הפעלה של נוירונים Optogenetic דג זברה החושית באמצעות שף tdTomato

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

טכניקות Optogenetic הפכו אותו ניתן ללמוד על התרומה של נוירונים ספציפיים להתנהגות. אנו מתארים שיטה בדג זברת זחל להפעלת נוירונים חושיים יחידים להביע channelrhodopsin ריאנט (שף) עם מדינה-דיודה שאובה מוצקה ליזר (DPSS) ולהקליט את ההתנהגויות שהושרו עם מצלמת וידאו במהירות גבוהה.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Palanca, A. M., Sagasti, A. Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato. J. Vis. Exp. (71), e50184, doi:10.3791/50184 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

דג זברת הזחל הם מתעוררים כמודל לתיאור ההתפתחות והתפקוד של מעגלים עצביים פשוטים. בשל ההפריה שלהם החיצוניות, ההתפתחות מהירה, והשקיפות, דג הזברה מתאים במיוחד גם לגישות optogenetic לחקור תפקוד מעגלים עצבי. בגישה זו, תעלות יונים רגישות לאור מבוטאות בתאי עצב מסוימים, ומאפשרים לניסוי כדי להפעיל או לעכב אותם ברצון ובכך להעריך את תרומתם להתנהגויות מסוימות. יישום שיטות אלו בדג זברת זחל הוא מושגית פשוט, אבל דורש אופטימיזציה של פרטים טכניים. כאן אנו מדגימים הליך לביטוי בגרסת channelrhodopsin נוירונים זחל דג זברה חושי, תאים בודדים מפעילות צילום, הקלטה ואת ההתנהגויות הנגזרות מכך. על ידי החדרה כמה שינויים לשיטות שנקבעו בעבר, גישה זו יכולה לשמש כדי לעורר תגובות התנהגותיות מתא עצב בודד הופעל עדללפחות 4 ימים לאחר ההפריה (DPF). באופן ספציפי, יצר transgene באמצעות חושי נוירון משפר, CREST3, לנהוג הביטוי מתויג channelrhodopsin הגרסה, שף tdTomato. הזרקת transgene זו לתוצאות עוברי שלב 1-תאים בביטוי פסיפס בנוירונים חושיים, שיכול להיות צלם עם מיקרוסקופיה confocal. מאיר זיהה תאים בבעלי חיים אלה עם אור ליזר DPSS ננומטר 473, מודרך דרך כבל סיב אופטי, מעורר התנהגויות שניתן להקליט במצלמת וידאו במהירות גבוהה ונותחו כמותית. טכניקה זו יכולה להיות מותאמת להתנהגויות לימוד שהושרו על ידי הפעלה כל נוירון דג זברה. שילוב של גישה זו עם הפרעות גנטיות או תרופתיות יהיה דרך רבה עצמה כדי לחקור היווצרות מעגל ותפקודו.

Introduction

פיתוח שיטות optogenetic לקידום או עיכוב רגישות עצבית באורכי גל מוגדר של אור אפשר ללמוד את הפונקציה של אוכלוסיות שונות של תאי עצב במעגלים עצביים השולטים 1 התנהגות, 19, 21. טכניקה זו משמשת לעתים קרובות כדי להפעיל קבוצות של תאי עצב, אבל זה גם יכול לשמש כדי להפעיל נוירונים בודדים. זחלי דג זברה הם בעיקר נוחות לשיטות אלה מכיוון שהם שקופים, מערכת העצבים שלהם מתפתחת במהירות, ויצירת חיות טרנסגניות היא מהירה ושגרתי. עם זאת, מכשולים טכניים משמעותיים שיש להתגבר אמין כדי להשיג הפעלת תא עצב יחידה.

כדי לייעל את ההליך להפעלת optogenetic של נוירונים בודדים דג זברה, התמקדו בנוירונים חושיים. זחלי דג זברה לזהות מגוון של גירויים חושיים באמצעות שתי אוכלוסיות של תאי עצב: עצב trigeminal, אשר מעצבבות את הראש וRohon-זקן (הנוירונים) RB, אשר מעצבבים את שאר הגוף. כל trigeminal וRB נוירון מקרין האקסון היקפי שסניפים רבים בעור כדי לזהות גירויים והאקסון מרכזי המתחבר למעגלים עצביים במורד זרם. בעלי חיים להגיב למגע מוקדם ככל 21 שעות שלאחר ההפריה (hpf), המציין כי המעגלים החושיים קוהרנטית יצרו 5, 18. במהלך התפתחות רימות לפחות חלק סינפסה נוירונים trigeminal וRB על תא מאוטנר להפעיל תגובות בריחה קלסיות, אך מצטברת ראיות מצביעה על כך שיש כיתות מרובות של נוירונים חושיים עם דפוסים שונים של קישוריות שעשויה לעורר וריאציות על התנהגות הבריחה 2, 4, 10, 12, 14, 15, 16, 17. המוטיבציה שלנו לפיתוח בשיטה זו הייתה לאפיין את התפקוד ההתנהגותי של סוגים שונים של תאי עצב חושיים, אך גישה זו יכולה בעיקרון לשמש כדי לחקור את הפונקציה של תא עצב או כל אוכלוסייה כמעט של הנוירונים בlarval דג זברה.

