Optogenetic активации нейронов данио рерио Соматосенсорные использованием шеф-tdTomato

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Optogenetic методы сделали возможным изучение вклада отдельных нейронов в поведении. Мы описываем метод в личиночной рыбок данио для активации одного соматосенсорной нейронов, экспрессирующих channelrhodopsin вариант (шеф-повар) с диодной накачкой твердом состоянии (DPSS) лазерные и записи вызвала поведения с высокоскоростной видео-камеры.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Palanca, A. M., Sagasti, A. Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato. J. Vis. Exp. (71), e50184, doi:10.3791/50184 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Личинки данио появляются как модель для описания развития и функционирования простых нейронных цепей. Благодаря своим внешним оплодотворением, быстрое развитие, и полупрозрачность, рыбок данио особенно хорошо подходит для подхода optogenetic для расследования нейронные функции цепи. При таком подходе светочувствительных ионных каналов выражается в конкретных нейронов, что позволяет экспериментатору, чтобы активировать или подавлять их волю и таким образом оценить их вклад в конкретное поведение. Применение этих методов в личиночной рыбок данио концептуально проста, но требует оптимизации технических деталей. Здесь мы показываем, процедуры для выражения вариант channelrhodopsin в личиночной рыбок данио нейронов соматосенсорной, фото-активирующие отдельные клетки, и записи в результате поведения. Вводя некоторые изменения в ранее установленные методы, этот подход может быть использован для выявления поведенческих реакций от отдельных нейронов активирован допо крайней мере 4 дня после оплодотворения (DPF). В частности, мы создали трансгенных использованием нейронных соматосенсорной усилитель, CREST3, чтобы управлять выражением отмеченных channelrhodopsin вариант, шеф-tdTomato. Потребители инъекционных этого трансгена в 1-клеточной стадии эмбриона приводит к мозаике выражение в соматосенсорной нейронов, которые могут быть выявлены с конфокальной микроскопии. Освещающая определены клеток в этих животных с света от 473 нм лазер DPSS, направляется через волоконно-оптический кабель, вызывает поведение, которое может быть записано с помощью высокоскоростных видеокамер и количественный анализ. Эта техника может быть адаптирована к исследованию поведения, вызванного активацией нейронов любых рыбок данио. Отсюда и подход с генетическим или фармакологических возмущений будет мощный способ исследовать формирование схемы и функции.

Introduction

Развитие optogenetic методы поощрения или подавления возбудимости нейронов с определенными длинами волн света дало возможность изучить функции различных популяций нейронов в нейронных цепях управления поведением 1, 19, 21. Этот метод часто используется для активации группы нейронов, но он также может быть использован для активации отдельных нейронов. Данио рерио Личинки особенно актуален в этих методах, так как они являются прозрачными, их нервная система развивается быстро, и создание трансгенных животных очень быстро и рутины. Тем не менее, значительные технические препятствия необходимо преодолеть, чтобы надежно достижения одной активации нейрона.

Для оптимизации процедуры optogenetic активации отдельных нейронов у рыбок данио, мы сосредоточились на соматосенсорной нейронов. Личинки данио рерио обнаружить различные соматосенсорной раздражители с помощью двух популяций нейронов: нейроны тройничного нерва, которые иннервируют голову, и Rohon-Борода (RB) нейроны, которые иннервируют остальные части тела. Каждый тройничного и RB нейронов проекты периферических аксонов, что ветви широко в кожу для обнаружения стимулов и центрального аксона, который подключается к вниз по течению нейронных цепей. Животные реагировать на прикосновение уже 21 часов после оплодотворения (HPF), указывая, что когерентное соматосенсорной схемы сформировали 5, 18. Во время развития личинок по крайней мере некоторые тройничного и RB нейроны синапсов на ячейку Mauthner для активации классического ответы побега, но накапливаются данные свидетельствуют о том, что существует несколько классов нейронов соматосенсорной с различными формами соединения, которые могут вызвать изменения на побег поведения 2, 4, 10, 12, 14, 15, 16, 17. Наша мотивация для развития этого метода было охарактеризовать поведенческие функции различных классов нейронов соматосенсорной, но такой подход в принципе может быть использован для изучения функций практически любой нейрон или популяции нейронов в ЛарВал рыбок данио.

Дуглас и соавт. Ранее описанного метода для активации Channelrhodopsin-2-выражения нейронов соматосенсорной с голубым светом, вызывая выход поведения 3. Их подход, используемый элемент усилителя от Isl1 генов для управления экспрессией ChR2-EYFP в соматосенсорной нейронов. Это трансгенов, однако, как сообщается, отображение относительно слабой флуоресценцией, требующих совместного введения второго докладчика, UAS :: GFP, чтобы обеспечить визуализацию клеток, экспрессирующих ChR2-EYFP. Этот подход был использован, чтобы вызвать поведение ответов между 24-48 HPF, но никогда не могли вызвать отклик последние 72 HPF. Таким образом, хотя этот метод работает для изучения нервной системы на ранних личиночных стадиях (24-48 HPF), оно является недостаточным для характеристики нейронных цепей и поведенческие реакции у пожилых личинки, когда более разнообразными поведенческими реакциями являются очевидными и нейронные цепи являются более зрелыми.

Мы стремилисьповысить чувствительность этого метода для того, чтобы охарактеризовать функции субпопуляций личинок нейронов РБ. Для улучшения выражения мы использовали соматосенсорной конкретного усилителя (CREST3) 20 для управления экспрессией LexA-VP16 и участок LexA оператор последовательности (4xLexAop) 11 для усиления экспрессии флуоресцентно отмеченных свет активированного канала. Эта конфигурация усиливается экспрессия каналов, устраняя необходимость для совместного выражения второго репортера и позволяющие непосредственно определить относительное содержание канала в каждый нейрон. Использование LexA / LexAop последовательность была дополнительным преимуществом, что позволяет нам ввести трансгенных данио рерио в линии репортеру, что использовать Gal4/UAS системы. Переходный выражение этого трансгена в результате различных уровней выражение, но, как правило, достаточно прочной, чтобы визуализировать как тело клетки и аксональной проекции отдельных нейронов в течение нескольких дней. Для оптимизации чувствительностиность на свет мы использовали свет активированного канала шеф-повара, вариант channelrhodopsin, состоящий из химеры channelopsin-1 (Chop1) и channelopsin-2 (Chop2) с кроссовером сайте спирали цикл EF 13. Этот канал активируется при той же длине волны, как ChR2, но требует низкой интенсивности света для активации, что делает его более чувствительным, чем другие широко используемые каналы, в том числе ChR2. Белка повар был слит с красным флуоресцентным белком, tdTomato, позволяя нам для выявления экспрессии белка без активации канала. В качестве источника света, мы использовали диодной накачкой твердотельным (DPSS) лазерный связан с волоконно-оптическим кабелем для доставки точным, мощным импульсом синего света на конкретный регион личинок. Это позволило нам сосредоточиться лазерного излучения на отдельных нейронов, устраняя необходимость в поиске редких трансгенных животных, выразив канал в одном нейроне. Используя этот подход, мы смогли активировать отдельных нейронов РБ, записывать поведенческая реакцияс, высокоскоростные видеокамеры, изображения и активированные нейроны в высоком разрешении с конфокальной микроскопии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Подготовьте следующие раньше времени.

1. Подготовка оптического кабеля

  1. Создайте запоминающее устройство для оптического кабеля путем плавления конической шейке стекло пипетки Пастера над горелкой Бунзена создать ~ 150 °.
  2. С помощью резака проволоки или лезвие бритвы, аккуратно вырезать оптического кабеля на две части. Каждая часть должна иметь один конец с FC / PC адаптер и один открытый конец. Хранить одну часть в качестве кабеля резерва.
  3. Снимите оптический кабель до оболочке путем удаления оболочки волокна и укрепления волокон (рис. 1А) от 5,0 см срез кабеля.
  4. Вставьте оптический кабель в подготовленную пипетки Пастера. Убедитесь, что кабель может легко перемещаться в и из кончика пипетки.
  5. С оптическим кабелем выступающие из кончика пипетки Пастера, аккуратно вырезать и удалить оболочки волокна по всему стекловолокна, ~ 2 мм от среза.
  6. Использование алмазов ручка / стеклорез, ник стекловолокна и разбить оFF конца, чтобы создать чистый срез / поверхности на конце волокна (рис. 1б).
  7. Уберите оптический кабель в пипетку Пастера для хранения. Повторите шаг (1,6), если кончик оптического волокна получает сколы или перерывов неравномерно.
  8. Позиция оптического кабеля в пипетку Пастера с помощью микроманипулятора (рис. 1С).

Процедуры 2-8 описывают метод для потребителей инъекционных трансгенов в эмбрионы вообще применимо ко многим экспериментах данио рерио. Вариации на тему этого метода, как описано в других Юпитера видео 6, 7, 8, 9, 22 одинаково эффективны.

2. Потяните иглы для инъекций

  1. С помощью иглы съемник, извлеките из боросиликатного стекла трубки на две иглы инъекции постепенно снижалась чаевых. Съемник параметры будут меняться. (На игле съемник Sutter Instruments мы используем настройки: P = 500, Heat = 720, Pull = 50, Скорость = 70, а Время = 150). Каждая игла съемник разные, поэтому оптимизация параметров съемника EMэмпирически. Для получения дополнительной конической иглы, увеличить тепло-и / или тянуть. Для менее конической иглы, увеличить время и / или уменьшения тяги.
  2. Хранить иглы в безопасном контейнере (например, чашку Петри с проката лента, клей из сторон).

3. Залить Пресс-формы

  1. Растопите 0,5 г агарозы в 30 эмбрион мл / голубой водой, пока агарозном полного растворения.
  2. Налейте в нижней части чашки Петри.
  3. Поместите прямоугольной формы с монтажной скважин (рис. 2) в агарозы, будьте осторожны, чтобы ограничить образование пузырьков вокруг колодцев.
  4. Разрешить агарозном чтобы затвердеть.
  5. Удалить плесень и заполнить чашку Петри с голубыми / эмбрионов воды.
  6. Хранить в вертикальном, наполненный чистой водой, при комнатной температуре в течение же дня использования или при 4 ° C для дальнейшего использования.

4. Сделать плазмиды Mix ДНК для инъекций

  1. Развести плазмидной ДНК в концентрации 50 нг / мкл с 1:10 фенола красного в DDH 2 O. ДляНапример:
    1,0 мл плазмидной ДНК (250 нг / мл)
    0,5 мл фенол красный
    3,5 мл DDH 2 O
  2. ДНК смесь можно хранить при комнатной температуре, если использовать сразу или хранить при температуре 4 ° С в течение нескольких дней.

5. Настройка спаривания пар

Это должно быть сделано накануне вечером вы планируете делать инъекции.

  1. Заполните разведения цистерны с водой системы и место мужчины и женщины рыбы вместе. Если инъекций не может быть выполнена, как только подсветка включается на объекте, отдельные мужские и женские рыбы с разделителем.

6. Подготовка к инъекции (это можно делать во время ожидания эмбрионов)

  1. Включите давление инжектора установки. Убедитесь, что система установлена ​​на импульс. Начните с множеством длительность импульса до 1.
  2. Включите воздушный клапан иОтрегулируйте давление инжектора ~ 20 фунтов на квадратный дюйм.
  3. Использование рассекает сферу при максимальном увеличении, сломать кончик иглы с помощью пинцета или покер, чтобы создать ~ 2 мкм открытия (рис. 3, Фильм 1).
  4. Заполните иглы с ДНК смесь: 1. Размещение игла, кончиком вверх, в ДНК смесь и дать иглу заполнить под действием капиллярных сил или 2. Использование долгосрочных достичь наконечник пипетки 1-2 мкл ДНК смешивают непосредственно в иглу.
  5. Место заполнено иглу в безопасное место до момента инъекции.

7. Сбор эмбрионов

  1. После объекте огни включены, удалить делителей (если применимо). Сбор эмбрионов с фильтром / мелкое сито и передавать их в чашку Петри со свежей голубой / эмбрионов воды.

8. Inject эмбрионов на 1-2 клеточной стадии

  1. Передача собранных эмбрионов для литья под давлением с помощью пластиковой пипетки.
  2. Использование рассекает микроскопом, осторожно надавите эмбрионов вскважин с щипцами или тупой покер (рис. 4, фильм 2).
  3. Поместите загруженный иглу в микроманипулятора и положение над эмбрионами.
  4. Калибровка Объем впрыска путем изменения длительности импульсов в 1-с шагом, пока не достигнете желаемого объема (~ 1 п). Это может быть откалиброван с помощью микрометра слайд, как описано в предыдущем видео Юпитер 8, 22, но для этого эксперимента точность не нужна, так как широкий спектр инъекции объемах приведет к адекватным выражением.
  5. Inject ~ 1 п ДНК смешивают непосредственно в клетку и повторить для всех эмбрионов. ДНК может быть также введен в желтке, но это, как правило, менее эффективны (рис. 5, фильм 3).
  6. Удалить впрыском эмбрионов от плесени использованием нежного потока синий / эмбрионов воды.
  7. Магазин вводят эмбрионы на 28,5 ° C в темноте.
  8. Удалить неоплодотворенной, поврежденные или мертвые эмбрионы периодически.
  9. Лечить эмбрионов Wiго ПТУ между 18-24 HPF, чтобы предотвратить пигментацию.

9. Экран для экспрессии трансгенов

  1. Вручную dechorionate 24-48 HPF эмбрионов с помощью пинцета.
  2. Anesthetize личинки использованием 0,02% Tricaine.
  3. С помощью флуоресцентного микроскопа рассекает, выявления личинок с РБ или тройничного выражение нейрона и перенести их в новое блюдо со свежим ПТУ синий / эмбрионов воды. Эмбрионы с редкими выражение в легко идентифицировать клетки являются оптимальным, но отдельные нейроны будут направлены на активацию с волоконно-оптическим кабелем таким широким спектром выражения плотности является приемлемым.
  4. Магазин эмбрионов при 28,5 ° C в темноте, пока желаемый экспериментальной стадии.

10. Установите Личинки поведения Эксперименты

  1. Сделайте 1,5% с низкой температурой плавления агарозы в DDH 2 O и хранят в 42 ° C тепла блока, чтобы предотвратить затвердевание.
  2. Использование стеклянной пипетки Пастера, передача одного из предварительно отобранных личинок в ваннойе 1,5% с низкой температурой плавления агарозы с минимальным синим / эмбрионов воды, сколько возможно.
  3. Передача личинок в капле агарозы на небольшой чашке Петри.
  4. В рассекает микроскопом, положение личинки спинной вверх.
  5. Когда агарозном укрепил, срезать агарозы с тонким лезвием (# 11 скальпель), в результате чего клин агар по всему личинки.
  6. Сделайте две диагональные надрезы на каждой стороне желтка, возьмите аккуратно, не повреждая личинку.
  7. Заполните окрестностях агарозы с эмбрионом / голубой водой.
  8. Потяните агарозном от туловища и хвоста личинки (рис. 6).

11. Подготовка Высокоскоростные камеры и обработки изображений

  1. Гора высокая скорость камеры на рассекающих области.
  2. Подключите фотокамеру к компьютеру.
  3. Включите компьютер.
  4. Включите высокоскоростные камеры.
  5. Открыть видео / изображений программное обеспечение (Мы используем AOS обработки изображений и будет описывать процедуры для использования его здесь, но и других изображенийПрограмма одинаково приемлемы).
  6. Настройка параметров камеры соответственно (то есть 1000 кадров в секунду (FPS), 50% триггером буфера или других параметров).
  7. Начать запись.

12. Активировать отдельных нейронов с помощью 473 нм лазерный

  1. Прикрепить стимулятор, лазерных и оптических кабелей.
  2. Включите стимулятор.
  3. Установить стимулятор максимум на 5 вольт и длительностью импульса 5 мс.
  4. Включите лазер в соответствии с инструкциями производителя.
  5. Используйте рассекает микроскопом, чтобы позиционировать кончик оптического кабеля вблизи тела клетки нейрона с шеф-tdTomato выражении (рис. 6).
  6. Доставка импульса синего света для активации сенсорного нейрона.
  7. Запись поведение с помощью высокоскоростной камеры установлены на 500 или 1000 кадров в секунду.
  8. Повторите эксперимент по желанию, ожидая, 1 мин между каждой активации, чтобы избежать привыкания. (Мы записываем как минимум три ответа для каждого нейрона).
  9. Квыпуск личинок, подглядывать друг от друга агарозном щипцами, стараясь не травмировать животное. Это животное может быть допущен к дальнейшему развитию и процедура может быть повторена в более старшем этапе характеризуют развитие поведения. Эмбриона может быть также перемонтирована высокого разрешения конфокальной микроскопии из клеток, активированных соотносить поведение с ячеистой структурой, как описано ниже.
  10. Передача личинки к культуре пластины с свежая синяя / эмбрионов воды. Мы используем 24-луночный планшет для отслеживания отдельных личинок.

13. Изображение Нейрон (ы) с конфокальной микроскопии

  1. Anesthetize личинок с 0,02% Tricaine.
  2. Гора личинки, спинной стороной вверх, в 1,2% с низкой температурой плавления агарозы или в спинном формы.
  3. Изображение шеф-tdTomato нейронов с лазерным 543 нм и соответствующий фильтр и объективным. Мы используем 20x цели.
  4. Удалить личинок из агарозы и вернуться в отдельных скважин с голубыми / эмбрионов воды.
  5. Хранить при температуре 28,5 ° C в темноте фуrther анализа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Рисунок 1
Рисунок 1. Оптический кабель создана. (A) слоев волоконно-оптического кабеля. (B) Stripped волоконно-оптического кабеля в пипетку Пастера. (C) Волоконно-оптический кабель в пипетку Пастера позиционируется с помощью микроманипулятора.

Рисунок 2
Рисунок 2. Шаблон инъекции плесень.

Рисунок 3
Рисунок 3. (Фильм 1). Нарушение иглы.

Рисунок 4
Рисунок 4. (Фильм 2). Размещение эмбрионов в литья под давлением.

ther.within-страница = "Всегда"> Рисунок 5
Рисунок 5. (Фильм 3). Инъекционное 1 NL ДНК смесь в 1-клетки эмбриональной стадии.

Рисунок 6
Рисунок 6. Схема установлен личинки данио рерио и представитель нейронов, участвующих в личиночной ответ ощупь. Данио рерио Личинки были частично установлены в 1,5% с низкой температурой плавления агарозы (пунктирными линиями окружающих ростральной части личинки). Тройничного нейрона (в голове) и Rohon-Борода нейрона (в багажнике) изображены красным цветом. Mauthner клетки обведены пунктирными линиями на личинку. Оптический кабель (белый) показано, располагается над телом клетки RB нейронов.

oad/50184/50184fig7.jpg "ALT =" Рисунок 7 "FO: содержание ширина =" 5 дюймов "FO: SRC =" / files/ftp_upload/50184/50184fig7highres.jpg "/>
Рисунок 7. (Фильм 4). Активация одного нейрона РБ expressingChEF вызывает поведенческую реакцию. (A) Кадры изображающие активации одного нейрона РБ выразил шеф-tdTomato. Одноместный нейроны активируются 5 мс импульса от 473 нм голубой лазер через 200 мкм волоконно-оптического кабеля. Напряжение вождения синий лазер был установлен на уровне максимум 5 вольт. В результате поведение было записано в 1000 кадров в секунду с помощью высокоскоростных камер. (B) конфокальной микроскопии был использован для изображения активированных нейронов РБ. Стрелка показывает региона стимулировали в поведении кадры. (C) увеличенное изображение RB нейронов указано в (B). Шкала бар, 100 мкм. (Фильм 5 и 6) той же рыбы, (фильм 5) тройничного активации (Фильм 6) RB нейронов над расширением желток.p_upload/50184/50184fig7large.jpg "целевых =" _blank "> Щелкните здесь для просмотра больших фигура.

Рисунок 8
Рисунок 8. Задержка поведения при различных условиях. Для большинства экспериментов мы активировали один нейрон в ~ 35 HPF личинки выразил шеф-tdTomato с 5 мс импульса от 473 нм голубой лазер приводится в движение 5 В источника питания (рис. 6). Чтобы лучше понять динамику активации шеф-повар, мы варьировали параметры для определения их влияния на поведение. (A) продолжительностью световой стимуляции (5 мс против 10 мс) не влияет на задержку при количественном от начала импульса света. (B) на ~ 35 HPF, напряжение обратно влияет на задержку. Нижняя напряжения привело к увеличению задержки движения. Для наших экспериментов мы использовали максимальное напряжение (5 В) PErmissible для нашего лазерного аппарата, что вызвало надежно стереотипные формы поведения Наиболее ярко-экспрессирующих нейронов РБ.

Рисунок 9
Рисунок 9. (Фильм 7). Активация шеф-tdTomato выражения RB нейроны в 60 личинок HPF. (A) Кадры изображающие активации нейронов РБ выразил шеф-tdTomato по 10 мс импульс от 473 нм голубой лазер через 200 мкм волоконно-оптического кабеля. В результате поведение было записано в 1000 кадров в секунду с помощью высокоскоростных камер. (B) конфокальной микроскопии был использован для изображения активированного RB нейронов (ы). Стрелка показывает региона стимулировали в поведении кадры. Шкала бар, 100 мкм.

Рисунок 10 о: SRC = "/ files/ftp_upload/50184/50184fig10highres.jpg" />
Рисунок 10. (Фильм 8). Активация шеф-tdTomato выражения RB нейронов в 4 DPF личинок. Кадры изображающие активации нейронов РБ выразил шеф-tdTomato по 20 мс импульс от 473 нм голубой лазер через 200 мкм волоконно-оптического кабеля. В результате поведение было записано в 1000 кадров в секунду с высокоскоростной камерой.

Фильм 1. Щелкните здесь для просмотра фильмов .

Фильм 2. Щелкните здесь для просмотра фильмов .

Фильм 3. Щелкните здесь для просмотра фильмов .

Фильм 4.ТТП :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/50184/50184movie4.mpg "целевых =" _blank "> Щелкните здесь для просмотра фильмов.

Фильм 5. Щелкните здесь для просмотра фильмов .

Фильм 6. Щелкните здесь для просмотра фильмов .

Фильм 7. Щелкните здесь для просмотра фильмов .

Фильм 8. Щелкните здесь для просмотра фильмов .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы описали подход к optogenetic активации отдельных нейронов РБ в живых рыбок данио. Наш метод использует переходный трансгенез, чтобы выразить флуоресцентно отмеченных channelrhodopsin вариант, шеф-tdTomato 13, в определенных нейронах соматосенсорной. Такой подход может быть легко адаптирована для использования в других личиночных популяций клеток рыбок данио.

Используя этот подход, мы последовательно вызвало поведенческие реакции от 34-48 HPF личинки выразил шеф-tdTomato. Использование 5 мс импульс синим светом при 5 В, мы смогли активировать отдельных нейронов RB (рис. 7). По позиционирования оптического волокна в различных точках вдоль животных, мы обнаружили, что необходимо стремиться к синим светом прямо в тело клетки, чтобы выявить поведенческие реакции. Световые импульсы не вызывают ответа от личинки, которые не выражают шеф-повара. Кроме того, световые импульсы вдоль центральных аксонов или периферических аксонов никогда не вызывала отклик, электроннойВен у молодых личинок (данные не представлены). Это свойство было выгодно, так как мы могли уверенно активации отдельных нейронов у животных, в которых несколько нейронов были помечены, даже если центральный аксонов других нейронов прошел вблизи тела клетки целевого нейрона (фильм 4-6).

Для проверки надежности этого подхода для оценки кинематических параметров, мы определили задержку выхода реакции (время от светло активации поведенческой реакции) между 40 и 48 HPF, параметр, который, как известно, весьма стереотипно. Чтобы определить, если продолжительность светового раздражителя влияет активации нейрона, мы освещении целевых нейронов в течение 5 или 10 мс (рис. 8А). С поведенческой задержки в обоих случаях были одинаковыми при расчете с самого начала светового импульса, мы пришли к выводу, что продолжительность светового импульса не влияет задержка поведения. Однако, мы обнаружили, что снижение напряжения увеличился йэлектронной задержкой поведения (рис. 8Б). В 5 В, однако, многие ответы (9 из 16 рыб) составляли 20 ± 5 мс, похожие на задержки сообщалось естественная реакция бегства. Таким образом, активация нейронов с 5 V приближается к максимальной активации.

Параметры для эффективного выявления поведенческих реакций с активацией отдельных нейронов РБ варьироваться в старых личинок. Мы успешно вызвало поведенческие реакции животных стара, как 4 DPF, существенно позже, чем сообщалось ранее. Однако, несмотря на активацию отдельных нейронов РБ с 5 мс импульса света при 5 В последовательно привели к поведенческой реакции до 48 HPF, активизация личинок старшего (> 60 HPF) не был столь последователен. Более импульсов (10-100 мс) света часто необходимо активировать нейроны в старших личинок (рис. 9 и 10, Movie 7 и 8, соответственно). Таким образом, активация параметров может потребоватьсябыть оптимизирована / калиброванного основана на экспериментальной стадии.

Подход, который мы описываем здесь могут быть использованы для многих потенциальных применений. Мы используем этот метод, чтобы определить поведенческие реакции вызваны различными подтипами нейронов, но она также может быть использована для характеристики развития поведенческих реакций, как животное созревает, эффекты лекарств или мутанты на поведение, или, в сочетании с физиологией или изображений, чтобы охарактеризовать вниз по течению схемы активируется определены нейрона. Наоборот, ингибирующих каналы, такие как halorhodopsin, могут быть использованы для подавления конкретных нейронов в нейронной сети.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgements

Мы благодарим Фуми Кубо, Tod Тиле и HerwigBaier (UCSF / Max Planck Institute) за советы по поведению экспериментов и DPSS лазерных созданы; Heesoo Ким и Кьяра Cerri от MBL курс нейробиологии за помощь в шеф-tdTomato экспериментов; PetronellaKettunen (университет Гетеборга ) для начальных сотрудничество по optogenetic экспериментов; BaljitKhakh, Эрик Хадсон, Майк Бака и Джон Миллиган (UCLA) за технической консультацией, и Роджер Цзянь (UCSD) для шеф-tdTomato построить. Эта работа была поддержана АЯРБ (5F31NS064817) награду AMSP и гранта NSF (RIG: 0819010) на AS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Glass Pasteur pipette Fisher 1367820B or equivalent (10-15 mm diameter)
200 μm optic fiber ThorLabs AFS200/220Y-CUSTOM Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030
50 μm optic fiber ThorLabs AFS50/125Y-CUSTOM Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030
Adjustable Stripping Tool ThorLabs AFS900 or Three-Hole Stripping Tool (FTS4)
Diamond Wedge scribe ThorLabs S90W
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter Instruments P-97 or equivalent
Borosilicate glass tubing with filament Sutter Instruments BF-100-78-10
Injection mold n/a n/a Figure 5
1.5 ml centrifuge tubes Any Any
Petri dish (100x15 mm) Any Any
Petri dish (60x15 mm) Any Any
Pressure injector ASI MPPI-3 or equivalent
Micromanipulator and metal stand Narashige M152 or equivalent
Disposable plastic pipettes Fisherbrand 13-711-7 or equivalent
Poker (Pin holder and Insect pin) Fine Science Tools, Inc. 26018-17 and 26000-70 or equivalent
Forceps Fine Science Tools, Inc. 11255-20 or equivalent
Microloader pipette tips Eppendorf 9300001007
28.5 °C incubator any any
42 °C heat block Any Any
Non-Sterile scalpel blades #11 Fine Scientific Tools, Inc. 10011-00 or equivalent
Dissecting scope Zeiss Stemi or equivalent
Fluorescent dissecting scope with standard filter Any any or equivalent
Confocal microscope Zeiss LSM 510 or 710 or equivalent with lasers for GFP and RFP, and 10x, 20x and 40x objectives
High speed camera AOS Technologies, Inc. X-PRI (130025-10) or equivalent
473 nm portable laser Crystal lasers CL-473-050 or higher power, with TTL option
S48 Stimulator Astro-Med, Inc. Grass Instrument division S48K or equivalent
FC/PC to FC/PC mating sleeve ThorLabs ADAFC1 May need for optic cable connection
Laser Safety Glasses ThorLabs LG10 or equivalent
24 culture plates Genesee 25-102 or equivalent
Single depression slides Fisher S175201 Or equivalent
Reagent
Instant ocean Aquatic Ecosystems IS50
Methylene blue Fisher S71325
Phenol red Sigma P4758
Agarose EMD 2125 or equivalent
Low Melt agarose Sigma A9045 or equivalent
PTU Sigma P7629
Tricaine Sigma A5040
blue/embryo water 10 L ddH2O
0.6 g Instant Ocean
6 drops methylene blue
phenol red (5 mg/ml in 0.2 M KCl)
100x PTU 0.150 g PTU
50 ml ddH2O
dissolve at 70 °C, shake often
aliquot and store at -20 °C
1x PTU 1 ml 100x PTU
99 ml blue/fish water
Tricaine stock solution 400 mg tricaine
97.9 ddH2O
~2.1 ml 1M Tris, pH9.0 adjust pH to ~7.0
store in 4 °C or -20 °C for long term storage

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, (42), 17968-17973 (2009).
  2. Burgess, H. A., Johnson, S. L., Granato, M. Unidirectional startle responses and disrupted left-right co-ordination of motor behaviors in robo3 mutant zebrafish. Genes Brain Behav. 8, (5), 500-511 (2009).
  3. Douglass, A. D., Kraves, S., Deisseroth, K., Schier, A. F., Engert, F. Escape behavior elicited by single, channelrhodopsin-2-evoked spikes in zebrafish somatosensory neurons. Curr. Biol. 18, (15), 1133-1137 (2008).
  4. Downes, G. B., Granato, M. Supraspinal input is dispensable to generate glycine-mediated locomotive behaviors in the zebrafish embryo. J. Neurobiol. 66, (5), 437-451 (2006).
  5. Drapeau, P., Saint-Amant, L., Buss, R. R., Chong, M., McDearmid, J. R., Brustein, E. Development of the locomotor network in zebrafish. Prog. Neurobiol. 68, (2), 85-111 (2002).
  6. Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish. J. Vis. Exp. (52), e2689 (2011).
  7. Graeden, E., Sive, H. Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (26), e1217 (2009).
  8. Kague, E., Weber, C., Fisher, S. Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences. J. Vis. Exp. (41), e1722 (2010).
  9. Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation. J. Vis. Exp. (29), e1394 (2009).
  10. Kohashi, T., Oda, Y. Initiation of Mauthner- or non-Mauthner-mediated fast escape evoked by different modes of sensory input. J. Neurosci. 28, (42), 10641-10653 (2008).
  11. Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat. Neurosci. 9, (5), 703-709 (2006).
  12. Liao, J. C., Haehnel, M. Physiology of afferent neurons in larval zebrafish provides a functional framework for lateral line somatotopy. J. Neurophysiol. 107, (10), 2615-2623 (2012).
  13. Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophys J. 96, (5), 1803-1814 (2009).
  14. Liu, K. S., Fetcho, J. R. Laser ablations reveal functional relationships of segmental hindbrain neurons in zebrafish. Neuron. 23, (2), 325-335 (1999).
  15. Liu, Y. C., Bailey, I., Hale, M. E. Alternative startle motor patterns and behaviors in the larval zebrafish (Danio rerio). J. Comp. Physiol. A. Neuroethol. Sens Neural. Behav. Physiol. 198, (1), 11-24 (2012).
  16. Palanca, A. M., Lee, S. L., Yee, L. E., Joe-Wong, C., Trinh, L. A., Hiroyasu, E., Husain, M., Fraser, S. E., Pellegrini, M., Sagasti, A. New transgenic reporters identify somatosensory neuron subtypes in larval zebrafish. Dev. Neurobiol. (2012).
  17. Pujol-Martí, J., Zecca, A., Baudoin, J. P., Faucherre, A., Asakawa, K., Kawakami, K., López-Schier, H. Neuronal birth order identifies a dimorphic sensorineural map. J. Neurosci. 32, (9), 2976-2987 (2012).
  18. Saint-Amant, L., Drapeau, P. Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo. J. Neurobiol. 37, (4), 622-632 (1998).
  19. Szobota, S., et al. Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor. Neuron. 54, (4), 535-545 (2007).
  20. Uemura, O., et al. Comparative functional genomics revealed conservation and diversification of three enhancers of the isl1 gene for motor and sensory neuron-specific expression. Dev. Biol. 278, (2), 587-606 (2005).
  21. Wyart, C., Del Bene, F., Warp, E., Scott, E. K., Trauner, D., Baier, H., Isacoff, E. Y. Optogenetic dissection of a behavioural module in the vertebrate spinal cord. Nature. 461, (7262), 407-410 (2009).
  22. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics