मानव त्वचा बायोप्सी में nociceptive Intraepidermal तंत्रिका तंतुओं के तीन आयामी इमेजिंग

Medicine

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Summary

दर्दनाक न्यूरोपैथी (पीएन) में nociceptive intraepidermal तंत्रिका तंतुओं (IENFs) के परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए, हम सीधे nociceptive IENFs में मनाया तीन आयामी morphological परिवर्तन की जांच कर सकता है कि प्रोटोकॉल विकसित की है. IENFs के तीन आयामी विश्लेषण पी.एन. में IENF के morphological परिवर्तन का मूल्यांकन करने की क्षमता है.

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Dauch, J. R., Lindblad, C. N., Hayes, J. M., Lentz, S. I., Cheng, H. T. Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies. J. Vis. Exp. (74), e50331, doi:10.3791/50331 (2013).

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Abstract

त्वचा के एक पंच बायोप्सी आमतौर पर परिधीय पोलीन्यूरोपैथी 1,2 के निदान के लिए intraepidermal तंत्रिका फाइबर घनत्व (IENFD) यों के लिए प्रयोग किया जाता है. वर्तमान में, यह बाहर का पैर (डीएल) और लंबाई पर निर्भर polyneuropathies 3 के मूल्यांकन के लिए समीपस्थ जांघ (पीटी) से 3 मिमी त्वचा बायोप्सी इकट्ठा करने के लिए आम बात है. हालांकि, IENFs की multidirectional प्रकृति के कारण, यह दो आयामी (2 डी) इमेजिंग के विश्लेषण के माध्यम से तंत्रिका संरचनाओं ओवरलैपिंग की जांच के लिए चुनौतीपूर्ण है. वैकल्पिक रूप से, तीन आयामी (3 डी) इमेजिंग इस दुविधा के लिए एक बेहतर उपाय दे सकती है.

वर्तमान रिपोर्ट में, हम दर्दनाक न्यूरोपैथी (पीएन) के अध्ययन के लिए 3 डी इमेजिंग लागू करने के लिए तरीके प्रस्तुत करते हैं. IENFs की पहचान करने के लिए, त्वचा के नमूनों प्रोटीन जीन उत्पाद 9.5 (पीजीपी), एक पैन neuronal मार्कर के immunofluorescent विश्लेषण के लिए कार्रवाई कर रहे हैं. वर्तमान में, यह IENFD रोकते उपयोग कर छोटे फाइबर न्यूरोपैथी का निदान करने के लिए मानक अभ्यास हैbrightfield माइक्रोस्कोपी 4 का उपयोग पीजीपी immunohistochemistry द्वारा खनन किया. वर्तमान अध्ययन में, हम पीजीपी का उपयोग कर, कुल IENFD की पहचान करने के लिए डबल immunofluorescent विश्लेषण लागू, और nociceptive IENF, तंत्रिका वृद्धि कारक 5 के लिए एक (TRK ए), उच्च आत्मीयता रिसेप्टर tropomyosin रिसेप्टर काइनेज समझते हैं कि एंटीबॉडी के उपयोग के माध्यम से. पीजीपी और TRK एक एंटीबॉडी के साथ सह धुंधला IENF के फायदे स्पष्ट रूप से पीजीपी पॉजिटिव, nociceptive फाइबर धुंधला करके पी.एन. के अध्ययन के लाभ. ये फ्लोरोसेंट संकेत पी.एन. के साथ जुड़े IENF की nociceptive IENFD और morphological परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. फ्लोरोसेंट छवियों confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा अधिग्रहीत और 3 डी विश्लेषण के लिए कार्रवाई कर रहे हैं. 3 डी इमेजिंग आगे पी.एन. के साथ जुड़े morphological परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए आवर्ती क्षमताओं प्रदान करता है. साथ में ले ली, फ्लोरोसेंट सह धुंधला हो जाना, confocal इमेजिंग, और 3 डी विश्लेषण स्पष्ट रूप से पी.एन. के अध्ययन के लाभ.

Introduction

वर्तमान में, यह छोटे फाइबर न्यूरोपैथी 3, 6-8 निदान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो त्वचा पंच बायोप्सी से intraepidermal तंत्रिका फाइबर घनत्व, (IENFD) यों के लिए चिकित्सकों के लिए आम बात है. बायोप्सी बाहर का पैर (डीएल), पार्श्व malleolus ऊपर 10 सेमी, और समीपस्थ जांघ (पीटी), पूर्वकाल श्रोणिफलक रीढ़ 9 से नीचे 20 सेमी से ले रहे हैं. सभी IENF प्रोटीन जीन उत्पाद 9.5 (पीजीपी), एक पैन neuronal मार्कर 10-12 का उपयोग कर चिह्नित कर रहे हैं. वर्तमान में, यह मानक का उपयोग कर छोटे फाइबर न्यूरोपैथी का निदान करने के लिए अभ्यास brightfield माइक्रोस्कोपी 6 साथ पीजीपी धुंधला द्वारा निर्धारित IENFD. है साथ ही, कई अनुसंधान समूहों पीजीपी immunohistochemistry के 7-9 के लिए immunofluorescent प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है. छोटे फाइबर न्युरोपटी सामान्यतः न्यूरोपैथिक दर्द के साथ जुड़ा हुआ है. आगे दर्द प्रसंस्करण के लिए आवश्यक IENF की भूमिका को समझने के क्रम में, हम दर्द उत्पन्न कि फाइबर के साथ सह लेबल कुल IENF के लिए एक तकनीक विकसित की है. Nocicepविशेष रूप से Aδ ेश्य IENF, और सी फाइबर, पीजीपी साथ IENF के सह लेबलिंग और nociceptive मार्कर, tropomyosin रिसेप्टर किनासे A (TRK ए) 5 के माध्यम से अध्ययन किया जा सकता है. Trk एक nociception के विकास के लिए आवश्यक है कि तंत्रिका वृद्धि कारक के लिए उच्च आत्मीयता रिसेप्टर है. TRK एक पॉजिटिव nociceptive तंत्रिका तंतुओं पेप्टिडर्जिक फाइबर हैं कि एक्सप्रेस पदार्थ पी (सपा) और कैल्सीटोनिन जीन संबंधी पेप्टाइड (CGRP). इससे पहले, Lauria और उनके सहयोगियों पी.एन., 10 एक nociceptive मार्कर के साथ सह लेबलिंग पीजीपी पॉजिटिव IENF अध्ययन करने के लिए डबल लेबलिंग तकनीक लागू. हमारे पिछले अध्ययन में, हम TRK एक पॉजिटिव IENF, लेकिन नहीं TRK एक नकारात्मक IENF, दर्दनाक मधुमेह न्युरोपटी 5 के एक पशु मॉडल में upregulated थे कि प्रदर्शन किया. यह सह लेबलिंग तकनीक IENFD और पी.एन. के साथ जुड़े morphological परिवर्तन का अध्ययन करने की क्षमता कुल nociceptive IENFD की मात्रा का ठहराव तुलना करने की क्षमता प्रदान करता है. nociceptive IENF और कंपनियों कल्पना करने की क्षमताnociceptive IENFD लिए कुल IENFD के फिर मात्रा का ठहराव पी.एन. के साथ जुड़े दर्द की गंभीरता में उद्देश्य दर्द की उपस्थिति के सबूत, और संभवतः अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है. इस तकनीक को भी पशु मॉडल की त्वचा के लिए लागू है. पिछले अध्ययनों की तुलना में, मौजूदा प्रोटोकॉल 2 डी छवि विश्लेषण में हो सकता है कि त्रुटियों से बचने के लिए अवसर पैदा करने, 3 डी छवि विश्लेषण के लिए तरीके का वर्णन करता है.

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Protocol

हिस्सा: Immunohistochemistry

पृष्ठभूमि धुंधला पंच त्वचा बायोप्सी की 96 अच्छी तरह से थाली और रोकथाम की तैयारी मानव विषयों से एकत्र और लगानेवाला समाधान में 12-24 घंटे (2% 0.75 एम एल Lysine समाधान (7.4 पीएच) के साथ paraformaldehyde और 0.05 मिमी सोडियम periodate) के लिए incubated हैं 4 डिग्री सेल्सियस के रूप में पहले 8 वर्णित है. नमूने तो फिर बढ़ते मीडिया इष्टतम काटने तापमान (अक्टूबर), एक cryostat पर 50 माइक्रोन मोटी वर्गों में sectioned में एम्बेडेड, ऊपर 1 सप्ताह के लिए 4 से कम 20% ग्लिसरॉल डिग्री सेल्सियस के साथ खारा (पीबीएस) buffered फॉस्फेट में cryoprotected रहे हैं. नीचे वर्णित प्रोटोकॉल एक 96 अच्छी तरह से थाली में मुक्त अस्थायी immunohistochemistry गुजरना करने के लिए त्वचा वर्गों की अधिकतम संख्या संभव, 8 त्वचा वर्गों के लिए बनाया गया है.

दिन 1:

1. परत corneum में गैर विशिष्ट immunoreactivity की रोकथाम

  1. लेबल 96 अच्छी तरह से थाली चित्र 1 में दिखाया गया है. छवि आईटी 96 अच्छी तरह से थाली के 1 पंक्ति में प्रत्येक कुएं में पृष्ठभूमि धुंधला 11,12, रोकने के लिए प्रभावी विदेशी मुद्रा सिग्नल (छवि आईटी) के 150 μl जोड़ें.
  2. 96 अच्छी तरह से थाली की पंक्ति 2 और 3 में प्रत्येक कुएं में 1X पीबीएस के 150 μl जोड़ें.
  3. रोगी प्रति दो 50 माइक्रोन वर्गों मोल: डीएल में लिया बायोप्सी से एक अनुभाग, पीटी में लिया बायोप्सी से एक खंड. एक inoculating पाश (LeLoop) रूपात्मक क्षति से बचने के लिए अगले करने के लिए कुल्ला एक से वर्गों स्थानांतरित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. धीरे छवि आईटी युक्त, अच्छी तरह से 1 पंक्ति के एक व्यक्ति में, एक inoculating पाश का उपयोग कर, प्रत्येक 50 माइक्रोन खंड हस्तांतरण. एक फ्लैट घुमाव पर आरटी पर 30 मिनट के लिए छवि आईटी में वर्गों सेते हैं.
  4. आरटी पर 10 मिनट के लिए 1X पीबीएस (पंक्तियाँ 2 और 3) के साथ दो बार वर्गों कुल्ला. Rinses के बीच एक फ्लैट घुमाव पर अच्छी तरह से थाली रखें.

2. 5% बीएसए अवरुद्ध समाधान और 1% Rinsing समाधान की तैयारी

  1. बायोप्सी वर्गों छवि आईटी में incubating रहे हैं, समाधान अवरुद्ध 5% तैयारमोर्चे (5% बीएसए पूरी तरह घुल जब तक बीएसए, 0.3% TX-100, 0.1 एम पीबीएस भंवर समाधान).
  2. पंक्ति 4 से प्रत्येक कुएं में 5% बीएसए अवरुद्ध समाधान के 150 μl जोड़ें.
  3. एक inoculating पाश का प्रयोग, 5% बीएसए अवरुद्ध समाधान के व्यक्तिगत कुओं में वर्गों हस्तांतरण. एक फ्लैट घुमाव पर 1-2 आरटी पर घंटे के लिए 5% बीएसए अवरुद्ध समाधान में वर्गों सेते हैं.

3. प्राथमिक एंटीबॉडी के 1% बीएसए Rinsing समाधान और कमजोर पड़ने की तैयारी

  1. 5 वर्गों% बीएसए अवरुद्ध समाधान में incubating रहे हैं, 1% rinsing समाधान (1% बीएसए, 0.3% TX-100, 0.1 एम पीबीएस भंवर समाधान बीएसए पूरी तरह घुल तक) तैयार करते हैं.
  2. 5 वर्गों% बीएसए अवरुद्ध समाधान में incubating रहे हैं, 1% समाधान rinsing में प्राथमिक एंटीबॉडी पतला.
    1. आठ वर्गों (8 एक्स 150 μl = 1200 μl) के लिए 1,200 μl की कुल जरूरत है. प्राथमिक एंटीबॉडी 1500 μl (20% अतिरिक्त मात्रा के बारे में) में बना रहे हैं.
    2. प्राथमिक एंटीबॉडी की dilutions: पीजीपी, 1:500, TRK ए,1:500 1 में% BSA समाधान rinsing.

4. प्राथमिक एंटीबॉडी में sectioned बायोप्सी की ऊष्मायन

  1. 96 अच्छी तरह से थाली के नामित कुओं (पंक्ति 5) में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के 150 μl जोड़ें.
  2. नामित प्राथमिक एंटीबॉडी कुओं (पंक्ति 5) में 5% अवरुद्ध समाधान (पंक्ति 4) से वर्गों स्थानांतरण.
  3. सुखाने और प्रकाश जोखिम से बचने के लिए parafilm और एल्यूमीनियम पन्नी के साथ 96 अच्छी तरह से थाली सील.
  4. एक फ्लैट घुमाव पर 96 अच्छी तरह से थाली 4 पर हे / एन डिग्री सेल्सियस सेते हैं.

दिन 2:

5. 1% बीएसए Rinsing समाधान में बायोप्सी कुल्ला

  1. प्रत्येक पंक्ति 6 ​​में अच्छी तरह से, 7 और 8 में 1% बीएसए rinsing समाधान के 150 μl जोड़ें.
  2. आरटी पर 1 घंटा प्रत्येक समय के लिए 1% बीएसए rinsing समाधान (पंक्तियाँ 6, 7, और 8) के साथ वर्गों तीन बार कुल्ला. Rinses के बीच फ्लैट घुमाव पर एल्यूमीनियम पन्नी और जगह के साथ अच्छी तरह से कवर प्लेट.

6. माध्यमिक एंटीबॉडी के कमजोर पड़ने

<राजभाषा>
  • वर्गों (पंक्ति 8) 1% बीएसए rinsing समाधान की कुल्ला आखिरी में incubated हैं, वहीं 1% बीएसए rinsing समाधान में माध्यमिक एंटीबॉडी पतला:
    1. आठ वर्गों (8 एक्स 150 μl = 1200 μl) के लिए 1,200 μl की कुल जरूरत है. माध्यमिक एंटीबॉडी 1500 μl (20% अतिरिक्त मात्रा के बारे में) में बना रहे हैं.
    2. माध्यमिक एंटीबॉडी की dilutions: 1% बीएसए rinsing समाधान में TRK ए (एलेक्सा Fluor 647 गधा विरोधी बकरी, 1:250) के लिए पीजीपी (एलेक्सा Fluor 488 गधा विरोधी खरगोश, 1:250), के लिए.
  • 7. माध्यमिक एंटीबॉडी में sectioned बायोप्सी की ऊष्मायन

    1. 96 अच्छी तरह से थाली के उनके नामित कुओं (9 पंक्ति) में पतला माध्यमिक एंटीबॉडी के 150 μl जोड़ें.
    2. अच्छी तरह से माध्यमिक एंटीबॉडी में 1% बीएसए अवरुद्ध समाधान (पंक्ति 8) (9 पंक्ति) से वर्गों स्थानांतरण.
    3. सुखाने और प्रकाश जोखिम से बचने के लिए parafilm और एल्यूमीनियम पन्नी के साथ 96 अच्छी तरह से थाली सील.
    4. नामित माध्यमिक एंटीबॉडी हे में वर्गों सेते4 / एन ° एक फ्लैट घुमाव पर सी.

    8. 1% बीएसए Rinsing समाधान में बायोप्सी कुल्ला

    1. पंक्ति 10, 11, और 12 में एक कुएँ में 1% बीएसए rinsing समाधान के 150 μl जोड़ें.
    2. आरटी पर 1 घंटा प्रत्येक समय के लिए 1% बीएसए rinsing समाधान (पंक्तियाँ 10, 11, और 12) के साथ वर्गों तीन बार कुल्ला. Rinses के बीच एक फ्लैट घुमाव पर एल्यूमीनियम पन्नी और जगह के साथ अच्छी तरह से कवर प्लेट.

    9. माइक्रोस्कोप स्लाइड्स और बढ़ते sectioned बायोप्सी की तैयारी

    1. बायोप्सी वर्गों 1% बीएसए rinsing समाधान (पंक्ति 12) की कुल्ला आखिरी में incubating रहे हैं, खुर्दबीन स्लाइड तैयार करते हैं.
    2. एक समय में एक स्लाइड पर 1% बीएसए rinsing समाधान के 50 μl रखें.
    3. 1% बीएसए rinsing समाधान (पंक्ति 12) से वर्गों निकालें, और नामित खुर्दबीन स्लाइड पर 1% बीएसए rinsing समाधान के 50 μl ड्रॉप में जगह है. खंड की स्थिति के अनुकूलन के बाद, सावधानियों लेने, एक bulbed कांच विंदुक के साथ अतिरिक्त 1% बीएसए rinsing समाधान निकालनेनमूना छू से बचने के लिए.

    नोट: खंड से जोड़ नहीं है सुनिश्चित करें; नमूना खुर्दबीन स्लाइड की सतह के खिलाफ फ्लैट होना चाहिए.

    1. की जगह 1 बूंद खुर्दबीन स्लाइड पर बायोप्सी के पास DAPI साथ अभिकर्मक बढ़ते गोल्ड antifade लम्बा. एक 22x22 मिमी खुर्दबीन गिलास coverslip लो और धीरे बायोप्सी पर जगह और की एक बूंद DAPI गिरावट के साथ गोल्ड antifade अभिकर्मक लम्बा. प्रत्येक खंड के लिए दोहराएँ.
    2. अंधेरे में आरटी पर ओ / एन खुर्दबीन स्लाइड सूखी.

    नोट: एक विंदुक टिप का उपयोग कर किसी भी हवाई बुलबुले निकालें. गोल्ड antifade अभिकर्मक लम्बा दूर अतिरिक्त साफ कर लें.

    भाग ख: confocal इमेजिंग

    10. Confocal इमेजिंग

    1. एक 40X तेल विसर्जन (1.3 एनए) उद्देश्य और FluoView संस्करण 5.0 सॉफ्टवेयर के साथ ज़ूम दो बार के साथ confocal खुर्दबीन स्कैनिंग एक ओलिंप FluoView 500 लेजर का उपयोग कर छवि प्रतिदीप्ति संकेत है. क्रमश: 543 एनएम HeNe हरी लेजर और 633 एनएम HeNe लाल लेजर, उत्तेजित करने के लिए एलेक्सा Fluor 488 और एलेक्सा Fluor 647 का प्रयोग करें. एलेक्सा Fluor 488 संकेत एक लाल lut के द्वारा तालिका ऊपर एक हरे रंग की नज़र (lut) और एलेक्सा Fluor 647 का प्रतिनिधित्व करती है.
    2. संकेतों को बढ़ाने के लिए 400 माइक्रोन से कम प्रत्येक डिटेक्टर के लिए confocal apertures के सेट करें. अनुक्रमिक स्कैन संकेत जुदाई को अधिकतम करने के लिए 1024 x 1024 के एक प्रस्ताव पर लिया जाना चाहिए.
    3. Kalman औसत (दो फ्रेम) के साथ 1.2 माइक्रोन z कदम अंतराल (FluoView सॉफ्टवेयर द्वारा गणना इष्टतम स्कैन यूनिट के आधार पर) का उपयोग कर तीन आयामी Z-श्रृंखला पर कब्जा है.

    भाग सी: तीन आयामी दृश्य और एनिमेशन

    11. तीन आयामी (3 डी) दृश्य और एनिमेशन

    1. Imaris x 64 सॉफ्टवेयर में ओपन FluoView फ़ाइलों (संस्करण 7.3, Bitplane एजी) 3 डी छवि सेट कल्पना करने के लिए.
    2. समायोजित के रूप में तंत्रिका विशिष्ट संकेत के विपरीत बढ़ाने की जरूरत प्रदर्शित करते हैं.
    3. एक सु बनाएँत्वचीय-epidermal सीमा कल्पना करने rface. सीमा आकर्षित करने के लिए आकर्षित मोड में कंटूर उपकरण का उपयोग करें.
    4. अंतर्निहित फ्लोरोसेंट संकेतों को देखने के लिए सीमा के लिए एक अर्द्ध पारदर्शी सतह निरुपित.
    5. 3 डी फिल्म के फोटो चित्र बनाने के लिए 3 डी फ्लोरोसेंट संकेतों के अभी भी छवियों पर कब्जा.
    6. एक 3 डी फिल्म बनाने के लिए एनिमेशन सुविधा का उपयोग करें. छवियों (आंकड़े 2, 3, और 4) अलग और मर्ज किए गए प्रत्येक संकेत दिखाने के लिए 360 डिग्री कई बार घुमाया जा सकता है. प्रति सेकंड 15 तख्ते पर एनिमेटेड 200 फ्रेम से मिलकर फिल्में बनाने के लिए एनीमेशन सेट. एक कच्चे AVI फ़ाइल के रूप में प्रत्येक फिल्म को बचाओ.
    7. VirtualDub सॉफ्टवेयर (संस्करण 1.9.4) के साथ अंतिम AVI फिल्म सेक.

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    Representative Results

    हम पी.एन. के साथ रोगियों से पीटी और डीएल त्वचा बायोप्सी में IENF की आकारिकी अध्ययन करने के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल लागू. त्वचा, तीन विषयों से, पी.एन. के साथ जुड़े pathomorphology प्रदर्शित करने के यूटा विश्वविद्यालय में एकत्र किया गया था. विषयों में शामिल हैं: केस 1: टाइप 2 मधुमेह (: 14 महीने, दर्द स्कोर: अवधि 51), के पी एन के इतिहास के साथ एक 51 वर्षीय पुरुष केस 2: पी.एन. के इतिहास के साथ एक 56 वर्षीय पुरुष और केस 3: टाइप 2 मधुमेह (: 42 महीने, दर्द स्कोर: अवधि 46) की पी.एन. के इतिहास के साथ एक 66 वर्षीय पुरुष, टाइप 2 मधुमेह (:; 47 दर्द स्कोर 108 महीने की अवधि) के. मात्रात्मक संवेदी परीक्षण और तंत्रिका चालन अध्ययन सहित मस्तिष्क संबंधी इतिहास और परीक्षा, परिधीय न्यूरोपैथी का आकलन करने के लिए प्रदर्शन किया गया. दर्द स्कोर 0-100 दृश्य अनुरूप दर्द पैमाने के आधार पर निर्धारित किया गया है.

    इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम मानव त्वचा में IENFs (चित्रा 2) के 3 डी संरचना का अध्ययन करने में सक्षम हैं. चित्रा 2 में (चित्रा 3) का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. चित्रा 3 में प्रस्तुत axonal सूजन, के 3 डी इमेजिंग इन सूजन IENFs साथ वितरित गोलाकार संरचना है कि दर्शाता है. इसके अलावा, इन तरीकों IENFs (चित्रा 4) में शाखाओं में अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. चित्रा 4 में प्रस्तुत शाखाओं की 3 डी छवियों morphological परिवर्तन पी.एन. की उपस्थिति के साथ उस जगह ले प्रदर्शित करता है. पहले से वर्णित है, त्वचीय-epidermal सीमा आकारिकी और अभिविन्यास नसों की और dermis और epidermis के बीच 8 पिक्सेल तीव्रता अंतर के आधार पर निर्धारित किया गया था. नीले आंकड़े 2, 3 में दर्शाया अनुरेखण, और 4, त्वचीय-epidermal जंक्शन इंगित करता है.

    चित्रा 1
    चित्रा 1. त्वचा बायोप्सी immunohistochemistry के लिए एक 96 अच्छी तरह से थाली के लिए सेटअप का प्रतिनिधित्व योजनाबद्ध आरेख.

    चित्रा 2. IENF के तीन आयामी (3 डी) छवियों. (ए) पीजीपी पॉजिटिव IENF के प्रतिनिधि 3 डी छवि, nociceptive IENF सेकंड (360 डिग्री रोटेशन) का प्रतिनिधित्व लाल लेबल कुल IENF (पहले 360 डिग्री रोटेशन) और (बी) TRK एक पॉजिटिव IENF, का प्रतिनिधित्व, ग्रीन लेबल, और (सी ) प्रकरण 1 से त्वचा के नमूने में पीजीपी पॉजिटिव, nociceptive IENF (तृतीय 360 डिग्री रोटेशन) का प्रदर्शन एक विलय छवि. बार = 20 माइक्रोन. फिल्म देखने के लिए यहां क्लिक करें.

    चित्रा3. पी.एन. की IENF में axonal सूजन के तीन आयामी (3 डी) छवि. केस 2 से एक त्वचा के नमूने में एक हरी झंडी साथ पीजीपी द्वारा लेबल IENFs साथ axonal सूजन (तीर) के और subdermal जाल भीतर प्रतिनिधि 3 डी छवि. बार = 10 माइक्रोन. फिल्म देखने के लिए यहां क्लिक करें.

    4 चित्रा. पी.एन. की IENF में शाखाओं में बंटी axonal के तीन आयामी (3 डी) छवि. प्रकरण 3 से एक त्वचा के नमूने में, एक हरी झंडी साथ पीजीपी द्वारा लेबल IENFs साथ axonal शाखाओं में बंटी (तीर) के प्रतिनिधि 3 डी छवि,. बार = 20 माइक्रोन. फिल्म देखने के लिए यहां क्लिक करें.

    5% बीएसए अवरुद्ध समाधान के घटक: 12.5 मिलीलीटर के लिए आवश्यक राशि
    1X पीबीएस 8.125 मिलीग्राम
    0.1% ट्राइटन X-100 (टेक्सास -100) [अंतिम एकाग्रता: 0.03%] 3.75 मिलीलीटर
    गोजातीय सीरम albumin (BSA) 0.625 ग्राम
    कुल 12.5 मिलीलीटर

    तालिका 1. 5% बीएसए समाधान अवरुद्ध.

    1% के घटक समाधान Rinsing: 12 मिलीलीटर के लिए आवश्यक राशि
    1X पीबीएस 8.625 मिलीग्राम
    0.1% TX-100 [अंतिम एकाग्रता: 0.03%] 3.25 मिलीलीटर
    गोजातीय सीरम albumin (BSA) 0.125 ग्राम
    कुल 12 मिलीलीटर

    तालिका 2. 1% बीएसए समाधान अवरुद्ध.

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    Discussion

    IENFD के मापन व्यापक रूप से परिधीय neuropathies 13,14 की डिग्री का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. वर्तमान में, सबसे अधिक इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल केवल epidermis के तहखाने झिल्ली घुसना कि तंत्रिका तंतुओं के घनत्व के उपाय, यह ध्यान में axonal शाखाओं में बंटी और / या नसों के morphological परिवर्तन नहीं ले करता है. इसके अलावा, मौजूदा IENFD विश्लेषण पी.एन. 15 में दर्द की उपस्थिति के साथ IENFD सहसंबंधी नहीं दिखाया गया है.

    हम पहले से nociceptive IENFD की बढ़ी संख्या डीबी / डीबी चूहों में दर्द व्यवहार, टाइप 2 मधुमेह 5 के एक माउस मॉडल के साथ जुड़े रहे हैं की सूचना दी. उस रिपोर्ट में, हम पहले nociceptive IENF अध्ययन करने के लिए एक डबल immunofluorescent प्रोटोकॉल लागू. वर्तमान अध्ययन में, हम पी.एन. के साथ रोगियों से मानव त्वचा के लिए हमारे प्रोटोकॉल का विस्तार. डबल immunofluorescent विश्लेषण कि मध्यस्थता IENFs के सबसेट, कुल IENF और nociceptive IENF दोनों का मापन प्रदान करता हैदर्द. ये nociceptive IENF TRK एक और अन्य nociceptive neuropeptides 5 के लिए ज्यादातर सकारात्मक रहे हैं. दर्दनाक न्यूरोपैथी के लिए इसी तरह के डबल immunofluorescent विश्लेषण Lauria और उनके सहयोगियों ने 10 से वर्णित किया गया है. वे सूचना दी दर्दनाक न्यूरोपैथी के साथ रोगियों में क्षणिक रिसेप्टर संभावित कटियन चैनल उपपरिवार वी सदस्य 1 (TRPV1) के लिए IENFD कम कर दिया. मौजूदा प्रोटोकॉल हमारे पशु डेटा 5 पर आधारित nociceptive IENFD की माप के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रदान कर सके.

    मौजूदा प्रोटोकॉल IENF संरचना के अध्ययन के लिए एक 3 डी दृष्टिकोण प्रदान करता है. डबल immunofluorecent विश्लेषण के साथ संयोजन में, मौजूदा प्रोटोकॉल nociceptive IENFs की आकारिकी की जांच करने के लिए तरीके प्रदान करता है. पिछले अध्ययनों घनत्व के बीच या पी.एन. साथ nociceptive IENF की शाखाओं में एक संघ की सूचना नहीं है. यहाँ, हम axonal मानव त्वचा की IENFs में शाखाओं में बंटी और सूजन के अध्ययन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदर्शित करता है. हमारे 3 डी विश्लेषण से पता चलता है कि इस मीटरethod पी.एन. में IENF के morphological परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, 3 डी इमेजिंग 2 डी इमेजिंग के साथ जुड़े अतिव्यापी संरचनाओं के कम दृश्य के साथ जुड़े रहे हैं कि त्रुटियों से बचने के द्वारा IENFD माप की मौजूदा प्रोटोकॉल में सुधार सकता है.

    Axonal सूजन से अधिक दो बार मूल axonal क्षमता 16 की है कि एक व्यास के साथ एक axonal भाग की एक वृद्धि के रूप में परिभाषित किया गया है. यह संरचना axonal cytoskeleton है और axonal परिवहन के घटकों के टुकड़े शामिल हैं. Axonal सूजन axonal न्यूरोपैथी 6,16,17 का एक प्रारंभिक विशेषता माना जाता है. हालांकि, axonal सूजन संरचनाओं के 3 डी विश्लेषण साहित्य में सूचित नहीं किया गया है. 3 चित्र में दिखाया गया के रूप में, 3 डी इमेजिंग पी.एन. के साथ जुड़े axonal सूजन के लिए महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकता है.

    यह अच्छी तरह से axonal शाखाओं में तंत्रिका चोट 18 से वसूली के साथ जुडा हुआ है कि विशेषता है. हालांकि,axonal शाखाओं बढ़ाता के लिए उपलब्ध पद्धति अभी भी 2 डी इमेजिंग के आधार पर सीमित है. चित्रा 4 में वर्णित है, axonal शाखाओं regenerating के नसों के कपटपूर्ण प्रकृति से जटिल हो सकता है. नतीजतन, शाखाओं में बंटी अंक मात्रा का ठहराव की शुद्धता को प्रभावित करने के लिए पास तंत्रिका तंतुओं से छिप जा सकता है. हमारे प्रोटोकॉल के 3 डी इमेजिंग विश्लेषण शाखाओं में नसों के विवरण के लिए बेहतर दृश्य प्रदान करता है.

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    Disclosures

    ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा करने के लिए.

    Acknowledgements

    इस काम के स्वास्थ्य अनुदान के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया K08 NS061039-01A2, न्यूरोलॉजी अनुसंधान और डिस्कवरी, और मिशिगन विश्वविद्यालय में ए अल्फ्रेड Taubman चिकित्सा अनुसंधान संस्थान के लिए कार्यक्रम. इस काम आकृति विज्ञान और मधुमेह और पाचन और गुर्दा रोग के राष्ट्रीय संस्थान से स्वास्थ्य अनुदान 5P90 डी.के. 20,572 के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा वित्त पोषित मिशिगन मधुमेह अनुसंधान और प्रशिक्षण केन्द्र की छवि विश्लेषण कोर का इस्तेमाल किया. लेखकों nociceptive biomarker के immunohistochemistry तकनीक के प्रारंभिक विकास का समर्थन करने के लिए मानव त्वचा के नमूनों के अपने उदार दान के लिए रॉबिन्सन सिंगलटन और गॉर्डन स्मिथ (यूटा विश्वविद्यालय) को धन्यवाद देना चाहूंगा.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    10X PBS Fisher Scientific BP399-4 To make up 1X PBS
    Image-IT FX Signal Invitrogen I36933 Image-IT
    Protein Gene Product 9.5 (Polyclonal rabbit) AbD Serotec 7863-0504 PGP
    Tropomyosin Related-Kinase A (Polyclonal goat) R&D Systems AF1056 Trk A
    Alexa Fluor 488 donkey α-rabbit Invitrogen A21206 AF488 donkey α-goat
    Alexa Fluor 647 donkey α-goat Invitrogen A21447 AF647 donkey α-goat
    Albumin, from Bovine Serum Sigma-Aldrich A7906-100 BSA
    Triton X- 100 Sigma-Aldrich T9284 TX-100
    Non-calibrated Loop LeLoop MP 199025 inoculating Loop
    96-well assay plate Corning Incorporated 3603 Well plate
    Prolong Gold antifade reagent with DAPI Invitrogen P36931 DAPI
    Microscope Cover Glass 22x22 mm Fisher Scientific 12-541-B Coverslips
    Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15 Microscope Slides
    Olympus Fluoview Laser Scanning Confocal Microscope Olympus FV500 Confocal Microscope
    Optimum Cutting Temperature Sakura 4583 OCT
    Leica cryostat Leica CM1850 Cryostat

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    References

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