דאגלס et al. תאר שיטה בעבר להפעלת Channelrhodopsin-2-לבטא נוירונים חושיים עם אור כחול, לעורר התנהגות בריחה 3. הגישה שלהם משמשת אלמנט משפר מגן isl1 לנהוג ביטוי של ChR2-EYFP בנוירונים חושיים. transgene זה, עם זאת, דווח להצגת פלואורסצנטי החלש יחסית, שדורש שיתוף הזרקה של כתב שני, כטב"מ :: GFP, כדי לאפשר הדמיה של תאים לבטא ChR2-EYFP. גישה זו הייתה בשימוש כדי לעורר תגובות התנהגות בין 24-48 hpf, אבל אף פעם לא יכולה לעורר תגובת העבר 72 hpf. וכך, בעוד שיטה זו פועלת ללימוד מעגלים עצביים בשלבים מוקדמים מאוד זחל (24-48 hpf), אינו מתאים לאפיון מעגלים עצביים ותגובות התנהגותיות בזחלים מבוגרים יותר, כאשר תגובות התנהגותיות מגוונות יותר ניכרות והמעגלים עצביים הם יותר בוגרים.

אנחנו בקשנולשפר את הרגישות של טכניקה זו כדי לאפיין את הפונקציה של אוכלוסיות של נוירונים RB זחל. כדי לשפר את הביטוי שהיינו משפר חושי ספציפי (CREST3) 20 לנהוג ביטוי של LexA-VP16 ומתיחה של רצפי מפעיל כסה (4xLexAop) 11 כדי להגביר את הביטוי של ערוץ האור המופעל מתויג fluorescently. תצורה זו מוגברת ביטוי של הערוץ, ומבטל את הצורך לביטוי שיתוף כתב שני ומאפשר לנו לקבוע באופן ישיר את השפע היחסי של הערוץ בכל נוירון. שימוש ברצף LexA / LexAop היה יתרון נוסף, מאפשר לנו להציג את transgene לתוך שורות כתב דג זברה שמשתמשות במערכת Gal4/UAS. ביטוי זמני של transgene זה הביא לרמות שונות של ביטוי, אך בדרך כלל היה חזק מספיק כדי להמחיש היא את גוף התא ותחזיות axonal של נוירונים בודדים על פני כמה ימים. כדי לייעל sensitivity להדליק השתמשנו באור הופעל ערוץ שף, גרסת channelrhodopsin מורכב דמיוני של channelopsin-1 (Chop1) וchannelopsin-2 (Chop2) עם אתר מוצלב בסליל לולאת EF 13. ערוץ זה מופעל באותו האורך הגל כChR2, אבל דורש עוצמת אור נמוכה יותר להפעלה, מה שהופך אותו רגיש יותר מערוצים אחרים בשימוש נפוץ, כולל ChR2. חלבון השף הותך לחלבון פלואורסצנטי האדום, tdTomato, ומאפשר לנו להקרין לביטוי חלבון ללא הפעלת הערוץ. כמקור אור, השתמש דיודה שאובה ליזר מצב מוצק (DPSS) מצמיד את כבל סיב אופטי, כדי לספק דופק מדויק ובעל עצמה של אור הכחול לאזור מסוים של הזחלים. זה מאפשר לנו למקד את אור ליזר על נוירונים בודדים, ומבטל את הצורך במציאת בעלי חיים מהונדסים נדירים המבטאים את הערוץ בתא עצב יחיד. שימוש בגישה זו, שהיינו מסוגל להפעיל נוירונים RB בודדים, להקליט תגובה התנהגותיתשל עם מצלמת וידאו במהירות גבוהה, ותמונת הנוירונים מופעלים ברזולוציה גבוהה עם מיקרוסקופיה confocal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הכן הבא מבעוד מועד.

1. הכן כבלים אופטיים

  1. יצירת יחידת אחסון לכבל האופטי על ידי המסת הצוואר המחודד של זכוכית פיפטה פסטר מעל מבער בונזן ליצור ~ 150 מעלות זווית.
  2. באמצעות חותך חוט או סכין גילוח, לחתוך בזהירות את הכבל האופטי לשני חלקים. כל תכשיט צריך להיות קצה אחד עם קצה חשוף FC 1 / מתאם למחשב אישי ו. אחסן חתיכה אחת ככבל מילואים.
  3. חשוף את הכבל האופטי עד לחיפוי על ידי הסרת מעייל הסיבים וסיבי חיזוק (איור 1 א ') מ5.0 סנטימטר של קצה חתוך של הכבל.
  4. הכנס כבל אופטי לתוך פיפטה פסטר המוכנה. ודא כבל יכול בקלות לעבור ולצאת מקצה פיפטה.
  5. עם כבל אופטי בולט מקצה פסטר פיפטה, לחתוך בזהירות ולהסיר חיפוי סיבים מרחבי סיבי זכוכית, ~ 2 מ"מ מקצה חתוך.
  6. באמצעות חותך יהלומי עט / זכוכית, ניק סיבי הזכוכית ולשבור off הסוף ליצור חתך / משטח נקי בסופו של הסיב (1B איור).
  7. לחזור בו כבל אופטי לתוך פיפטה פסטר לאחסון. חזור על פעולה (1.6) אם קצה הסיב אופטי מקבל סדוק או הפסקות בצורה לא אחיד.
  8. כבל אופטי עמדה בפיפטה פסטר באמצעות micromanipulator (התרשים 1C).

נהלים 2-8 מתארים שיטה להזרקת transgenes לעוברים בדרך החלימו על דג זברת ניסויים רבים. וריאציות על שיטה זו, כמו אלה המתוארים בסרטונים אחרים יופיטר 6, 7, 8, 9, 22 הן יעילות באותה מידה.

2. משוך מחטי הזרקה

  1. שימוש חולץ מחט, למשוך צינורות זכוכית ורוסיליקט לשתי מחטי הזרקה עם קצה מחודד בהדרגה. הגדרות חולץ תשתנינה. (בחולץ מחט מכשירי סאטר להשתמש בהגדרות: P = 500, חום = 720, משוך = 50, מהירות = 70 וזמן = 150). כל חולץ מחט הוא שונה, כדי לייעל את חולצם הגדרותpirically. למחטים מחודדות יותר, להגביר את החום ו / או משוך. למחטים פחות מחודדות, להגדיל את הזמן ו / או למשוך את הירידה.
  2. מחטים שומרות בכלי מאובטח (כלומר צלחת פטרי עם קלטת התגלגלה, את הצד דבק).

3. יוצק תבניות להזרקה

  1. ממסים 0.5 גרם agarose בעובר מ"ל 30 / מים כחולים, עד agarose נמס לחלוטין.
  2. יוצק לתוך החצי תחתון של צלחת פטרי.
  3. הנח עובש מלבני עם הרכבת בארות (איור 2) לagarose, נזהר להגביל היווצרות בועה סביב הבארות.
  4. אפשר agarose כדי לחזק.
  5. הסרת עובש ולמלא צלחת פטרי עם צבע כחול / מי עובר.
  6. אחסן זקוף, מלא במים נקיים, בטמפ 'חדר לאותו יום או שימוש ב 4 ° C לשימוש עתידי.

4. הפוך Mix-DNA פלסמיד לזריקות

  1. דלל DNA פלסמיד לריכוז של 50 ng / μl באדום פנול 1:10 בDDH 2 O. עבורדוגמה:
    1.0 מ"ל DNA פלסמיד (250 ng / ml)
    0.5 מ"ל פנול אדום
    3.5 מ"ל DDH 2 O
  2. תמהיל DNA יכול להישמר בטמפרטורת חדר, אם להשתמש מייד או מאוחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך מספר ימים.

5. הגדרת צמדי הזדווגות

זה צריך להיעשות בערב לפני שאתה מתכנן לעשות זריקות.

  1. מלא טנקי רבייה במי מערכת ומקום דג זכר ונקבה ביחד. אם זריקות לא ניתן לבצע בהקדם להדליק אורות במתקן, דגי זכר ונקבה נפרדים עם מחיצה.

6. היכון לזריקות (ניתן לעשות זאת בזמן המתנה לעוברים)

  1. הפעל לחץ מזרק אסדה. ודא שהמערכת מוגדרת לדופק. התחל עם סט משך הפעימה ל1.
  2. הפעל סתום האוויר ולהתאים ללחוץ מזרק ל~ 20 psi.
  3. שימוש ביתור בהגדלה הגבוהה ביותר, לשבור קצה המחט עם מלקחיים או פוקר כדי ליצור ~ פתיחת 2 מיקרומטר (איור 3, סרט 1).
  4. מלא מחטים בתערובת ה-DNA על ידי: 1. צבת המחט, הצד עד הקצה, לתערובת ה-DNA ומניח את המחט על ידי פעולת נימים למלא או 2. שימוש בטיפ ארוך להגיע לפיפטה 1-2 μl של דנ"א לערבב ישירות לתוך המחט.
  5. מקום מלא מחט במקום בטוח עד מוכן להזרקה.

7. לאסוף עוברים

  1. לאחר כיבוי אורות מתקן הפעילו, להסיר מחיצות (אם קיימים). לאסוף עוברים עם מסננת / מסננת קטנה ולהעבירם לצלחת פטרי עם כחול טריים / מי עובר.

8. הזרק עוברים בשלב התא 1-2

  1. העברת עוברים נקטפו לתבניות להזרקה באמצעות פיפטה פלסטיק.
  2. באמצעות מיקרוסקופ לנתח, דחף בעדינות לתוך עובריםבארות עם מלקחיים או פוקר בוטה (איור 4, סרט 2).
  3. הנח מחט טעונה אל micromanipulator ועמדה על עוברים.
  4. כיול נפח הזרקה באמצעות התאמת משך הפעימה במרווחי 1-צעד עד להשגת הנפח הרצוי (~ 1 NL). זה יכול להיות מכויל עם שקופית מיקרומטר, כמתואר בסרטונים קודמים יופיטר 8, 22, אבל לדיוק ניסוי זה אינו הכרחי, שכן מגוון רחב של נפחי הזרקה יגרום לביטוי הולם.
  5. הזרק ~ 1 nl DNA לערבב ישירות לתוך התא וחזור לכל העוברים. ה-DNA יכולה להיות גם מוזרקת לתוך החלמון, אבל זה נוטה להיות פחות יעיל (איור 5, סרט 3).
  6. הסר עוברים הזריקו מעובש באמצעות זרם עדין של כחול / מי עובר.
  7. החנות הזריקה עוברים ב28.5 מעלות צלזיוס בחושך.
  8. הסר מופרים, עוברים פגומים או מתים מעת לעת.
  9. פנק את העוברים wiה PTU בין 18-24 hpf כדי למנוע פיגמנטציה.

9. מסך לביטוי transgene

  1. 24-48 עוברי hpf ידני dechorionate באמצעות מלקחיים.
  2. הרדם זחלים באמצעות 0.02% tricaine.
  3. באמצעות מיקרוסקופ לנתח ניאון, לזהות זחלים עם RB או ביטוי נוירון trigeminal ולהעביר אותם לצלחת חדשה עם מים טריים PTU כחול / עובר. עוברים בעלי ביטוי דליל בתאים קלים לזיהוי הם אופטימליים, אבל נוירונים בודדים יהיו ממוקדים להפעלה עם כבל סיב אופטי כך מגוון רחב של צפיפות ביטוי מקובל.
  4. עוברי חנות ב28.5 מעלות צלזיוס בחושך עד שלב ניסיוני רצוי.

10. הר זחלים לניסויים בהתנהגות

  1. הפוך להמס agarose 1.5% נמוכים בDDH 2 O וחנות ב° C בלוק 42 חום כדי למנוע ממנה להתגבש.
  2. שימוש בזכוכית פסטר פיפטה, העברה אחד מהזחלים מראש הוקרנו לאמבטיהדואר של 1.5% להמס agarose הנמוך עם כמים כחולים / עובר קטנים ככל האפשר.
  3. העברת זחלים בירידה של agarose על צלחת פטרי קטנה.
  4. תחת מיקרוסקופ לנתח, עד הגבו זחל עמדה.
  5. כאשר agarose בסס, כרת את agarose עם סכין גילוח דק (# 11 אזמל), עוזב טריז של אגר סביב כל הזחל.
  6. בשני חתכים אלכסוניים בכל צד של החלמון, לדאוג שלא כינוי הזחל.
  7. מלא את האזור שמסביב לagarose עם עובר / מים כחולים.
  8. משוך agarose מהחדק והזנב של הזחל (איור 6).

11. הכן את המצלמה במהירות גבוהה ותוכנת הדמיה

  1. הר מצלמה במהירות גבוהה על ביתור היקף.
  2. חבר את המצלמה למחשב.
  3. הפעל את המחשב.
  4. הפעל את המצלמה במהירות גבוהה.
  5. וידאו / הדמית תוכנה פתוחה (אנו משתמשים בתוכנת הדמית AOS ונתאר נהלים לשימוש בו כאן, אבל הדמיה אחרתתוכנה היא באותה מידה מקובלת).
  6. התאם את גדרות מצלמה בהתאם (1000 מסגרות לשנייה (כלומר fps), חיץ הדק 50% או הגדרות מועדפות אחרות).
  7. להתחיל בהקלטה.

12. הפעל נוירונים בודדים באמצעות ליזר ננומטר 473

  1. צרף ממריץ, ליזר וכבלים אופטיים.
  2. הפעל ממריץ.
  3. הגדר ממריץ למקסימום של 5 וולט ומשך פעימה של 5 אלפיות שני.
  4. הפעל ליזר בהתאם להוראות היצרן.
  5. השתמש במיקרוסקופ לנתח כדי למקם את קצה הכבל האופטי בקרבת גוף תא של נוירון עם השף tdTomato ביטוי (איור 6).
  6. לספק דופק של אור הכחול להפעלת הנוירון חושי.
  7. התנהגות הקלטה באמצעות מצלמה מהירה ביותר שנקבעה ב500 או 1,000 מסגרות לשנייה.
  8. חזור על ניסוי כרצוי, מחכה 1 דקות בין כל הפעלה, כדי למנוע התרגלות. (אנו רושמים את המינימום של שלוש תשובות לכל נוירון).
  9. אלזחלי שחרור, לחטט בנפרד agarose עם מלקחיים, נזהר שלא לפגוע בבעלי החיים. חיה זו יכולה להיות מותרת להמשיך לפתח וההליך ניתן לחזור בשלב מבוגר לאפיין התפתחות של ההתנהגות. העובר יכול להיות גם שב ועלה להדמית confocal ברזולוציה גבוהה של התא הפעיל, כדי לקשר בין התנהגות עם מבנה תאי, כפי שיתואר להלן.
  10. העברת זחל לצלחת עם התרבות כחולה טריים / מי עובר. אנו משתמשים בצלחת 24 גם כדי לעקוב אחר זחלי פרט.

13. תמונת Neuron (הים) עם confocal מיקרוסקופ

  1. הרדם זחלים עם 0.02% tricaine.
  2. זחלי הר, צד גב למעלה, ב1.2% להמס agarose הנמוך או בעובש הגבה.
  3. הנוירונים תמונת השף tdTomato עם ליזר ננומטר 543 ומסנן ואובייקטיבי מתאים. אנו משתמשים 20x אובייקטיבי.
  4. הסר זחלים מagarose ולחזור לבודדים היטב עם כחול / מי עובר.
  5. חנות ב 28.5 מעלות צלזיוס בחושך לפוניתוח rther.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 1
איור 1. כבל אופטי להגדיר. (A) שכבות של כבל סיב אופטי. (ב) כבל Stripped סיבים אופטי בפסטר פיפטה. (ג) כבל סיב אופטי בפיפטה פסטר מוצב באמצעות micromanipulator.

איור 2
איור 2. תבנית הזרקת עובש.

איור 3
איור 3. (סרט 1). שוברי שהמחט.

איור 4
איור 4. (סרט 2). הצבת עוברים לתוך תבנית ההזרקה.

ther.within עמודים = "תמיד"> איור 5
איור 5. (סרט 3). הזרקת תערובת 1 nl DNA לעובר בשלב 1-תא.

איור 6
איור 6. תרשים של זחל רכוב דג זברה ונוירונים נציג המעורב בתגובת מגע הזחל. זחלי דג זברה היו רכוב אופן חלקי בשיעור של 1.5% להמס agarose הנמוך (מיוצג על ידי קווים מקווקווים מסביב החלק המקורי של הזחל). נוירון trigeminal (בראש) ונוירון Rohon-בירד (בתא המטען) מתוארים באדום. תאי מאוטנר מתוארים על ידי קווים מקווקווים בזחל. הכבל האופטי (לבן) מוצג ממוקם מעל גוף תא עצב RB.

oad/50184/50184fig7.jpg "alt =" איור 7 "fo: תוכן רוחב =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/50184/50184fig7highres.jpg "/>
איור 7. (סרט 4). הפעלה של נוירון RB expressingChEF אחת מעוררת תגובה התנהגותית. () ובכל מסגרות מתארות הפעלה של נוירון RB יחיד להביע שף tdTomato. נוירונים יחידים הופעלו כ5 אלפיות מדופק ליזר כחול 473 ננומטר באמצעות כבל 200 סיבים אופטי מיקרומטר. מתח נהיגת הליזר הכחול נקבע מקסימום של 5 וולט. ההתנהגות כתוצאה נרשמה ב 1000 פריימים לשנייה על ידי מצלמה במהירות גבוהה. (ב) מיקרוסקופיה confocal שמשה לתמונה נוירון RB הפעיל. חץ מראה אזור המגורה בסטילס התנהגות. (ג) תמונה מוגדלת של RB נוירון מצוין ב( B). סרגל קנה מידה, 100 מיקרומטר. (סרט 5 ו 6) אותו דג, (סרט 5) הפעלת trigeminal, (סרט 6) RB נוירון על הארכת חלמון.p_upload/50184/50184fig7large.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 8
איור 8. עיכוב של התנהגות בתנאים משתנים. עבור רוב הניסויים שהופעלנו תא עצב יחיד ב~ 35 זחלים hpf להביע שף tdTomato עם 5 אלפיות מדופק ליזר כחול 473 ננומטר מונע על ידי מקור כוח V 5 (איור 6). כדי להבין טוב יותר את הדינמיקה של הפעלת שף, אנחנו מגוונים פרמטרים כדי לקבוע את השפיע על התנהגות. () זמן גירוי אור (5 אלפיות לעומת 10 אלפיות שני) לא השפיע על חביון כאשר לכמת מהתחלה של דופק אור. (ב) ב~ 35 hpf, מתח הפוך משפיע זמן אחזור. מתח נמוך הביא לעלייה בהשהיה של תנועה. על הניסויים שלנו, השתמש במתח המרבי (5 V) permissible למכשיר הליזר שלנו, שהושר על התנהגויות סטריאוטיפיות אמין מרוב הנוירונים RB מאור מבטא-.

איור 9
איור 9. (סרט 7). הפעלה של שף tdTomato לבטא נוירונים RB בזחלי 60 hpf. (A) עדיין מסגרות המתארות הפעלה של נוירונים RB מבטאים שף tdTomato ידי 10 אלפיות שני מדופק ליזר כחול 473 ננומטר באמצעות כבל 200 סיבים אופטי מיקרומטר. ההתנהגות כתוצאה נרשמה ב 1000 פריימים לשנייה על ידי מצלמה במהירות גבוהה. (ב) מיקרוסקופיה confocal שמשה לתמונה הופעלה RB נוירון (הים). חץ מראה אזור המגורה בסטילס התנהגות. סרגל קנה מידה, 100 מיקרומטר.

איור 10 o: src = "/ files/ftp_upload/50184/50184fig10highres.jpg" />
איור 10. (סרט 8). הפעלה של שף tdTomato לבטא נוירונים RB ב4 זחלי DPF. סטילס מסגרות המתארות הפעלה של נוירונים RB מבטאים שף tdTomato ידי 20 אלפיות שני מדופק ליזר כחול 473 ננומטר באמצעות כבל 200 סיבים אופטי מיקרומטר. ההתנהגות כתוצאה נרשמה ב 1000 פריימים לשנייה עם מצלמה במהירות גבוהה.

סרט 1. לחץ כאן לצפייה בסרט.

סרט 2. לחץ כאן לצפייה בסרט.

סרט 3. לחץ כאן לצפייה בסרט.

סרט 4.:/ / Www.jove.com/files/ftp_upload/50184/50184movie4.mpg "target =" _blank ttp "> לחץ כאן לצפייה בסרט.

סרט 5. לחץ כאן לצפייה בסרט.

סרט 6. לחץ כאן לצפייה בסרט.

סרט 7. לחץ כאן לצפייה בסרט.

סרט 8. לחץ כאן לצפייה בסרט.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כבר תארנו את גישה להפעלת optogenetic של נוירונים בודדים בדג הזברה RB חי. השיטה שלנו מעסיקה transgenesis החולף להביע גרסה מתויגת fluorescently channelrhodopsin, 13 השף tdTomato, בנוירונים חושיים ספציפיים. גישה זו יכולה בקלות להיות מותאמת לשימוש באוכלוסיות תאים אחרות זחל דג זברה.

שימוש בגישה זו באופן עקבי עורר תגובות התנהגותיות מזחלי 34-48 hpf להביע שף tdTomato. שימוש 5 אלפית דופק של אור כחול ב5 וולט, היינו יכול להפעיל נוירונים RB יחידים (איור 7). לפי מיקום הסיבים האופטיים בנקודות שונות לאורך החיים, מצא כי היה צורך לכוון את האור הכחול ישירות בגוף תא כדי לעורר תגובה התנהגותית. הבזקי אור לא לעורר תגובה מזחלים שלא להביע את השף. בנוסף, הבזקי אור לאורך האקסון המרכזי או האקסון ההיקפי מעולם לא זכו לתגובה, דוארven בזחלים צעירים (מידע לא מוצג). מאפיין זה היה יתרון כי אנחנו בביטחון יכולים להפעיל נוירונים בודדים בבעלי חיים שבנוירונים מרובים היו שכותרתו, גם אם את האקסונים המרכזיים של נוירונים אחרים עברו ליד גוף התא של נוירון הממוקד (סרט 4-6).

כדי לבדוק את אמינותה של הגישה להערכת פרמטרי kinematic, קבע ההשהיה של תגובת הבריחה (הזמן מהפעלת אור לתגובה התנהגותית) בין 40 ל 48 hpf, פרמטר שידוע להיות סטריאוטיפי ביותר. כדי לקבוע אם משך גירוי האור משפיע על הפעלת תא עצב, אנו מוארים הנוירונים היעד ל5 או 10 אלפיות שני (איור 8 א). מאז ההשהיה התנהגותי בשני התנאים היו זהה כאשר מחושבים מההתחלה של דופק האור, הגיע למסקנה שמשך דופק האור לא השפיע השהיה של התנהגות. עם זאת, אנו לא מוצאים כי הפחתת המתח מוגבר החביון הדואר של התנהגות (8B איור). בשעת 5 V זאת, תגובות, רבות (9 מתוך 16 דגים) היו 20 ± 5 אלפיות שניות, בדומה למיסות דיווחו לתגובות מילוט טבעיות. לפיכך, הפעלת נוירונים עם 5 וולט מתקרבת הפעלה מקסימלי.

פרמטרים ללעורר תגובות התנהגותיות יעילים מהפעלת נוירונים בודדים RB המגוונים בזחלים מבוגרים. אנחנו עוררנו תגובות התנהגותיות בהצלחה מחיות עתיקות כמו 4 DPF, באופן משמעותי מאוחר ממה שדווח בעבר. עם זאת, בעוד שהפעלה של נוירונים RB יחידים עם דופק אור 5 אלפיות שני ב5 וולט עקבית הביאה לתגובה התנהגותית לפני 48 hpf, הפעלה של זחלים מבוגרים (> 60 hpf) לא היה עקבי. יותר קטניות (10-100 אלפיות) של אור היו לעתים קרובות יש צורך להפעיל את הנוירונים בזחלים מבוגרים (איור 9 ו 10, סרט 7 ו 8, בהתאמה). לכן, פרמטרי הפעלה ייתכן שיצטרכולהיות מותאם / מכויל מבוסס על שלב ניסיוני.

הגישה מתוארת כאן יכולה לשמש ליישומים פוטנציאליים רבים. אנחנו משתמשים בשיטה זו כדי להגדיר את התגובות התנהגותיות שהושרו על ידי תת סוגים שונים של תאי עצב, אבל זה גם יכול לשמש כדי לאפיין את ההתפתחות של תגובות התנהגותיות כמו החיה מתבגרת, את ההשפעות של תרופות או מוטאנטים התנהגות, או בשילוב עם פיזיולוגיה או הדמיה, כדי לאפיין מעגלי זרם מופעלים על ידי תא עצב שזוהה. לעומת זאת, ערוצים מעכבים, כגון halorhodopsin, יכולים לשמש כדי לעכב נוירונים ספציפיים בתוך רשת עצבית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרס כלכלי מתחרה.

Acknowledgements

אנו מודים פומי קובל טוד Thiele וHerwigBaier (קליפורניה / מקס פלנק) עצה על ניסויי התנהגות וDPSS הליזר הקים; Heesoo קים וקיארה Cerri מקורס נוירוביולוגיה MBL לסיוע בניסויי השף tdTomato; PetronellaKettunen (אוניברסיטת גטבורג ) לשיתוף פעולה ראשוני על ניסויי optogenetic; BaljitKhakh, אריק הדסון, מייק Baca וג'ון מיליגן (UCLA) לייעוץ טכני, ורוג'ר צ'היין (UCSD) לשף tdTomato לבנות. עבודה זו נתמכה על ידי פרס NRSA (5F31NS064817) לAMSP ומענק של NSF (RIG: 0819010) ל-AS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Glass Pasteur pipette Fisher 1367820B or equivalent (10-15 mm diameter)
200 μm optic fiber ThorLabs AFS200/220Y-CUSTOM Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030
50 μm optic fiber ThorLabs AFS50/125Y-CUSTOM Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030
Adjustable Stripping Tool ThorLabs AFS900 or Three-Hole Stripping Tool (FTS4)
Diamond Wedge scribe ThorLabs S90W
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter Instruments P-97 or equivalent
Borosilicate glass tubing with filament Sutter Instruments BF-100-78-10
Injection mold n/a n/a Figure 5
1.5 ml centrifuge tubes Any Any
Petri dish (100x15 mm) Any Any
Petri dish (60x15 mm) Any Any
Pressure injector ASI MPPI-3 or equivalent
Micromanipulator and metal stand Narashige M152 or equivalent
Disposable plastic pipettes Fisherbrand 13-711-7 or equivalent
Poker (Pin holder and Insect pin) Fine Science Tools, Inc. 26018-17 and 26000-70 or equivalent
Forceps Fine Science Tools, Inc. 11255-20 or equivalent
Microloader pipette tips Eppendorf 9300001007
28.5 °C incubator any any
42 °C heat block Any Any
Non-Sterile scalpel blades #11 Fine Scientific Tools, Inc. 10011-00 or equivalent
Dissecting scope Zeiss Stemi or equivalent
Fluorescent dissecting scope with standard filter Any any or equivalent
Confocal microscope Zeiss LSM 510 or 710 or equivalent with lasers for GFP and RFP, and 10x, 20x and 40x objectives
High speed camera AOS Technologies, Inc. X-PRI (130025-10) or equivalent
473 nm portable laser Crystal lasers CL-473-050 or higher power, with TTL option
S48 Stimulator Astro-Med, Inc. Grass Instrument division S48K or equivalent
FC/PC to FC/PC mating sleeve ThorLabs ADAFC1 May need for optic cable connection
Laser Safety Glasses ThorLabs LG10 or equivalent
24 culture plates Genesee 25-102 or equivalent
Single depression slides Fisher S175201 Or equivalent
Reagent
Instant ocean Aquatic Ecosystems IS50
Methylene blue Fisher S71325
Phenol red Sigma P4758
Agarose EMD 2125 or equivalent
Low Melt agarose Sigma A9045 or equivalent
PTU Sigma P7629
Tricaine Sigma A5040
blue/embryo water 10 L ddH2O
0.6 g Instant Ocean
6 drops methylene blue
phenol red (5 mg/ml in 0.2 M KCl)
100x PTU 0.150 g PTU
50 ml ddH2O
dissolve at 70 °C, shake often
aliquot and store at -20 °C
1x PTU 1 ml 100x PTU
99 ml blue/fish water
Tricaine stock solution 400 mg tricaine
97.9 ddH2O
~2.1 ml 1M Tris, pH9.0 adjust pH to ~7.0
store in 4 °C or -20 °C for long term storage

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, (42), 17968-17973 (2009).
  2. Burgess, H. A., Johnson, S. L., Granato, M. Unidirectional startle responses and disrupted left-right co-ordination of motor behaviors in robo3 mutant zebrafish. Genes Brain Behav. 8, (5), 500-511 (2009).
  3. Douglass, A. D., Kraves, S., Deisseroth, K., Schier, A. F., Engert, F. Escape behavior elicited by single, channelrhodopsin-2-evoked spikes in zebrafish somatosensory neurons. Curr. Biol. 18, (15), 1133-1137 (2008).
  4. Downes, G. B., Granato, M. Supraspinal input is dispensable to generate glycine-mediated locomotive behaviors in the zebrafish embryo. J. Neurobiol. 66, (5), 437-451 (2006).
  5. Drapeau, P., Saint-Amant, L., Buss, R. R., Chong, M., McDearmid, J. R., Brustein, E. Development of the locomotor network in zebrafish. Prog. Neurobiol. 68, (2), 85-111 (2002).
  6. Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish. J. Vis. Exp. (52), e2689 (2011).
  7. Graeden, E., Sive, H. Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (26), e1217 (2009).
  8. Kague, E., Weber, C., Fisher, S. Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences. J. Vis. Exp. (41), e1722 (2010).
  9. Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation. J. Vis. Exp. (29), e1394 (2009).
  10. Kohashi, T., Oda, Y. Initiation of Mauthner- or non-Mauthner-mediated fast escape evoked by different modes of sensory input. J. Neurosci. 28, (42), 10641-10653 (2008).
  11. Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat. Neurosci. 9, (5), 703-709 (2006).
  12. Liao, J. C., Haehnel, M. Physiology of afferent neurons in larval zebrafish provides a functional framework for lateral line somatotopy. J. Neurophysiol. 107, (10), 2615-2623 (2012).
  13. Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophys J. 96, (5), 1803-1814 (2009).
  14. Liu, K. S., Fetcho, J. R. Laser ablations reveal functional relationships of segmental hindbrain neurons in zebrafish. Neuron. 23, (2), 325-335 (1999).
  15. Liu, Y. C., Bailey, I., Hale, M. E. Alternative startle motor patterns and behaviors in the larval zebrafish (Danio rerio). J. Comp. Physiol. A. Neuroethol. Sens Neural. Behav. Physiol. 198, (1), 11-24 (2012).
  16. Palanca, A. M., Lee, S. L., Yee, L. E., Joe-Wong, C., Trinh, L. A., Hiroyasu, E., Husain, M., Fraser, S. E., Pellegrini, M., Sagasti, A. New transgenic reporters identify somatosensory neuron subtypes in larval zebrafish. Dev. Neurobiol. (2012).
  17. Pujol-Martí, J., Zecca, A., Baudoin, J. P., Faucherre, A., Asakawa, K., Kawakami, K., López-Schier, H. Neuronal birth order identifies a dimorphic sensorineural map. J. Neurosci. 32, (9), 2976-2987 (2012).
  18. Saint-Amant, L., Drapeau, P. Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo. J. Neurobiol. 37, (4), 622-632 (1998).
  19. Szobota, S., et al. Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor. Neuron. 54, (4), 535-545 (2007).
  20. Uemura, O., et al. Comparative functional genomics revealed conservation and diversification of three enhancers of the isl1 gene for motor and sensory neuron-specific expression. Dev. Biol. 278, (2), 587-606 (2005).
  21. Wyart, C., Del Bene, F., Warp, E., Scott, E. K., Trauner, D., Baier, H., Isacoff, E. Y. Optogenetic dissection of a behavioural module in the vertebrate spinal cord. Nature. 461, (7262), 407-410 (2009).
  22. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics