High-throughput, geautomatiseerde extractie van DNA en RNA uit klinische monsters met behulp TruTip Technology op Common Liquid Handling Robots

Bioengineering
 

Summary

TruTip is een eenvoudige nucleïnezuur extractie technologie waarbij een poreuze monolithische bindende matrix wordt in een pipetpunt. Bijgevolg monstervoorbereiding compatibel is met de meeste vloeistofverwerking instrumenten, en kan worden gebruikt voor vele medium tot hoog-klinische toepassingen en soorten monsters.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Holmberg, R. C., Gindlesperger, A., Stokes, T., Brady, D., Thakore, N., Belgrader, P., Cooney, C. G., Chandler, D. P. High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots. J. Vis. Exp. (76), e50356, doi:10.3791/50356 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

TruTip is een eenvoudige nucleïnezuur extractie technologie waarbij een poreuze monolithische bindende matrix wordt in een pipetpunt. De geometrie van de monoliet kunnen worden aangepast voor specifieke pipetpunten variërend in volume 1,0-5,0 ml. De grote porositeit van de monoliet maakt visceuze of complexe monsters gemakkelijk doorheen kan met minimale fluidisch tegendruk. Bidirectionele stroom maximaliseert verblijftijd tussen de monoliet en steekproef, en maakt grote steekproef volumes worden verwerkt binnen een TruTip. De fundamentele stappen, ongeacht monstervolume of TruTip geometrie omvatten cellyse nucleïnezuur binding aan de binnenste poriën van de TruTip monoliet, het wegwassen van ongebonden monster onderdelen en lysis buffers en geëlueerd gezuiverd en geconcentreerd nucleïnezuren in een geschikte buffer. De attributen en het aanpassingsvermogen van TruTip worden aangetoond in drie geautomatiseerde klinische monster verwerkingsprotocollen met een Eppendorf epMotion 5070, Hamilton STAR en Starplus liquid handling robots, waaronder RNA isolatie uit nasopharyngeal aspireren, genomische DNA-isolatie uit volbloed en foetale DNA-extractie en verrijking van grote hoeveelheden plasma van de moeder (respectievelijk).

Introduction

Nucleïnezuur zuivering is noodzakelijk voor de meeste moleculaire diagnostiek, alleen het onderzoek te gebruiken, en life science applicaties. Verschillende benaderingen zijn gekomen sinds de tijd van fenol / chloroform extracties, waarvan vele zijn gebaseerd op het fundamentele beginsel van nucleïnezuur binding aan silica in aanwezigheid van chaotrope zouten 1. Het extractieproces is gestroomlijnd en geautomatiseerd door het gebruik van verschillende kralen-en membraan-gebaseerde formaten, met spin filters, magnetische kralen en aanverwante benaderingen domineren de life sciences industrie (zie voorbeelden in 2-13). Hoewel effectief, hebben deeltjes en membranen beperkingen bekend wanneer ze geconfronteerd worden met uitdagende klinische matrices. Bijvoorbeeld, membranen en bead-based kolommen voldoen, hebben kleine poriën (dus, hoge drukken rug), en vereisen een soort van steun om te worden verwerkt door een centrifuge of een vacuümsysteem. De fysische eigenschappen van membranen en kralen kolommen leidensignificant vloeibare weerstand, dat het soort monsters die efficiënt kan worden verwerkt zonder verstopping van de verbruiksgoederen en / of het totaal (input) monstervolume dat unidirectioneel verwerkt via de stromingsbaan kan worden beperkt. Anderzijds moet magnetische deeltjes in het monster worden verdeeld door roeren. De noodzaak om homogeen verdelen magnetische deeltjes in een oplossing beperkt de totale input monstervolume dat kan worden verwerkt met de meeste magnetische bead verbruiksgoederen. Klinisch monster attributen (zoals viscositeit of complexiteit) kan tot inefficiënte magnetisch concentratie aan de zijkant van een buis of stang. Daarnaast kan silica fijn stof af te breken van de korrels tijdens het extractieproces, verliezen hun magnetisatie en vervuilen het eindmonster.

De TruTip technologie is ontwikkeld sommige nucleïnezuurmonster verwerking beperkingen en restricties 14 overwinnen. Door het inbedden van een poreuze monoliet binnenpipetpunt, fluïdische tegendruk wordt verlaagd, waardoor flow control stelt door middel van vacuüm (dwz pipet aspiratie). Deze functie maakt het extractieproces en instrumentatie die nodig zijn om nucleïnezuren uit moeilijke types monster zuiveren sterk vereenvoudigd worden (figuur 1). De geometrie en de porositeit van de monoliet is afgestemd op verstopping te minimaliseren, terwijl de dikte van de monoliet voldoende nucleïnezuur bindingscapaciteit voor monstervolumes variërend 1,0-5,0 ml. Bidirectionele stroom tijdens monsteraspiratie en doseren zorgt voor langere verblijftijden tussen het monsterextract en de binding monoliet voor een efficiënte nucleïnezuur herstel en elutie, en maakt relatief grote steekproef volumes te verwerken dat het volume capaciteit van de pipet tip zelf overschrijdt. We hebben eerder gemeld de ontwikkeling en toepassing van een handmatige procedure TruTip voor het zuiveren van influenza RNA uit nasopharyngeal monsters met behulp van een enkel-of meerkanaals Rainin pipet 15. Equivalent extractie efficiëntie werd verkregen tussen geautomatiseerde QIAcube en handmatige TruTip methoden bij 10 6 genkopieën influenza A per ml nasopharyngeal aspireren. Het doel van deze studie was om het midden-en high-throughput, geautomatiseerde TruTip nucleïnezuurzuivering procedures voor nasopharyngeal aspireren (NPA) en andere klinisch relevante soorten, met gebruik van liquid handling robots vaak gevonden in verwijzing klinische laboratoria aan.

Protocol

Drie geautomatiseerde TruTip extractie protocollen worden beschreven en hier aangetoond: 1) het midden-throughput RNA-extractie uit NPA op een Eppendorf epMotion 5070; 2) high-throughput genomische DNA-extractie van lage volumes van volbloed op de Hamilton STAR, en 3) selectieve isolatie en verrijking van gefragmenteerde foetale DNA van grote hoeveelheden plasma van de moeder op de Hamilton Starplus. Geautomatiseerde scripts zijn beschikbaar vanaf Akonni en enige high-level programma descriptoren worden hier gegeven. De extractie en elutie reagentia automatisch ontheven bulk reagens troggen naar 96-well platen de geautomatiseerde script (s) vóór klinische monsters worden verwerkt.

1. Geautomatiseerde RNA-extractie uit Nasopharyngeal Aspireren

De eerder beschreven handmatige methode TruTip 15 wordt nu aangepast om te draaien op een Eppendorf epMotion 5070 liquid handling robot, met een grote poriën TruTip matrix ingebed in 1,0 ml Eppendorf buistte tips, een 2 ml deep-well plaat (USA Scientific), Akonni TruTip extractie reagentia, en NPA als het soort monster. De epMotion 5070 liquid handling robot kan maximaal 8 tips tegelijk, dus een baseline geautomatiseerd protocol wordt beschreven voor 8 parallelle extracties. Echter, kunnen maximaal 24 monsters worden verwerkt in een enkel programma in een diepe en 96-well monster plaat. Een aparte epMotion programma beschikbaar (en vereist) om 16 of 24 steekproeven te verwerken. Het protocol hieronder beschreven is voor een 8 steekproef geautomatiseerd script.

Setup

  1. Breng nasopharyngeal monsters naar RT voor aanvang van de winning.
  2. Verdeel 100 pi nasopharyngeal aspireren plus 150 ul nuclease-vrij water in kolom 1 van het monster plaat (Figuur 2A).
  3. Leg het monster plaat in positie B1 op de epMotion Werktafel (Figuur 2B).
  4. Plaats pipetpunten, TruTips en 30 ml reagens drinkbakken op hun respectieve epMotion Worktable positie (figuur 2B).
  5. Open de Eppendorf epBlue software, kies de Run-bestand geleverd door Akonni voor 8 monsters, en laadt de methode door te klikken op de RUN-toets op het tabblad RUN.
  6. Onder Niveau Instellingen Sensor, selecteer Niveaus en tips, en klik op de knop RUN.
  7. Voer het volume monster in de software en klik op RUN.
  8. De epMotion script vraagt ​​de gebruiker om de opvraging en elutie reagentia toe te voegen aan de reagensreservoirs zich op positie B2 op de werktafel. Vul de aanbevolen hoeveelheden van elk reagens de desbetreffende trog. Voor 8 monsters, de minimale reagens volumes zijn:
Reagens Volume (ml) Trough Positie
95% ethanol 3.5 2
Wash Buffer D 9.0 3
Wash Buffer E 9.0 4
Elution Buffer A2 1.3 5
Lysis en Binding Buffer D 11.0 6
  1. Voer de volumes reagens in de tabel door de epMotion software gepresenteerd tijdens de prompt uit stap 8 hierboven. De invoerwaarde moet het werkelijke volume buffer afgegeven door de gebruiker in elke respectieve reagensreservoir weerspiegelen en moet groter zijn dan of gelijk zijn aan de hoeveelheden hierboven vermeld zijn. Verkeerde volume gegevens misschien niet juist volumes door epMotion hardware die aan elke buis of put in de plaat met 96 putjes (s).

Geautomatiseerde Program

  1. Selecteer RUN om de geautomatiseerde methode te starten. De geautomatiseerde script zal bewegen door de volgende stappen zonder tussenkomst van de gebruiker:
    Monster Lysis en Reagens Distributie:
    1. Verdeel 375 pi lyseerbuffer D in kolom 1 en meng gedurende 10cycli (apirate + afzien = 1 cyclus). Deze stap begint de lysis broedproces terwijl de overige reagentia zijn aliquotted.
    2. Verdeel 1,6 ml Wash Buffer D in kolom 2.
    3. Verdeel 1,6 ml Wash Buffer E in kolom 3.
    4. Doseer 50 ul elutiebuffer A in kolom 4.
    5. Pauze voor 6 min. tot de 10 min monster incubatie voltooien lyseerbuffer D.
    6. Voeg 375 ul ethanol aan elke well in kolom 1, mengen elk monster met ethanol door 10 cycli pipetteren.
    Extractie:
    1. Laad 8 TruTips positie van A2 op de werktafel en begint het extractieproces geschetst in figuur 1.
    2. Aspireren en afzien sample / lysis buffer / ethanol mengsel van kolom 1 van de monsterplaat zeven cycli aan het nucleïnezuur binden aan de TruTip monoliet. Hoewel monsterstroom via TruTip kan variëren (door verschillen in klinische monster viscositeit), nucleïnezuur opbrengst van deze monster geent beïnvloed door de stroming variatie. Opties voor de verbetering monsterstroom worden beschreven in de discussie.
    3. Verplaatsen TruTips te proeven plaat kolom 2, en fietsen Wash Buffer D 5x over de monoliet om resterende lysebuffer en monstermatrix verwijderen.
    4. Verplaatsen TruTips te proeven plaat kolom 3, en fietsen Wasbuffer E 5x over de monoliet aan eiwitten en andere verontreinigingen uit het gebonden nucleïnezuur te verwijderen.
    5. Verplaatsen TruTips om de lege reagens reservoir positie 1 (in Werktafel locatie B2) en fietsen 80x (in een snel debiet) aan de monoliet drogen. Het is belangrijk om grondig drogen TruTip, zoals restsolventen in geëlueerde nucleïnezuurpreparaten negatieve verandering enzymen zoals reverse transcriptase en Taq DNA polymerase.
    6. Verplaatsen TruTips te proeven plaat kolom 4 en fietsen 5x in Elutiebuffer A. De gehaald en gezuiverd nucleïnezuur is nu in elutiebuffer in steekproefplaat kolom 4 putten.
    7. Uitwerpen TruTips in de epMotion afvalbak.

Het programma van 16 in totaal monsters zullen stappen 10.1 herhalen door 10,13 behulp monsterplaat kolommen 5-8. Voor de 24-sample-programma, stappen 10.1 tot 10.13 herhaald 2x behulp monsterplaat kolommen 5-8 en 9-12, resp.

2. 96-Genomic DNA-extractie uit volbloed

Een Hamilton STAR liquid handling robot wordt gebruikt om automatische extractie van 96 monsters tegelijk te tonen uit volbloed. De Hamilton STAR verschilt van het epMotion systeem dat een optionele verwarming / shaker unit is op het dek, wat belangrijk is voor enzymatische digestie van bepaalde klinischcal matrices, zoals volbloed. Omdat het systeem kan worden voorzien van een 96-kanaals pipet head, is er een speciale 96-well plaat voor elk van de TruTip stappen en reagentia.

Setup

  1. Zet de STAR-instrument en de computer.
  2. Open het Hamilton Run control software.
  3. Open het Run-bestand geleverd door Akonni voor 96 monsters.
  4. Plaats labware op de STAR dek zoals getoond in figuur 3.
  5. Doseer reagentia in hun overeenkomstige goten (volumes duiden vereist om 96 monsters te verwerken minimum):
Reagens Volume (ml) Trough Positie
Lysis en Binding Buffer F 75 5
95% ethanol 100 6
Wash Buffer J 175 7
WassenBuffer K 175 8
Elution Buffer A2 12 9
Proteinase K (20 mg ml-1) 8 15

6. Laat monsters in evenwicht te RT.

7. Plaats het monster buizen in de Sample Carrier rekken (dek positie 4 in figuur 3). Plaats Monster 1 op de achterkant van de uiterst linkse vervoerder en bewegen achtereenvolgens neer elke drager met Steekproef 96 eindigend in de rechtsvoor positie.

Geautomatiseerde Program

  1. Selecteer de PLAY-knop in de linkerbovenhoek van het Run venster Bestand en voer het aantal monsters worden verwerkt. De geautomatiseerde script zal dan verder via de volgende stappen zonder tussenkomst van de gebruiker:
    Monster Lysis en Reagens Distributie
    1. De overdracht 200 pi van elk monster buis naar de incubatie plaat op positie 14 op de hijater / shaker module (Figuur 3).
    2. Doseer 80 ul proteinase K in elk monster putje van de incubatie plaat.
    3. Verdeel 600 pi lyseerbuffer F in elk putje van de incubatie plaat.
    4. Meng de oplossing gedurende 10 cycli, en incubeer gedurende 20 minuten bij 70 ° C en 500 rpm. De 70 ° C ingestelde temperatuur resulteert in een ~ 60 ° C monstertemperatuur binnen de diepe well plaat, die binnen het bereik van proteïnase K-activiteit. Terwijl de monsters worden incubatie, de liquid handling systeem blijft operationeel bij doseren reagentia in hun overeenkomstige platen en putten:
      • 100 gl Elution Buffer A in elk putje van de diepe putjesplaat op positie 13.
      • 800 ul ethanol in elk putje van de diepe put plaat op positie 10.
      • 1.6 ml Wash Buffer K in elk putje van de diepe put plaat op positie 12.
      • 1.6 ml Wash Buffer J in elk putje van de diepe put plaat op positie 11.
    5. Uitwerpen reagens tips in de afvalbak.
      Extractie
      Dit gedeelte van de gDNA bloed procedure vergelijkbaar met de epMotion influenza protocol, behalve de samenstelling van wasreagentia en cyclusnummers. De Hamilton TruTips tips zijn zwart, zodat de stroming van vloeistoffen door de TruTip niet zichtbaar.
    1. Laad 96 TruTips van dek positie 3.
    2. Aspireren en afzien van het monster / lysebuffer / ethanol mengsel in positie 10 voor 10 cycli om nucleïnezuren binden aan de TruTip monoliet.
    3. Verplaatsen TruTips in stand 11 en cyclus Wash Buffer J 5x over de monoliet om resterende lysebuffer en monstermatrix verwijderen.
    4. Verplaatsen TruTips te positioneren 12 en cyclus Wasbuffer K 5x om eiwitten en andere verontreinigingen uit het gebonden nucleïnezuur te verwijderen. Cyclus het TruTip 40x op hoge snelheid aan de lucht drogen.
    5. Verplaatsen TruTips om positie 13 en cyclus 5x in Elutiebuffer A2. De geëxtraheerde en gezuiverde nucleïnezuur nu in elutiebuffer in het diepe putjesplaat.
    6. Uitwerpen TruTips in de afvalbak.

Wanneer het programma is voltooid, verwijdert de elutie plaat uit het instrument en breng de geëxtraheerde monsters passende buizen voor opslag of verdere toepassingen.

3. DNA-extractie uit Groot Volume Plasma Monsters

De Hamilton Starplus instrument wordt gebruikt om een ​​geautomatiseerd protocol voor extractie van vrij circulerend foetaal DNA van 5 ml van maternale plasma aantonen. Het Starplus systeem ondersteunt twee geautomatiseerde pipet kanaal armen, een met 8 x 5 ml kanalen en een met 8 x 1 ml kanalen. Deze wapens kunnen parallel voor gespreide verwerking in batches van 8 monsters elk. Een 5 ml TruTip wordt gebruikt voor de eerste large-volume extractie, en een 1 ml TruTip wordt gebruikt voor scheiding volgens grootte en de verdere concentratie van de geëxtraheerde nucleïnezuur.

Structuur

  1. Zet de Starplus instrument en de computer.
  2. Open het Hamilton Run control software.
  3. Open het Run-bestand geleverd door Akonni voor 8 grote hoeveelheid plasma monsters.
  4. Plaats labware op de Starplus dek zoals in de figuur 4.
  5. Doseer reagentia in hun overeenkomstige reservoirs:
Reagens Volume (ml) Trough Positie
CN-W1 17 5A
CN-W2 17 5B
CN-W4 21 5C
Proteinase K (20 mg ml-1) 5 6A
EBB 17 6B
EBA2 5 6C
CN-W3 5 6D
CN-B2 5 6E
CN-B3 5 6F
CN-L1 52 7
CN-B1 175 8
  1. Laat monster in evenwicht te RT.
  2. Plaats het monster buizen in de Sample Carrier rekken (dek positie 3 in figuur 4). Het monster 1 in de achterste en verplaats achtereenvolgens naar de voorkant van het dek.

Geautomatiseerde Program

Vanwege de grote in-monstervolume dient lysis en homogenisatiestappen worden uitgevoerd uit de Hamilton Starplus instrument in een waterbad. Stappen tussenkomst van de gebruiker binnen de geautomatiseerde protocol worden aangegeven met een sterretje (*) bij de beginning van de zin, en vetgedrukt.

Monster Lysis en reagens Distributie: Het monster wordt geïncubeerd met proteinase K en lysis buffer om het monster te homogeniseren en laat het DNA.

  1. Selecteer de PLAY-knop in de linkerbovenhoek van het venster Uitvoeren bestand. Voer het aantal monsters worden verwerkt, de locatie van de pipet tips op het dek, en de locatie van TruTips op het dek.
  2. De geautomatiseerde script voegt 615 ul proteinase K, 5 ml plasma, en 6,2 ml lyseerbuffer CN-L1 aan elke 50 ml conische buis, en zal dan PAUZE.
  3. * Verwijder de 50 ml conische buizen van het monster dek, vortex gedurende 30 seconden op hoge snelheid en incubeer off-line gedurende 30 minuten bij 60 C in een waterbad of verwarmingsblok °. Na de conische buizen van de Hamilton dek zijn verwijderd, HERVAT de geautomatiseerde script te blijven doseren reagentia in hun respectievelijke platen en putten (figuur 4B en 4C): 2 ml CN-W1 iedere andere goed in stand 9 kolom 1.
  4. 2 ml CN-W2 iedere andere goed in positie 9 kolom 2.
  5. 2 ml CN-W4 iedere andere goed in positie 9 kolom 3.
  6. 250 ul EBA2 iedere andere goed in positie 9 kolommen 4 en 5.
  7. 495 pi CN-B2 iedere andere goed in stand 10 kolom 1.
  8. 1 ml EBB aan elke put op positie 10 kolom 2.
  9. 500 pi CN-W3 iedere andere goed in positie 10 kolom 3.
  10. 500 pi CN-W4 iedere andere goed in positie 10 kolom 4.
  11. 50 ul EBA2 iedere andere goed in positie 10 kolom 5.

Omdat de 5 ml kanalen te groot om aangrenzende wells voor elk monster, het geautomatiseerd programma verstrekkingen reagentia in elke well van de diepe putjesplaat in deck positie 9. De mechanische arm voor de kanalen 1 ml vereist ook het gebruik van elke andere algemeen in reagens platen voor uitsluiting en concentratie steps van het protocol.

Na de afgifte reagentia, zal het programma PAUZE.

  1. * Na 30 min, 60 ° C incubatie, plaatst de 50 ml conische buizen op ijs gedurende 5 minuten.
  2. * Zet de 50 ml conische buizen op hun oorspronkelijke posities binnen de steekproef drager rek op dek positie 4, en RESUME de geautomatiseerde script.
  3. Voeg 12 ml Binding Buffer CN-B1 aan elk monster buis en meng 10x.

Grote Volume Extraction: 5 ml TruTips worden gebruikt voor de extractie van de totale DNA van de gelyseerde plasma monster.

  1. Pick-up 5 ml TruTips van positie 2 voor de grote-volume nucleïnezuur extractie.
  2. Cyclus het monster mixture15 keer in de 50 ml conische buis, te beginnen bij de bodem van de buis en bewegende 3 mm groter na elke cyclus pipetteren. Deze stap bindt het totale nucleïnezuur aan de TruTip monoliet.
  3. Verplaatsen TruTips naar de diepe putjes op positie 6 kolom 1, en cycle 1x in Wash Buffer CN-W1.
  4. Verplaatsen TruTips tot 9 kolom 2 en cyclus 1x in Wash CN-W2 positioneren.
  5. Verplaatsen TruTips tot 9 kolom 3 en cyclus 2x in Wash CN-W4 positioneren.
  6. Verplaatsen TruTips in stand 9 kolom 4 en fietsen 40x op hoge snelheid te drogen binding matrix.
  7. Verplaatsen TruTips tot 9 kolom 5 en fietsen 10x tot de gebonden nucleïnezuren van de 5 ml TruTips elueren positioneren. Dit grote volume elutie # 1.
  8. Verplaatsen TruTips naar kolom 6 en herhaal de stap met de tweede portie van elutiebuffer. Dit grote volume elutie # 2.
  9. Overdracht elutie # 2 in positie 9 kolom 5 te combineren met elutie # 1 en gooi de TruTips.

Uitsluiting en concentratie: De hoge molecuulgewicht DNA wordt uit het monster geëxtraheerd en de overblijvende DNA wordt geïsoleerd en geconcentreerd.

  1. Voeg gecombineerd eluens uit stap 22-10 kolom 1 positioneren en meng 10x.
  2. Neem 1 ml TruTips van positie 13 en cyclus 20x het hoge molecuulgewicht DNA binden aan de monoliet.
  3. Verplaats de TruTips op stand 10 kolom 2 en cyclus 5x om de tip te spoelen en te verwijderen hoog moleculair gewicht DNA. De TruTips worden bewaard en terug geplaatst in de punt rek op positie 13.
  4. Met reagens tips van positie 12, voeg 575 ul van Binding Buffer CN-B3 om het monster in positie 10 kolom 1 en meng 10x.
  5. Pak de TruTips vanaf stap 25, terug naar 10 kolom 1, en fietsen 20x om de resterende DNA binden van het monster tot het 1 ml TruTip positioneren.
  6. Verplaatsen TruTips tot 10 kolom 4 en fietsen 1x positioneren in Wash CN-W3 om alle resterende remmers te verwijderen.
  7. Verplaats de TruTips tot 10 kolom 5 en fietsen 1x in Wash CN-W4 positioneren restzouten spoelen van GN-W3.
  8. Verhogen TruTips dan positie 10 kolom 5 en cyclus lucht door de tips 35x naar de monoliet drogen.
  9. Verplaatsen TruTips tot 10 kolom 6 en fietsen 10x in EBA2 positioneren om het gezuiverde, grootte-selectie eluerented en geconcentreerd nucleïnezuur.
  10. Gooi TruTips.
  11. Breng de kolom geëlueerde monster van 6-1,5 ml buizen in positie 11. Gewonnen monsters zijn klaar voor opslag of verdere verwerking.

Representative Results

Real-time PCR data voor griep RNA-extractie uit NPA zijn weergegeven in figuur 5A. Geschatte nucleïnezuur extractie rendement is vergelijkbaar met de resultaten verkregen met de handmatige versie van het protocol 15. Een lineaire respons van de gemiddelde Ct-waarden waargenomen tussen 10 4 en 10 gewijzigd 6 genexemplaren ml -1 influenza (R2 = respectievelijk 0,99 en 0,98 voor influenza A en B,), met een standaardafwijking van de gemiddelde Ct-waarden kleiner dan 1 cyclus. Het ontbreken van kruisbesmetting met epMotion wordt aangetoond in figuur 5B, waarbij 12 monsters die positief NPA 10 6 genexemplaren ml -1 NPA werden afgewisseld met 12 buffer blanco's. De gemiddelde C t voor de positieve controles was 30,16 ± 0,14, en al buffer blanks waren negatief. Het totale monster verwerkingstijd is 16, 28 en 40 min bij 8, 16 en 24-monsters.Omdat een typische klinische nasopharyngeal aspireren of wattenstaafje wordt 10 7 genkopieën ml -1 bevatten (uitgaande van 1000 virusdeeltjes per TCID 50 16 en> 10 4 TCID 50 ml -1 influenza 17), wordt de automatische epMotion protocol verwacht effectief te zijn op een meerderheid NPA klinische specimens.

Gezien het grote aantal moleculaire tests uitgevoerd op humaan genomisch DNA, het hoofddoel van nucleïnezuur extractie uit vol bloed is vrij van verontreinigingen met hoog molecuulgewicht genomisch DNA produceren. De geautomatiseerde protocol voor 96 monsters binnen 1 uur, wat een verbetering is andere geautomatiseerde systemen (Promega MagneSil = 90 min en Qiagen QIAamp DNA Blood BioRobot MDx systeem = 2,5 uur). Figuur 6A toont de UV / Vis absorptie profielen 45 positieve bloedstalen gelijktijdig verwerkt met 45 reagens blanks op de Hamilton STAR-protocol, met een gemiddelde A 260/230 verhouding van 1,93. Een A 260/280 verhouding tussen 1,7-2,0 en A 260/230 verhouding> 1,7 zijn in het algemeen indicatief voor zeer zuiver DNA, vrij van residuele zouten, eiwitten of oplosmiddelen, en aanvaardbaar voor de meeste downstream-moleculaire toepassingen. De 1% agarose gel in Figuur 6B toont dat de resulterende gDNA is hoog molecuulgewicht (> 24 kb), met minimale afschuiving. De gemiddelde nucleïnezuur opbrengst van het volledige 45 positieve monsters is 5,26 ± 0,46 ug humaan DNA per 200 gl bloed, gebaseerd op het Life Technologies Quantifiler Human DNA Kwantificering Kit. Kruisbesmetting studies gelijk aan die getoond in Figuur 5B werden uitgevoerd met negatieve controle buffer blanks afgewisseld met de positieve monsters en geëxtraheerd in parallel, alle blanks werden opnieuw negatief door PCR (niet getoond). Het gezuiverde gDNA is ook geschikt voor talrijke andere PCR-gebaseerde analyse (niet getoond).

Real-time resultaten van acht identieke monsters van samengevoegde maternale plasmamonster verwerkt met het grote volume TruTip procedure zijn weergegeven in figuur 7. Het volledige protocol (zoals off-line proteinase K incubatie) keert in ongeveer 2,5 uur, vergelijkbaar met de Qiagen handmatige Circulerende Nucleic Acids Kit (geen vergelijkbare automatische extractie kits zijn bekend). De gemiddelde Ct-waarden over alle replicaten zijn 34,58 ± 0,66 en 29,76 ± 0,50 voor foetale mannelijke (CHY) en totaal (CH1) DNA zijn, welke werd een uitstekende reproduceerbaarheid van de geautomatiseerde extractie methode. De concentratie van foetale DNA binnen de totale DNA pool (in genoomequivalenten), wordt berekend op basis fit point analyse vergelijking met standaarden, met de resulterende gemiddelde% foetaal DNA in alle monsters van 2,8%. De eigenlijke% foetaal DNA voor dit monster is onbekend omdat monsters werden samengevoegd alvorens de extractie. Foetaal DNA samenstellingin niet-gepoolde plasma monsters geëxtraheerd met behulp van de methode TruTip typisch 1,5-voudig hoger vergeleken met de resultaten van een Qiagen Circulerende Nucleic Acids Kit (niet getoond).

Figuur 1
Figuur 1. De TruTip extractieproces en work flow, ongeacht de liquid handling systeem. Andere monstervoorbereiding of liquid handling stappen kunnen in geautomatiseerde routines afhankelijk van de mogelijkheden van de specifieke liquid handling-instrument en de software worden opgenomen.

Figuur 2
Figuur 2. (A) Eppendorf epMotion 5070 monsterplaat layout. (B) Regeling van reagentia / verbruiksbles op de werktafel. Het monster plaat kan worden geconfigureerd voor maximaal 24 monsters (kolommen 1, 5 en 9,), hoewel de epMotion zal slechts maximaal 8 monsters tegelijkertijd verwerken. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 3
Figuur 3. Hamilton STAR dekindeling voor het zuiveren van genomisch DNA uit vol bloed (niet op schaal) Dek Positie 1 = Hamilton 1 ml gefiltreerd tips;. Hamilton 2 = 1 ml ongefilterde tips, 3 = Akonni / Hamilton 1 ml LPT 2 mm TruTips; 4 = ingang bloedmonster dragers (bloedafnamebuisjes of microcentrifugebuisjes); 5-9 = 290 ml reagens troggen voor lyseerbuffer F, Ethanol, Wash Buffer J, Wash Buffer K en Elutiebuffer A2, respectievelijk; 10 = 96 deep goed Binding plaat; 11 = 96 diepe put wassen J; 12 = 96 diepe put Wash K; 13 = 96 diepe put Elueren plaat; 14 = Hamilton HHS2 heater / shaker met Nunc 96 diepe put Incubation plaat; 15 = 50 ml reagens trog bevattende proteïnase K. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 4
Figuur 4. Hamilton Starplus dekindeling voor het zuiveren van DNA uit grote volume plasmamonsters (niet op schaal). Het systeem is voorzien van 8 x 5 ml kanalen en 8 x 1 ml kanalen (niet in de dekindeling getoond). Dek Positie 1 = Hamilton 4 ml gefilterd tips; 2 = Akonni / Hamilton 5 ml TruTips; 3 = bronplasma monsters; 4 = 50 ml conische buizen; 5 = 120 ml reagens troggen met CN-W1, CN-W2 en CN-W4 Reagegen; 6 = low-volume reagens troggen met proteinase K, CN-B2, CN-B3, EBA2, EBB en CN-W3 reagentia; 7 = 290 ml reagens buis met CN-L1 reagens; 8 = 290 ml reagens buis met CN -B1 reagens; 9 = 96 diepe putjes voor Stap 1; 10 = 96 diepe putjes voor Stap 2; 11 = monster dragers voor gezuiverd, eindproduct; 12 = Hamilton 1 ml ongefilterd tips; 13 = Akonni / Hamilton 1 ml LPT 4 mm TruTips. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 5
Figuur 5. (A). Real-time PCR resultaten van geautomatiseerde TruTip winning van influenzavirus toegevoegd in nasopharyngeal aspireren (NPA). Input NPA volume = 100 ul, elutievolume = 50 pl. Resultaten zijn het gemiddelde van 3 herhaalde extractions uit 5 verschillende NPA achtergronden (n = 15) per verdunning niveau en griep doel. qPCR werd uitgevoerd op het LightCycler 480 systeem met assayomstandigheden eerder beschreven 15. (B) Geen kruisbesmetting wordt gedetecteerd wanneer 12 positieve NPA monsters worden afgewisseld met geen template controles en onderworpen aan de automatische extractie procedure. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 6
Figuur 6. Resultaten van humaan genomisch DNA-extractie uit vol bloed. A) UV-zichtbare sporen van een NanoDrop 1000 (ThermoFisher) van 10 willekeurig geselecteerde repliceert. B) 1% agarose gel gezuiverd TruTip gDNA. M = Fisher 24 kb Max DNA Ladder. Lanen 1-4 = ~ 100 ng gezuiverd gDNA van vier willekeurig geselecteerde repliceert. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 7
Figuur 7. Real-time PCR resultaten van acht repliceren TruTip extracties van vrij circulerend DNA uit plasma. Monsters aangeduid met een sterretje (* of **) werden geëxtraheerd op afzonderlijke dagen. CHY kwantificeert mannelijke foetaal DNA en CH1 kwantificeert de totale DNA aanwezig (foetale en maternale). qPCR werd uitgevoerd op een LightCycler 480 systeem (Roche) met eerder gepubliceerde assays gericht CHY en CH1 18.

Discussion

De eenvoud van de TruTip concept en workflow (figuur 1) maken het gemakkelijk aangepast, geautomatiseerd, efficiënt en effectief voor een aantal klinische monstermatrices, ingang monster volumes en liquid handling systemen. Er dient echter te worden erkend dat elk klinisch monster is uniek en verschilt ene naar de volgende in viscositeit, deeltjes, slijm, verontreinigingen, microbiële en / of menselijke genetische achtergronden. Gegeven de verwachte veranderingen in de klinische steekproef samenstelling en het beoogde gebruik van een geautomatiseerde TruTip monstervoorbereiding protocol, kan het noodzakelijk zijn om bepaalde stappen in een TruTip procedure om de gewenste resultaten voor een bepaald type monster te bereiken te wijzigen. Ongeacht het type monster echter TruTip parameters die typisch de meest significante impact op nucleïnezuur zuiverheid en / of terugwinning omvatten:

  1. Sample mengen en homogeniseren met lysis buffer (en alcohol). Hoewel TruTips een relatief grote poriegrootte, sample homogenisering en vloeibaar is zeer belangrijk voor een efficiënte cel lysis en daaropvolgende binding stappen om de TruTip monoliet. Met een homogene en goed vloeibaar lysaat, kunnen monsters door de TruTip bewegen met hogere stroomsnelheden, waardoor de totale steekproef verwerkingstijd vermindert. Het grote volume plasma-protocol toont het potentieel voor gebruikers om grondig te homogeniseren en vloeibaar moeilijke monsters (on-line of off-line), ondanks de grote ingang monstervolume.
  2. Stroomsnelheden. Tragere stroomsnelheden tijdens nucleïnezuur binden of elutie doorgaans tot hogere opbrengsten nucleïnezuur, hetgeen ten koste van de totale verwerkingstijd. Langzamer debieten kan ook de mate van DNA scheren.
  3. Cyclus nummers. Het optimale aantal aspiratie en afzien cycli is afhankelijk van het type monster, totale volume monster, en debieten. Stap 1 in fig. 1 is meestal het punt waarop cyclus numbers (en debieten) kan enige empirische optimalisatie vereisen, met monsters, zoals nasopharyngeal aspireren (figuur 5) vertegenwoordigen een van de meer uitdagende lysaten te optimaliseren als gevolg van het bereik van de NPA viscositeiten van verschillende patiënten.
  4. Drogen. Volledige droging van de TruTip monoliet is noodzakelijk om te voorkomen dat resterende organische oplosmiddelen uit co-elueren met het gezuiverde nucleïnezuurstaal en remmen downstream processen of testen. Omdat TruTip niet wordt gedroogd via centrifugatie of vacuümfiltratie, is het belangrijk om zowel de stroomsnelheid en het aantal schakelingen gedurende de droogstap maximaliseren. Soms is er een resterende druppel wasoplossing aan de terminus van TruTip na de droogcyclus is voltooid. De Hamilton robot heeft de mogelijkheid om een ​​"tip aanraking 'op de zijde van de put naar de druppel vrij voeren, waardoor wordt gewaarborgd een oplosmiddelvrije elutie. Het epMotion systeem beschikt niet over deze functie, maar een pre-spoeling van de TruTip eindpunt in elution buffer kan worden geprogrammeerd om hetzelfde effect te bereiken.

Omdat de geometrie, pipetpunt materiaal, en de gehechtheid methode om de robot kanaal armen zijn uniek voor elke fabrikant van het instrument, is een andere TruTip construct vereist voor elke liquid handling systeem. De TruTip monoliet afmetingen (diameter, dikte en poriegrootte) correleren met nucleïnezuur bindingscapaciteit (en elutie efficiëntie), zoals verwacht voor een vaste-fase extractie techniek. Terwijl dikke (> 4 mm) matrices kunnen worden ingebed in een 1 ml TruTip tot nucleïnezuur bindingscapaciteit voor zware volumemonsters verhogen en / of egaliseren de bindingscapaciteit in specifieke TruTip formats, er een afweging tussen TruTip dikte en stroomsnelheden tijdens de initiële binding stap (in aanwezigheid van ruwe lysaten). Derhalve is het soms voordelig om grotere diameter monolieten insluiten in een groter volume pipetpunten voor de eerste stappen van een geautomatiseerd protocol (bijv. </ Em> de 5 ml Hamilton / Akonni TruTips voor groot-volume extracties). Gezien de specifieke TruTip configuraties gedicteerd door de fabrikanten van liquid handling robots wij echter niet per se verwachten TruTip nucleïnezuur rendementen op identiek voor liquid handling platformen van verschillende fabrikanten, of over verschillende TruTip maten zijn.

Klinische monsters (per definitie) zal aanzienlijke hoeveelheden van het menselijk genoom DNA bevatten, tenzij ze worden verkregen uit een normaal steriele plaatsen (bv cerebrospinale vloeistof). Soms menselijk genomisch DNA wordt gewenst (zoals in figuur 6), terwijl in andere toepassingen de menselijke DNA vertegenwoordigt een ongewenste genomische achtergrond (zoals bij figuur 5). De aanwezigheid van achtergrond DNA is gewoonlijk geen probleem zolang de totale hoeveelheid nucleïnezuur in het monster wordt de bindingscapaciteit van de monoliet niet overschrijden, en de achtergrond DNA kan dienen als een drager als de gewenste doelwitnucleïnezuurzuur is aanwezig in zeer kleine hoeveelheden. Het doel van de high-volume plasma extractie protocol (figuur 7) is te isoleren (gefragmenteerde) foetaal DNA in de aanwezigheid van een 10-20-voudige overmaat van maternale DNA, die vergelijkbaar is met de monstervoorbereiding doelstelling tests voor infectieziekten uitzondering de sequenties zijn zeer congruent en kan slechts worden verkregen door zeer specifieke moleculaire tests en / of discriminatie grootte. In dit geval wordt de totale circulerende DNA geïsoleerd met behulp van een 5 ml TruTip en daaropvolgende hoogmoleculaire en laagmoleculaire foetale DNA gescheiden door daaropvolgende binding en elutie van een 1 ml TruTip doordat het de binding buffer omstandigheden. Selectieve scheiding volgens grootte en verrijking van doelnucleïnezuren op basis van hun binding en elutie eigenschappen over een silicagelkolom monoliet is significant verschillend werkingsmechanisme dan bereikt door membranen of grootte exclusie spinkolommen. Maat scheiding en verrijking van microbiële DNA uit humaan genomisch DNA kan eenccomplished in toekomstige toepassingen via het aanpassen TruTip binding en elutiebuffers.

De geautomatiseerde protocollen aangetoond benadrukken hier het nut van de TruTip monoliet zelf te verwerken verschillende klinische monsters, en hoe het kan worden aangepast voor grote volumes en specifieke vloeistofverwerking robots. De gestroomlijnde methoden meestal resulteren in snellere extractieprotocollen vergelijking met andere geautomatiseerde systemen. De eenvoud van de TruTip technologie echter biedt ook een aantal kostenvoordelen voor diegenen die geïnteresseerd in aanschaf van een nieuwe, geautomatiseerde nucleïnezuur zuiveringssysteem, omdat de primaire hardware die voor automatisering TruTip procedures is het kanaal pipet arm zelf en niet magnetische staven, vacuümsystemen , of on-board centrifuges. Gebruik te maken van vooraf ingevulde reagens platen kan ook verminderen ruimte en benodigde verbruiksartikelen, en het dubbele van de omzet per run. Het minimaliseren van het dek ruimte met TruTip protocollen ook zorgt voor geavanceerde gebruikers te integreren stroomopwaarts of downstream geautomatiseerde processen met de TruTip. Bijvoorbeeld Hamilton easyBlood oplossing te fractioneren volbloed kan worden samengevoegd met de geautomatiseerde TruTip extractiemethode, die aanzienlijk biobanking processen zou stroomlijnen. Post-extractie processen zoals nucleïnezuur kwantificatie, normalisatie, PCR set-up, of DNA-sequencing zijn ook gemakkelijk geïntegreerd met TruTip op de grotere liquid handling platforms.

Disclosures

De auteurs zijn medewerkers van Akonni Biosystems, Inc die materialen gebruikt in dit artikel te produceren.

Gratis toegang en productie van dit artikel wordt gesponsord door Akonni Biosystems, Inc

Acknowledgments

Delen van dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) onder toekenning R 44 AI072784. Wij danken dr. Kirsten St. George, Sara B. Griesemer, Daryl Lamson en Amy Dean van het Laboratorium voor Virale Ziekten, Wadsworth Center, New York State Dept of Health voor gekwantificeerde influenza virusdeeltjes en toegang tot klinisch gevalideerde influenza real-time PCR assays.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
TruTip Influenza Extraction Kit (EPM TruTips) Akonni Biosystems, Inc. 300-11120
95% Ethanol Acros Organics/ThermoFisher Scientific AC615110040
99% Acetone Sigma-Aldrich 270725-4L
DEPC-treated water Life Technologies AM9906
Reagent Reservoir, 30 ml Eppendorf 960050100
Deep well plate 96/2,000 μl USA Scientific 30502302
epT.I.P.S. Motion Filtertips, 1,000 μl Eppendorf 960050100
Equipment
epMotion 5070 System Eppendorf 5070 000.000
Dispensing tool TM1000-8 960001061
Reservoir rack 960002148
Table 1. Reagents and equipment for automated RNA extraction from NPA.
Reagent/Material
TruTip gDNA Blood Extraction Kit (Hamilton TruTips) Akonni Biosystems, Inc. 300-20341
95% ethanol Acros Organics/ThermoFisher Scientific AC615110040
Proteinase K AMRESCO LLC E195
1 ml Hamilton filtered CO-RE 96 tip rack Hamilton Robotics, Inc. 235905
1 ml Hamilton non-filtered CO-RE 96 tip rack Hamilton Robotics, Inc. 235904
50 ml Reagent Trough Hamilton Robotics, Inc. 187297
Deep Well 2 ml plate USA Scientific 1896-2800
Nunc 96 DWP-2 ml Thermofisher 27874
Reagent Trough Fisher 14-222-412
Equipment
Hamilton STAR System Hamilton Robotics, Inc. 173027
1 ml Independent Pipette Channels / Modular Arm Hamilton Robotics, Inc. 173081/173050
1 ml 96-channel head Hamilton Robotics, Inc. 199090
Tip Carriers Hamilton Robotics, Inc. 182085
Sample Carriers/Inserts Hamilton Robotics, Inc. 173400/182238
Plate Carriers Hamilton Robotics, Inc. 182090
Multiflex Carrier Hamilton Robotics, Inc. 188039
HHS2 Heater Shaker Unit Hamilton Robotics, Inc. 199033
Rack Carrier Hamilton Robotics, Inc. 188047
Table 2. Regents and equipment for 96-well genomic DNA extraction from whole blood.
Reagent/Material
TruTip R+D Circulating DNA Extraction Kit (Hamilton TruTips) Akonni Biosystems, Inc. Call to inquire
100% ethanol Sigma-Aldrich 459828-1L
Isopropanol Acros Organics/ThermoFisher Scientific AC327270010
Proteinase K AMRESCO LLC E195
Filtered 4 ml Tips Hamilton Robotics, Inc. 184022
Unfiltered 1 ml Tips Hamilton Robotics, Inc. 235939
96-Deep Well Plates USA Scientific 1896-2800
50 ml Conical Tubes Corning/ThermoFisher Scientific 05-526B
50 ml Reagent Troughs Hamilton Robotics, Inc. 187297
120 ml Reagent Troughs Hamilton Robotics, Inc. 182703
Large Volume 96-Pos Reagent Troughs ThermoFisher Scientific 14-222-412
Equipment
STARplus Autoload Workstation Base / Deck Module Hamilton Robotics, Inc. 173025/190012
1 ml Independent Pipette Channels / Arm Hamilton Robotics, Inc. 173081/173052
5 ml Independent Channel / Modular Arm Hamilton Robotics, Inc. 184090/173050
Plate Carriers Hamilton Robotics, Inc. 182090
Multiflex Carrier Hamilton Robotics, Inc. 188039
Rack Carrier for 50 ml Reagent Troughs Hamilton Robotics, Inc. 188047
120 ml Reagent trough carrier Hamilton Robotics, Inc. 185290
Tip Carriers Hamilton Robotics, Inc. 182085
50 ml Tube Carriers Hamilton Robotics, Inc. 182245
24 Position Sample Carriers Hamilton Robotics, Inc. 173400
32 Position Sample Carrier Hamilton Robotics, Inc. 173410
Table 3. Reagents and equipment for large volume DNA extraction from plasma.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boom, R., Sol, C. J. A., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).
  2. Baker, M. P., Mitchell, A., et al. Isolation of genomic DNA from blood using a novel filter-based DNA purification technology. BioTechniques. 31, 142-145 (2001).
  3. Sinclair, B. To bead or not to bead: applications of magnetic bead technology. The Scientist. 12, 17-24 (1998).
  4. Dederich, D. A., Okwuonu, G., et al. Glass bead purification of plasmid template DNA for high throughput sequencing of mammalian genomes. Nucl. Acids Res. 30, e32 (2002).
  5. Levison, P. R., Badger, S. E., et al. Recent developments of magnetic beads for use in nucleic acid purification. J. Chromatogr. A. 816, 107-111 (1998).
  6. Hourfar, M. K., Schmidt, M., Seifried, E., Roth, W. K. Evaluation of an automated high-volume extraction method for viral nucleic acids in comparison to a manual procedure with preceding enrichment. Vox Sang. 89, 71-76 (2005).
  7. Perelle, S., Cavellini, L., et al. Use of a robotic RNA purification protocol based on the NucliSens easyMAG for real-time RT-PCR detection of hepatitis A virus in bottled water. J. Virol. Methods. 157, 80-83 (2009).
  8. Riemann, K., Adamzik, M., et al. Comparison of manual and automated nucleic acid extraction from whole-blood samples. J. Clin. Lab. Anal. 21, 244-248 (2007).
  9. Hukari, K. W., Shultz, M., Isely, N., Milson, R., West, J. A. A completely automated sample preparation instrument and consumable device for isolation and purification of nucleic acids. J. Lab. Autom. 16, 355-365 (2011).
  10. Kessler, H., Mühlbauer, G. Fully automated nucleic acid extraction. MagNA Pure LC. Clin. Chem. 47, 1124-1126 (2001).
  11. Miller, S., Seet, H., Khan, Y., Wright, C., Nadarajah, R. Comparison of QIAGEN automated nucleic acid extraction methods for CMV quantitative PCR testing. Am. J. Clin. Pathol. 133, 558-563 (2010).
  12. Dundas, N., Leos, N. K., Mitui, M., Revell, P., Rogers, B. B. Comparison of automated nucleic acid extraction methods with manual extraction. J. Mol. Diagn. 10, 311-316 (2008).
  13. Kruhøffer, M., Voss, T., et al. Evaluation of the QIAsymphony SP workstation for magnetic particle-based nucleic acid purification from different sample types for demanding downstream applications. J. Lab. Autom. 15, 41-51 (2010).
  14. Akonni Biosystems, Inc. Apparatus, system, and method for purifying nucleic acids. United States Patent. Belgrader, P. US7759112 (2010).
  15. Chandler, D. P., Griesemer, S. B., et al. Rapid, simple influenza RNA extraction from nasopharyngeal samples. J. Virol. Methods. 183, 8-13 (2012).
  16. Chan, K. H., Lai, S. T., et al. Analytical sensitivity of rapid influenza antigen detection tests for swine-origin influenza virus (H1N1). J. Clin. Virol. 45, 205-207 (2009).
  17. Chan, K. H., Lama, S. Y., et al. Comparative analytical sensitivities of six rapid influenza A antigen detection test kits for detection of influenza A. subtypes H1N1, H3N2 and. 38, 169-171 (2007).
  18. Fan, H. C., Blumenfeld, Y. J., Chitkara, U., Hudgins, L., Quake, S. R. Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by shotgun sequencing DNA from maternal blood. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 16266-16271 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics