일반적인 액체 취급 로봇에 TruTip 기술을 사용하여 임상 샘플에서 DNA와 RNA의 높은 처리량, 자동 추출

Bioengineering
 

Summary

TruTip은 다공성, 모 놀리 식 바인딩 행렬 피펫 팁에 삽입 그것에 간단한 핵산 추출 기술입니다. 따라서, 샘플 준비 형식은 대부분의 액체 취급 장비와 호환되며, 높은 처리량 임상 응용 및 샘플 유형에 여러 매체에 사용할 수 있습니다.

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Holmberg, R. C., Gindlesperger, A., Stokes, T., Brady, D., Thakore, N., Belgrader, P., Cooney, C. G., Chandler, D. P. High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots. J. Vis. Exp. (76), e50356, doi:10.3791/50356 (2013).

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Abstract

TruTip은 다공성, 모 놀리 식 바인딩 행렬 피펫 팁에 삽입 그것에 간단한 핵산 추출 기술입니다. 기둥의 형상은 1.0에서 5.0 ML에 볼륨까지 특정 피펫 팁을 적용 할 수 있습니다. 모노리스의 큰 기공은 쉽게 최소한의 유체 배압으로 통과 점성 또는 복잡한 시료 수 있습니다. 양방향 흐름은 기둥과 샘플 사이의 체류 시간을 극대화하고 단일 TruTip 내에서 처리 할 큰 샘플 볼륨을 할 수 있습니다. 에 관계없이 샘플 볼륨 또는 TruTip 기하학의 기본 단계, 세포 용해, TruTip 모노리스의 내부 기공에 바인딩 핵산, 언 바운드 샘플 구성 요소 및 용해 버퍼를 씻어하고, 적절한 버퍼로 정제 농축 핵산 용출 있습니다. TruTip의 특성과 적응성이 에펜 도르프 epMotion 5070를 사용하여 세 개의 자동화 된 임상 샘플 처리 프로토콜에 설명되어 있습니다해밀턴 스타와 비 인두 흡인, 전체 혈액에서 게놈 DNA 분리 및 태아 DNA 추출 및 모체 혈장의 대량 (각각)에서 농축로부터 RNA 분리 등 STARplus 액체 처리 로봇.

Introduction

핵산 정제는 대부분의 분자 진단에 대한 연구는 사용할 필요하고, 생명 과학 응용 프로그램. 다양한 방법이 클로로포름 / 페놀 추출의 시간 이후 등장, 그 중 많은 chaotropic 소금 1의 존재 실리카에 바인딩 핵산의 기본 원칙을 기반으로하고 있습니다. 추출 과정은 (2-13 예제를 참조하십시오) 스핀 필터, 자석 구슬 및 생명 과학 산업을 지배하는 관련 방법과 다양한 비드와 멤브레인 기반 형식의 사용을 통해 간소화 및 자동화하고있다. 효과적인 동안 도전적인 임상 행렬에 직면했을 때, 입자 막은 한계를 알고있다. 예를 들어, 세포막 비드 기반의 열 준수, 작은 기공 크기 (즉, 하이 백 압력)이 있고, 원심 분리기 또는 진공 시스템에서 처리 할 수​​ 있도록 지원의 일부 유형을 필요로합니다. 세포막의 물리적 특성 및 비드 열 결과효율적 소모품 및 / 또는 유니 방향성 흐름 경로를 통해 처리 할 수​​있는 총 (입력) 샘플 볼륨을 막힘없이 처리 할 수​​있는 샘플의 종류를 제한하는 중요한 유체 저항. 반대로, 자석 입자를 교반하여 샘플에 배포해야합니다. 균일 솔루션 내에서 자성 입자를 배포 할 필요는 대부분의 자기 비드 소모품으로 처리 할 수​​있는 총 입력 샘플 볼륨을 제한합니다. 임상 샘플 속성 (예 : 점도 복잡성) 관 또는 막대의 측면에서 비효율적 자기 입자 농도로 이어질 수 있습니다. 또한, 실리카 미세 입자들이 자기를 잃고 최종 샘플을 오염, 추출 과정에서 구슬을 해소 할 수 있습니다.

TruTip 기술은 이러한 핵산 시료 처리 조건 및 제한 사항 14 중 일부를 극복하기 위해 개발되었다. 내 다공성 모노리스를 포함하여피펫 팁, 유체의 배압이 저하되어 진공 (즉, 피펫 흡인)에서 흐름 제어를 가능하게하는. 이 기능은 크게 (그림 1) 간소화하기 어려운 종류의 시료에서 핵산을 정화하는 데 필요한 추출 과정과 계측을 할 수 있습니다. 기둥의 형상과 다공성 모노리스의 두께가 1.0에서 5.0 ML에 이르기까지 샘플 볼륨에 대한 충분한 핵산 결합 용량을 제공하면서, 막힘 최소화하기 위해 지어진다. 시료 흡입 및 토출 동안 양방향 흐름은 샘플 추출하고 효율적인 핵산 복구 및 용출에 대한 바인딩 기둥 사이에 장기 체류 시간을 허용하고 피펫 팁 자체의 볼륨 용량을 초과하는 처리 할 상대적으로 큰 샘플 볼륨을 할 수 있습니다. 우리는 이전에 단일 또는 멀티 채널 라이를 사용하여 인두 샘플에서 인플루엔자 RNA를 정제하기위한 수동 TruTip 절차의 개발 및 응용 프로그램을보고닌 피펫 15. 동등한 추출 효율은 10 6 유전자 사본에 자동 QIAcube 및 수동 TruTip 방법 사이에 인플루엔자 ml 당 인두 흡인을 하였다. 본 연구의 목적은 일반적 참고 임상 실험실에있는 액체 처리 로봇을 사용하여 비 인두 흡인 (NPA) 및 기타 임상 관련 샘플 유형에 대한 중간 및 높은 처리량, 자동화 TruTip 핵산 정화 절차를 시연했다.

Protocol

세 자동화 TruTip 추출 프로토콜을 설명하고 여기에 설명되어 있습니다 : 에펜 도르프 epMotion 5070에서 NPA에서 1) 중간 처리 RNA 추출, 2) 해밀턴 STAR에 전체 혈액의 낮은 볼륨에서 높은 처리량 게놈 DNA 추출, 3) 선택적 분리 와 해밀턴 STARplus에 산모의 혈장 큰 볼륨에서 조각난 태아 DNA의 농축. 자동화 된 스크립트는 Akonni에서 사용할 수 있습니다 만 높은 수준의 프로그램 설명이 여기에 제공됩니다. 임상 샘플을 처리하기 전에 추출 및 용출 시약은 자동으로 자동 스크립트 (들)에 의해 대량 시약 골짜기에서 96 - 웰 플레이트에 분주합니다.

1. 인두 흡입 물에서 자동화 된 RNA 추출

앞에서 설명한 수동 TruTip 방법 15 현재 1.0 ML Eppendorf의 파이프에 포함 된 큰 기공 TruTip 행렬을 사용하여 에펜 도르프 epMotion 5070 액체 처리 로봇에서 실행하도록 구성되어 있습니다쿠스코 팁 2 ㎖ 깊은 웰 플레이트 (USA 과학), Akonni TruTip 추출 시약 및 NPA 샘플 형식으로. epMotion 5070 액체 처리 로봇이 동시에, 그래서 기본 자동화 프로토콜은 8 병렬 추출에 대한 설명 8 개의 끝까지 넣을 수 있습니다. 그러나 최대 24 샘플은 하나의 깊은 잘 96 - 웰 샘플 플레이트에 하나의 프로그램 중에 처리 할 수​​ 있습니다. 별도의 epM​​otion 프로그램은 16 또는 24 샘플을 처리하기 위해 (그리고 필요)를 이용하실 수 있습니다. 아래에서 설명하는 프로토콜은 8 샘플 자동 스크립트입니다.

설정

  1. 추출을 시작하기 전에 RT에 인두 샘플을 가져옵니다.
  2. 샘플 플레이트 (그림 2A)의 열 1에 100 ㎕의 비 인두 흡인 플러스 150 μL nuclease가없는 물을 분배.
  3. epMotion 작업대 (그림 2B)에 위치 B1에 샘플 판을 놓습니다.
  4. 장소 피펫 팁, TruTips과 각각의 epM​​otion의 Worktab 위에 30 ML 시약 골짜기르 위치 (그림 2B).
  5. 에펜 도르프 epBlue 소프트웨어를 열고, 8 샘플 Akonni에서 제공하는 실행 파일을 선택하고 RUN 탭에서 RUN 버튼을 클릭하여 방법을로드합니다.
  6. 레벨 센서 설정에서 레벨 및 팁을 선택하고 실행 버튼을 클릭합니다.
  7. 소프트웨어에 입력 샘플 볼륨을 실행을 클릭합니다.
  8. epMotion 스크립트는 사용자가 작업대에 위치 B2에있는 시약 저수지 추출 및 용출 시약을 추가하라는 메시지가 표시됩니다. 각각의 통에 각 시약의 권장 볼륨을 추가합니다. 8 샘플, 최소 시약 볼륨은 다음과 같습니다
시약 볼륨 (ML) 여물통 위치
95 % 에탄올 3.5 2
버퍼 D 세척 9.0 3
버퍼 E 세척 9.0 4
용출 버퍼 A2 1.3 5
용해 및 바인딩 버퍼 D 11.0 6
  1. 위의 8 단계에서 프롬프트 동안 epMotion 소프트웨어에 의해 제시된 표에 입력 시약 볼륨을. 입력 값은 각 각 시약 저장소에 사용자가 분배 버퍼의 실제 양을 반영해야하며,보다 크거나 위에서 언급 한 최소한의 볼륨 같아야합니다. 잘못된 볼륨 항목은 96 - 웰 플레이트 (들)의 각 튜브 또는 잘하는 epMotion 하드웨어에 의해 전달 잘못된 볼륨이 발생할 수 있습니다.

자동화 프로그램

  1. 자동화 된 방법을 시작하려면 실행을 선택합니다. 자동화 된 스크립트는 사용자 개입없이 다음 단계로 이동합니다 :
    샘플 용해 및 시약 유통 :
    1. 열 1에 375 μL 용해 버퍼 D를 분배하고 10 혼합사이클 (+ = 1 사이클을 분배 apirate). 남은 시약을 분주하는 동안이 단계는 용해 배양 프로세스를 시작합니다.
    2. 열 (2)에 1.6 ML 세척 버퍼 D를 분배.
    3. 3 열에 1.6 ML 세척 버퍼 E 분배.
    4. 이 칼럼 4에 50 μL 용출 버퍼를 분배.
    5. 용해 버퍼에서 10 분 샘플 배양을 완료하는 6 분 동안 일시 중지 D.
    6. 10 피펫 사이클을 통해 에탄올로 각 시료를 혼합, 열 1의 각 well에 375 ㎕의 에탄올을 추가합니다.
    추출 :
    1. 작업대에 위치 A2에서 8 TruTips을로드하고, 그림 1에 나와있는 추출 프로세스를 시작합니다.
    2. 기음과 TruTip 기둥에 핵산을 바인딩하는 일곱 사이클의 샘플 플레이트의 1 열에서 시료 / 용해 버퍼 / 에탄올 혼합물을 분배. (임상 시료의 점도 차이로 인해) TruTip을 통해 샘플의 흐름은 다를 수 있지만, 이러한 샘플에 대한 핵산 생산량은 없었다t는 유량 변화에 의해 영향을 미쳤다. 샘플 흐름을 개선하기위한 옵션은 토론에 설명되어 있습니다.
    3. 잔류 용해 버퍼와 샘플 매트릭스를 제거하는 샘플 플레이트 2 열 및 기둥에 배 사이클 워시 버퍼 D에 TruTips 이동합니다.
    4. 샘플 플레이트 열 3, 바인딩 핵산에서 단백질 및 기타 오염 물질을 제거하기 위해 기둥에 배 사이클 세척 버퍼 E에 TruTips 이동합니다.
    5. 모노리스를 건조하는 빈 시약 저수지 위치 1 (작업대 위치 B2에서) 및 사이클 80X (빠른 유속)에 TruTips 이동합니다. 용출 된 핵산 제제의 잔류 용매에 부정적인 같은 역전사 효소와 DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소와 같은 효소에 영향을 미치기 때문에 그것은 철저하게 TruTip 건조하는 것이 중요합니다.
    6. 추출 및 정제 핵산 샘플 플레이트 4 열 우물에서 용출 버퍼에 지금 용출 버퍼 A.에서 배 샘플 플레이트 열 4주기 TruTips 이동합니다.
    7. epMotion 폐기물 빈에 TruTips를 꺼냅니다.

총 16 개의 샘플 프로그램 샘플 플레이트 열에게 5-8를 사용하여 10.13 단계 10.1 반복합니다. 24 샘플 프로그램, 10.13 통해 10.1 단계가 반복되는 배 샘플 플레이트 열을 각각 5-8과 9-12를 사용하여.

2. 전체 혈액의 96 - 웰 게놈 DNA 추출

해밀턴 STAR 액체 처리 로봇은 전체 혈액에서 동시에 96 샘플 자동 추출을 설명하는 데 사용됩니다. 해밀턴 STAR는 옵션 히터 / 셰이커 장치가 특정 임상의 효소 소화에 중요한 갑판에 사용할 수있는 epMotion 시스템에서 다른같은 전혈로 교정 행렬. 시스템은 96 채널 피펫 헤드를 장착 할 수 있기 때문에, TruTip 단계 및 시약의 각각 전용 96 - 웰 플레이트가있다.

설정

  1. STAR 악기와 컴퓨터를 켭니다.
  2. 해밀턴 실행 제어 소프트웨어를 엽니 다.
  3. 96 샘플 Akonni에서 제공하는 실행 파일을 엽니 다.
  4. STAR 갑판 위에 장소는 실험 실용 그림 3과 같이.
  5. 해당 골짜기 (볼륨 96 샘플을 처리하는 데 필요한 최소를 나타냅니다)에 시약을 분주 :
시약 볼륨 (ML) 여물통 위치
용해 및 바인딩 버퍼 F 75 5
95 % 에탄올 100 6
버퍼 J 세척 175 7
세척버퍼 K 175 8
용출 버퍼 A2 12 9
단백질 분해 효소 K (20 MG ML -1) 8 15

6. 샘플 RT 평형을 할 수 있습니다.

7. 샘플 캐리어 랙 (그림 3 갑판의 위치 4)의 샘플 튜브를 놓습니다. 맨 왼쪽 캐리어의 뒤쪽에 위치 예제 1을 전면 오른쪽 위치에 샘플 96 결말 각 캐리어 아래로 순차적으로 이동합니다.

자동화 프로그램

  1. 실행 파일 창 및 입력 처리되는 샘플 수의 왼쪽 상단에있는 PLAY 버튼을 선택합니다. 자동화 된 스크립트는 사용자 개입없이 다음 단계로 이동합니다 :
    샘플 용해 및 시약 유통
    1. 그는 각 샘플 튜브의 위치 14에서 배양 플레이트에 200 μl를 전송합니다ater에 / 뿌리 모듈 (그림 3).
    2. 배양 플레이트의 각 잘 샘플에 80 ㎕의 단백질 분해 효소 K 분배.
    3. 배양 플레이트의 각 웰에 600 μL 용해 버퍼 F를 분배.
    4. 10 사이클 솔루션을 혼합 후 ° C, 500 rpm으로 70 20 분 동안 품어. 70 ° C 설정 온도 ~ 60 결과 ° 단백 분해 효소 K 활동의 범위 안에 깊은 우물 격판 덮개, 내 C 시료 온도. 샘플을 배양하는 동안, 액체 처리 시스템은 해당 판 우물에 시약을 조제하여 운영을 계속 :
      • 위치 13에서 깊은 우물 플레이트의 각 웰에 100 μL 용출 버퍼.
      • 위치 10에서 깊은 우물 플레이트의 각 웰에 800 ㎕의 에탄올.
      • 위치 12시 딥 웰 플레이트에 1.6 ML 세척 버퍼 K.
      • 위치 11에서 깊은 우물 플레이트의 각 웰에 1.6 ML 세척 버퍼 J.
    5. 폐기물 빈에 시약 팁을 꺼냅니다.
      추출
      gDNA를 피 절차의이 부분은 세척 시약 및 사이클 수의 구성을 제외 epMotion 인플루엔자 프로토콜과 매우 비슷합니다. 해밀턴 TruTips 끝은 검은 색이다, 그래서 TruTip을 통해 액체의 흐름을 볼 수 없습니다.
    1. 갑판 위치 3에서 96 TruTips을로드합니다.
    2. 대기음 샘플 / TruTip 기둥에 핵산을 바인딩하는 10주기 위치를 10 용해 버퍼 / 에탄올 혼합물을 분배.
    3. 잔류 용해 버퍼와 샘플 매트릭스를 제거하는 모노리스에 11 배 사이클 세척 버퍼 J의 위치를​​ TruTips 이동합니다.
    4. 12 바인딩 핵산에서 단백질 및 기타 오염 물질을 제거하기 위해 배 사이클 세척 버퍼 K 위치를 TruTips 이동합니다. 사이클 고속 40X TruTip 건조한 공기.
    5. 위치 13 용출 버퍼 A2에서 배주기 TruTips 이동합니다. 추출 및 정제 핵산 깊은 우물 플레이트 용출 버퍼에 지금이다.
    6. 폐기물 빈에 TruTips를 꺼냅니다.

프로그램이 완료되면, 악기에서 용출 플레이트를 제거하고 저장 또는 다운 스트림 응용 프로그램에 대한 적절한 튜브로 추출 된 샘플을 전송합니다.

3. 대량의 플라즈마 샘플에서 DNA 추출

해밀턴 STARplus 기기는 산모의 혈장 5 ㎖에서 태아의 DNA를 순환 자유롭게 추출하기위한 자동화 된 프로토콜을 설명하는 데 사용됩니다. STARplus 시스템은 두 자동 피펫 채널 팔, 8 × 5 ML 채널을 하나의 8 x 1 ML 채널을 지원할 수 있습니다. 이 무기는 8 샘플을 각 배치에 정열 처리를 위해 병렬로 작동 할 수 있습니다. 5 ML의 TruTip은 초기 L에 사용됩니다ARGE 볼륨을 추출하고, 1 ML의 TruTip는 크기를 분리하고 추출 된 핵산의 추가 농축에 사용됩니다.

셋업

  1. STARplus 악기와 컴퓨터를 켭니다.
  2. 해밀턴 실행 제어 소프트웨어를 엽니 다.
  3. 8 대용량 플라즈마 샘플 Akonni에서 제공하는 실행 파일을 엽니 다.
  4. 그림 4와 같이 STARplus 갑판 위에 장소는 실험 실용.
  5. 해당 저수지에 시약을 분주 :
시약 볼륨 (ML) 여물통 위치
CN-W1 17 5A
CN-W2 17 5B
CN-W4 21 5C
단백질 분해 효소 K (20 MG ML -1) 5 6A
EBB 17 6B
EBA2 5 66
CN-W3 5 6D
CN-B2 5 6E
CN-B3 5
CN-L1 52 7
CN-B1 175 8
  1. 샘플 RT 평형을 할 수 있습니다.
  2. 샘플 캐리어 랙 (그림 4 갑판의 위치 3)의 샘플 튜브를 놓습니다. 후면 장소 예제 1과 데크의 앞쪽으로 순차적으로 이동합니다.

자동화 프로그램

때문에 큰 입력 샘플 볼륨, 용해 및 균질화 단계는 물을 욕조에 해밀턴 STARplus 기기의 전원을 수행해야합니다. 자동화 된 프로토콜에서 사용자의 개입을 필요로하는 단계는 beginnin에 별표 (*)로 표시됩니다문장, 굵은 체의 g.

샘플 용해 및 시약 유통 : 샘플이 샘플을 균질화하고 DNA를 분리 단백 분해 효소 K와 용해 버퍼 배양한다.

  1. 실행 파일을 윈도우의 왼쪽 상단에있는 PLAY 버튼을 선택합니다. 샘플의 입력 수는 갑판에 피펫 팁의 위치 및 갑판에 TruTips의 위치를​​ 처리하는.
  2. 자동화 된 스크립트는 615 ㎕의 단백질 분해 효소 K, 5 ML 플라즈마, 각 50 ML 원뿔 튜브 6.2 ML 용해 버퍼 CN-L1을 추가됩니다 다음 PAUSE.
  3. * 높은 속도에 30 초 샘플 데크, 소용돌이에서 50 ML 원뿔 튜브를 제거하고 60 ° C의 물을 욕조 또는 열 블록에서 30 분 동안 오프 라인을 배양한다. 원뿔 튜브 해밀턴 갑판에서 제거 된 후, 각각의 판 우물 (그림 4B와 4C)에 시약을 분배 계속해서 자동화 된 스크립트를 재시작 : 2 위치 9 열 1의 모든 다른 잘 ml로 CN-W1.
  4. 2 ㎖ CN-W2 위치 9 열 2의 모든 다른 잘합니다.
  5. 2 ㎖ CN-W4 위치 9 열 3의 모든 다른 잘합니다.
  6. 위치의 모든 다른 잘 ~ 250 μl를 EBA2 9 열 4와 5.
  7. 위치 10 열 1의 모든 다른 잘에 495 ㎕의 CN-B2.
  8. 위치 10 열 2의 모든 다른 잘 1 ML의 EBB.
  9. 위치 10 열 3의 모든 다른 잘 ~ 500 μl의 CN-W3.
  10. 500 μL CN-W4 위치에 모든 다른 잘 10 열 4.
  11. 위치 10 열 다섯의 모든 다른 잘 50 μL EBA2.

5 ML 채널 갑판 위치 9 깊은 우물 격판 덮개의 다른 모든 우물에 각 샘플에 대한 인접 우물, 자동 프로그램 분배 시약을 사용하기 너무 넓은 때문이다. 1 ML 채널에 사용되는 기계 팔은 배제 농도 성을위한 시약 접시에 다른 모든 우물의 사용을 필요로프로토콜의 EPS입니다.

분배 시약 후, 프로그램이 일시 중지됩니다.

  1. * 30 분 후, 60 ° C 배양, 5 분 동안 얼음에 50 ML 원뿔 튜브를 놓습니다.
  2. * 갑판의 위치 4에서 샘플 캐리어 랙 내에서 원래 위치로 50 ML 원뿔 튜브를 반환하고 자동화 된 스크립트를 다시 시작합니다.
  3. 각 샘플 튜브에 12 ML 바인딩 버퍼 CN-B1를 추가하고 배 섞는다.

대량 추출 : 5 ML의 TruTips이 용해 혈장 시료에서 총 DNA를 추출하는 데 사용됩니다.

  1. 대량의 핵산 추출 위치 2에서 5 ML TruTips을 선택합니다.
  2. 주기 샘플 50 ML 원뿔 튜브 mixture15 배, 튜브의 바닥에서 시작하여 각 피펫주기 후 높은 3mm를 이동. 이 단계는 TruTip 기둥에 총 핵산을 바인딩합니다.
  3. 위치에 깊은 우물 격판 덮개에 6 열 1 및 CY를 TruTips를 이동워시 버퍼 CN-W1에서 사이클 1X.
  4. 세척 CN-W2 9 열 2주기 1X 위치를 TruTips 이동합니다.
  5. 9 열 3 세척 CN-W4의 사이클 배의 위치를​​ TruTips 이동합니다.
  6. 바인딩 행렬을 건조하는 높은 속도 40 배 9 열 4 사이클의 위치를​​ TruTips 이동합니다.
  7. 5 ML의 TruTips에서 바인딩 된 핵산 용출하는 배 9 열 5와주기를 배치 TruTips 이동합니다. 이 대량의 용출 # 1.
  8. 열 6 TruTips를 이동하고 용출 버퍼의 두 번째 나누어지는을 가진 단계를 반복합니다. 이 대량의 용출 # 2.
  9. 용출 # 1와 결합하고, TruTips을 폐기 위치 9 열 5로 용출 # 2 전송합니다.

제외 및 농도 : 고 분자량 DNA는 추출 된 샘플에서 제거되고 나머지 DNA는 격리되어 집중했다.

  1. 10 1 열을 배치하고 철저하게 배 혼합 22 단계에서 결합 용출액을 추가합니다.
  2. 1 ML TruTi 픽업기둥에 고 분자량 DNA를 바인딩 할 위치 13주기를 20 배에서 PS.
  3. 팁을 씻어 고 분자량 DNA를 제거하는 배 10 열 2주기를 배치 TruTips 이동합니다. TruTips은 유지 및 위치 13의 팁 랙에 다시 배치됩니다.
  4. 위치 12에서 시약 팁, 위치 10X 10 열 1과 혼합의 샘플에 바인딩 버퍼 CN-B3의 575 μl를 추가합니다.
  5. 25 단계에서 TruTips를 들고, 1 ML의 TruTip에 샘플에 남아있는 DNA를 바인딩하는 10 열 1 및 사이클 20 배의 위치를​​ 반환합니다.
  6. 남은 억제제를 제거하는 세척 CN-W3에서 10 열 4 사이클 1X 위치를 TruTips 이동합니다.
  7. CN-W3에서 잔류 염을 헹구어 세척 CN-W4 10 컬럼 5, 사이클 1X 위치를 TruTips 이동합니다.
  8. 위치에 기둥을 건조 35 배의 도움말을 통해 10 열 5와 순환 공기를 TruTips를 올립니다.
  9. 정제, 사이즈 셀렉을 용출하는 EBA2에서 10 배 10 열 6주기를 배치 TruTips를 이동테드 집중 핵산.
  10. TruTips 폐기하십시오.
  11. 위치 11 열 6-1.5 ML 튜브에서 용출 샘플을 전송합니다. 추출 된 샘플 저장 및 다운 스트림 처리를위한 준비가되어 있습니다.

Representative Results

NPA에서 인플루엔자 RNA 추출을위한 실시간 PCR 데이터는 그림 5A에 표시됩니다. 예상 핵산 추출 효율은 프로토콜 15의 수동 버전으로 얻은 결과와 유사하다. 평균 C t 값의 선형 응답이 평균 C t의 표준 편차 이하 1 값으로 6 4 10 ~ 10 유전자 사본 ML -1, (A와 B 독감 = 0.99 및 0.98, 각각 R 2) 인플루엔자 개정 관찰 주기. epMotion 시스템과 교차 오염의 부재 10 6 유전자의 사본 ML -1 NPA를 포함하는 12 개의 긍정적 인 NPA 샘플을 12 버퍼 공백으로 산재 된 그림 5b에 설명되어 있습니다. 양성 대조군의 평균 C t는 ± 0.14 30.16이고, 모든 버퍼 공백 음성이었다. 전체 샘플 처리 시간은 각각 8, 16, 24 샘플 16, 28, 40 분입니다.전형적인 임상 인두 흡인이나 면봉 10 7 유전자 사본 ML -1을 포함하기 때문에 (1,000 TCID 당 비리 50 16 가정> 10 4 TCID 50 ML -1 독감 17), 자동 epMotion 프로토콜은 대부분의 효과가 기대된다 임상 NPA의 표본.

인간 게놈 DNA에서 수행 분자 시험의 범위를 감안할 때, 전체 혈액에서 핵산 추출의 주요 목적은 오염 물질이없는, 높은 분자량의 게놈 DNA를 생산하는 것입니다. 96 샘플 자동화 프로토콜 (예 : Promega 사 MagneSil = 90 분, Qiagen의 QIAamp DNA 혈액 BioRobot MDX 시스템 = 2.5 시간). 그림 6A는 UV / VIS 흡광 프로필을 보여 다른 자동화 된 시스템을 통해 개선 1 시간 내에 완료 평균과, 해밀턴 STAR 프로토콜에 45 시약 공백으로 동시에 처리 45 개의 긍정적 인 혈액 샘플 230분의 260 비율입니다. 1.7-2.0과> 1.7은 일반적으로 잔류 염, 단백질이나 용매 무료, 매우 순수한 DNA의 지표, 대부분의 하류 분자 응용 프로그램에 허용되는 230분의 260 비율 사이 280분의 260 비율입니다. 그림 6B의 1 % 아가로 오스 겔은 결과 gDNA를 최소한의 전단과 고 분자량 (> 24킬로바이트)입니다 것을 보여줍니다. 45 개의 긍정적 인 샘플의 전체 집합의 평균 핵산 수익률은 5.26입니다 ± 생명 기술 Quantifiler 인간 DNA의 정량 키트에 따라 200 μL 전체 혈액 당 0.46 μg 인간의 DNA. 그림 5b에 표시된 것과 유사한 교차 오염 연구는 긍정적 인 샘플 산재 병렬로 추출 대조군 버퍼 공백으로 수행되었다, 모든 공백 (미도시) PCR에 의해 다시 부정적이었다. 정제 된 gDNA를 (도시하지 않음) 또한 수많은 다른 PCR 기반의 분석에 적합합니다.

대용량 TruTip 절차를 처리 풀링 산모의 혈장 샘플 여덟 복제 샘플에서 실시간으로 결과는 그림 7에 표시됩니다. 전체 프로토콜 (오프라인 단백 분해 효소 K 부화 포함) 핵산 키트 (더 비교 자동 추출 키트는 아직 사용할 수 없습니다) 순환 Qiagen의 매뉴얼과 유사한 약 2.5 시간,으로 완성되고 있습니다. 모든 복제에 대한 평균 C t 값은 34.58 ± 0.66 및 29.76 ± 태아 남성 (CHY) 총 (CH1) DNA 0.50, 각각 자동 추출 방법의 우수한 반복성을 보여줍니다 수 있습니다. 총 DNA 풀 (게놈 등가물)에서 태아 DNA의 농도는 2.8 %의 모든 샘플에 걸쳐 결과 평균 % 태아 DNA와 기준에 맞는 포인트 분석 비교를 기반으로 계산됩니다. 샘플 추출을 수행하기 전에 풀링 되었기 때문에이 샘플에 대한 실제 % 태아 DNA는 알 수 없습니다. 태아의 DNA 성분에서 풀링되지 않은 혈장 샘플 TruTip 방법을 사용하여 추출 Qiagen의 순환 핵산 키트 (표시되지 않음) 결과에 비해 일반적으로 1.5 배 높다.

그림 1
그림 1. TruTip 추출 과정과 액체 처리 시스템에 관계없이 작업 흐름. 다른 샘플 준비 또는 액체 처리 단계는 특정 액체 취급 장비 및 소프트웨어의 기능에 따라 자동화 루틴에 통합 할 수 있습니다.

그림 2
그림 2. (A) 에펜 도르프 epMotion 5070 샘플 플레이트 레이아웃입니다. 시약 / consuma의 (B) 배열epMotion은 동시에 8 샘플의 최대 처리더라도 작업대에 준한. 샘플 판은 24 샘플 (열 1, 5, 각각 9)를 위해 구성 할 수 있습니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 3
그림 3. 전체 혈액에서 게놈 DNA를 정화 해밀턴 STAR 데크 레이아웃 (눈금 표시) 갑판 위치 1 = 해밀턴 ML 필터링 팁;. 2 = 해밀턴 ML 필터링되지 않은 끝, 3 = Akonni / 해밀턴 ML LPT 2mm의 TruTips, 4 = 입력 혈액 샘플 캐리어 (혈액 수집 튜브 또는의 microcentrifuge 관) 용해 버퍼 F, 에탄올 5-9 = 290 ML 시약 골짜기, 각각 버퍼 J, 세척 버퍼 K 및 용출 버퍼 A2, 세척, 10 = 96 DEEP 잘 바인딩 플레이트, 11도 J 씻어 = 96 깊은, 13 = 96 깊은 우물 용출 격판 덮개;, 14 NUNC 96 깊은 우물 배양 플레이트 = 해밀턴 HHS2 히터 / 셰이커, 15 = 50 ML 시약 통 12 = 96 깊은 우물 K 세척 단백질 분해 효소 K.가 함유 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 4
그림 4. 대량의 혈장 (눈금 표시)에서 DNA를 정화 해밀턴 STARplus 데크 레이아웃입니다. 시스템은 8 × 5 ML 채널과 8 x 1 ML 채널 (데크 레이아웃에 표시되지 않음)가 장착되어 있습니다. 갑판 위치 1 = 해밀턴 ML 필터링 팁, 2 = Akonni / 해밀턴 ML의 TruTips, 3 = 소스 혈장, 4 = 50 ML 원뿔 튜브, CN-W1, CN-W2와 CN-W4를 포함한 5 = 120 ML 시약 골짜기 reage국세청, 6 단백 분해 효소 K, CN-B2, CN-B3, EBA2, EBB와 CN-W3 시약을 포함 = 소량의 시약 골짜기, 7 = CN-L1 시약을 포함한 290 ML 시약 통, 8 = 290 ML 시약 통이 들어 CN -B1 시약, 9 1 단계 = 96 깊은 우물 격판 덮개, 10 단계 2 = 96 깊은 우물 격판 덮개, 정제, 최종 제품에 대한 11 = 샘플 캐리어, 12 = 해밀턴 ML 필터링되지 않은 팁, ​​13 = Akonni / 해밀턴 ML LPT 4mm TruTips가. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 5
그림 5. (A). 인플루엔자 바이러스의 자동 TruTip 추출에서 실시간 PCR 결과는 비 인두 흡인 (NPA)에 추가되었습니다. 입력 NPA 볼륨 = 100 μL 용출 양 = 50 μL. 결과는 3 복제 E의 평균입니다희석 수준 인플루엔자 목표 기준의 5 가지 NPA 배경 (N = 15)에서 xtractions. qPCR에 이전에 15 기술 분석 조건 LightCycler 480 시스템에서 수행 하였다. 총 12 개의 긍정적 인 NPA 샘플이없는 템플릿 컨트롤과 자동 추출 절차에 따라 산재하는 경우 (B) 아니오 교차 오염이 감지되지 않습니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 6
그림 6. 무작위로 선택된 10 일부터 Nanodrop 분광 1000 (ThermoFisher)에서 전체 혈액에서 인간의 게놈 DNA 추출 결과.) UV 눈에 보이는 흔적 복제합니다. B) 1 % TruTip 정제 된 gDNA를의 아가 로스 젤. M = 피셔 24킬로바이트 최대 DNA 사다리. 레인 1 - 5 = ~ 100 NG 정제 된 gDNA를 네에서 무작위로 선택된 복제합니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 7
그림 7. 자유롭게 혈장 DNA를 순환 여덟 복제 TruTip 추출에서 실시간 PCR 결과. 별표 (* 또는 **)로 표시된 샘플은 별도의 일에 추출 하였다. CHY 남성 태아의 DNA를 정량화하고 CH1 전체 DNA의 존재 (태아와 산모를) 정량화. qPCR에이 CHY 및 CH1 18을 대상으로 이전에 발행 된 분석과 함께 LightCycler 480 시스템 (로슈)에서 수행 하였다.

Discussion

TruTip 개념 및 워크 플로우의 단순성 (그림 1)은 쉽게 자동화 효율성 및 임상 시료 매트릭스, 입력 샘플 볼륨 및 액체 처리 시스템의 수에 대한 효과적인 적응합니다. 그것은 모든 임상 샘플 독특한, 그러나, 인식되어야하며, 점도 향후 한, 분진, 점액, 표면 오염 물질, 미생물, 및 / 또는 인간의 유전 적 배경을 달라집니다. 임상 샘플 구성 및 자동화 TruTip 샘플 준비 프로토콜의 의도 된 용도에 예상되는 변화 감안할 때, 그것은 따라서 특정 시료 유형에 대해 원하는 결과를 달성하기 위해 TruTip 과정의 특정 단계를 수정해야 할 수도 있습니다. 에 관계없이 샘플 유형, 그러나, 일반적으로 핵산의 순도 및 / 또는 회복에 가장 큰 영향을 미칠 TruTip 매개 변수는 다음과 같습니다 :

  1. 용해 버퍼 (알코올)과 샘플 혼합 및 균질화. TruTips가 다시 가지고 있지만latively 큰 기공 크기, 시료 균질화 및 액화 효율적인 세포 용해를 위해 아주 중요하다, 그리고 TruTip 모노리스 이후에 바인딩 단계. 균일하고 잘 액화 해물로, 샘플은 전체 샘플 처리 시간을 줄여 더 높은 유량과 TruTip를 통해 이동할 수 있습니다. 많은 양의 플라즈마 프로토콜은 큰 입력 샘플 볼륨에도 불구하고, 완전히 균질화하고 어려운 샘플 (온라인 또는 오프라인) 액화하는 사용자에 대한 가능성을 보여줍니다.
  2. 유량. 느린 유속 핵산 바인딩 또는 용출시는 일반적으로 전체 처리 시간의 비용이기는하지만, 높은 핵산 수율 결과. 느린 유속은 또한 DNA 전단의 범위를 줄일 수 있습니다.
  3. 사이클 수. 최적의 열망의 수와 사이클을 분배 샘플 유형, 총 샘플 볼륨 및 흐름 속도에 따라 달라집니다. 그림 1의 1 단계는 일반적으로 지점입니다주기 numbe을시RS (및 유속)은 다른 환자 때문에 NPA 점도의 범위를 최적화하기 위해 더 도전 해물 중 하나를 나타내는 비 인두 흡인 (그림 5)와 같은 샘플 몇 가지 경험적 최적화가 필요할 수 있습니다.
  4. 건조. TruTip 모노리스의 완전한 건조 정제 된 핵산 샘플 및 억제 다운 스트림 프로세스 또는 테스트를 공동 용출에서 잔류 유기 용매을 방지하기 위해 필수적입니다. TruTip은 원심 분리 또는 진공 여과를 통해 건조되지 않기 때문에, 그것은 건조 단계에서 유량과 사이클 수를 모두 극대화하는 것이 중요합니다. 때로는 건조 사이클을 완료 한 후에는 TruTip의 종착역에 세척 용액의 잔여 액이있다. 해밀턴 로봇함으로써 무용제 용출을 보장 물방울을 해제하는 우물의 측에 "팁 터치"를 수행 할 수있는 능력을 가지고 있습니다. epMotion 시스템이 기능을 가지고 있지만, 엘 TruTip 말단의 사전 린스하지 않습니다ution 버퍼는 동일한 효과를 달성하기 위해 프로그래밍 할 수 있습니다.

로봇 채널 팔의 형상, 피펫 팁 자료 및 부착 방법은 각 악기 제조 업체 고유하기 때문에, 다른 TruTip의 구조는 각 액체 처리 시스템이 필요합니다. TruTip 기둥 치수 (직경, 두께, 기공 크기)는 핵산 결합 용량 (및 용출 효율)과 상관 관계 않는 등의 고체상 추출 기술에 대해 예상된다. 두께 (> 4mm) 행렬 대용량 샘플 및 / 핵산 결합 용량을 증가 또는 특정 TruTip 형식을 통해 바인딩 용량을 맞춰야하는 1 ML의 TruTip에 포함 할 수 있지만, TruTip 두께와 유량 사이의 트레이드 오프 중에있다 초기 바인딩 단계 (원유 해물의 존재). 따라서, 자동화 프로토콜의 초기 단계는 더 큰 볼륨 피펫 팁으로 더 큰 직경의 모노리스를 포함 때로는 유익 (예를 들어 </ em>를 대용량 추출을위한 5 ML 해밀턴 / Akonni TruTips). 액체 처리 로봇의 제조 업체에 의해 결정되는 특정 TruTip 구성을 감안할 때, 그러나, 우리는 반드시 TruTip 핵산 생산량은 다른 제조 업체, 또는 다른 TruTip 크기에 걸쳐 액체 처리 플랫폼에서 동일하게 기대하지 않습니다.

그들은 일반적으로 무균 사이트 (예를 들어 뇌척수액)로부터 획득하지 않는 한 임상 샘플 (정의에 의해) 인간 게놈 DNA의 상당한 수량을 포함합니다. 다른 응용 프로그램에서 인간의 DNA가 원하지 않는 게놈 배경 (그림 5)을 나타내는 반면, 때로는 인간의 게놈 DNA는 (그림 6)을 원하는 않습니다. 배경 DNA의 존재는 일반적으로 기둥의 결합 용량을 초과하지 않는 샘플 핵산의 총 금액만큼 문제가되지 않으며, 배경 DNA는 캐리어 역할을 할 수 원하는 타겟 핵산 경우산 미량 존재이다. 대용량 플라즈마 추출 프로토콜 (그림 7)의 목적은 제외 감염증 테스트의 샘플 준비의 목적과 유사합니다 산모 DNA의 20 배 초과의 존재 (조각화) 태아 DNA를 분리하는 것입니다 서열이 높은 합동에만 매우 구체적인 분자 시험 및 / 또는 크기 차별로 구분할 수 있습니다. 이 경우, 전체 순환 DNA는 5 ML TruTip, 후속 고분자와 저분자 태아 DNA를 분리를 사용하여 격리 된 바인딩 버퍼 조건을 변경하여 1 ML의 TruTip 이후에 바인딩 및 용출. 실리카 모노리스에 그들의 바인딩과 용출 특성에 따라 타겟 핵산의 선택적 크기의 분리와 농축 막 또는 크기 배제 스핀 컬럼에 의해 달성보다 행동의 유의 한 차이 모드입니다. 인간 게놈 DNA의 미생물 DNA의 크기 분리 농축 할 수 있습니다TruTip 바인딩 및 용출 버퍼를 사용자 정의를 통해 미래의 응용 프로그램에서 ccomplished.

자동화 된 프로토콜은 여기에 다양한 임상 샘플을 처리 TruTip 모노리스 자체의 유틸리티 및 방법은 많은 양의 특정 액체 처리 로봇 적용 할 수 있습니다을 강조 보여 주었다. 유선형의 방법은 일반적으로 다른 자동화 시스템에 비해 빠른 추출 프로토콜에서 결과. TruTip 절차를 자동화하는 데 필요한 기본 하드웨어 피펫 채널 암 자체보다는 자기 봉, 진공 시스템이기 때문에 TruTip 기술의 단순함은, 그러나, 또한 새로운 자동 핵산 정화 시스템 구매에 관심있는 사람에 대한 몇 가지 비용 이점을 준다 또는 온보드 원심 분리기. 미리 채워진 시약 판을 활용하면 공간과 필요한 소모품을 줄이고, 실행 당 처리량을 두 배로 할 수 있습니다. TruTip 프로토콜과 데크 공간을 최소화하면 통합하는 고급 사용자 수 상위 또는 DTruTip와 ownstream 자동화 된 프로세스. 예를 들어 분별 전혈 해밀턴의 easyBlood 솔루션은 크게 바이오 뱅킹 프로세스를 간소화 할 자동화 TruTip 추출 방법으로 통합 할 수 있습니다. 같은 핵산 정량, 정상화, PCR 셋업, 또는 DNA 시퀀싱과 같은 글 추출 프로세스는 쉽게 큰 액체 처리 플랫폼 TruTip에 통합되어 있습니다.

Disclosures

저자는이 문서에서 사용되는 재료를 생산 Akonni 생물계, 주식 회사의 직원입니다.

이 기사의 무료 액세스 및 생산은 Akonni 생물계, 주식 회사에 의해 후원

Acknowledgments

이 작품의 일부는 부여 R 44 AI072784에 따라 국립 보건원 (NIH)에 의해 지원되었다. 우리는 박사 키얼 스틴 세인트 조지, 사라 B. Griesemer, 대릴 램슨 및 바이러스 성 질병, 워즈워스 센터, 정량 인플루엔자 비리 및 임상 검증 인플루엔자 실시간 접근을위한 건강의 뉴욕 주학과 연구소의 에이미 딘 감사합니다 PCR의 분석.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
TruTip Influenza Extraction Kit (EPM TruTips) Akonni Biosystems, Inc. 300-11120
95% Ethanol Acros Organics/ThermoFisher Scientific AC615110040
99% Acetone Sigma-Aldrich 270725-4L
DEPC-treated water Life Technologies AM9906
Reagent Reservoir, 30 ml Eppendorf 960050100
Deep well plate 96/2,000 μl USA Scientific 30502302
epT.I.P.S. Motion Filtertips, 1,000 μl Eppendorf 960050100
Equipment
epMotion 5070 System Eppendorf 5070 000.000
Dispensing tool TM1000-8 960001061
Reservoir rack 960002148
Table 1. Reagents and equipment for automated RNA extraction from NPA.
Reagent/Material
TruTip gDNA Blood Extraction Kit (Hamilton TruTips) Akonni Biosystems, Inc. 300-20341
95% ethanol Acros Organics/ThermoFisher Scientific AC615110040
Proteinase K AMRESCO LLC E195
1 ml Hamilton filtered CO-RE 96 tip rack Hamilton Robotics, Inc. 235905
1 ml Hamilton non-filtered CO-RE 96 tip rack Hamilton Robotics, Inc. 235904
50 ml Reagent Trough Hamilton Robotics, Inc. 187297
Deep Well 2 ml plate USA Scientific 1896-2800
Nunc 96 DWP-2 ml Thermofisher 27874
Reagent Trough Fisher 14-222-412
Equipment
Hamilton STAR System Hamilton Robotics, Inc. 173027
1 ml Independent Pipette Channels / Modular Arm Hamilton Robotics, Inc. 173081/173050
1 ml 96-channel head Hamilton Robotics, Inc. 199090
Tip Carriers Hamilton Robotics, Inc. 182085
Sample Carriers/Inserts Hamilton Robotics, Inc. 173400/182238
Plate Carriers Hamilton Robotics, Inc. 182090
Multiflex Carrier Hamilton Robotics, Inc. 188039
HHS2 Heater Shaker Unit Hamilton Robotics, Inc. 199033
Rack Carrier Hamilton Robotics, Inc. 188047
Table 2. Regents and equipment for 96-well genomic DNA extraction from whole blood.
Reagent/Material
TruTip R+D Circulating DNA Extraction Kit (Hamilton TruTips) Akonni Biosystems, Inc. Call to inquire
100% ethanol Sigma-Aldrich 459828-1L
Isopropanol Acros Organics/ThermoFisher Scientific AC327270010
Proteinase K AMRESCO LLC E195
Filtered 4 ml Tips Hamilton Robotics, Inc. 184022
Unfiltered 1 ml Tips Hamilton Robotics, Inc. 235939
96-Deep Well Plates USA Scientific 1896-2800
50 ml Conical Tubes Corning/ThermoFisher Scientific 05-526B
50 ml Reagent Troughs Hamilton Robotics, Inc. 187297
120 ml Reagent Troughs Hamilton Robotics, Inc. 182703
Large Volume 96-Pos Reagent Troughs ThermoFisher Scientific 14-222-412
Equipment
STARplus Autoload Workstation Base / Deck Module Hamilton Robotics, Inc. 173025/190012
1 ml Independent Pipette Channels / Arm Hamilton Robotics, Inc. 173081/173052
5 ml Independent Channel / Modular Arm Hamilton Robotics, Inc. 184090/173050
Plate Carriers Hamilton Robotics, Inc. 182090
Multiflex Carrier Hamilton Robotics, Inc. 188039
Rack Carrier for 50 ml Reagent Troughs Hamilton Robotics, Inc. 188047
120 ml Reagent trough carrier Hamilton Robotics, Inc. 185290
Tip Carriers Hamilton Robotics, Inc. 182085
50 ml Tube Carriers Hamilton Robotics, Inc. 182245
24 Position Sample Carriers Hamilton Robotics, Inc. 173400
32 Position Sample Carrier Hamilton Robotics, Inc. 173410
Table 3. Reagents and equipment for large volume DNA extraction from plasma.

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References

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