GST-Su purificación: A dos pasos Affinity Protocolo Purificación Cediendo largos proteínas purificadas

1Genome Stability Laboratory, Oncology Axis, Hôtel-Dieu de Québec
* These authors contributed equally
Biology

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Summary

En el presente protocolo, se demuestra un método de purificación de proteínas a pequeña escala altamente eficiente y rentable, que permite la purificación de proteínas recombinantes, combinando de forma única una etiqueta de GST escindible y una pequeña cola de His.

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Maity, R., Pauty, J., Krietsch, J., Buisson, R., Genois, M. M., Masson, J. Y. GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins. J. Vis. Exp. (80), e50320, doi:10.3791/50320 (2013).

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Abstract

Ensayos de clave en enzimología para la caracterización bioquímica de las proteínas in vitro requieren altas concentraciones de la proteína purificada de interés. Protocolos de purificación de proteínas deben combinar eficiencia, simplicidad y rentabilidad 1. Aquí, describimos la GST-Su método como un nuevo sistema de purificación por afinidad a pequeña escala para proteínas recombinantes, sobre la base de un N-terminal de la etiqueta glutatión Sepharose (GST) 2,3 y una etiqueta 10xHis C-terminal 4, que tanto se fusionan a la proteína de interés. La última construcción se utiliza para generar baculovirus, para la infección de las células Sf9 infectadas para la expresión de proteínas 5. GST es una etiqueta bastante largo (29 kDa), que sirve para asegurar la eficacia de la purificación. Sin embargo, podría influir en las propiedades fisiológicas de la proteína. Por lo tanto, en que posteriormente se escinde la proteína usando la enzima PreScission 6. Con el fin de garantizar la máxima pureza y para eliminar el GST escindido, nosañadido una segunda etapa de purificación de afinidad basada en la comparativamente pequeña etiqueta de His. Es importante destacar que, nuestra técnica se basa en dos etiquetas diferentes que flanquean los dos extremos de la proteína, que es una herramienta eficaz para eliminar las proteínas degradadas y, por lo tanto, enriquece proteínas de longitud completa. El método que aquí se presenta no requiere una configuración fundamental caros, tales como FPLC. Además, incorporamos MgCl 2 y lavados ATP para eliminar las impurezas de la proteína de choque de calor y tratamiento con nucleasa de abolir ácidos nucleicos contaminantes. En resumen, la combinación de dos etiquetas diferentes que flanquean el N-y C-terminal y la capacidad de escindir una de las etiquetas, garantiza la recuperación de una proteína altamente purificada y de longitud completa de interés.

Introduction

La purificación de proteínas recombinantes es crucial para hacer frente a cuestiones fundamentales de la bioquímica. Formas convencionales de purificación de proteínas, como la cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de exclusión por tamaños se basan en las propiedades físicas de la proteína diana, como su punto isoeléctrico y la carga o el tamaño, respectivamente. Las características de proteínas últimos son compartidos por una variedad de proteínas, lo que aumenta considerablemente la probabilidad de proteínas contaminantes en las estrategias de purificación de proteínas convencionales. Este problema puede ser evitado con el uso de múltiples columnas de purificación, lo que consume tiempo. Al mismo tiempo, los métodos de cromatografía de éstos exigen configuración experimental caro. La purificación por afinidad-etiqueta aumenta fuertemente objetivo-especificidad, como en la mayoría de los casos la etiqueta será único para la proteína de interés. En estudios recientes, la purificación de la bandera-o HA-afinidad se ha usado ampliamente.

En contraste con rec existenteprotocolos de purificación de proteínas ombinant en la que se utilizan etiquetas individuales, se estableció la combinación única de dos etiquetas. Nuestro método implica la fusión de una etiqueta de GST en el extremo N-terminal y una etiqueta de His en el extremo C-terminal de la proteína de interés, para una relación óptima entre la cantidad y la pureza de la proteína deseada. El GST es un largo etiqueta (29 kDa), que es altamente eficiente para la purificación sobre glutatión Sepharose bolas. Por otra parte, el uso de GST garantiza la rentabilidad de nuestro método 1. La posibilidad de escindir la GST con la enzima PreScission (con secuencia de reconocimiento de LeuGluValLeuPheGln / GlyPro, lo que resulta en la adición de sólo dos aminoácidos) tiene muchas ventajas, por ejemplo, esta estrategia evita alteraciones de las funciones de las proteínas fisiológicas debido al impedimento alostérico. La pequeña etiqueta de His fusionada a la otra extremidad de proteína sirve en una segunda etapa de purificación para aumentar la pureza de proteína mediante el lavado de la GST escindido, así como las proteínas degradadas y otra contaminantes. Además, el protocolo no requiere una etapa de diálisis cuando se cambia de la GST para columnas de paso de la Su-purificación (resina TALON). Contaminantes comunes en este tipo de procesos de purificación son proteínas de choque térmico (HSP). La adición de una etapa de incubación con MgCl 2 y ATP permite la eliminación de estos contaminantes (Figura 1).

Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) son técnicas comunes que dependen de instrumentación costosa de generar un alto rendimiento de la proteína purificada de interés. El protocolo de purificación de lotes se presenta aquí, en contraste, es manual y no requiere una configuración de instrumento caro. Un alto rendimiento de proteína se puede llegar por la ampliación del protocolo. Al mismo tiempo, con el protocolo de purificación de lotes, el volumen de elución se puede ajustar con el fin de mejorar la concentración de proteína, que no se da con FPLC o HPLC.

ntent "> También, con el GST-Su protocolo de purificación por lotes, las proteínas con un tamaño de rango de ~ 10-300 kDa pueden purificarse. Una de las mayores ventajas es dada por el hecho de que uno puede purificar varias proteínas al mismo tiempo , por ejemplo, tanto una de tipo salvaje y su proteína mutante. El éxito del protocolo presentado depende únicamente en el nivel de expresión y la solubilidad de la proteína de interés.

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Protocol

1. Producción de baculovirus recombinante

Los baculovirus son generados utilizando el sistema de expresión de baculovirus Bac-to-Bac de Invitrogen principalmente de acuerdo con el protocolo del fabricante con modificaciones sólo leves:

  1. A pFastBac1 vector modificado (Gibco, la vida) fue creado que contiene el GST y Sus etiquetas (Figura 2). El sitio de clonación múltiple (MCS) de un pET-52b (+) vector (Novagen), que contiene una 10xHis-tag, se insertó en el MCS de un vector pFastBac1 generar pFastBac1-Strep-10xHis. La secuencia de MCS pET-52b (+) fue amplificado por PCR entre los sitios de restricción XbaI y BLPI, la adición de un sitio de restricción BglII en el extremo 5 'y un sitio de restricción HindIII en el extremo 3'. El producto de PCR se clonó entonces entre BamHI y el sitio de restricción HindIII de pFastBac1, usando la compatibilidad de las secuencias de restricción BamHI y BglII. Puesto que el objetivo era generar un pFastBac1 permite la expresión deproteína recombinante con estreptavidina y 10xHis-tags, el sitio de restricción BamHI de pET-52b (+) no se utilizó la secuencia de MCS. Además, el sitio de restricción XbaI no se utilizó para evitar la redundancia de los sitios de restricción que se producen entre los sitios que ya están en el MCS de pFastBac1 y estos insertado con el MCS de pET-52b (+). A continuación, se inserta la secuencia de codificación GST con el sitio PreScission proteasa reconocimiento (LeuGluValLeuPheGln / GlyPro) en pFastBac1-Strep-10xHis. La secuencia de ADNc de GST a partir de pGEX-6P-2 (GE Healthcare) se amplificó por PCR con cebadores que contienen sitios de restricción NcoI y KpnI en los extremos 5 'y 3' extremidades, respectivamente. El sitio NcoI permite la adición de un codón de inicio sino también una alanina a la GST. El producto de PCR fue clonado en pFastBac1-Strep-10xHis entre los sitios de restricción NcoI y KpnI, dando lugar a la supresión de la estreptavidina-tag. El nuevo vector de fusión así obtenido se denominó pFastBac1-GST-10xHis.
  2. Clonar el ADNc que codifica para la prOtein de interés en el vector pFastBac-GST-10xHis entre la GST (N-terminal) y la etiqueta de His (C-terminal). Tenga cuidado de eliminar el codón de parada de ADNc para permitir la fusión con el extremo C-terminal de His-tag.
  3. Transformar E. coli DH10Bac con el pFastBac recombinante (obtenida en la etapa 1.2) para generar el bácmido. Permitir colonias para crecer durante la noche a 37 ° C y varias horas a 30 ° C en placas de selección que contienen Bluo-gal e IPTG (10 mg / ml de tetraciclina, 50 mg / ml de kanamicina, 7 mg / ml de gentamicina, 100 mg / ml de Bluo- Gal, 40 g / ml de IPTG).
  4. Pick and restreak 2 colonias blancas (del Paso 1.3) en placas de selección para confirmar el fenotipo blanco.
  5. Inocular 2 ml de LB que contienen 10 mg / ml de tetraciclina, 50 mg / ml de kanamicina, 10 mg / ml de gentamicina con las dos colonias blancas de la etapa 1.4 y dejarlos crecer durante la noche bajo agitación (250 rpm) a 37 ° C.
  6. Con el fin de purificar el ADN bácmido, sedimentar las bacterias de la etapa 1.5,resuspender las células en 300 l de solución I y añadir 300 l de solución II (kit de Qiagen maxiprep). Incubar durante 5 min a temperatura ambiente, añadir 300 l de 3 M KOAc pH 5,5 y se incuba durante 10 minutos en hielo. Centrifugar las muestras a 4 º C, la velocidad máxima durante 10 min. Añadir 800 l de isopropanol a los sobrenadantes y se incuba durante 10 minutos en hielo. Centrifugar las muestras durante 15 min a 4 ° C y lavar el precipitado con 500 l de etanol al 70%. Deje que el pellet seco y resuspender en condiciones estériles en 40 l de Tris-EDTA pH 8,0. El ADN bácmido debe almacenarse a 4 ° C.
  7. Generar baculovirus como se describe en el protocolo del fabricante. Los baculovirus se pueden almacenar a 4 º C protegidas de la luz.

2. Expresión de proteínas recombinantes

  1. Con el fin de elegir el baculovirus más eficiente para la purificación y para vigilar a qué hora se alcanza el pico de expresión de la proteína, lleve a cabo un ensayo de mini-infección de unas sigue: Infect 2 x 10 7 Sf9 de células infectadas se cultivaron a 27 ° C en medio de Grace (complementado con 10% de FBS y 1% P / S) con 133 l (1/150) de baculovirus. Recoger alícuotas de 1,5 ml a 0, 24, 48, y 72 horas después de la infección. Sedimentar las células y analizar el nivel de expresión de la proteína de interés mediante transferencia Western usando anticuerpos anti-etiqueta.
  2. Utilice el baculovirus más eficiente desde el paso 2.1 para infectar una ruleta que contiene 1,0 x 10 6 células Sf9 por ml en 500 ml de los medios de comunicación con una proporción de 1/150 entre el virus y los medios de comunicación. Deje que las células infectadas crecen en suspensión a 27 º C y cosechan las células cuando se alcanza la máxima expresión de proteínas (según lo determinado en el paso 2.1). Las células sedimentadas se pueden almacenar a -80 ° C hasta su uso posterior.

3. Preparación de lisado celular soluble

Todas las siguientes etapas de incubación se llevan a cabo a 4 ° C en rotación suave.

  1. Lyse Scélulas F9 que expresan su proteína de interés en ~ 20 ml de tampón de unión de GST (NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 0,05% de Triton-X-100, 1 mM de DTT en PBS1X para una concentración final de NaCl de 250 mM, y el inhibidor de la proteasa cóctel (Roche). En un baño de agua helada, Dounce la solución 20x con un homogeneizador Dounce, sonicar 3x 30 segundos cada uno (salida 70%), y de nuevo Dounce 20x.
  2. (Opcional). Incubar el lisado total de células con 1 mM de MgCl 2 y Benzonase nucleasa 7 (2,5 U / ml) durante 30 min a 4 ° C para eliminar la contaminación de ADN o ARN.
  3. Centrifugar a 18000 rpm durante 30 min a 4 ° C. Mantenga el sobrenadante.
  4. (Opcional). Centrifugar el sobrenadante de nuevo durante 30 min a 18.000 rpm a 4 ° C para obtener un lisado soluble clara. Pasar el sobrenadante a través de un filtro de 0,2 o 0,45 micras para evitar obstrucciones.

4. Unión de la proteína en los granos de GST

  1. Incubar el lisado soluble de células con 1 ml de perlas de GST (previamente lavada dos veces con10 ml de tampón de unión de GST) durante 1 hora a 4 ° C en rotación suave.

Comentario: El tiempo de incubación debe ser optimizado de acuerdo a la estabilidad de la proteína y la eficacia de unión.

  1. Un paseo rápido a 700 rpm y eliminar el sobrenadante que contiene las proteínas no unidas (esto se pueden mantener para su posterior análisis). Lavar las proteínas GST unida (Figura 3B, pista 1) con tampón de lavado de GST (GST tampón de unión con 350 mM de NaCl final de).
  2. Repita el paso 4.2 2x. En el último lavado, eliminar la mayor cantidad sobrenadante como sea posible.
  3. Incubar las perlas con 5 mM de ATP y 15 mM de MgCl 2 (en tampón de unión 10 ml de GST) durante 1 hora a 4 ° C para evitar la unión no específica de proteínas de choque térmico 8. Lavar las perlas tres veces con tampón de lavado de GST.

5. PreScission escisión del GST

  1. Centrifugar las perlas de GST, separar el sobrenadante y lavar las perlas de GST con P5 bufFer (50 mM NaHPO 4 pH 7,0, NaCl 500 mM, 10% de glicerol, 0,05% de Triton-X-100, imidazol 5 mM).
  2. Incubar las GST-cuentas con enzima PreScission en tampón P5 de 3 horas a la noche a 4 ° C. (Divida las perlas de GST en fracciones de 100 l y agregue 4-8 unidades (2-4 mu l) de la enzima diluida en 100 l de tampón P5).

Comentario: El tiempo de incubación de la etapa de PreScission debe ser optimizado de acuerdo con el peso molecular, así como la estabilidad de la proteína. Si se observa la degradación, este tiempo de incubación se puede disminuir a un mínimo de 2 horas en lugar de durante la noche.

  1. Un paseo rápido y recoger el sobrenadante. Repita este paso dos veces después de la adición de 100 l de P5 amortiguar hasta el talón y aunar todas las fracciones (Figura 3B, carril 2).

Comentario: Las perlas restantes pueden ser utilizados para el análisis de la eficacia de escisión (Figura 3B

6. A TALON metal Affinity Resin La unión a proteínas-

  1. Divida la elución desde arriba en 3 fracciones de 1 ml e incubar cada uno con 100 perlas secas de resina de afinidad de metal Talon mu l (prelavadas dos veces con tampón de P5) durante 1 hora bajo rotación.

Comentario: La división de la elución en varias fracciones aumenta la eficiencia de unión / lavados.

  1. Lavar la resina 5 min con tampón de P30 (tampón P5 con una concentración final de imidazol 30 mM).
  2. Repita el paso 6.2 2x y agrupar las cuentas en un solo tubo. Antes de que el último lavado, eliminar la mayor cantidad sobrenadante como sea posible.

Comentario: Esto corresponde a la TALON unido de la muestra (Figura 3B, carril 4).

7. La elución de la proteína purificada

  1. Se incuba la proteína unida a resina TALON durante 5 min en rotación con P500 tampón (tampón P5 con una concentración final de imidazol 500 mM). Utilice una relación entre la memoria y cuentas de 1:1 v / v (Por ejemplo, si usted ha tomado 200 l de granos secos, usted tendrá que añadir 200 l de P500). Repita este paso dos veces y mantener cada fracción eluida por separado (llamado elución 1 (E1), elución 2 (E2) y la elución 3 (E3); Figura 3B, carriles 5-7).

Comentario: Las perlas restantes pueden ser utilizados para el análisis de la eficiencia de elución (Figura 3B, pista 8). Típicamente, un 60-80% de la proteína se eluye en total.

  1. Analizar la cantidad y la calidad de su proteína purificada por la carga de aproximadamente 20-40 l de cada fracción con una concentración patrón de BSA en un SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie (Figura 3B) o SYPRO tinción de proteínas para la visualización.

Comentario: La proteína de interés se puede detectar también excelentes referenciasughout el procedimiento de purificación utilizando anti-GST y anticuerpos anti-His (Figura 3C).

8. El almacenamiento de la proteína purificada

  1. Se dializa la proteína purificada contra un tampón de almacenamiento apropiado (por ejemplo 20 mM de Tris Acetato pH 8,0, 200 mM de KAc, 10% de glicerol, EDTA 1 mM, DTT 0,5 mM) a 4 ° C. Es importante comprobar la precipitación de la proteína purificada durante la diálisis. Por lo general, diálisis a 2x durante 1 hora a 4 ° C bajo rotación agitación.
  2. Hacer pequeñas alícuotas de la proteína purificada (10-20 l) y la congelación en hielo seco durante 30 min. Almacene las alícuotas a -80 ° C y evitar muchos ciclos de descongelación / congelación.

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Representative Results

Con el fin de ilustrar la eficiencia de la GST-Su protocolo de purificación, purificamos Rec14, un S. pombe proteína de 32,9 kDa. El cDNA fue clonado Rec14 en nuestro vector pFastBac1 modificado que permite la adición de GST-y sus etiquetas en el extremo N-y C-terminales, respectivamente (Figura 1 A). El baculovirus recombinante se prepararon entonces y se utilizan para infectar células SF9 infectadas para la expresión de proteínas. Los lisados ​​celulares solubles se incubaron con perlas de GST y las proteínas unidas se eluyeron mediante la escisión de la GST con la proteasa PreScission. El Rec14-Su proteína resultante fue purificado por afinidad en resina TALON y obligada, las proteínas se eluyeron con tampón TALON contiene imidazol 500 mM. Purificada Rec14-Su se dializó en tampón de almacenamiento y se almacenó a -80 ° C (Figura 1B).

Los lisados ​​celulares solubles totales y de células SF9 infectadas con el baculovirus recombinante Rec14, o-infectados de forma simulada como control, se analizaron por Coomassie coloración azul, lo que nos permite confirmar la expresión de GST-Rec14-His (Figura 3A). Durante el proceso de purificación, se analizaron varias muestras para seguir la eficacia del método. El análisis de estas muestras por tinción con azul de Coomassie (Figura 3B) muestra que durante la primera etapa de purificación, GST-Rec14 fue enlazado correctamente a perlas de GST, con un peso molecular aparente de ~ 60 kDa debido a la fusión de Rec14 (32,9 kDa) con GST (29 kDa) (carril 1). Después de PreScission la escisión de la GST, GST-libre Rec14-Sus migra alrededor de 37 kDa (carril 2), mientras que la GST escindido se pueden visualizar en las perlas de GST (carril 3, alrededor de 25 kDa). A pesar de una porción de Rec14 exentos del GST que todavía se mantuvo vinculado a las perlas de GST (carril 3), notable enriquecimiento en Rec14-His se logró (carril 2, sin contaminante visible en la tinción de azul de Coomassie). Este paso podría mejorarse aumentando el tiempo de incubación de la proteína con PreScission. Análisis de Rec14-Su ligado a TALONcuentas (después del paso 7.1, carril 4) en comparación con las proteínas eluidas después del paso de purificación GST (carril 2), muestra que una gran fracción de Rec14-Su se une a perlas TALON. Después de varios lavados, Rec14-His se eluyó y se recoge. Se habían realizado tres eluciones. El análisis reveló una alta pureza de Rec14-Su (sin contaminantes visibles por tinción de Coomassie, carriles 5 a 7), y la mayor concentración de Rec14-His en la primera elución. Comparación de fracciones eluidas (carriles 5 a 7) a las perlas después de la elución TALON (carril 8) ilustra la eficiencia de la elución, ya que-Su Rec14 se puede detectar sólo unos pocos como enlazado sobre perlas.

Las muestras utilizadas en la Figura 3B se sometieron a análisis de transferencia Western con anticuerpos anti-GST y anticuerpos anti-His con el fin de seguir Rec14 durante todo el procedimiento (Figura 3C). El blot anti-GST muestra que algunos de GST-Rec14 y GST sola, estaban presentes en las proteínas eluidas de la etapa de purificación de GST (carril 2), y then los contaminantes se eliminaron por la afinidad etapa de purificación His-tag. Esta mancha nos permite también monitorear que GST había sido retirado de manera eficiente desde Rec14 por el tratamiento PreScission y la etapa de purificación His-tag (carriles 4-8). El anti-blot Su objetivo es detectar Rec14. Así, podemos confirmar que GST-Rec14-Su y Rec14-Su no fueron completamente escindidos y retirados de las perlas de GST (carril 11). Por otra parte, en una alta concentración, Rec14 parece a agregarse (carril 13). En resumen, los resultados presentados demuestran la eficacia de la GST-Su purificación para la purificación de S. pombe Rec14.

Figura 1
Figura 1. Esquema de la estructura de la GST-Su método de purificación de afinidad de dos pasos. A. GST-Rec14-Su construcción se clonó en pFastBac (Baculovir. nos vector de expresión) B. purificación por afinidad de dos pasos de GST-Rec14-Su de Sf9 lisado celular soluble., seguido por PreScission escisión de la unión GST GST-, y la elución con imidazol vinculante TALON- Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Figura 2
Figura 2. Representación esquemática de pFastBac1-GST-10xHis. GST (verde), el sitio de la proteasa PreScission (azul claro), el sitio de clonación múltiple (rojo), y el 10-His (azul oscuro) se muestran. En minúsculas son las secuencias de nucleótidos procedentes de pET-52b (+). Haz click aquí para ver más grande la figura .

together.within-page = "always"> Figura 3
Figura 3. Resultado ejemplar de GST-Su purificación de Rec14. A. Tinción de Coomassie de la fracción de proteína total (carril 2 y 3) y lisado celular soluble (carril 4 y 5) a partir de células Sf9 tratados de forma simulada (carril 2 y 4) o infectados con GST-Rec14-Sus baculovirus (carril 3 y 5). Rec14-Su y GST poseer un peso molecular de aproximadamente 32,9 kDa y 29 kDa, respectivamente, y el-Rec14-Su GST proteína de fusión tiene un peso molecular de aproximadamente 61,9 kDa. B. tinción de Coomassie demostrando cada paso del método de purificación de proteínas (por explicación detallada véase el procedimiento) C. Western blot de las fracciones siguiendo el procedimiento de purificación con anti-GST (carril 1-8) y anti-Sus (carril 9 a 16) anticuerpos.upload/50320/50320fig3large.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver más grande la figura.

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Discussion

El GST-Su protocolo de purificación que aquí se presenta es adecuado para la purificación de una amplia gama de tamaños de proteínas recombinantes: Se purificaron con éxito Li RAD51 (41kDa), piBRCA2 (120 kDa), PALB2 (130kDa), y una proteína de alto peso molecular inestable peso de Leishmania infantum: Li BRCA2 (125kDa) 6,9. Por otra parte, las proteínas purificadas con este protocolo eran bioquímicamente activa 6. El éxito de este método depende únicamente de la expresión, solubilidad y estabilidad de la proteína deseada.

Vectores de biología molecular para la expresión en otros huéspedes, tales como E. coli o de levadura, se pueden modificar fácilmente usando el GST ampliamente disponibles y sus etiquetas. Esto pone de relieve la aplicabilidad y la relación coste-eficacia de la técnica actual para la mayoría de los laboratorios de biología molecular. Una variedad de ventajas influyó en nuestra decisión de elegir a las células infectadas a través de las células bacterianas o de mamífero para recombinant expresión y purificación de proteínas. Por ejemplo, modificaciones postraduccionales tales como la metilación, fosforilación y ubiquitinylation pueden influir fuertemente en la función enzimática de una proteína de 10. Por lo tanto, para estudiar las propiedades fisiológicas de una proteína, es favorable utilizar un sistema que permite la modificación postraduccional, tal como células Sf9 infectadas. Otra ventaja de usar Sf9 sobre células de mamífero, por ejemplo, es de naturaleza económica, como el sistema de célula infectada requiere considerablemente menos células y ningún método de transfección costoso en comparación con el sistema de mamífero.

La simplicidad del método presentado ayudará a los investigadores para obtener una proteína o complejo de proteínas en una forma altamente purificada con equipo de laboratorio estándar, lo que es ventajoso para un laboratorio con equipo mínimo.

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Acknowledgements

Damos las gracias a Anne-Marie Dion-Cote para los debates que conducen al desarrollo del método. JK y RB son FQNRT académicos de doctorado, M.-MG es un erudito Vanier CIHR, y J.-YM es un investigador senior FRSQ. Este trabajo fue apoyado por fondos de las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de JY. M.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
E.Coli DH10Bac (competent) Invitrogen
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System Invitrogen
Maxi Prep Kit Qiagen 12163 Solution I and II
Ultra Pure Bluo-Gal Gibco (Life) 15519028
IPTG Gibco (Life) 15529019
Sf9 infected cells ATCC CRL-1711
PreScission enzyme GE Healthcare 27084301
Grace's infected medium supplemented Gibco (Life) 11605-094
Fetal Bovine Serum characterized Hyclone SH30396.03
P/S (Penicillin-Streptomycin) Gibco (Life) 15070-063
Glutathione Sepharose resin GE bioscience 17075605
Protease inhibitor cocktail Roche 11873580001
Talon resin Clontech 635504
Imidazole BioShop 288324
Gentamicin Gibco (Life) 15710064
Polyclonal GST-antibody Production in house
Monoclonal 6X-His-antibody Clontech 631212
EQUIPMENT
Dounce homogenizer (tight) Wheaton 357546
Sonicator (Fisher dismembrator) Fisher Model 150
Dialysis bag (50 mm) Fisher Scientific 2115217

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).
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