Høy gjennomstrømning, Automated Utvinning av DNA og RNA fra kliniske prøver ved hjelp TruTip Technology på Common Væskehåndtering Robots

Bioengineering
 

Summary

TruTip er en enkel nukleinsyreekstraheringsenheten teknologi hvorved en porøs monolittisk bindende matrise settes inn i en pipettespiss. Følgelig er prøveopparbeidelse format som er kompatibelt med de fleste væskehåndtering instrumenter, og kan brukes til mange middels til høy gjennomstrømning kliniske applikasjoner og prøvetyper.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Holmberg, R. C., Gindlesperger, A., Stokes, T., Brady, D., Thakore, N., Belgrader, P., Cooney, C. G., Chandler, D. P. High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots. J. Vis. Exp. (76), e50356, doi:10.3791/50356 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

TruTip er en enkel nukleinsyreekstraheringsenheten teknologi hvorved en porøs monolittisk bindende matrise settes inn i en pipettespiss. Geometrien i monolitten kan tilpasses til spesifikke pipettespisser som varierer i volum 1,0 til 5,0 ml. Den store porøsiteten til monolitten muliggjør viskøse eller komplekse prøver til lett å passere gjennom med minimal fluidteknisk mottrykk. Toveis flyt maksimerer oppholdstid mellom monolitten og prøve, og gjør store prøven volumer som skal behandles innen en enkelt TruTip. De grunnleggende trinn, uavhengig av prøvevolum eller TruTip geometri, omfatter cellelyse, nukleinsyre binding til de indre porene i TruTip monolitt, vaske bort ubundet prøvekomponenter og lysis buffere, og eluere renset og konsentrert nukleinsyrer i en egnet buffer. Attributtene og tilpasningsevne av TruTip er vist i tre automatiserte kliniske utvalgets behandling protokoller ved hjelp av en Eppendorf epMotion 5070, Hamilton STAR og STARPLUS væskehåndtering roboter, inkludert RNA isolert fra nasofaryngealt aspirate, genomisk DNA isolert fra fullblod, og fosterets DNA-ekstraksjon og berikelse av store volumer av maternal plasma (henholdsvis).

Introduction

Nukleinsyrerensing er nødvendig for de fleste molekylær diagnostikk, forskning bruk og life science applikasjoner. Forskjellige tilnærminger har kommet siden tidspunktet for fenol / kloroform ekstraksjoner, mange av hvilke er basert på det grunnleggende prinsipp av nukleinsyren bindes til silisium i nærvær av chaotropiske salter 1. Utpakkingen har blitt strømlinjeformet og automatisert gjennom bruk av ulike perle-og membran-baserte formater, med spin filtre, magnetiske perler og relaterte tilnærminger dominerer biovitenskap (se eksempler i 2-13). Mens effektive, har partikler og membraner kjent begrensninger når konfrontert med utfordrende kliniske matriser. For eksempel, membraner og perle-baserte kolonner er kompatibel, har små porer størrelser (og dermed høye mottrykk), og kreve noen form for støtte for å bli behandlet av en sentrifuge eller vakuum system. De fysiske egenskapene til membraner og vulsten kolonner førerbetydelig fluidteknisk motstand, noe som begrenser den type prøver som kan behandles effektivt uten tilstopping av forbruksmateriell, og / eller det totale (inngang) prøvevolum som kan være uni-retningsbores behandlet gjennom strømningsbanen. I motsatt fall må magnetiske partikler bli distribuert over hele prøven ved omrøring. Behovet for å homogent fordele magnetiske partikler i en løsning begrenser den tilførte prøvevolum som kan behandles med de magnetiske kuler forbruksvarer. Prøvematerialet attributter (for eksempel viskositet eller kompleksitet) kan føre til ineffektiv magnetisk partikkelkonsentrasjon på siden av et rør eller en stang. I tillegg kan fin silika partikler løsner av perlene under utpakkingen, mister sin magnetisering og forurenser den endelige prøven.

Den TruTip teknologien ble utviklet for å overvinne noen av disse nukleinsyre sample behandle begrensninger og begrensninger 14. Ved å bygge en porøs monolitt innen enpipette spissen, fluidic mottrykk er senket, noe som gjør det mulig flyt kontroll av vakuum (dvs. pipette aspirasjon). Denne funksjonen gjør at utpakkingen og instrumentering kreves for å rense nukleinsyrer fra vanskelige prøvetyper å være sterkt forenklet (figur 1). Geometrien og porøsiteten til monolitten er skreddersydd for å minimalisere tilstopping, mens tykkelsen av monolittmaterialet gir tilstrekkelig nukleinsyre-bindende kapasitet for prøvemengder som strekker seg 1,0 til 5,0 ml. Toveis volumstrøm ved prøven aspirasjon og dispensering tillater lengre oppholdstider mellom prøven ekstrakt og bindingen monolitten for effektiv nukleinsyre utvinning og eluering, og muliggjør relativt store prøvevolumer for å bli behandlet som overskrider volumkapasiteten av pipettespissen selv. Vi har tidligere rapportert utvikling og anvendelse av en manuell TruTip prosedyre for rensing av influensa RNA fra nasofaryngeale prøver ved hjelp av en enkelt-eller flerkanals Rainin pipetten 15. Tilsvarende utvinning effektivitet ble oppnådd mellom automatisert Qiacube og manuelle TruTip metoder på 10 6 genkopier influensa A per ml nasofaryngealt aspirate. Målet med denne studien var å vise middels og høy gjennomstrømning, automatiserte TruTip nukleinsyrerensing prosedyrer for nasofaryngealt aspirate (NPA) og andre klinisk relevante prøvetyper, ved hjelp av væskehåndtering roboter som vanligvis finnes i referanse kliniske laboratorier.

Protocol

Tre automatiserte TruTip utvinning protokoller er beskrevet og demonstrert her: 1) medium-throughput RNA ekstraksjon fra Norsk Folkehjelp på en Eppendorf epMotion 5070, 2) high-throughput genomisk DNA-ekstraksjon fra lave volumer av fullblod på Hamilton STAR, og 3) selektiv isolering og anriking av fragmentert fosterets DNA fra store volumer av maternal plasma på Hamilton STARPLUS. Automatisert skript er tilgjengelig fra Akonni og bare høyt nivå program beskrivelsene er gitt her. Utvinning og eluering reagensene spylt fra bulk reagens trau til 96-brønners plater ved den automatiserte skriptet (e) før de kliniske prøvene behandles.

En. Automatisert RNA Utvinning fra Nasofaryngeal Sug

Den tidligere beskrevne manuelle TruTip metode 15 er nå tilpasset for å kjøre på en Eppendorf epMotion 5070 væskehåndtering robot, ved hjelp av en stor pore TruTip matrise innebygd i 1,0 ml Eppendorf rørtte tips, en 2 ml dype brønnen plate (USA Scientific), Akonni TruTip utvinning reagenser, og Norsk Folkehjelp som prøvetype. Den epMotion 5070 væskehåndtering robot har plass til opptil 8 tips samtidig, slik at en baseline automatisert protokollen er beskrevet for åtte parallelle ekstraksjoner. Imidlertid kan opptil 24 prøvene bli behandlet i løpet av et enkelt program i en dyp brønn 96-godt utvalg plate. Et eget epMotion program er tilgjengelig (og nødvendig) for å behandle 16 eller 24 prøver. Protokollen er beskrevet nedenfor er for en åtte prøve automatisert skript.

Oppsett

  1. Ta nasofaryngeale prøver å RT før du starter utvinning.
  2. Tilsett 100 ul nasofaryngealt aspirate pluss 150 ul nukleasefritt vann i kolonne 1 i prøven plate (Figur 2A).
  3. Plasser prøven plate på plass B1 på epMotion arbeidsbord (figur 2B).
  4. Plasser pipetter, TruTips og 30 ml Reagens trau på sine respektive epMotion Worktable stillinger (figur 2B).
  5. Åpne Eppendorf epBlue programvare, velg Kjør filen levert av Akonni for åtte prøver, og laste den metoden ved å klikke på RUN-knappen på RUN-kategorien.
  6. Under nivåsensor Innstillinger, velg Levels og tips, og klikk på RUN-knappen.
  7. Input prøven volum inn i programvaren, og klikk på RUN.
  8. Den epMotion skriptet vil be brukeren om å legge utvinning og eluering reagenser til reagensbeholdere plassert i posisjon B2 på arbeidsbord. Legg de anbefalte volumer av hver reagens til de respektive trau. For åtte prøver, minimum reagensvolumene er:
Reagens Volum (ml) Gjennom Position
95% etanol 3.5 2
Vask Buffer D 9.0 3
Vask Buffer E 9.0 4
Elueringsbuffer A2 1.3 5
Lysis og Binding Buffer D 11.0 6
  1. Innspill reagensvolumene i tabellen presentert av epMotion programvare under melding fra trinn 8 ovenfor. Inngangsverdien bør reflektere det faktiske volum av buffer utlevert av brukeren inn i hver respektive reagensreservoar, og må være større enn eller lik den minste volum som er nevnt ovenfor. Feil volum oppføringer kan resultere i feilaktige mengder som leveres av epMotion maskinvare til hvert rør eller brønn i 96-brønns plate (e).

Automatisert Program

  1. Velg Kjør for å starte automatisert metode. Den automatiserte script vil gå gjennom følgende trinn uten brukermedvirkning:
    Sample Lysis og Reagens Distribusjon:
    1. Tilsett 375 ul lysebuffer D til kolonne 1 og bland for 10sykluser (apirate + dispensere = 1 syklus). Dette trinnet starter lysis inkubasjonstiden prosessen mens de resterende reagenser er aliquotted.
    2. Tilsett 1,6 ml Wash Buffer D til kolonne 2.
    3. Tilsett 1,6 ml Wash Buffer E i kolonne 3.
    4. Tilsett 50 mL Elution Buffer A i kolonne 4.
    5. Pause for 6 min for å fullføre 10 min sample inkubasjon i lysebuffer D.
    6. Legg 375 mL etanol til hver brønn i en kolonne, blande hver prøve med etanol gjennom 10 sykluser pipettering.
    Utvinning:
    1. Last 8 TruTips fra posisjon A2 på arbeidsbord, og begynne utpakkingen skissert i figur 1.
    2. Aspirer og dispensere sample / lyseringsbuffer / etanol-blanding fra kolonne 1 av prøven plate i syv sykluser for å binde nukleinsyren til TruTip monolitten. Selv om prøven strømme gjennom TruTip kan variere (på grunn av forskjeller i klinisk prøve viskositet), var nukleinsyre utbytte for disse Prøve nrt påvirket av flyt variasjon. Alternativer for å bedre flow er beskrevet i diskusjonen.
    3. Flytt TruTips å sample plate kolonne 2, og sykle Wash Buffer D 5x over monolitten å fjerne rester av lysis buffer og prøvematrisen.
    4. Flytt TruTips å sample plate kolonne 3, og sykle Wash Buffer E 5x over monolitten å fjerne proteiner og andre forurensninger fra det bundne nukleinsyre.
    5. Flytt TruTips til den tomme reagensbeholder posisjon 1 (i arbeidsbord plassering B2) og sykle 80x (på en rask flow rate) tørke monolitten. Det er viktig å tørke TruTip, som rester av løsemidler i eluerte nukleinsyre forberedelser vil negativt påvirke enzymer som revers transkriptase og Taq DNA polymerase.
    6. Flytt TruTips å sample plate kolonne 4 og sykle 5x i Elution Buffer A. trukket ut og renset nukleinsyre er nå i elueringsbuffer i prøven plate kolonne fire brønner.
    7. Løs ut TruTips inn i epMotion søppelbøtten.

Programmet for 16 totalt prøvene vil gjenta trinn 10,1 gjennom 10.13 med sample plate kolonner 5-8. For den 24-sample program, steg 10.1 til 10.13 gjentas 2x bruker sample plate kolonner 5-8 og 9-12, henholdsvis.

2. 96-brønn Genomic DNA Utvinning fra fullblod

En Hamilton STAR væske håndtering robot brukes til å demonstrere automatisert uttak av 96 prøver samtidig fra fullblod. Den Hamilton stjerne skiller seg fra den epMotion system ved at et valgfritt varmeapparat / shaker enhet er tilgjengelig på dekk, noe som er viktig for enzymatisk nedbrytning av visse kliniskcal matriser, slik som fullblod. Fordi systemet kan være utstyrt med en 96-kanals pipette hode, er det en egen 96-brønners plate for hver av de TruTip trinn og reagenser.

Oppsett

  1. Slå på STAR instrument og datamaskin.
  2. Åpne Hamilton Run Control-programvaren.
  3. Åpne Kjør filen levert av Akonni til 96 prøver.
  4. Sted labware på STAR dekk som vist i Figur 3..
  5. Tilsett reagenser inn i de tilsvarende trau (volumer betegne det minimum som kreves for å behandle 96 prøver):
Reagens Volum (ml) Gjennom Position
Lysis og Binding Buffer F 75 5
95% etanol 100 6
Vask Buffer J 175 7
VaskBuffer K 175 8
Elueringsbuffer A2 12 9
Proteinase K (20 mg ml -1) 8 15

6. Tillate prøver å tilpasse seg til RT.

7. Plassere prøverørene i prøvebæreren reoler (dekk posisjon 4 i figur 3). Sted Prøve 1 på baksiden av helt til venstre transportør og flytte sekvensielt ned hver transportør med Sample 96 ending i fremre høyre posisjon.

Automatisert Program

  1. Velg PLAY-knappen i øvre venstre hjørne av Run fil vinduet, og angi antall prøver som blir behandlet. Den automatiserte script vil deretter gå gjennom følgende trinn uten brukermedvirkning:
    Sample Lysis og Reagens Distribusjon
    1. Overfør 200 pl fra hver prøve røret til den plate inkubering ved posisjon 14 på hanater / shaker modul (figur 3).
    2. Tilsett 80 pl proteinase K i hver prøvebrønn av inkuberingen plate.
    3. Tilsett 600 ul lysebuffer F i hver brønn av inkuberingen plate.
    4. Blande løsningen i 10 sykluser, og deretter inkuberes i 20 min ved 70 ° C og 500 rpm. De 70 ° C Innstilt temperatur gir et ~ 60 ° C prøvetemperatur innenfor dyp brønn plate, som er innenfor området av proteinase K-aktivitet. Mens prøvene ruger, fortsetter væsken håndteringssystem opererer ved å dispensere reagenser inn i de tilsvarende plater og brønner;
      • 100 pl buffer A Eluering inn i hver brønn på dyp brønn plate ved posisjon 13..
      • 800 mL etanol inn i hver brønn på dypt brønn plate med posisjon 10..
      • 1.6 ml vaskebuffer K inn i hver brønn på dyp brønn plate med posisjon 12..
      • 1.6 ml vaskebuffer J i hver brønn av den dyp brønn plate ved posisjon 11..
    5. Eject reagenser tips i søppelbøtten.
      Utvinning
      Denne delen av gDNA blod prosedyren er meget lik den epMotion influensa-protokoll, med unntak av sammensetningen av vask reagenser og syklus tall. The Hamilton TruTips tips er svart, slik at flyten av væske gjennom TruTip er ikke synlig.
    1. Last 96 TruTips fra dekk 3. plass.
    2. Aspirer og støte prøven / lyseringsbuffer / etanol-blanding i posisjon 10 i 10 sykluser for å binde nukleinsyrer til TruTip monolitten.
    3. Flytt TruTips å posisjonere 11 og sykle Wash Buffer J 5x over monolitten å fjerne rester av lysis buffer og prøvematrisen.
    4. Flytt TruTips å posisjonere 12 og sykle Wash Buffer K 5x å fjerne proteiner og andre forurensninger fra det bundne nukleinsyre. Sykle TruTip 40x i høy hastighet for å lufttørke.
    5. Flytt TruTips til posisjon 13 og sykle 5x i Elution Buffer A2. Det ekstraherte og rensede nukleinsyre er nå i elueringsbufferen i dyp brønn plate.
    6. Løs ut TruTips inn i søppelbøtten.

Når programmet er ferdig, fjerner du Elution Plate fra instrumentet og overføre hentet prøvene til de rette rør for lagring eller nedstrøms applikasjoner.

3. DNA Utvinning fra store volum plasmaprøver

The Hamilton STARPLUS instrumentet brukes til å demonstrere en automatisert protokoll for utpakking fritt sirkulerende fosterets DNA fra 5 ml av morens plasma. Den STARPLUS systemet kan støtte to automatiserte pipette kanal armer, en med 8 x 5 ml kanaler og en med 8 x 1 ml kanaler. Disse armene kan operere i parallell for forskjøvet behandling i grupper på åtte prøver hver. En 5 ml TruTip er brukt for den initielle large-volum ekstraksjon, og en 1 ml TruTip brukes for størrelse separasjon og ytterligere konsentrasjon av den ekstraherte nukleinsyre.

Set-up

  1. Slå på STARPLUS instrument og datamaskin.
  2. Åpne Hamilton Run Control-programvaren.
  3. Åpne Kjør filen levert av Akonni for åtte store volum plasma.
  4. Sted labware på STARPLUS dekk som vist i Figur 4.
  5. Tilsett reagenser inn i de tilsvarende reservoarer:
Reagens Volum (ml) Gjennom Position
CN-W1 17 5A
CN-W2 17 5B
CN-W4 21 5C
Proteinase K (20 mg ml -1) 5 6A
EBB 17 6B
EBA2 5 6C
CN-W3 5 6D
CN-B2 5 6E
CN-B3 5 6F
CN-L1 52 7
CN-B1 175 8
  1. Tillate prøve å tilpasse seg til RT.
  2. Plasser prøverør i prøvebærerens racks (dekk posisjon 3 i figur 4). Plasser Prøve 1 i bakre og bevege sekvensielt mot fronten av dekket.

Automatisert Program

På grunn av den store inndata prøvevolum, må lysis og homogenisering trinn utføres av av Hamilton STARPLUS instrument i et vannbad. Trinn som krever brukermedvirkning innenfor automatisert protokollen er merket med en stjerne (*) på beginning av dommen, og fet skrift.

Sample Lysis og Reagens Distribusjon: Prøven inkuberes med proteinase K og lysis buffer til å homogenisere prøven og slipp DNA.

  1. Velg PLAY-knappen i øvre venstre hjørne av Run fil vinduet. Input antall prøver som blir behandlet, plasseringen av pipettespisser på dekk, og plasseringen av TruTips på dekk.
  2. Den automatiserte script legger 615 ul proteinase K, 5 ml plasma, og 6,2 ml lysebuffer CN-L1 til hver 50 ml konisk tube, og vil deretter PAUSE.
  3. * Fjern 50 ml koniske rør fra prøven dekk, vortex i 30 sek på høy hastighet, og inkuber off-line i 30 min ved 60 ° C i et vannbad eller varmeblokk. Etter at de koniske rør blir fjernet fra Hamilton dekk, gjenoppta automatisert skript å fortsette dispensering av reagenser inn i sine respektive plater og brønner (figur 4B og 4C): 2 ml CN-W1 til alle andre i god posisjon 9 kolonne 1.
  4. 2 ml CN-W2 til alle andre godt i posisjon 9 kolonne to.
  5. 2 ml CN-W4 til alle andre godt i posisjon 9 kolonne 3.
  6. 250 mL EBA2 til alle andre i god posisjon ni kolonner fire og fem.
  7. 495 mL CN-B2 til alle andre godt i posisjon 10 kolonne 1.
  8. 1 ml EBB til alle andre godt i posisjon 10 kolonne to.
  9. 500 mL CN-W3 til alle andre godt i posisjon 10 kolonne 3.
  10. 500 mL CN-W4 til alle andre godt i posisjon 10 kolonne 4.
  11. 50 mL EBA2 til annenhver brønn i posisjon 10 kolonne 5.

Fordi de 5 ml kanalene er for brede til å bruke tilstøtende brønner for hver prøve, automatisert program dispenserer reagenser inn i hver brønn av den andre dyp brønn plate i dekk stilling 9.. Den mekaniske arm brukes for 1 ml kanaler krever også bruk av enhver annen brønn i platene reagens for uttrekket og konsentrasjon steps av protokollen.

Etter levering av reagenser, vil programmet PAUSE.

  1. * Etter 30 min, 60 ° C inkubering plassere de 50 ml koniske rør på is i 5 min.
  2. * Tilbake til 50 ml koniske rør til sine opprinnelige posisjoner innenfor prøvebærerens rack på dekk 4. plass, og gjenoppta automatisert skript.
  3. Tilsett 12 ml Binding Buffer CN-B1 til hvert prøverør og bland 10x.

Stort volum Ekstraksjon: 5 ml TruTips brukes for ekstrahering totalt DNA fra den lyserte plasmaprøven.

  1. Plukk opp 5 ml TruTips fra posisjon 2 for stort volum nukleinsyreekstraheringsenheten.
  2. Syklus prøven mixture15 ganger i 50 ml konisk rør, som starter ved bunnen av røret og beveger seg 3 mm høyere etter hvert pipettering syklus. Dette trinnet binder den totale nukleinsyre til TruTip monolitten.
  3. Flytt TruTips til de dype brønn plater i posisjon seks kolonne 1, og cycle 1x i Wash Buffer CN-W1.
  4. Flytt TruTips å posisjonere 9 kolonne 2 og sykle 1x i Wash CN-W2.
  5. Flytt TruTips å posisjonere 9 kolonne 3 og sykle 2x i Wash CN-W4.
  6. Flytt TruTips å posisjonere 9 kolonne 4 og sykle 40x i høy hastighet for å tørke bindende matrise.
  7. Flytt TruTips å posisjonere 9 kolonne 5 og sykle 10x til Eluer bundet nukleinsyrer fra 5 ml TruTips. Dette er stort volum eluering nr. 1.
  8. Flytt TruTips til kolonne 6 og gjenta trinnet med den andre alikvot av elueringsbuffer. Dette er stort volum eluering nr. 2.
  9. Overfør eluering nr. 2 i posisjon 9 kolonne 5 å kombinere det med eluering nr. 1, og kast TruTips.

Uttrekk og Konsentrasjon: Den høye molekylvekt-DNA er fjernet fra ekstraktet, og det gjenværende DNA blir isolert og konsentrert.

  1. Legg kombinert eluent fra trinn 22 til posisjon 10 kolonne 1 og bland godt 10x.
  2. Plukk opp 1 ml TruTips fra stilling 13 og syklusen 20x til å binde med høy molekylvekt og DNA til monolitten.
  3. Flytt TruTips å posisjonere 10 kolonne 2 og sykle 5x å skylle tips og fjern høy molekylvekt DNA. De TruTips beholdes og settes tilbake i spissen rack på 13. plass.
  4. Med reagenser tips fra posisjon 12, tilsett 575 mL av Binding Buffer CN-B3 til prøven i posisjon 10 kolonne 1 og bland 10x.
  5. Plukke opp TruTips fra trinn 25, går tilbake til posisjon 10 kolonne 1, og syklusen 20x for å binde det resterende DNA fra prøven til 1 ml TruTip.
  6. Flytt TruTips å posisjonere 10 kolonne 4 og sykle 1x i Wash CN-W3 for å fjerne eventuelle gjenværende hemmere.
  7. Flytt TruTips å posisjonere 10 kolonne 5 og sykle 1x i Wash CN-W4 å skylle rester salter fra CN-W3.
  8. Hev TruTips løpet posisjon 10 kolonne 5 og sykle luft gjennom tipsene 35x tørke monolitten.
  9. Flytt TruTips å posisjonere 10 kolonne 6 og sykle 10x i EBA2 å eluere renset, størrelse-selecTed og konsentrert nukleinsyre.
  10. Kast TruTips.
  11. Overfør eluerte prøven fra kolonne 6 til 1,5 ml rør i posisjon 11. Ekstraherte prøvene er klare for lagring eller nedstrøms behandling.

Representative Results

Real-time PCR data for influensa RNA ekstraksjon fra Norsk Folkehjelp er vist i figur 5A. Beregnet nukleinsyre ekstraksjonseffektiviteten er lik resultatene som oppnås med den manuelle versjonen av protokollen 15.. En lineær respons i gjennomsnitt C t-verdier som er observert mellom 10 4 og 10 6 genkopier ml -1 endret influensa (R 2 = 0,99 og 0,98 for influensa A og B, respektivt), med standardavvik i gjennomsnitt C t-verdier mindre enn 1 syklus. Fraværet av krysskontaminering med epMotion systemet er vist i figur 5B, hvor 12 positive NPA prøver som inneholder 10 6 gen kopier ml -1 NPA ble ispedd 12 buffer mellomrom. Den gjennomsnittlige C t for de positive kontrollene var 30,16 ± 0,14, og alle buffer blanks var negative. Den totale utvalget saksbehandlingstid er 16, 28 og 40 min for 8, 16 og 24 prøver.Fordi en typisk klinisk nasofaryngealt aspirate eller vattpinne vil inneholde 10 7 genet kopier ml -1 (forutsatt 1000 virions per TCID 50 16 og> 10 4 TCID 50 ml -1 influensa 17), er den automatiserte epMotion protokollen forventes å være effektiv på et flertall av kliniske NPA prøver.

Gitt omfanget av molekylære tester utført på humant genomisk DNA, er det overordnede målet for nukleinsyreekstraheringsenheten fra fullblod å produsere forurensning-fri, høy molekylvekt genomisk DNA. Den automatiserte protokoll for 96 prøver er fullført innen en time, noe som er en forbedring i forhold til andre automatiserte systemer (f.eks Promega MagneSil = 90 min og Qiagen QIAamp DNA Blood BioRobot MDx system = 2,5 t). Figur 6A viser UV / Vis absorbansavlesninger profiler for 45 positive blodprøver behandlet samtidig med 45 reagensbeholdere feltene for Hamilton STAR protokollen, med en gjennomsnittlig A 260/230 ratio på 1,93. En A 260/280 ratio mellom 1,7 til 2,0 og A 260/230 ratio> 1,7 er vanligvis et tegn på svært rent DNA, fri for rester av salter, proteiner eller løsemidler, og akseptabelt for de fleste nedstrøms molekylære applikasjoner. Den 1% agarosegel i figur 6B viser at det resulterende gDNA er av høy molekylvekt (> 24 kb), med minimal skjærkraft. Den gjennomsnittlige nukleinsyre avkastning fra komplett sett av 45 positive prøver er 5.26 ± 0.46 mg menneskelig DNA per 200 mL fullblod, basert på Life Technologies Quantifiler Menneskelig DNA Kvantifisering Kit. Krysskontaminering studier som ligner dem som er vist i figur 5B ble utført med negative kontrollbuffer blanke ispedd positive prøver og ekstrahert i parallell, alle mellomrom ble igjen negativt ved PCR (ikke vist). Det rensede gDNA er også egnet for en rekke andre PCR-baserte analyser (ikke vist).

Sanntid resultater fra åtte replikate prøver av en samlet maternal plasmaprøve behandlet med stort volum TruTip prosedyre er vist i figur 7.. Den fullstendige protokollen (inkludert off-line proteinase K inkubasjon) er ferdig i ca 2,5 time, lik den Qiagen manuell Sirkulerte nukleinsyrer Kit (ingen sammenlignbare automatiserte utvinning kits er tilgjengelig ennå). De gjennomsnittlige C t verdier over alle gjentak er 34,58 ± 0,66 og 29,76 ± 0,50 for fosterets mann (CHY) og totalt (CH1) DNA, henholdsvis, som viser svært god repeterbarhet av automatiserte utvinning metoden. Konsentrasjonen av foster-DNA innen det totale DNA-basseng (i genom-ekvivalenter), beregnes på grunnlag av fit punkt-analyse sammenlignet med standarder, med en middelverdi på% føtalt DNA over alle prøvene på 2,8%. Selve% fosterets DNA for dette utvalget er ukjent fordi prøvene ble samlet før du utfører utvinning. Fosterets DNA-sammensetningi ikke-sammenslåtte plasmamålinger ekstrahert ved hjelp TruTip metoden er typisk 1,5 ganger høyere sammenlignet resultatene med en Qiagen Sirkulerte nukleinsyrer Kit (ikke vist).

Figur 1
Figur 1. Den TruTip utpakkingen og arbeidsflyt, uavhengig av flytende håndteringssystem. Andre prøveopparbeidelse eller væskehåndtering trinn kan bli innlemmet i automatiserte rutiner avhengig av egenskapene til spesifikke væske håndtering instrument og programvare.

Figur 2
Figur 2. (A) Eppendorf epMotion 5070 sample plate layout. (B) Arrangement av reagenser / consumables på arbeidsbord. Prøven plate kan konfigureres for opp til 24 prøver (kolonne 1, 5 og 9, henholdsvis), selv om epMotion vil bare behandle maksimalt åtte prøver samtidig. Klikk her for å se større figur .

Figur 3
Figur 3. Hamilton STAR dekk layout for rensing av genomisk DNA fra blod (ikke i målestokk) Deck Posisjon 1 = Hamilton 1 ml filtrert tips;. 2 = Hamilton 1 ml ufiltrerte tips; 3 = Akonni / Hamilton 1 ml LPT 2 mm TruTips, 4 = inngang blod prøvebærere (blodprøverør eller mikrosentrifugerør), 5-9 = 290 ml Reagens trau for lysebuffer F, Etanol, Vaskbuffer J, Wash Buffer K og Elution Buffer A2, henholdsvis, 10 = 96 deep godt Binding plate; 11 = 96 dyp brønn Vask J; 12 = 96 dyp brønn Vask K, 13 = 96 dyp brønn Elution plate; 14 = Hamilton HHS2 varmeapparat / shaker med Nunc 96 dyp brønn Inkubasjon plate; 15 = 50 ml reagens trough som inneholder proteinase K. Klikk her for å se større figur .

Figur 4
Figur 4. Hamilton STARPLUS dekk layout for rensing av DNA fra store volum plasma prøver (ikke i målestokk). Systemet er utstyrt med 8 x 5 ml kanaler og 8 x 1 ml kanaler (ikke vist i kortstokken layout). Deck Stilling 1 = Hamilton 4 ml filtrert tips, 2 = Akonni / Hamilton 5 ml TruTips, 3 = kilde Plasmaprøver, 4 = 50 ml koniske rør, 5 = 120 ml Reagens trau som inneholder CN-W1, CN-W2 og CN-W4 reagents, ​​6 = lavt volum reagenser trau som inneholder proteinase K, CN-B2, CN-B3, EBA2, EBB og CN-W3 reagenser, 7 = 290 ml reagens trau som inneholder CN-L1 reagenser, 8 = 290 ml reagens trau som inneholder CN -B1 reagenser, 9 = 96 dyp brønn plater for Trinn 1, 10 = 96 dyp brønn plater for Trinn 2, 11 = prøvebærere for renset, sluttprodukt, 12 = Hamilton 1 ml ufiltrerte tips; 13 = Akonni / Hamilton 1 ml LPT 4 mm TruTips. Klikk her for å se større figur .

Figur 5
Figur 5. (A). Real-time PCR resultater fra automatisert TruTip utvinning av influensavirus lagt inn nasofaryngealt aspirate (NPA). Input NPA volum = 100 ul, elueringsvolum = 50 pl. Resultatene er gjennomsnittet av tre replikere extractions fra fem forskjellige NPA bakgrunner (n = 15) pr fortynning nivå og influensa målet. qPCR ble utført på LightCycler 480 system med analysebetingelser beskrevet tidligere 15. (B) Ingen krysskontaminering blir oppdaget når 12 positive NPA prøvene er ispedd ingen mal kontroller og underlagt den automatiserte utvinning prosedyre. Klikk her for å se større figur .

Figur 6
Figur 6. Resultater av humant genomisk DNA-ekstraksjon fra fullblod. A) UV-Synlige spor fra en NanoDrop 1000 (ThermoFisher) fra 10 tilfeldig utvalgte gjentak. B) 1% agarose gel av TruTip renset gDNA. M = Fisher 24 kb Max DNA Ladder. Lanes 1-4 = ~ 100 ng renset gDNA fra fire tilfeldig valgte gjentak. Klikk her for å se større figur .

Figur 7
Figur 7. Real-time PCR resultater fra åtte replikere TruTip utdrag av fritt sirkulerende DNA fra plasma. Prøver merket med stjerne (* eller **) ble hentet på forskjellige dager. CHY kvantifiserer mannlig fosterets DNA og CH1 kvantifiserer total DNA tilstede (foster eller mor). qPCR ble utført på en LightCycler 480 system (Roche) med tidligere publiserte analyser rettet CHY og CH1 18.

Discussion

Enkelheten i TruTip konsept og arbeidsflyt (figur 1) gjør det lett tilpasses, automatisert, effektive for en rekke kliniske prøven matriser, input prøvemengder, og flytende håndteringssystemer. Det bør bli anerkjent imidlertid at hver prøvematerialet er unik, og vil variere den ene til den neste i viskositet, partikler, slim, overflateforurensninger, mikrobielle, og / eller humane genetiske bakgrunner. Gitt forventet variasjon i klinisk prøve sammensetning og tiltenkte bruk av en automatisert TruTip prøveopparbeidelse protokoll, kan det derfor være nødvendig å endre enkelte trinn i en TruTip prosedyre for å oppnå ønskede resultater for en spesifikk prøvetype. Uavhengig av prøvetype imidlertid TruTip parametere som typisk har størst virkning på nukleinsyre renhet og / eller gjenvinning omfatter:

  1. Eksempel på blanding og homogenisering med lysis buffer (og alkohol). Mens TruTips ha en relerende stor pore størrelse, sample homogenisering og LNG er svært viktig for effektiv cellelyse, og påfølgende bindende skritt til TruTip monolitt. Med et homogent og godt flytende lysate, kan prøvene flytte gjennom TruTip med høyere gjennomstrømning, noe som reduserer den samlede utvalgets behandling tid. Det store volum plasma protokoll demonstrerer potensialet for brukere å grundig homogenisering og kondensere vanskelige prøver (on-line eller off-line), til tross for det store inndata prøvevolum.
  2. Strømningshastigheter. Langsommere flyt priser under nukleinsyre bindende eller eluering typisk resultere i høyere nukleinsyre gir, om enn på bekostning av total saksbehandlingstid. Langsommere strømningshastigheter kan også redusere omfanget av DNA skråstilling.
  3. Cycle tall. Den optimale antall aspirasjon og dispensere sykluser er avhengig av prøvetype, totalt prøvevolum, og gjennomstrømning. Trinn 1 i figur 1 er typisk det punktet hvor syklus numbers (og strømningshastigheter) kan kreve noe empirisk optimalisering, med prøver som nasofaryngealt aspirate (figur 5) som representerer en av de mer utfordrende lysater for å optimalisere på grunn av omfanget av NPA viskositeter fra forskjellige pasienter.
  4. Tørking. Komplett tørking av TruTip Monolitten er avgjørende for å hindre gjenværende organiske løsemidler fra co-eluering med renset nukleinsyre prøven og hemme nedstrøms prosesser eller tester. Fordi TruTip ikke er tørket via sentrifugering eller vakuumfiltrering, er det viktig å maksimere både strømningshastigheten og syklus tall i løpet av tørketrinnet. Noen ganger er det en gjenværende dråpe vask løsning på endestasjonen TruTip etter tørking sykluser er fullført. Den Hamilton roboten har evnen til å utføre en "tip preg" på siden av brønnen for å frigjøre dråpestørrelse og derved sikre et løsemiddelfritt eluering. Den epMotion systemet ikke har denne funksjonen, men en pre-skylling av TruTip endestasjonen i elution buffer kan programmeres til å oppnå samme effekt.

Fordi geometri, pipette tips materiale, og vedlegg metode for å robot kanal armene er unike for hvert instrument produsent, er en annen TruTip konstruksjon kreves for hver flytende håndteringssystem. De TruTip monolitt dimensjoner (diameter, tykkelse og pore størrelse) ikke korrelerer med nukleinsyre bindende kapasitet (og eluering effektivitet), er som forventet for noen solid-fase ekstraksjon teknikk. Mens tykke (> 4 mm) matriser kan være innebygd i en 1 ml TruTip å øke nukleinsyre-bindende kapasitet for stort volum prøver og / eller utjevne bindingskapasitet på tvers av bestemte TruTip formater, er det en avveining mellom TruTip tykkelse og strømningsmengder i løpet den innledende binding trinn (i nærvær av rå lysater). Dermed er det noen ganger en fordel å legge større diameter bautasteiner i større volum pipette tips for de første trinnene i en automatisert protokoll, (f.eks </ Em> de 5 ml Hamilton / Akonni TruTips for stort volum utdrag). Gitt de spesifikke TruTip konfigurasjoner diktert av produsentene av væskehåndtering roboter, derimot, trenger vi ikke nødvendigvis forvente TruTip nukleinsyre gir å være identisk på tvers væskehåndtering plattformer fra forskjellige produsenter, eller på tvers av ulike TruTip størrelser.

Kliniske prøver (per definisjon) vil inneholde betydelige mengder av humant genomisk DNA med mindre de er kjøpt fra normalt sterile områder (f.eks cerebral spinal væske). Noen ganger er det humant genomisk DNA er ønsket (som i figur 6), mens i den andre anvendelser humant DNA representerer en uønsket genomisk bakgrunn (for eksempel på figur 5). Tilstedeværelsen av DNA bakgrunn er vanligvis ikke problematisk, så lenge den totale mengde av nukleinsyre i prøven, ikke overskrider bindingskapasiteten av monolitten, og bakgrunnen DNA kan tjene som en bærer hvis ønsket target nukleinsyre er tilstede i spormengder. Formålet med høyt volum plasma ekstraksjon protokoll (figur 7), er å isolere (fragmenterte) føtalt DNA i nærvær av et 10-20 gangers overskudd av mors-DNA, som er lik den prøvepreparering målet for smittsomme sykdommer tester, bortsett fra at sekvensene er svært kongruente og kan bare skilles ved meget spesifikke molekylære testing og / eller størrelse diskriminering. I dette tilfellet er totalt sirkulerende DNA isolert ved hjelp av en 5 ml TruTip, og påfølgende høymolekylær og lavmolekylær vekt føtalt DNA blir separert gjennom påfølgende binding og eluering på en 1 ml TruTip ved å endre bindingsbuffer forhold. Selektiv størrelse separasjon og berikelse av målet nukleinsyrer basert på deres bindende og eluering egenskapene til en silika monolitt er en vesentlig annen virkningsmekanisme enn oppnås ved membraner eller størrelseseksklusjonstrinn spin kolonner. Størrelse separasjon og anrikning av mikrobiell DNA fra humant genomisk DNA kan være enccomplished i fremtidige søknader via tilpassing TruTip bindende og eluering buffere.

De automatiserte protokoller demonstrert her understreke nytten av TruTip monolitten seg for å behandle ulike kliniske prøver, og hvordan det kan tilpasses for store volumer og spesifikke væskehåndtering roboter. Den strømlinjeformede metoder typisk resultere i raskere utvinning protokoller i forhold til andre automatiserte systemer. Enkelheten av TruTip teknologi, derimot, gir også noen kostnadsfordeler for de som er interessert i å kjøpe en ny, automatisert nukleinsyrerensing system, fordi den primære maskinvaren som kreves for å automatisere TruTip prosedyrer er pipetten kanal arm selv heller enn magnetiske stenger, vakuum systemer , eller om bord sentrifuger. Utnytte forhåndsutfylte reagenser plater kan også redusere plass og nødvendige forbruksvarer, og doble gjennomstrømningen per løp. Minimere dekksplass med TruTip protokoller gjør også avanserte brukere å integrere oppstrøms eller downstream automatiserte prosesser med TruTip. For eksempel Hamiltons easyBlood løsning på fraksjonerer fullblod kan bli innlemmet med den automatiserte TruTip utvinning metoden, som i betydelig grad ville effektivisere bio-bank prosesser. Post-ekstraksjonsprosesser for eksempel nukleinsyrekvantifisering, normalisering, PCR oppsett, eller DNA-sekvensering er også lett integreres med TruTip på de større flytende håndtering plattformer.

Disclosures

Forfatterne er ansatte i Akonni Biosystems, Inc. som produserer materialer som brukes i denne artikkelen.

Fri tilgang og produksjon av denne artikkelen er sponset av Akonni Biosystems, Inc.

Acknowledgments

Deler av dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) i henhold til stipend R 44 AI072784. Vi takker Dr. Kirsten St. George, Sara B. Griesemer, Daryl Lamson og Amy dekan ved Laboratory of Viral Diseases, Wadsworth sentrum, New York State Dept. of Health for tallfestede influensavirioner og tilgang til klinisk validert influensa sanntid PCR-analyser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
TruTip Influenza Extraction Kit (EPM TruTips) Akonni Biosystems, Inc. 300-11120
95% Ethanol Acros Organics/ThermoFisher Scientific AC615110040
99% Acetone Sigma-Aldrich 270725-4L
DEPC-treated water Life Technologies AM9906
Reagent Reservoir, 30 ml Eppendorf 960050100
Deep well plate 96/2,000 μl USA Scientific 30502302
epT.I.P.S. Motion Filtertips, 1,000 μl Eppendorf 960050100
Equipment
epMotion 5070 System Eppendorf 5070 000.000
Dispensing tool TM1000-8 960001061
Reservoir rack 960002148
Table 1. Reagents and equipment for automated RNA extraction from NPA.
Reagent/Material
TruTip gDNA Blood Extraction Kit (Hamilton TruTips) Akonni Biosystems, Inc. 300-20341
95% ethanol Acros Organics/ThermoFisher Scientific AC615110040
Proteinase K AMRESCO LLC E195
1 ml Hamilton filtered CO-RE 96 tip rack Hamilton Robotics, Inc. 235905
1 ml Hamilton non-filtered CO-RE 96 tip rack Hamilton Robotics, Inc. 235904
50 ml Reagent Trough Hamilton Robotics, Inc. 187297
Deep Well 2 ml plate USA Scientific 1896-2800
Nunc 96 DWP-2 ml Thermofisher 27874
Reagent Trough Fisher 14-222-412
Equipment
Hamilton STAR System Hamilton Robotics, Inc. 173027
1 ml Independent Pipette Channels / Modular Arm Hamilton Robotics, Inc. 173081/173050
1 ml 96-channel head Hamilton Robotics, Inc. 199090
Tip Carriers Hamilton Robotics, Inc. 182085
Sample Carriers/Inserts Hamilton Robotics, Inc. 173400/182238
Plate Carriers Hamilton Robotics, Inc. 182090
Multiflex Carrier Hamilton Robotics, Inc. 188039
HHS2 Heater Shaker Unit Hamilton Robotics, Inc. 199033
Rack Carrier Hamilton Robotics, Inc. 188047
Table 2. Regents and equipment for 96-well genomic DNA extraction from whole blood.
Reagent/Material
TruTip R+D Circulating DNA Extraction Kit (Hamilton TruTips) Akonni Biosystems, Inc. Call to inquire
100% ethanol Sigma-Aldrich 459828-1L
Isopropanol Acros Organics/ThermoFisher Scientific AC327270010
Proteinase K AMRESCO LLC E195
Filtered 4 ml Tips Hamilton Robotics, Inc. 184022
Unfiltered 1 ml Tips Hamilton Robotics, Inc. 235939
96-Deep Well Plates USA Scientific 1896-2800
50 ml Conical Tubes Corning/ThermoFisher Scientific 05-526B
50 ml Reagent Troughs Hamilton Robotics, Inc. 187297
120 ml Reagent Troughs Hamilton Robotics, Inc. 182703
Large Volume 96-Pos Reagent Troughs ThermoFisher Scientific 14-222-412
Equipment
STARplus Autoload Workstation Base / Deck Module Hamilton Robotics, Inc. 173025/190012
1 ml Independent Pipette Channels / Arm Hamilton Robotics, Inc. 173081/173052
5 ml Independent Channel / Modular Arm Hamilton Robotics, Inc. 184090/173050
Plate Carriers Hamilton Robotics, Inc. 182090
Multiflex Carrier Hamilton Robotics, Inc. 188039
Rack Carrier for 50 ml Reagent Troughs Hamilton Robotics, Inc. 188047
120 ml Reagent trough carrier Hamilton Robotics, Inc. 185290
Tip Carriers Hamilton Robotics, Inc. 182085
50 ml Tube Carriers Hamilton Robotics, Inc. 182245
24 Position Sample Carriers Hamilton Robotics, Inc. 173400
32 Position Sample Carrier Hamilton Robotics, Inc. 173410
Table 3. Reagents and equipment for large volume DNA extraction from plasma.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boom, R., Sol, C. J. A., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).
  2. Baker, M. P., Mitchell, A., et al. Isolation of genomic DNA from blood using a novel filter-based DNA purification technology. BioTechniques. 31, 142-145 (2001).
  3. Sinclair, B. To bead or not to bead: applications of magnetic bead technology. The Scientist. 12, 17-24 (1998).
  4. Dederich, D. A., Okwuonu, G., et al. Glass bead purification of plasmid template DNA for high throughput sequencing of mammalian genomes. Nucl. Acids Res. 30, e32 (2002).
  5. Levison, P. R., Badger, S. E., et al. Recent developments of magnetic beads for use in nucleic acid purification. J. Chromatogr. A. 816, 107-111 (1998).
  6. Hourfar, M. K., Schmidt, M., Seifried, E., Roth, W. K. Evaluation of an automated high-volume extraction method for viral nucleic acids in comparison to a manual procedure with preceding enrichment. Vox Sang. 89, 71-76 (2005).
  7. Perelle, S., Cavellini, L., et al. Use of a robotic RNA purification protocol based on the NucliSens easyMAG for real-time RT-PCR detection of hepatitis A virus in bottled water. J. Virol. Methods. 157, 80-83 (2009).
  8. Riemann, K., Adamzik, M., et al. Comparison of manual and automated nucleic acid extraction from whole-blood samples. J. Clin. Lab. Anal. 21, 244-248 (2007).
  9. Hukari, K. W., Shultz, M., Isely, N., Milson, R., West, J. A. A completely automated sample preparation instrument and consumable device for isolation and purification of nucleic acids. J. Lab. Autom. 16, 355-365 (2011).
  10. Kessler, H., Mühlbauer, G. Fully automated nucleic acid extraction. MagNA Pure LC. Clin. Chem. 47, 1124-1126 (2001).
  11. Miller, S., Seet, H., Khan, Y., Wright, C., Nadarajah, R. Comparison of QIAGEN automated nucleic acid extraction methods for CMV quantitative PCR testing. Am. J. Clin. Pathol. 133, 558-563 (2010).
  12. Dundas, N., Leos, N. K., Mitui, M., Revell, P., Rogers, B. B. Comparison of automated nucleic acid extraction methods with manual extraction. J. Mol. Diagn. 10, 311-316 (2008).
  13. Kruhøffer, M., Voss, T., et al. Evaluation of the QIAsymphony SP workstation for magnetic particle-based nucleic acid purification from different sample types for demanding downstream applications. J. Lab. Autom. 15, 41-51 (2010).
  14. Akonni Biosystems, Inc. Apparatus, system, and method for purifying nucleic acids. United States Patent. Belgrader, P. US7759112 (2010).
  15. Chandler, D. P., Griesemer, S. B., et al. Rapid, simple influenza RNA extraction from nasopharyngeal samples. J. Virol. Methods. 183, 8-13 (2012).
  16. Chan, K. H., Lai, S. T., et al. Analytical sensitivity of rapid influenza antigen detection tests for swine-origin influenza virus (H1N1). J. Clin. Virol. 45, 205-207 (2009).
  17. Chan, K. H., Lama, S. Y., et al. Comparative analytical sensitivities of six rapid influenza A antigen detection test kits for detection of influenza A. subtypes H1N1, H3N2 and. 38, 169-171 (2007).
  18. Fan, H. C., Blumenfeld, Y. J., Chitkara, U., Hudgins, L., Quake, S. R. Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by shotgun sequencing DNA from maternal blood. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 16266-16271 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics