Optogenético La activación de las neuronas somatosensoriales pez cebra utilizando Chef-tdTomato

Neuroscience

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Summary

Técnicas optogenético han hecho posible el estudio de la contribución de las neuronas específicas de comportamiento. Se describe un método en larvas de pez cebra para la activación de las neuronas somatosensoriales individuales que expresan una variante canalrodopsina (Chef) con un bombeado por diodos de estado sólido (DPSS) láser y el registro de los comportamientos provocados con una cámara de vídeo de alta velocidad.

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Palanca, A. M., Sagasti, A. Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato. J. Vis. Exp. (71), e50184, doi:10.3791/50184 (2013).

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Abstract

Larvas de pez cebra se están convirtiendo en un modelo para describir el desarrollo y la función de simples circuitos neuronales. Debido a su fertilización externa, el rápido desarrollo, y la translucidez, en particular el pez cebra se presta a los enfoques optogenético para investigar la función de circuitos neuronales. En este enfoque, sensibles a la luz los canales de iones se expresan en neuronas específicas, permitiendo que el experimentador para activar o inhibir a voluntad y por lo tanto evaluar su contribución a comportamientos específicos. La aplicación de estos métodos en larvas de pez cebra es conceptualmente simple, pero requiere la optimización de los detalles técnicos. Aquí se demuestra un procedimiento para la expresión de una variante en larvas de pez cebra canalrodopsina neuronas somatosensoriales, foto-activación de las células individuales, y el registro de los comportamientos resultantes. Mediante la introducción de algunas modificaciones a los métodos previamente establecidos, este enfoque podría ser utilizado para provocar respuestas de comportamiento de neuronas individuales activados hastaa por lo menos 4 días después de la fertilización-(DPF). En concreto, hemos creado un transgén utilizando una neurona somatosensorial potenciador, CREST3, para conducir la expresión de la variante etiquetados canalrodopsina, Chef-tdTomato. Inyectando este transgén en los embriones de 1-etapa de células resulta en una expresión mosaico en las neuronas somatosensoriales, que se pueden obtener imágenes de microscopía confocal. Illuminating identificado células en estos animales con la luz de un láser DPSS 473 nm, guiado a través de un cable de fibra óptica, provoca comportamientos que se pueden grabar con una cámara de vídeo de alta velocidad y analizados cuantitativamente. Esta técnica podría adaptarse a las conductas de estudio provocados por la activación de cualquier neurona pez cebra. La combinación de este método con perturbaciones genéticas o farmacológico será una manera poderosa para investigar la formación del circuito y la función.

Introduction

El desarrollo de métodos optogenética para promover o inhibir la excitabilidad neuronal con longitudes de onda definidas de luz ha permitido estudiar la función de las distintas poblaciones de neuronas en los circuitos neurales que controlan el comportamiento de 1, 19, 21. Esta técnica se utiliza a menudo para activar grupos de neuronas, pero también puede ser usado para activar las neuronas individuales. Larvas de pez cebra son particularmente susceptibles a estos métodos ya que son translúcidas, su sistema nervioso se desarrolla rápidamente, y la creación de animales transgénicos es rápido y de rutina. Sin embargo, importantes obstáculos técnicos se debe superar para lograr fiablemente activación única neurona.

Para optimizar un procedimiento para la activación de las neuronas optogenético pez cebra individuales, nos hemos centrado en las neuronas somatosensoriales. Larvas de pez cebra detectar una variedad de estímulos somatosensoriales utilizando dos poblaciones de neuronas: las neuronas del trigémino, que inervan la cabeza, y Rohon-(BeardRB), las neuronas que inervan el resto del cuerpo. Cada trigémino y RB neurona proyecta un axón periférico que se ramifica extensamente en la piel para detectar los estímulos y un axón central que se conecta aguas abajo a los circuitos neuronales. Los animales responden a tocar tan pronto como 21 horas después de la fertilización (hpf), lo que indica que los circuitos somatosensoriales coherentes han formado 5, 18. Durante el desarrollo larvario al menos algunas sinapsis las neuronas del trigémino y RB sobre la célula de Mauthner para activar respuestas clásicas de escape, pero la acumulación de evidencia sugiere que hay varias clases de neuronas somatosensoriales con diferentes patrones de conectividad que pueden provocar variaciones en el comportamiento de escape 2, 4, 10, 12, 14, 15, 16, 17. Nuestra motivación para el desarrollo de este método fue caracterizar la función de comportamiento de las diferentes clases de neuronas somatosensoriales, pero este enfoque podría en principio ser usado para estudiar la función de la neurona o casi cualquier población de neuronas en LARval pez cebra.

Douglass et al. Descrito previamente un método para activar canalrodopsina-2-expresando neuronas somatosensoriales con luz azul, provocando comportamiento de escape 3. Su enfoque utiliza un elemento potenciador del gen ISL1 para conducir la expresión de ChR2-EYFP en las neuronas somatosensoriales. Este transgén, sin embargo, se informó de que muestran una fluorescencia relativamente débil, lo que requiere la co-inyección de un segundo reportero, UAS :: GFP, para permitir la visualización de células que expresan ChR2-EYFP. Este enfoque se utilizó para obtener respuestas de comportamiento entre 24-48 HPF, pero nunca pudo obtener una respuesta más allá de 72 HPF. Por lo tanto, mientras que este método funciona para el estudio de los circuitos neuronales en las fases larvarias tempranas (24-48 hpf), es insuficiente para la caracterización de circuitos neurales y las respuestas de comportamiento en las larvas mayores, cuando haya más diversas respuestas de comportamiento son evidentes y circuitos neuronales son más maduros.

Se buscómejorar la sensibilidad de esta técnica con el fin de caracterizar la función de las subpoblaciones de neuronas RB larvales. Para mejorar la expresión se utilizó un potenciador somatosensorial-específico (CREST3) 20 para conducir la expresión de LexA-VP16 y un tramo de secuencias del operador LexA (4xLexAop) 11 para amplificar la expresión de un marcado fluorescentemente y activado por la luz de canal. Esta configuración amplificado expresión del canal, eliminando la necesidad de co-expresión de un segundo reportero y que nos permite determinar directamente la abundancia relativa de la canal en cada neurona. Usando la secuencia de LexA / LexAOp tenía la ventaja adicional de que permite introducir el transgén en líneas indicadoras de pez cebra que utilizan el sistema GAL4/UAS. La expresión transitoria de este transgén resultó en niveles variables de expresión, pero generalmente era lo suficientemente robusta como para visualizar tanto el cuerpo de la célula y las proyecciones axonales de las neuronas individuales en varios días. Para optimizar la sensibilidaddad a la luz se utilizó la luz activado canal Chef, una variante canalrodopsina que consiste en una quimera de channelopsin-1 (Chop1) y channelopsin-2 (Chop2) con un sitio de cruce en hélice bucle EF 13. Este canal se activa a la misma longitud de onda como ChR2, pero requiere una menor intensidad de luz para la activación, por lo que es más sensible que los otros canales de uso común, incluyendo ChR2. La proteína chef fue fusionado a la proteína fluorescente de color rojo, tdTomato, lo que nos permite cribar para la expresión de proteínas sin activar el canal. Como fuente de luz, se utilizó un diodo bombeado de estado sólido (DPSS) láser acoplado a un cable de fibra óptica para proporcionar una precisa, de alta potencia del pulso de luz azul a una región específica de las larvas. Esto nos permitió enfocar la luz láser sobre las neuronas individuales, eliminando la necesidad de encontrar raros animales transgénicos que expresan el canal en una sola neurona. El uso de este enfoque, hemos sido capaces de activar las neuronas individuales RB, registre la respuesta conductuals con una cámara de vídeo de alta velocidad, y la imagen de las neuronas activadas en alta resolución con microscopía confocal.

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Protocol

Preparar el siguiente antes de tiempo.

1. Prepare el cable óptico

  1. Crear una unidad de almacenamiento para el cable de fibra óptica por fusión del cuello cónico de una pipeta Pasteur de vidrio sobre un mechero de Bunsen para crear un ángulo de ~ 150 °.
  2. Usando un cortador de alambre o una hoja de afeitar, corte con cuidado el cable de fibra óptica en dos partes. Cada pieza debe tener un extremo con una FC / adaptador de PC y un extremo expuesto. La tienda de una sola pieza como un cable de reserva.
  3. Pelar el cable de fibra óptica hasta el revestimiento mediante la eliminación de la cubierta de la fibra y fibras de refuerzo (Figura 1A) de 5,0 cm de extremo cortado del cable.
  4. Inserte el cable óptico en preparados pipeta Pasteur. Asegúrese de cable puede moverse fácilmente dentro y fuera de la punta de la pipeta.
  5. Con cable de fibra óptica que sobresale de la punta de pipeta Pasteur, corte con cuidado y retire revestimiento de fibra de alrededor de la fibra de vidrio, ~ 2 mm del extremo del corte.
  6. El uso de un lápiz de diamante / cristal de corte, corte la fibra de vidrio y se rompen off al final para crear un corte limpio / superficie en el extremo de la fibra (Figura 1B).
  7. Retirar cable óptico en pipeta Pasteur para su almacenamiento. Repita el paso (1,6) si la punta de la fibra óptica se astilla o rompe de manera desigual.
  8. Cable óptico en posición pipeta Pasteur utilizando un micromanipulador (Figura 1C).

Procedimientos 2-8 describen un método para la inyección de transgenes en embriones generalmente aplicables a muchos experimentos de pez cebra. Variaciones sobre este método, como los descritos en otros vídeos Jové 6, 7, 8, 9, 22 son igualmente eficaces.

2. Tire de agujas de inyección

  1. El uso de un extractor de aguja, tire de tubos de vidrio borosilicato en dos agujas con punta afilada gradualmente. Extractor de configuración pueden variar. (En un extractor de aguja Sutter Instruments usamos valores: P = 500, Heat = 720, Pull = 50, velocidad = 70 y el Tiempo = 150). Cada tirador de aguja es diferente, así optimizar la configuración del extractor emempíricamente. Para obtener más agujas afiladas, aumente el calor y / o de extracción. Para agujas afiladas menos, aumentar el tiempo y / o Pull disminución.
  2. Agujas Almacenar en un contenedor seguro (es decir, una placa de Petri con una cinta enrollada, de un lado adhesivo).

3. Vierta Moldes de Inyección

  1. Derretir 0,5 g de agarosa en embrión de 30 ml / agua azul, hasta que agarosa se disuelva por completo.
  2. Vierta en la mitad inferior de una placa de Petri.
  3. Coloque molde rectangular con pozos de montaje (Figura 2) en agarosa, teniendo cuidado de limitar la formación de burbujas alrededor de los pozos.
  4. Permitir agarosa para solidificar.
  5. Retire el molde y llenar placa de Petri con azul / agua embrión.
  6. Guardar en posición vertical, llenado con agua limpia, a la temperatura ambiente para su uso el mismo día o a 4 ° C para su uso futuro.

4. Hacer la mezcla de ADN plasmídico para inyecciones

  1. Diluir plásmido de ADN a una concentración de 50 ng / ml con rojo fenol 1:10 en ddH 2 O. Paraejemplo:
    1,0 ml ADN de plásmido (250 ng / ml)
    0,5 ml rojo fenol
    3,5 ml ddH 2 O
  2. Mezcla de ADN se pueden mantener a temperatura ambiente si se utiliza inmediatamente o se almacenaron a 4 ° C durante varios días.

5. Configure parejas de apareamiento

Esto se debe hacer la noche antes de que usted planea hacer inyecciones.

  1. Llene los tanques de cría con agua de la instalación y el lugar peces machos y hembras juntos. Si las inyecciones no puede realizarse tan pronto como las luces se encienden en las instalaciones, pescado separado hombres y mujeres con un divisor.

6. Preparar para inyecciones (puede hacerse mientras se espera para embriones)

  1. Encienda el inyector de presión de perforación. Asegúrese de que el sistema se ajusta a pulso. Comience con la duración del impulso conjunto a 1.
  2. Encienda la válvula de aire yAjustar la presión del inyector de aproximadamente 20 psi.
  3. El uso de un microscopio de disección con el máximo aumento, romper la punta de la aguja con un fórceps o de póquer para crear una abertura ~ 2 micras (Figura 3, Movie 1).
  4. Rellenar con la mezcla de las agujas del ADN a través de: 1. La colocación de la aguja, lado de la punta hacia arriba, en la mezcla de DNA y dejando que la aguja de llenar por acción capilar o 2. Utilizando una punta de largo alcance para pipetear 1-2 l de la DNA mezclar directamente en la aguja.
  5. Lugar lleno aguja en un lugar seguro hasta que esté listo para inyectar.

7. Recoger embriones

  1. Después de las luces de las instalaciones se han encendido, quitar separadores (si corresponde). Recoge los embriones con un colador / tamiz pequeño y transferirlos a una placa de Petri con azul fresca / agua embrión.

8. Se inyecta embriones en la etapa de célula 1-2

  1. La transferencia de embriones recolectados para moldes de inyección utilizando una pipeta de plástico.
  2. El uso de un microscopio de disección, empuje suavemente embriones enpozos con fórceps o un póker romo (Figura 4, Movie 2).
  3. Coloque la aguja cargada en un micromanipulador y posición sobre embriones.
  4. Calibrar el volumen de inyección mediante el ajuste de la duración del pulso en incrementos de 1-paso hasta conseguir el volumen deseado (1 ~ nl). Esto podría ser calibrado con un micrómetro de portaobjetos, tal como se describe en algunos vídeos anteriores Jove 8, 22, pero para este experimento precisión no es necesaria, ya que una amplia gama de volúmenes de inyección se traducirá en una expresión adecuada.
  5. Inyectar 1 ~ nl ADN mezclar directamente en la célula y repita para todos los embriones. El ADN también se puede inyectar en la yema de huevo, pero esto tiende a ser menos eficiente (Figura 5, la película 3).
  6. Retire los embriones inyectados de molde con un chorro suave de azul / agua embrión.
  7. Tienda inyectado embriones a 28,5 ° C en la oscuridad.
  8. Retire fecundados, embriones dañados o muertos de forma periódica.
  9. Tratar a los embriones wiª PTU entre 18-24 HPF para evitar la pigmentación.

9. Pantalla para la expresión transgénica

  1. Manualmente dechorionate 24-48 HPF embriones utilizando fórceps.
  2. Anestesie larvas utilizando 0,02% tricaína.
  3. El uso de un microscopio de fluorescencia de disección, identificar las larvas con RB o expresión de neuronas del trigémino y transferirlos a un nuevo plato con dulce PTU azul / embrión agua. Los embriones con escasa expresión en las células fácilmente identificables son óptimas, pero las neuronas individuales se orientarán para la activación con un cable de fibra óptica para una amplia gama de la densidad de expresión es aceptable.
  4. Tienda de embriones a 28,5 ° C en la oscuridad hasta la etapa experimental deseado.

10. Monte larvas para experimentos de comportamiento

  1. Hacer un 1,5% de agarosa de baja fusión en ddH 2 O y guárdelo en un bloque de 42 ° C de calor para evitar que se solidifique.
  2. Uso de una pipeta Pasteur de vidrio, la transferencia de una de las larvas pre-seleccionados en una tinae del 1,5% de agarosa de baja fusión con tan poco azul / embrión agua como sea posible.
  3. Transferir las larvas en una gota de agarosa en una pequeña placa Petri.
  4. Bajo un microscopio de disección, larva posición dorsal hacia arriba.
  5. Cuando agarosa se ha solidificado, cortar la agarosa con una navaja fina (# 11 bisturí), dejando un trozo de agar alrededor de la larva completa.
  6. Haga dos cortes diagonales en ambos lados de la yema de huevo, tomar cuidado de no mellar la larva.
  7. Llene el área que rodea a la agarosa con embrión / agua azul.
  8. Tire de agarosa de distancia del tronco y la cola de la larva (Figura 6).

11. Preparar cámara de alta velocidad y software de imágenes

  1. Monte de alta velocidad de la cámara en la disección de alcance.
  2. Conecte la cámara al ordenador.
  3. Encienda el ordenador.
  4. Encienda cámara de alta velocidad.
  5. Abrir video / imágenes de software (Utilizamos software AOS imagen y se describen los procedimientos para su uso aquí, pero las imágenes de otrosoftware es igualmente aceptable).
  6. Ajuste la configuración de la cámara en consecuencia (es decir, 1.000 fotogramas por segundo (fps), el 50% de amortiguamiento gatillo u otros ajustes preferidos).
  7. Inicie la grabación.

12. Activa las neuronas individuales utilizando un láser 473 nm

  1. Conecte estimulador, láser y cable óptico.
  2. Encienda el estimulador.
  3. Establecer estimulador a un máximo de 5 voltios y una duración de pulso de 5 ms.
  4. Activar el láser de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  5. El uso de un microscopio de disección para colocar la punta del cable óptico cerca del cuerpo celular de una neurona con Chef-tdTomato expresión (Figura 6).
  6. Entregar pulso de luz azul para activar la neurona sensorial.
  7. Comportamiento de grabación con una cámara de alta velocidad en 500 o 1.000 imágenes por segundo.
  8. Repetir el experimento como se desee, a la espera 1 min entre cada activación para evitar la habituación. (Hemos registrado un mínimo de tres respuestas para cada neurona).
  9. Alarvas de liberación, separarlas de agarosa con pinzas, cuidando de no lastimar al animal. Este animal se puede permitir seguir desarrollando y el procedimiento se puede repetir en una etapa anterior para caracterizar el desarrollo del comportamiento. El embrión también puede volver a montar de alta resolución de imagen confocal de células activadas por la que se correlacionan con el comportamiento de la estructura celular, como se describe a continuación.
  10. Traslado larva a la placa de cultivo con azul fresca / agua embrión. Utilizamos una placa de 24 pocillos para realizar un seguimiento de las larvas individual.

13. Imagen Neuron (s) con un microscopio confocal

  1. Anestesie larvas con 0,02% tricaína.
  2. Larvas Mount, lado dorsal hacia arriba, en agarosa al 1,2% bajo punto de fusión o en un molde dorsal.
  3. Imagen Chef-tdTomato neuronas con un láser nm 543 y filtro apropiado y objetivo. Nosotros utilizamos un objetivo de 20x.
  4. Eliminar las larvas de agarosa y volver al bienestar individual con el azul / agua embrión.
  5. Almacenar a 28,5 ° C en la oscuridad durante further análisis.

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Representative Results

Figura 1
Figura 1. Cable óptico configurado. (A) Capas de un cable de fibra óptica. (B) de fibra óptica por cable pelado en una pipeta Pasteur. (C) El cable de fibra óptica en pipeta Pasteur coloca utilizando un micromanipulador.

Figura 2
Figura 2. Inyección plantilla molde.

Figura 3
Figura 3. (Vídeo 1). Romper la aguja.

Figura 4
Figura 4. (Movie 2). La colocación de los embriones en el molde de inyección.

ther.within-page = "always"> Figura 5
Figura 5. (Movie 3). Inyectar 1 nl mezcla de ADN en 1-célula del embrión etapa.

La figura 6
Figura 6. Diagrama de una larva de pez cebra montado y representativos neuronas implicadas en la respuesta táctil larval. Larvas de pez cebra fueron montadas parcialmente en 1,5% de agarosa de baja fusión (representada por líneas de trazos que rodean la porción rostral de la larva). Una neurona trigémino (en la cabeza) y una neurona Rohon-Beard (en el maletero) se representan en rojo. Células de Mauthner están delimitadas por líneas de trazos en la larva. El cable óptico (blanco) se muestra situada sobre el cuerpo de la célula RB neurona.

oad/50184/50184fig7.jpg "alt =" Figura 7 "fo: content-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/50184/50184fig7highres.jpg "/>
Figura 7. (Movie 4). Activación de una sola expressingChEF RB neurona provoca una respuesta conductual. (A) Todavía cuadros que representan la activación de una sola neurona RB expresar Chef-tdTomato. Las neuronas individuales se activaron mediante un pulso de 5 ms de un láser azul 473 nm a través de un cable de fibra óptica de 200 micras. Tensión conducir el láser azul se fijó en un máximo de 5 voltios. El comportamiento resultante se registró a 1.000 fotogramas por segundo por una cámara de alta velocidad. (B) La microscopía confocal se usó para la imagen de la neurona activado RB. Arrow demuestra región estimulada en alambiques de comportamiento. (C) imagen ampliada de RB neurona se indica en (B). Barra de escala, 100 micras. (Película 5 y 6) mismo pez, (Película 5) activación del trigémino, (Película 6) RB neurona sobre la extensión yema.p_upload/50184/50184fig7large.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ampliar la figura.

Figura 8
Figura 8. Latencia de comportamiento bajo condiciones variables. Para la mayoría de experimentos, se activa una sola neurona en ~ 35 larvas hpf expresar Chef-tdTomato con un pulso de 5 ms de un láser de 473 nm azul conducido por una fuente de alimentación de 5 V (Figura 6). Para comprender mejor la dinámica de activación chef, variamos los parámetros para determinar su efecto en el comportamiento. (A) La duración de la estimulación de la luz (5 mseg frente mseg 10) no afectó la latencia cuando se cuantificó a partir de inicio del pulso de luz. (D) A ~ 35 hpf, tensión inversa afecta a la latencia. Tensiones más bajas como resultado un aumento en la latencia de movimiento. Para nuestros experimentos, hemos utilizado el máximo de tensión (5 V) permissible para nuestro aparato láser, lo que provocó comportamientos estereotipados fiable de la mayoría de las neuronas que expresan brillante-RB.

Figura 9
La Figura 9. (Película 7). La activación de Chef-tdTomato neuronas que expresan RB en 60 larvas HPF. (A) de fotogramas estáticos que representan la activación de las neuronas que expresan RB Chef-tdTomato por un pulso de 10 ms nm de un láser azul 473 a través de un cable de fibra óptica 200 micras. El comportamiento resultante se registró a 1.000 fotogramas por segundo por una cámara de alta velocidad. (B) La microscopía confocal se usó para la imagen activado RB neurona (s). Arrow demuestra región estimulada en alambiques de comportamiento. Barra de escala, 100 micras.

Figura 10 o: src = "/ files/ftp_upload/50184/50184fig10highres.jpg" />
Figura 10. (Película 8). La activación de Chef-tdTomato neuronas que expresan RB en larvas dpf 4. Imágenes fijas que muestran la activación de las neuronas que expresan RB Chef-tdTomato por un pulso de 20 ms nm de un láser azul 473 a través de un cable de fibra óptica 200 micras. El comportamiento resultante se registró a 1.000 fotogramas por segundo con una cámara de alta velocidad.

Película 1. Haga clic aquí para ver la película .

Movie 2. Haga clic aquí para ver la película .

Movie 3. Haga clic aquí para ver la película .

Movie 4.ttp :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/50184/50184movie4.mpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver la película.

Movie 5. Haga clic aquí para ver la película .

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Movie 7. Haga clic aquí para ver la película .

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Discussion

Hemos descrito un enfoque para la activación de las neuronas optogenético RB individuales en el pez cebra en vivo. Nuestro método emplea transgénesis transitorio para expresar una variante fluorescente etiquetados canalrodopsina, Chef-tdTomato 13, en determinadas neuronas somatosensoriales. Este enfoque puede ser fácilmente adaptado para el uso en otras poblaciones de larvas de pez cebra celulares.

Usando este enfoque consistente suscitó respuestas conductuales 34 a 48 larvas hpf expresar Chef-tdTomato. El uso de un 5 ms pulso de luz azul a 5 V, hemos sido capaces de activar las neuronas individuales RB (Figura 7). Mediante la colocación de la fibra óptica en diferentes puntos a lo largo del animal, se encontró que era necesario para dirigir la luz azul directamente en un cuerpo de la célula para provocar una respuesta conductual. Luz intermitente no obtener una respuesta de las larvas que no expresó chef. Además, nunca pulsos de luz a lo largo del axón central o periférica del axón provocó una respuesta, even en las larvas jóvenes (datos no mostrados). Esta propiedad es ventajosa, ya que con confianza podría activar neuronas aisladas en animales en los que múltiples neuronas fueron etiquetados, incluso si los axones de otras neuronas centrales pasa cerca del cuerpo celular de la neurona específica de (Película 4-6).

Para probar la fiabilidad del método para evaluar los parámetros cinemáticos, se determinó la latencia de la respuesta de escape (el tiempo desde la activación de la luz de la respuesta conductual) entre 40 y 48 hpf, un parámetro que se sabe que es altamente estereotipado. Para determinar si la duración del estímulo de luz influye en la activación de las neuronas, las neuronas que ilumina objetivo durante 5 ó 10 ms (Figura 8A). Dado que la latencia de comportamiento en ambas condiciones fueron las mismas cuando se calcula a partir del comienzo del pulso de luz, llegamos a la conclusión de que la duración del pulso de luz no influyó en la latencia de comportamiento. Sin embargo, nos dimos cuenta de que la reducción de la tensión aumentó ªe latencia de un comportamiento (Figura 8B). A 5 V, sin embargo, muchas de las respuestas (9 de 16 peces) fueron 20 ± 5 ms, similar a la latencia reportado para respuestas de escape naturales. Por lo tanto, la activación de las neuronas con 5 V se acerca a la activación máxima.

Parámetros para la efectiva obtención de respuestas de comportamiento a partir de la activación de las neuronas individuales RB variaron en las larvas más viejas. Con éxito suscitó respuestas de comportamiento de los animales tan antigua como 4 dpf, sustancialmente más tarde que se había informado anteriormente. Sin embargo, mientras que la activación de las neuronas RB individuales con un pulso de 5 ms luz a 5 V produjo de manera consistente en una respuesta de comportamiento antes de 48 hpf, la activación de las larvas mayores (> 60 hpf) no fue tan consistente. Pulsos más largos (10-100 ms) de luz eran a menudo necesarias para activar las neuronas de las larvas mayores (Figura 9 y 10, la película 7 y 8, respectivamente). Por lo tanto, los parámetros de activación puede necesitarser optimizado / calibrado basado en la etapa experimental.

El enfoque que se describe aquí podría ser utilizado para muchas aplicaciones potenciales. Estamos utilizando este método para definir las respuestas de comportamiento provocados por diferentes subtipos de neuronas, pero también podría ser utilizado para caracterizar el desarrollo de las respuestas de comportamiento como el animal madura, los efectos de las drogas o mutantes en el comportamiento, o, en combinación con la fisiología o formación de imágenes, para caracterizar circuitos aguas abajo activadas por una neurona identificado. Por el contrario, los canales de inhibidores, tales como halorhodopsina, podría ser utilizado para inhibir las neuronas específicas dentro de una red neuronal.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen ningún interés en competencia financiera.

Acknowledgements

Damos las gracias a Fumi Kubo, Thiele y Tod HerwigBaier (UCSF / Max Planck Institute) para el asesoramiento sobre los experimentos de comportamiento y DPSS láser establecidos; Heesoo Kim y Chiara Cerri de la MBL Curso de Neurobiología de ayudar en Chef-tdTomato experimentos; PetronellaKettunen (Universidad de Gotemburgo ) para la colaboración inicial de los experimentos optogenético; BaljitKhakh, Eric Hudson, Baca Mike y John Milligan (UCLA) para el asesoramiento técnico, y Roger Tsien (UCSD) para el chef-tdTomato construir. Este trabajo fue apoyado por un NRSA (5F31NS064817) Premio a AMSP y una subvención de la NSF (RIG: 0819010) a AS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Glass Pasteur pipette Fisher 1367820B or equivalent (10-15 mm diameter)
200 μm optic fiber ThorLabs AFS200/220Y-CUSTOM Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030
50 μm optic fiber ThorLabs AFS50/125Y-CUSTOM Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030
Adjustable Stripping Tool ThorLabs AFS900 or Three-Hole Stripping Tool (FTS4)
Diamond Wedge scribe ThorLabs S90W
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter Instruments P-97 or equivalent
Borosilicate glass tubing with filament Sutter Instruments BF-100-78-10
Injection mold n/a n/a Figure 5
1.5 ml centrifuge tubes Any Any
Petri dish (100x15 mm) Any Any
Petri dish (60x15 mm) Any Any
Pressure injector ASI MPPI-3 or equivalent
Micromanipulator and metal stand Narashige M152 or equivalent
Disposable plastic pipettes Fisherbrand 13-711-7 or equivalent
Poker (Pin holder and Insect pin) Fine Science Tools, Inc. 26018-17 and 26000-70 or equivalent
Forceps Fine Science Tools, Inc. 11255-20 or equivalent
Microloader pipette tips Eppendorf 9300001007
28.5 °C incubator any any
42 °C heat block Any Any
Non-Sterile scalpel blades #11 Fine Scientific Tools, Inc. 10011-00 or equivalent
Dissecting scope Zeiss Stemi or equivalent
Fluorescent dissecting scope with standard filter Any any or equivalent
Confocal microscope Zeiss LSM 510 or 710 or equivalent with lasers for GFP and RFP, and 10x, 20x and 40x objectives
High speed camera AOS Technologies, Inc. X-PRI (130025-10) or equivalent
473 nm portable laser Crystal lasers CL-473-050 or higher power, with TTL option
S48 Stimulator Astro-Med, Inc. Grass Instrument division S48K or equivalent
FC/PC to FC/PC mating sleeve ThorLabs ADAFC1 May need for optic cable connection
Laser Safety Glasses ThorLabs LG10 or equivalent
24 culture plates Genesee 25-102 or equivalent
Single depression slides Fisher S175201 Or equivalent
Reagent
Instant ocean Aquatic Ecosystems IS50
Methylene blue Fisher S71325
Phenol red Sigma P4758
Agarose EMD 2125 or equivalent
Low Melt agarose Sigma A9045 or equivalent
PTU Sigma P7629
Tricaine Sigma A5040
blue/embryo water 10 L ddH2O
0.6 g Instant Ocean
6 drops methylene blue
phenol red (5 mg/ml in 0.2 M KCl)
100x PTU 0.150 g PTU
50 ml ddH2O
dissolve at 70 °C, shake often
aliquot and store at -20 °C
1x PTU 1 ml 100x PTU
99 ml blue/fish water
Tricaine stock solution 400 mg tricaine
97.9 ddH2O
~2.1 ml 1M Tris, pH9.0 adjust pH to ~7.0
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References

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