilaterale carotis vatocclusie met hypotensie (2VOH) is een model dat reversibele voorhersenen ischemie produceert, emuleren de cerebrale gebeurtenissen die kunnen optreden tijdens een hartstilstand en reanimatie. We beschrijven een model modificatie van Smith et al.. (1984) 2, Zoals eerst gepresenteerd in zijn huidige vorm Sanderson et al.. (2008) 3, die reproduceerbaar letsel veroorzaakt selectief kwetsbare hersengebieden 3-6. De betrouwbaarheid van het model wordt bepaald door nauwkeurige controle van de systemische bloeddruk tijdens toegepast hypotensie, de duur van de ischemie, scherpe temperatuurcontrole, een specifiek regime anesthesie en ijverig post-operatieve zorg. 8 minuten ischemie veroorzaakt celdood van CA1 hippocampale neuronen die in de loop van 6 tot 24 uur reperfusie vordert, terwijl minder kwetsbare hersenengebieden gespaard. Deze progressieve celdood gemakkelijk gekwantificeerd na 7-14 dagen na reperfusie, als een bijna volledig verlies van CA1 neuronen blijkt op dit moment.

Daarnaast hersentraumamodel presenteren we een werkwijze voor het CA1 schadekwantificatie op eenvoudige, maar grondige, methodologie. Belangrijk is dat kwantificering worden bereikt met behulp van een eenvoudige camera gemonteerde microscoop, eenda gratis ImageJ (NIH) software plugin, wegnemen van de noodzaak voor de kosten prohibitief stereology software programma's en een gemotoriseerde microscopische podium voor de beoordeling van schade.

Introduction

Hersenletsel als gevolg van een hartstilstand en beroerte is een belangrijke doodsoorzaak en langdurige arbeidsongeschiktheid. Terwijl reanimatie van slachtoffers van hartstilstand lukt herstellen spontane circulatie bij ongeveer 70.000 patiënten per jaar in de Verenigde Staten 7,8 tenminste 60% ​​van deze patiënten later sterven in het ziekenhuis als resultaat van uitgebreide hersenbeschadiging en slechts 3-10% van gereanimeerd patiënten kunnen hun vroegere levensstijl te hervatten 9,10. Duidelijk, het begrijpen van de mechanismen die leiden tot hersenbeschadiging na globale ischemie van de hersenen en het ontwerpen van therapeutische interventies om neurologische trauma te minimaliseren is het van cruciaal belang is.

Hersenischemie gemodelleerd worden gebruik meerdere methoden. Meestal wordt hersenischemie geproduceerd bij knaagdieren door afsluiten van een belangrijke bloedvat in de hersenen, de middelste cerebrale slagader, waardoor een focale ischemische beroerte 11,12 produceren. Hoewel klinisch belangrijke,focale hersenischemie geen nauwkeurige methode van hersenbeschadiging door hartstilstand / reanimatie bestuderen. Om deze klinische paradigma model het volledige hersenen dient te geschieden ischemische gevolgd door herintroductie van de bloedstroom. Om deze klinische presentatie na te bootsen, onderzoekers experimenteel induceren hartstilstand gevolgd door reanimatie met reanimatie en defibrillatie 13,14. Dit model is klinisch relevant, kan echter onvoorspelbaar reanimatie malen te verhogen variabiliteit en kan data-analyse moeilijk te interpreteren. Tevens wordt dit model geassocieerd met een hoge mortaliteit, een verdere verhoging dier benodigd zijn om een ​​hypothese te testen. Onderzoek van de cerebrale reactie op globale ischemie en / of reperfusie in een reproduceerbare consistente en survivable insult de voorkeur.

Globale ischemie kan worden geïnduceerd in de hersenen, terwijl sommige bloedstroom behoud systemisch. Dit vermindert sterfte, terwijl investigation van de mechanismen van weefselbeschadiging in de hersenen 2. Om wereldbrein ischemie produceren, is het noodzakelijk te onderbreken of aanzienlijk te beperken stroming in alle vier vaten die de hersenen, het interne halsslagaders en vertebrale slagaders leveren. Deze schepen leveren de hersenen met de bloedstroom door een vasculaire structuur genaamd de cirkel van Willis, die een anastomotische lus vormt. Deze vasculaire architectuur kan de hersenen perfusie bij proximale vasculaire occlusie behouden. Daarom, om volledig ischemie van de hersenen, de doorbloeding te induceren door alle bijdragende vaartuigen moeten plaatsvinden. Occlusie van de halsslagader kan worden bereikt met behulp van een minimaal invasieve ventrale nek cut-down en toepassing van aneurysma clips voor een gewenste periode. Onderbreking van de bloedstroom via de vertebrale slagaders kan moeilijk zijn, omdat ze incased in de dwarsrichting foramen van de wervelkolom. Onderzoekers hebben dit voorafgaand aan de halsslagader aangepakt door electrocauterizing de vertebrale slagaders 24-48 uurocclusie en ischemie van de hersenen (4VO model) 15. In tegenstelling tot deze aanpak, Smith et al.. Ontwikkelden een werkwijze voor het induceren globale hersenischemie doordat de gemiddelde arteriële bloeddruk (MAP) systemisch aan 40 mmHg perfusie te verminderen door de vertebrale slagaders naar een punt waar de bloedstroom wordt verloren of sterk verminderd 2 . In combinatie met carotis occlusie, produceert deze methode ischemie in de voorhersenen, waardoor een patroon van hersenbeschadiging die nabootst die van hartstilstand overlevenden. In een verdere verfijning van deze methode, het model hier geïntroduceerde vereist strak MAP regeling op 30 mmHg ± 1mHg gedurende de gehele 8 min ischemie. We vonden deze wijziging verbetert de reproduceerbaarheid van hersenletsel veroorzaakt door dit model met behoud van het lage sterftecijfer van de oorspronkelijke techniek ontworpen door Smith et al..

De precieze fenotype van celdood en totale mate van weefselschade doorde hier gepresenteerde model zijn direct afhankelijk van ischemische duur 16. Na 8 min ischemie, CA1 neuronen vertonen vertraagde celdood, suggereert dat er een tijdelijk venster voor therapeutische interventie in de reperfusiefase 15,17. Bij het ​​begin van reperfusie, neuronen snel weer functie en geen directe celdood detecteerbaar 18. Deze belediging veroorzaakt echter inductie van celdood cascades (apoptose) die culmineren in afgifte van apoptotische eiwitten uit mitochondriën, waaronder cytochroom c, tussen 4-6 uur van reperfusie 3,19. Tussen 6 en 24 uur van reperfusie, hebben neuronen van de hippocampus CA1 inzetten voor cel ondergang, en de apoptotische celdood programma wordt uitgevoerd 19. Opgemerkt wordt dat celdood fenotype verantwoordelijk voor ischemische schade zeer controversieel. Vroege studies hebben gesuggereerd necrose is de primaire celdood fenotype 20,21, terwijl andere anderen melden apoptosis als het voornaamste mechanisme 22,23. In totaal, de huidige gegevens suggereren dat cellen sterven van een spectrum van celdood fenotypes variërend van klassiek apoptose tot necrose. De specifieke wijze van celdood is afhankelijk van vele factoren, met de mogelijke bijdrage van elke fenotype afhankelijk van de ernst van de belediging, onder andere factoren 24,25. Door 24 uur van reperfusie, stervende cellen bezitten pyknotische kernen, gecondenseerde cytosol met duidelijk bewijs van geaggregeerde cellulaire inhoud, en het verlies van functionele mitochondriale morfologie. Dode cellen worden verder onderverdeeld, opgeslokt door immuuncellen, zoals macrofagen en / of de microglia, en gewist uit de CA1 hippocampus regio. Door het 4-7 dagen van reperfusie, worden dode cellen verwijderd, en alles wat overblijft zijn ontstekingscellen en geactiveerde gliacellen 17,26. Derhalve 7 dagen reperfusie vertegenwoordigt een optimale tijd waar hippocampale CA1 neuronale dood kan worden gekwantificeerd met behulp van eenvoudige, niet-specifieke cel vlekken inclusief Cresyl violet of hemotoxyline-eosine en geteld op basis van criteria morfologische insluiting. Nog op dit late reperfusie interval cellen kunnen worden geteld als overlevende cellen, waardoor een index van hersenbeschadiging.

Indien dit model wordt gebruikt om therapeutische interventies te testen, wordt voorgesteld dat de proefopzet volgen TRAPPEN criteria (Stroke Therapy Academic Industrie Roundtable) 27. Deze richtsnoeren moeten worden gevolgd bij het ontwerpen en uitvoeren van een onderzoek, worden echter niet besproken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Voorbereiding

Alle dierproeven moeten voldoen aan institutionele richtlijnen en voorafgaand aan de start goedkeuring door een respectievelijke dierverzorging commissie ontvangen. Alle procedures hier gepresenteerd zijn goedgekeurd door de Wayne State University Institutional Animal Care en gebruik Comite en volg de richtlijnen voor de ethische behandeling van dieren zoals naar voren gebracht in de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren en de Amerikaanse regering Principes voor de het gebruik en de verzorging van gewervelde dieren die in Testen, onderzoek en opleiding. Voor het begin van de operatie, de voorbereiding noodzakelijk chirurgisch materiaal en een operatie het herstel kooi. Deze procedure is een survival operatie en het is daarom noodzakelijk om steriele techniek te oefenen.

  1. Om een ​​vasculaire katheter te maken, snijd een 8 inch lengte van polyethyleen 50 (PE50) slang en plaats een afgestompte 23 gauge naald in een uiteinde. Katheters kunnen afzonderlijk worden gekocht vooraf gesteriliseerd of gekocht in bulk en vervolgens gesteriliseerd met ethyleen glycol als nodig.
  2. Beveilig deze naald op een poort van een drieweg kraantje en plaats nog een drieweg kraan aan de andere poort. Heparinize de kranen en de katheter door het uitvoeren van heparine-zoutoplossing door. Sluit een 10 ml zoutoplossing spuit op het kraantje loodrecht en distaal van de katheter. Sluit het kraantje distaal van de katheter naar de druksensor buis, vul het systeem met een zoutoplossing en verwijder eventuele luchtbellen.
  3. Setup het herstel kooi in overeenstemming met de regelgeving voor dierenwelzijn. De verkoeverkamer moet stil zijn en weinig verkeer. BELANGRIJK Zet de afzuigtafel of een soortgelijk gas opvangsysteem; vóór aanvang operatie te filteren verdampt isofluraan.

2. Chirurgische Voorbereiding

Sprague-Dawley ratten (300-350 g) worden in de 2VOH model van global forebrain ischemie. Anesthesie wordt geïnduceerd en onderhouden met isofluraan en supaangevuld met een sub-dissociatieve dosis ketamine. We hebben geconstateerd dat verdoving onderhouden door isofluraan alleen veroorzaakt een verhoogde optreden van beslaglegging tijdens post-op herstel. Epileptische aanvallen kunnen bijdragen tot neurale schade en sterfte, die de reproduceerbaarheid van dit model zal beïnvloeden. Aanvulling van anesthesie met ketamine kan een veel lagere dosis isofluraan een chirurgische kwaliteit van anesthesie te bereiken. Met behulp van een homeostatische thermische deken stelt strikte regulering van de kerntemperatuur. De chirurgische procedure houdt halsslagader cut-down en isolatie, en dijslagader cut-down en infusen.

NB Het is belangrijk om gedetailleerde dossiers gedurende elke afzonderlijke chirurgische procedure te houden. Veranderingen in kerntemperatuur, bloeddruk of andere fysiologische variabelen die voor of tijdens de operatie kan optreden drastisch veranderen resultaten en gegevens worden geanalyseerd om te zorgen voor procedurele consistentie tussen individuen en groepen. Consistentiein de fysiologische parameters van het dier kan worden verbeterd door de dieren vasten voorafgaand aan de operatie. Onderzoekers worden aangemoedigd om de methode die resulteert in de meest consistente pre-bediende hemodynamiek en serum concentratie glucose voor hun studie te bepalen.

  1. Induceren anesthesie door het plaatsen van de rat in een inductie kamer en vullen met een 30% oxygen/70% lachgas mengsel bij 5% isofluraan. Intuberen met een 12 gauge katheter, met behulp van een knaagdier laryngoscoop en ventileren met 30% oxygen/70% lachgas mengsel met 2,5% isofluraan. Ventilatie tarief moet 80 ademhalingen per minuut bij 2,5 ml per ademhaling.
  2. Geef een intraperitoneale injectie van ketamine (20 mg / kg) in zoutoplossing en vermindering isofluraan tot 1,5%. Belangrijk Het is noodzakelijk om het niveau van anesthesie tijdens de gehele procedure voldoende chirurgische vlak van anesthesie garanderen. Om de diepte van de anesthesie, snuifje check tussen de achterste ledematen cijfers, terwijl de controle pedaal reflex. Als de reflexafwezig anesthesie voldoende. Na canulatie van de femorale slagader, kan de bloeddruk worden gebruikt als een indicator van de anesthesie-niveau. Houd de dosis isofluraan zo laag mogelijk met behoud van een chirurgische vlak van anesthesie om het potentieel van post-ischemische aanvallen minimaliseren.
  3. Incisies worden gemaakt op de hals en in het bekkengebied. Scheer de nek en de juiste bekken, waarbij het bovenbeen aan de buik. Oriënteren de rat in een liggende positie op de homeostatische thermo-deken en steek de rectale thermometer met chirurgische glijmiddel. Gelden beschermende eye smeermiddel. Een 60 watt gloeilamp kan helpen reguleren de temperatuur. De lamp moet nooit dichter dan 8 cm van het dier. BELANGRIJKE Temperaturen boven of onder fysiologische temperatuur (37 ° C) bepaald grotendeels uiteindelijke neurologische schade. Handhaaf kerntemperatuur bij 37 ° C ± 0,5 ° C.
  4. Schrob de incisie gebieden met betadine en spoelen met 70% ethanol. Herhaal deze two meer keren. Plaats een chirurgische veld over de rat, en snijd gaten om de incisie gebieden bloot. BELANGRIJK halsslagader en dijslagaders kunnen worden geïsoleerd zonder enige trauma aan de daaraan gehechte spiermassa, waarvan de inning en geminimaliseerd daaropvolgende behoefte aan postoperatieve analgesie zal verbeteren.
  5. In afwachting van een adequate anesthesie, gebruik dan een nr. 10 scalpel een incisie te maken langs de hals, vervolgens, met behulp van hemostats botweg ontleden tussen de speekselklieren tot het bereiken van de sternohyoid spier, de prominente middellijn spiergroep die de luchtpijp. Opnieuw met zorgvuldige stompe dissectie techniek, scheid de grote spiergroepen van de sternohyoid van de musculus sternocleidomastoideus, bilateraal. Deze twee spiergroepen vormen een driehoekige inkeping die gebruikt kan worden als een mijlpaal de neurovasculaire bundel die de halsslagader bevat lokaliseren. De halsslagader takken in de interne en externe halsslagaders. Isoleer de halsslagader proximaal van de bifurcatie.
  6. Voorzichtig te scheiden deze twee spieren en zoek de halsslagader. Om te helpen bepalen dit schip op zoek naar een puls. Isoleer de halsslagaders aan beide zijden langs een ~ 5 cm lengte van 3-0 zijden hechtdraad onder het vat. Ruim fascia van de schepen. VOORZICHTIG De nervus vagus en sympathiek ketens worden opgenomen in het cervicale neurovasculaire bundel en zorg moeten worden genomen om te voorkomen dat schade aan het bij het ​​isoleren van de halsslagader.
  7. Gebruik een schaar om een ​​tweede incisie te maken in de lies, langs de inkeping waar de achterste ledematen dijspieren voldoet aan de buik. Ontleden onder de buikspier, langs de bovenbeenspieren totdat u de lies ligament bereiken. Dit zal de femorale neurovasculaire bundel bloot. Isoleren de dijslagader voorzichtig door het passeren van een ~ 5 centimeter lengte van 3-0 zijden hechtdraad onder het schip. Duidelijk fascia verlaten van 5-7 mm van de blootgestelde schip weg.
  8. Bind vaste knoop aan het distale uiteinde van de blootgestelde slagader.
  9. Breng tractie op de hechting aan het proximale uiteinde van de slagader naar de bloedstroom af te sluiten, door aan de hechtingen onderwezen. Voeg een kleine incisie aan de bovenkant van het vat met oogheelkundige schaar. Onvoldoende tractie op het vaartuig zal leiden tot bloedingen, die kunnen worden gestopt door toepassing van zwaardere tractie. Sluit de catheter bij de kraan.
  10. Met behulp van een vasculair introducer, steek de katheter slang in het vat, 7-9 mm voorbij het schip incisie en de richting van de middellijn. Zodra de katheter wordt geplaatst op de gewenste afstand, bind de losse knoop rond het schip en de katheter om het op zijn plaats vast te zetten. Verwijder tractie uit het vat en laat het op natuurlijke wijze liggen.
  11. Dien 0.3 ml heparine (100U/ml in zoutoplossing), intraveneus. Spoelbloed uit de katheter met een kleine hoeveelheid zoutoplossing om klonteren te voorkomen. Zet de drukregelaar en kalibreer de apparatuur. Open de kranen om de transducer om de bloeddruk te detecteren. Voor nauwkeurige metingen van de bloeddruk verkrijgen positionering van het systeem niet worden veranderd na ijking.
  12. Isofluraan dosering moet worden aangepast om een ​​gemiddelde arteriële bloeddruk (MAP) van 110 mmHg tot 130 mmHg leveren. Dit MAP zijn indicatieve cijfers van adequate chirurgische vlak van anesthesie.

3. Ischemie Protocol

Zoals eerder vermeld, vier schepen leveren perfusie naar de hersenen. Proximale occlusie van beide halsslagaders niet tot hersenischemie omdat de vertebrale slagaders compenseren door Cirkel van Willis. Het is aangetoond dat carotis occlusie combinatie met geïnduceerde systemische hypotensie wordt perfusie beperkt door de vertebrale slagaders resulteert in hersen ischemie. Hier Descr weIBE het protocol voor het onttrekken van bloed naar hypotensie veroorzaken en het klemmen van de halsslagaders aan gecontroleerde, reversibele ischemie produceren. Zie figuur 1.

Bloed zuurstof en kooldioxide, glucose concentratie en pH kan variëren tussen individuen in de steekproef en veroorzaken variatie in het letsel. Monitoring van deze fysiologische variabelen kunnen verminderen variabiliteit van het infarct. Zoals gezegd, temperatuur andere parameter die van belang te reguleren, maar hersentemperatuur hoeft niet overeen te kerntemperatuur, zoals perfusie sterk beperkt in experimentele ischemie 28. Onze specifieke chirurgische opstart resulteert in temperatuurveranderingen in de hersenen die spiegel veranderingen in kerntemperatuur tijdens ischemie. Het is echter belangrijk dat de experimentator het empirisch bepalen door het bewaken hersentemperatuur met thermokoppels of andere middelen om standaardisatie van de procedure. Als de kerntemperatuur niet spiegelen hersenen temtuur, is het belangrijk om de hersentemperatuur normothermic gedurende de gehele procedure, ongeacht kerntemperatuur handhaven.

Randomisatie dicteert dat de chirurg willekeurige volgorde het dier aan ischemie of schijn-geopereerde controle groep op dit punt. Sham operatie zal volgen alle procedures precies hetzelfde als ischemische dieren, behalve een eventuele verlaging van de bloeddruk en occlusie van de halsslagader. Het is belangrijk dat de schijn-geopereerde controles onder dezelfde dosis anesthesie voor een duur die overeenkomt met die van de ischemische dieren. Als er een behandelgroep opgenomen, die voor of na ischemie anesthesie nodig is, moet schijnvertoning en onbehandelde ischemie groepen overeenkomen met de verdoving dosis en de duur van de behandelde groep.

  1. Klaar hemostatische clips en clip applicator. Clips moet het vaartuig volledig af te sluiten zonder enige trauma. Ischemie kan worden geïnduceerd wanneer hemodynamics consequent zijn geworden. Sluit een 10 ml heparine syriNSE op de kraan, loodrecht en proximaal van de katheter. Er dient 0,3 ml (30 eenheden) gehepariniseerde zoutoplossing binnen de spuit om coagulatie van het onttrokken bloed voorkomen.
  2. Stel een timer voor 1 min en open de kraan aan het gehepariniseerde spuit, zodat het bloed kan worden ingetrokken.
  3. Trek bloed door aan de zuiger. Als er te veel zuigkracht wordt toegepast, zal het schip instorten of af te dichten tegen de katheter opening en zal geen bloed worden getrokken. Het moet mogelijk zijn om 7-9 ml bloed worden verwijderd in 1 minuut. Indien dit niet het geval is, geavanceerde katheter verder in de slagader en opnieuw proberen. We vinden dat 7-9 ml bloed moet worden verwijderd om de MAP bij 30 mmHg, de gewenste bloeddruk te ischemie bereiken verminderen. BELANGRIJK Zorg ervoor dat de onttrokken bloed wordt bewaard bij 37 ° C te koelen te vermijden tijdens bloed herinfusie.
  4. Na de een minuut bloed te trekken (7-9 ml bloed moet worden ingetrokken), hemostatische clips van toepassing op de halsslagaders en beginnen eentimer gedurende 8 minuten. Onmiddellijk controleren bloeddruk. Als de kaart niet bij 30 mmHg, bezielen of in te trekken bloed langzaam naar 30 mmHg ± 1 mm Hg te bereiken. Ga door met deze praktijk gedurende ischemie tot MAP van 30 mmHg te houden. BELANGRIJK Record bloeddruk gedurende de gehele ischemie protocol. Niet bloeddruk tot 30 mmHg ischemie kan beperken. Monitor kern en / of de hersenen temperatuur nauw tijdens herinfusie als stijgingen of dalingen van de temperatuur kan schade aan de hersenen beïnvloeden.
  5. Eind 8 min, beginnen reperfusie door verwijdering van de hemostatische klemmen en reinfusing het bloed langzaam 2 ml per minuut.
  6. Wanneer het bloed wordt geïnfuseerd de canule kan worden verwijderd uit de femorale slagader. Om alle bloedingen tijdens post-op, veilig twee aparte knopen proximaal van de incisie op de slagader te voorkomen.
  7. Hecht de insnijdingen met een discontinu patroon met behulp van een omgekeerde snijden naald, met 5-0 VICRYL hechtdraad. Deze hechtingen zal oplossen, dus het zal niet rnoodzakelijk maken verwijderen. NB Tijdens de procedure, als er voldoende verdoving niet kan worden bereikt met lagere niveaus van isofluraan, toedienen van een extra dosis van ketamine.

4. Analgesie en Herstel

Dierenwelzijn is de prioriteit tijdens het herstel evenals de chirurgische procedure. Postoperatieve zorg moet volgen de specifieke richtlijnen van de instelling. Dieren die globale ischemie van de hersenen ondergaan zijn vatbaar voor aanvallen. Tot inbeslagneming voorval te minimaliseren is het belangrijk dat de verkoeverkamer hebben een minimale stimulatie, dwz geluiden en visuele stoornissen. Onder onze dierlijke gebruik protocol, we huis postoperatieve dieren voor 72 uur in een afgezonderde ruimte voor dit doel.

  1. Na de insnijdingen zijn gehecht de rat kan worden gespeend van de beademing af. Schakel de isofluraan en blijven ventilatie bij 30% oxygen/70% lachgas totdat de rat begint te ademen tegen de ventilator.
  2. Dien 0,5 mg / kg butorfanol in 5 ml zoutoplossing subcutaan tussen de schouderbladen.
  3. Snel reinfusing bloed kunnen verhogen rechter ventrikel preload. Dit verhoogt pulmonale circulatie druk en kan longoedeem veroorzaken. Tekenen hiervan zijn bemoeilijkte ademhaling en krakende geluiden tijdens de ademhaling. Het toepassen van positieve uitademingsdruk zal helpen verbeteren longoedeem.
  4. Als vrijwillige controle van de ademhaling wordt herwonnen, extuberen, verwijder de thermometer en zet de verwarming deken. Op dit punt kan het dier worden geplaatst in een herstelkooi. De herstelkooi zo neer helft van de kooi op een watercirculatie deken (34 ° C) gedurende de eerste 24 uur van reperfusie. Plaats het dier aan de zijde van de kooi vloer via verwarmingsdeken te helpen bij temperatuurbehoud. Zodra het dier begint te herstellen van anesthesie en analgesie, zal het bewegen rond de kooi om zelf thermoregulate. Dieren zullen afzonderlijk worden gehuisvest tijdens post-op.
  5. Het dier moet hebben onbeperkt toegang tot het water. Voor twee dagen na de operatie, moet dit water 4 mg / kg vloeibare Tylenol oplossing bevatten. Naast knaagdier chow, wordt gezoete ontbijtgranen verstrekt in de kooi eten te stimuleren en te voorkomen dat het gewichtsverlies.
  6. Bedek de helft van de kooi met een laken en nauwlettend postoperatieve herstel.
  7. Als het dier herstelt van anesthesie is het belangrijk om te controleren op tekenen van nood. Gearbeid of inconsistent ademhaling kan een teken zijn van verdriet, mogelijk veroorzaakt door longoedeem of irritatie van luchtwegen tijdens intubatie zijn. Butorphenol zal verdoven van het dier, het verminderen van de activiteit echter mild activiteit moet worden hersteld binnen 1 uur. Wij vinden dieren zullen beginnen met het eten traktaties en drinken binnen 4 uur van extubation. Door 12 uur, moet normaal gedrag en het voeden activiteit worden hervat. Een ander teken van nood is het gewichtsverlies, een dier mag niet meer dan 20% van het oorspronkelijke lichaamsgewicht verliezen in elke 48 uur overspanning, indien overmatig gewichtsverlies is waargenomen van het dier moet worden geëuthanaseerd.
  8. Humane ingrijpen is nodig als epileptische aanvallen optreden. Dit soort epileptische activiteit wordt algemeen gezien 24 tot 48 uur na reperfusie. Epileptische aanvallen kunnen verhoogde schade aan de hersenen die onafhankelijk is van de ischemische insult per se leiden, moeten dus epileptische activiteit worden beschouwd als een exclusiecriterium in plaats voorafgaand aan de start van de studie 29. Epileptische aanvallen kunnen optreden als er niemand aanwezig is, dus is het belangrijk de signalen herkennen. Beddengoed worden verstoord en mogelijk verdreven uit de kooi. Een postictale rat zal een lome dispositie met snelle, moeilijke ademhaling en / of hebben een gekneusde of bloeden neus.

NB Elke tekenen van pijn of benauwdheid worden direct verlicht met pijnstillers. Als sympotoms niet verlicht worden met een dosis van pijnstillers of aanhouden na het vierde opeenvolgende dosis analgesie wordt het dier gedood en uitgesloten van de studie. Chirurgische wounds moeten worden gecontroleerd op een goede genezing voor acht dagen na de operatie.

5. Weefsel Verzamelen en verwerken

De hersenen worden vastgesteld bij transcardial infusie paraformaldehyde. Na bruto snijden en cryoprotection, snap we bevriezen de hersenen en sectie op een cryostaat. Deze hersenen secties worden gekleurd met Cresyl violet en afgebeeld op een lichtmicroscoop.

  1. Induceren anesthesie door het plaatsen van de dieren in de inductie kamer en het vullen met 30% zuurstof / 70% lachgas met 5% isofluraan. Intuberen het dier en ventileren bij 30% zuurstof / 70% lachgas met 5% isofluraan.
  2. Bereid het materiaal voor de perfusie procedure. Vul een bekerglas met 100 ml van 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bij 4 ° C en een bekerglas met 100 ml 4% paraformaldehyde (PFA) bij 4 ° C. De hersenen worden gespoeld met PBS, gevolgd door PFA, via een perfusiepomp. Slangen zullen in elk bekerglas geplaatst en verbonden door een driewegkraan naar eenllow een soepele overgang van PBS tot PFA perfusie. Plaats een afgestompte 18 gauge naald op de slang en vul de lijn met PBS. Zorgen dat er geen luchtbellen in de naald en slangen als lucht kan een embolie, die perfusie kunnen voorkomen vormen. Ook bereid een kleine container met PFA onderdompeling fixatie van de hersenen.
  3. Gebruik een vloeistof opvangbak met voldoende capaciteit om ten minste 200 ml vloeistof bevatten. Op dit moment het dier moeten worden geventileerd met isofluraan lang genoeg (ten minste 3 min) tot diepe anesthesie bereiken.
  4. BELANGRIJK Zorg chirurgische vlak van anesthesie is bereikt.
  5. Ga door een incisie om de borstholte door de buik. Klem de aorta descendens. Wanneer het hart wordt blootgesteld, plaatst u de afgestompte 18 gauge naald door de apex van het hart naar de aorta. Maak een kleine snede in de rechter oorschelp om perfusaat om het dier af te sluiten.
  6. Zet de pomp bij 50 ml / min, te beginnen met PBS. Na Pumping 100 ml PBS, schakelt het kraantje te perfuseren 100 ml PFA.
  7. Verwijder de hersenen, zorg ervoor dat u het weefsel beschadigen.
  8. Plaats de hersenen in een weefsel matrix en snijd tussen het cerebellum en cerebrum. Deel de voorhersenen, ~ 3 mm van de voorkant en achterkant van de cerebrale cortex. Dit levert drie secties, zal het middelste gedeelte van de hippocampus bevatten.
  9. Plaats de hersenen secties in een pot met voldoende PFA voor een volledige onderdompeling. Onderdompeling fix de hersenen precies 2 uur.
  10. Om het weefsel te beschermen tegen schade veroorzaakt door bevriezing, is het brein cryoproteced door het vervangen van de PFA met 30% sucrose in PBS. Cryoprotection is compleet met de weefselmonsters zinken in de sucrose-oplossing (~ 24-48 uur).
  11. Snap bevriezen de hersenen secties, plaats een beker in droog ijs en vul aan met 2-methylbutanol gedurende tien minuten. Leg de plakjes hersenen in de methylbutanol voor 5 min, vervolgens over in een afsluitbare container en bewaar bij -80 ° C tot cryostbij het snijden.
  12. Cryostaat gedeelte hersenen op 20 urn, er minimaal 3 secties 3 brain atlas coördinaten (The Rat Brain in stereotaxische coördinaten. Paxinos en Watson, plaatdelen 29, 31, 33 of Bregma -2,8 mm, -3,3 mm en -3,8 mm). De secties zijn op geladen objectglaasjes geplaatst en laten drogen voordat u het opbergt bij -80 ° C.
  13. Cresylviolet (0,1% bij pH 3,5) vlek 9 hersenen secties, 3 op elke hersenen atlas coördinaat.
  14. Afbeelding het CA1 gebied van de hippocampus bij 40x met een microscoop gemonteerde camera en plaats een 300 micrometer schaal bar parallel met de CA1 neuronale vliegtuig. Afbeeldingen opslaan als TIFF-bestanden.

6. Brain Damage Kwantificering

ImageJ, een gratis programma aangeboden door de National Institute of Health, kan worden gebruikt om te tellen en kwantificeren van de levensvatbare neuronen, die de omvang van hersenletsel vertegenwoordigen.

  1. Open microscoop TIFF-afbeeldingen met de 'celgetalmeter' plugin van ImageJ. Selecteer eenmarkering kleuren en tellen neuronen binnen de grenzen van de schaal bar. Neuronen worden geteld op basis van eenvoudige criteria opgenomen op basis van neuronale morfologie (grote, piramidale vorm) of uitsluitingscriteria voor microglia / astrocyten morfologie (kleine ronde of lange buisvormige vorm).
    BELANGRIJK Wees consistent met inclusie / uitsluiting tussen dia's, en individuen bij het ​​tellen van neuronen.
  2. Record neuron telt en sla het venster cel teller.
  3. Neuron tellingen moeten worden ingevuld door twee afzonderlijke mensen om consistente, accurate neuron telt bereiken.
  4. Het gemiddelde van alle 9 beelden van elk dier wordt een enkel gemiddeld "neuron count", dat is de kwantitatieve maat hippocampale CA1 schade worden gebruikt in de statistische analyse. Groepen kunnen worden vergeleken statisch met een one-way ANOVA gevolgd door HSD-test een Tukey voor post hoc analyse, of, indien van normaliteit test faalt, een Kruskal-Wallis one-way ANOVA op de gelederen, gevolgd door Dunn's post hoc analyse om statistisch verschillen tussen groepen te evalueren. Specifieke statistische analyse dienen te worden bepaald door de individuele onderzoeksopzet, kan het hier gepresenteerde niet geschikt voor de specifieke hypotheses getest.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De 2VOH model van global hersenen ischemie / reperfusie veroorzaakt neuronale dood in het CA1 gebied van de hippocampus. Figuur 2 geeft de schade door 8 min wereldbrein ischemie, verwerkt 14 dagen na reperfusie. Figuren 2A en 2B vergelijken de hippocampus van sham en post-ischemische hersenen, gekleurd met Cresyl violet. Figuur 2A toont een hippocampus van een schijn-geopereerde ratten die normale morfologie vertoont, met inbegrip van een intacte CA1. Figuur 2B toont de hippocampus onderworpen aan ischemie / reperfusie, waar de dentate gyrus, CA2 en CA3 hebben minimaal beïnvloed morfologie. Het selectief kwetsbare neuronen van de hippocampus CA1 niet overleven ischemie / reperfusie schade en alleen verspreid neuronen blijven. Echter, de dramatische stijging van infiltrerende macrofagen en / of microglia (Iba-1-positieve cellen), en reactieve astrocyten (GFAP-positieve cellen) zijn duidelijk in het CA1 hippocampal veld. Specifieke immunofluorescente labeling van neuronen met NeuN, macrofagen / microglia labeling met Iba-1 en astrocyte labeling met GFAP bevestigen deze bevindingen.

Figuur 2C presenteert monster neuron tellen ramen voor microscoop beelden van de CA1 bij 40x vergroting. Het bovenste paneel toont CA1 van een schijn-geopereerde controle en het onderste paneel toont de CA1 volgende ischemie / reperfusie. De gewonde CA1 toont een kleuring die microglia en astrocyten, die klein en buisvormig of druppelvormige verschijnen omvat. Deze kunnen worden onderscheiden van neuronen door hun vorm. Intact hippocampale neuronen, zowel in de dentate gyrus, CA2 of CA1, zijn groot met een cirkelvormige of piramidevorm.

Figuur 2D is een grafische analyse van de 2VOH geïnduceerd letsel gekwantificeerd door CA1 neuronale tellingen. Er kan worden geconcludeerd dat 8 min ischemie door de 2VOH model kan veroorzaken consistente en reproducible letsel dat wordt voornamelijk geïsoleerd aan de CA1 hippocampus.

Figuur 1
Figuur 1. Experimentele Tijdlijn. De experimentele tijdlijn is een weergave van de chirurgische stappen en weefselverwerking.

Figuur 2
Figuur 2. Representatieve resultaten. Hippocampus schade in een onbehandelde ratten blootgesteld aan I / R (B) in vergelijking met een schijn-geopereerde controle rat (A). Cresylviolet gebrandschilderde hippocampus (10X) [Surround] 40x vergrotingen van de CA1, CA2, CA3, hilus, en DG (top leftà de klok mee). (B) Schade is gelokaliseerd aan de CA1 hippocampus (C) Vertegenwoordiger tellen windows gebruikt voor neuron tellen en schade kwantificering in een schijn-geopereerde controle dieren (top, controle) en een dier blootgesteld aan wereldwijde hersenen ischemie (bodem, I / R). (D) Vertegenwoordiger kwantificering van CA1. hippocampale neuron tellingen van een gepubliceerde studie (gemiddelde + standaarddeviatie, n = 8, p <0,05).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het beschreven model produceert een ischemisch insult de hersenen die kan optreden als gevolg van een hartstilstand en reanimatie, die een verwonding vergelijkbaar met die bij mensen. Deze werkwijze voor het produceren wereldbrein ischemie is een van meerdere protocollen. We maken gebruik van dit protocol vooral voor haar relatief lage sterfte, sneller herstel, en reproduceerbare resultaten. De hartstilstand / reanimatie-model is waarschijnlijk de meest klinisch relevante model, maar technisch de moeilijkste om voortdurend reproduceren. De 4VO model van globale ischemie hersenen is een algemeen gebruikt protocol waardevol dat alle vier bijdragen schepen afgesloten tijdens ischemie. Dit model heeft ook nadelen, die meerdere operaties en de mogelijkheid van neuroprotectieve preconditionering omvatten. De 4VO model is aangepast, waardoor tijdelijke occlusie van alle vier vaten gedurende een procedure ischemie te produceren, maar de operatie blijft technischely veeleisende 30.

Variaties op 2VOH is aangetoond dat verschillende resultaten opleveren 31,32. Duur van de ischemie en de mate van hypotensie zijn de belangrijkste variabelen die van invloed kunnen uitkomst. Rapporten hebben aangetoond dat als de bloeddruk niet voldoende verminderd de schade geproduceerd inconsistente of unilateraal kan zijn bij ratten 30. We hebben 30 mmHg gevonden om een ​​optimale mate van hypotensie, omdat het produceert betrouwbare ischemie zonder dat noemenswaardige perifeer letsel. Dit paradigma produceert ischemie gekarakteriseerd als ernstig, maar na ons protocol zal het anders verhoogde kans op complicaties te verminderen. Door de ernst van de belediging kan de reden lichte variatie in fysiologische parameters tussen dieren meestal niet van invloed op letsel consistentie zijn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen financiële belangenconflicten.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material Name
5-0 VICRYL suture, reverse cutting Ethicon J391H
Scalpel, No.10 Swann-Morton 6601
Gauze Sponges Fisher 22-362-178
18G x 1 ½ in needle BD 305201
23G x 1 in needle BD 305145
26 G x 3/8 in needle BD 305110
18 G x 1 ¼ catheter EXEL 26735
1 ml syringe BD 309659
10 ml syringe BD 309604
60 ml syringe BD 309653
Surgilube Henry Schein 1152666
.9% Saline, plastic IV bag Henry Schein 1537468
Suture 3-0 Silk Henry Schein 1007842
Puralube Ophthalmic Ointment Henry Schein 3390017
Betadine Henry Schein 6903564
Sterile Towel Drape Moore Medical 14170
Polyethylene Tubing, 50 Intramedic 427411
Stopcock, 3 way Smiths medical MX9311L
Drug Name
AERRANE (isoflurane) Henry Schein 2091966
Mapap Liquid (Tylenol) Major Pharmaceuticals 1556
Kedavet (ketamine) Ketathesia Butney NDC 50989-996-06
Butorphic (butorphanol) Lloyd Labs 4881
Heparin APP Pharmaceuticals 504011
Chemical Name
Paraformaldehyde prills Elecron Microscopy Sci. 19202
2-methylbutane Sigma 270342
Cresyl Violet Acetate Sigma C5042
Sucrose Sigma S9378
Software
ImageJ NIH

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kirino, T., Sano, K. Selective vulnerability in the gerbil hippocampus following transient ischemia. Acta Neuropathologica. 62, 201-208 (1984).
  2. Smith, M. L., Auer, R. N., Siesjo, B. K. The density and distribution of ischemic brain injury in the rat following 2-10 min of forebrain ischemia. Acta Neuropathologica. 64, 319-332 (1984).
  3. Sanderson, T. H., Kumar, R., Sullivan, J. M., Krause, G. S. Insulin blocks cytochrome c release in the reperfused brain through PI3-K signaling and by promoting Bax/Bcl-XL binding. Journal of Neurochemistry. 106, 1248-1258 (2008).
  4. Sanderson, T. H., et al. Insulin activates the PI3K-Akt survival pathway in vulnerable neurons following global brain ischemia. Neurological Research. 31, 947-958 (2009).
  5. Sanderson, T. H., et al. PKR-like endoplasmic reticulum kinase (PERK) activation following brain ischemia is independent of unfolded nascent proteins. Neuroscience. 169, 1307-1314 (2010).
  6. Hazelton, J. L., et al. Hyperoxic reperfusion after global cerebral ischemia promotes inflammation and long-term hippocampal neuronal death. Journal of Neurotrauma. 27, 753-762 (2010).
  7. Lloyd-Jones, D., et al. Heart disease and stroke statistics--2010 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 121, e46-e215 (2010).
  8. Krause, G. S., Kumar, K., White, B. C., Aust, S. D., Wiegenstein, J. G. Ischemia, resuscitation, and reperfusion: mechanisms of tissue injury and prospects for protection. American Heart Journal. 111, 768-780 (1986).
  9. Krause, G. S., White, B. C., Aust, S. D., Nayini, N. R., Kumar, K. Brain cell death following ischemia and reperfusion: a proposed biochemical sequence. Critical Care Medicine. 16, 714-726 (1988).
  10. Bloom, H. L., et al. Long-term survival after successful inhospital cardiac arrest resuscitation. American Heart Journal. 153, 831-836 (2007).
  11. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke; a Journal of Cerebral Circulation. 20, 84-91 (1989).
  12. Uluc, K., Miranpuri, A., Kujoth, G. C., Akture, E., Baskaya, M. K. Focal cerebral ischemia model by endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in the rat. J. Vis. Exp. (48), e1978 (2011).
  13. Neumar, R. W., et al. Calpain mediates eukaryotic initiation factor 4G degradation during global brain ischemia. J. Cereb. Blood Flow Metab. 18, 876-881 (1998).
  14. Paine, M. G., Che, D., Li, L., Neumar, R. W. Cerebellar Purkinje Cell Neurodegeneration After Cardiac Arrest: Effect of Therapeutic Hypothermia. Resuscitation. (2012).
  15. Pulsinelli, W. A., Brierley, J. B., Plum, F. Temporal profile of neuronal damage in a model of transient forebrain ischemia. Annals of Neurology. 11, 491-498 (1982).
  16. Edinger, A. L., Thompson, C. B. Death by design: apoptosis, necrosis and autophagy. Current Opinion in Cell Biology. 16, 663-669 (2004).
  17. Kirino, T. Delayed neuronal death in the gerbil hippocampus following ischemia. Brain Research. 239, 57-69 (1982).
  18. Yager, J. Y., Brucklacher, R. M., Vannucci, R. C. Cerebral energy metabolism during hypoxia-ischemia and early recovery in immature rats. The American Journal of Physiology. 262, 672-677 (1992).
  19. Sugawara, T., Fujimura, M., Morita-Fujimura, Y., Kawase, M., Chan, P. H. Mitochondrial release of cytochrome c corresponds to the selective vulnerability of hippocampal CA1 neurons in rats after transient global cerebral ischemia. J. Neurosci. 19, RC39 (1999).
  20. Nishino, H., et al. Pathophysiological process after transient ischemia of the middle cerebral artery in the rat. Brain Research Bulletin. 35, 51-56 (1994).
  21. Ross, D. T., Ebner, F. F. Thalamic retrograde degeneration following cortical injury: an excitotoxic process. Neuroscience. 35, 525-550 (1990).
  22. Soriano, M. A., Ferrer, I., Rodriguez-Farre, E., Planas, A. M. Apoptosis and c-Jun in the thalamus of the rat following cortical infarction. Neuroreport. 7, 425-428 (1996).
  23. Watanabe, H., et al. Protein synthesis inhibitor transiently reduces neuronal death in the thalamus of spontaneously hypertensive rats following cortical infarction. Neuroscience Letters. 233, 25-28 (1997).
  24. Wei, L., Ying, D. J., Cui, L., Langsdorf, J., Yu, S. P. Necrosis, apoptosis and hybrid death in the cortex and thalamus after barrel cortex ischemia in rats. Brain Research. 1022, 54-61 (2004).
  25. Zong, W. X., Thompson, C. B. Necrotic death as a cell fate. Genes & Development. 20, 1-15 (2006).
  26. Ito, U., Spatz, M., Walker, J. T., Klatzo, I. Experimental cerebral ischemia in mongolian gerbils. I. Light microscopic observations. Acta Neuropathologica. 32, 209-223 (1975).
  27. Saver, J. L., Albers, G. W., Dunn, B., Johnston, K. C., Fisher, M. Stroke Therapy Academic Industry Roundtable (STAIR) recommendations for extended window acute stroke therapy trials. Stroke; a Journal of Cerebral Circulation. 40, 2594-2600 (2009).
  28. Busto, R., Dietrich, W. D., Globus, M. Y., Ginsberg, M. D. The importance of brain temperature in cerebral ischemic injury. Stroke; a Journal of Cerebral Circulation. 20, 1113-1114 (1989).
  29. Voll, C. L., Auer, R. N. Postischemic seizures and necrotizing ischemic brain damage: neuroprotective effect of postischemic diazepam and insulin. Neurology. 41, 423-428 (1991).
  30. Yamaguchi, M., Calvert, J. W., Kusaka, G., Zhang, J. H. One-stage anterior approach for four-vessel occlusion in rat. Stroke; a Journal of Cerebral Circulation. 36, 2212-2214 (2005).
  31. Gionet, T. X., Warner, D. S., Verhaegen, M., Thomas, J. D., Todd, M. M. Effects of intra-ischemic blood pressure on outcome from 2-vessel occlusion forebrain ischemia in the rat. Brain Research. 586, 188-194 (1992).
  32. Sugawara, T., et al. Effect of hypotension severity on hippocampal CA1 neurons in a rat global ischemia model. Brain Research. 877, 281-287 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics