تحليل Transcriptomic من العينات الجراحية الإنسان الشبكية عن طريق مجلة

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 1 hour trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

استخدمنا عينات من شبكية العين retinectomy لتحليل transcriptomic من انفصال الشبكية. وضعنا الداخلي الذي يسمح بحفظ RNA بين الكتل الجراحية والمختبرية. نحن موحدة بروتوكول لتنقية الحمض النووي الريبي التي كتبها السيزيوم كلوريد تنبيذ فائق للتأكد من أن الرنا المنقى هي مناسبة لتحليل ميكروأري.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Delyfer, M. N., Aït-Ali, N., Camara, H., Clérin, E., Korobelnik, J. F., Sahel, J. A., Léveillard, T. Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl. J. Vis. Exp. (78), e50375, doi:10.3791/50375 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

انفصال الشبكية (RD) يصف انفصال الشبكية العصبي الحسي من الظهارة الصباغية الشبكية (RPE). قواعد الإجراءات والإثبات أمر ضروري من أجل وظيفة طبيعية من الخلايا العصبية الحساسة للضوء، ومبصرات. انفصال الشبكية من قواعد الإجراءات والإثبات يخلق فجوة المادية التي يتم تعبئة مع السائل خارج الخلية. RD يبادر الأحداث السلبية الخلوية والجزيئية التي تؤثر على كل من شبكية العين العصبي الحسي وقواعد الإجراءات والإثبات منذ تبادل الفسيولوجية للأيونات ونواتج الأيض ومنزعجة بشدة. ويرتبط العاقبة للرؤية لمدة مفرزة منذ reapposition السريع لاثنين من الأنسجة النتائج في استعادة الرؤية 1. علاج RD هو الجراحية حصرا. ويتبع إزالة هلام الجسم الزجاجي (استئصال الزجاجية) عن طريق إزالة جزء غير أساسي من شبكية العين في جميع أنحاء منطقة منفصلة لصالح انفصال الشبكية. العينات الشبكية إزالة هي بلا مالك (لا شيء) وبالتالي التخلص منها بشكل طبيعي.لاستعادة الحمض النووي الريبي من هذه العينات الجراحية، قمنا بتطوير مجلة الإجراء الذي يسمح بحفظ RNA أثناء نقل من كتلة الجراحية إلى المختبر. نحن أيضا موحدة بروتوكول لتنقية الحمض النووي الريبي التي كتبها السيزيوم كلوريد تنبيذ فائق للتأكد من أن الرنا المنقى هي مناسبة لتحليل التعبير الجيني العالمي. جرى التحقق من نوعية الحمض النووي الريبي على حد سواء من قبل RT-PCR وتحليل ميكروأري. تحليل البيانات يظهر تورط في وقت واحد من الالتهابات وانحطاط مبصرة خلال RD.

Introduction

الهدف العلاجي الرئيسي في انفصال الشبكية (RD) هو إيجاد وسيلة للحد من تلف الخلايا المستقبلة للضوء والتهاب شبكية العين الناتجة عن فصل مبصرات من الخلايا الظهارية المصطبغة الشبكية. خلال RD، يتم تنشيط خلايا RPE، ترحيل، dedifferentiate، وتتكاثر على سطح الشبكية منفصلة، ​​وممارسة القوات مقلص مما يؤدي إلى مضاعفات. تحليل Transcriptomics من RD هو وسيلة لتحديد الجينات المستهدفة مع التعبير بعد تعديل RD والجزيئات العلاجية بالتالي المستقبلية التي يمكن أن تحسن نتائج البصرية النهائي في تركيبة مع الجراحة. ومن المعلوم حمض النووي الريبي (RNA) ليست مستقرة كما هو حمض النووي الريبي منقوص الأكسجين (DNA)، وهذه الأخيرة تستخدم على نطاق واسع للدراسات الجينية واستقراره سمحت تسلسل الجينوم النياندرتال من العينات الحفرية من أكثر من 30،000 سنة 2. النسخ من الحمض النووي من الجينات من الجينوم في الحمض النووي الريبي هو رسولعملية كبيرة في التعبير الجيني، ومرنا غير قابل للتغيير من أجل يشكل إشارة. الرنا هي جدا المتدهورة بسرعة عن طريق الانزيمات التي ريبونوكلياز إنهاء إشارة. عندما يتم عزل الأنسجة من كائن حي، والرنا غالبا ما تكون متدهورة قبل أن يتم درس التعبير في مختبر الأبحاث. ليست مناسبة RNA المتدهورة للتحليل التعبير الجيني. لأن موظفي المختبرات لا يمكن أن تشارك في عملية جراحية، وضعنا الداخلي التي هي سهلة وتتطلب فقط أن الجراح لاسترداد الأنسجة إلى حل ريبونوكلياز خالية من مناسبة. الحمض النووي الريبي من الأنسجة غير مستقرة ويمكن تحليلها دون أي علامة على تدهور بعد 72 ساعة في درجة حرارة الغرفة في هذا الحل. يتم تنقية الرنا من العينات بطريقة موحدة تنطوي على تنبيذ فائق على التدرج كلوريد السيزيوم بعد أن تم نقلها إلى المختبر 3. ثم، يتم تقييم جودة الرنا بواسطة الاغاروز الكهربائي للهلام وRT-PCR. بروتوكول تنقية الحمض النووي الريبي لديهميزة فصل الجزيئات وفقا لكثافتها التي تختلف عن DNA و RNA ويؤكد أن الحمض النووي الريبي هو غير ملوثة من قبل جزيئات الحمض النووي من شأنها أن تولد إشارات مصطنعة في دراسات التعبير الجيني. وبالإضافة إلى ذلك، يتم فصل الرنا نقل (tRNAs)، والتي هي من الناحية الكمية الحمض النووي الريبي الأكثر وفرة داخل الخلية، وفقا لنفس الممتلكات المادية من الحمض النووي الريبي الريباسي (rRNAs) والرنا المرسال (mRNAs و)، تلك الماضيين واحد يجري المنتج النهائي من عملية تنقية. إزالة الحمض الريبي النووي النقال من إعداد مفيد لأن معظم البروتوكولات التحليلية ميكروأري ينطوي على استخدام transcriptases العكسي وبلمرة RNA التي تحول دون الحمض الريبي النووي النقال 4-6. وصفت الحمض النووي الريبي تنقيته من العينات الجراحية باستخدام بروتوكول قياسي والمهجنة إلى رقاقة ميكروأري ويتم تحليل النتائج باستخدام طريقتين التكميلية، طريقة معدل اكتشاف كاذبة، وباستخدام أسلوب الرواية استنادا إلى المعلومات المتبادلة وvisualiزد على الخادم على شبكة الإنترنت Retinobase 7،8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. مجلة: إجراء لاسترداد عينات من كتلة الجراحية

في المختبر

  1. الحصول على عقد من استيراد شركة الشحن السريع.
  2. ملء 10 (أو 25) أشكال الشحن مع العنوان البريدي للمختبر مما يدل على الشخص المسؤول عن الاتصال في المختبر (رقم الهاتف وعنوان البريد الإلكتروني).
  3. إعداد 10 (أو 25) أشكال عينات مرقمة من 1 إلى 10 (أو 25). وتشمل هذه الأشكال مساحات مخصصة للإبلاغ عن أ) تحديد المجهول للمريض، ب) من تاريخ الجراحة وج) أي ملاحظات إضافية فإن الجراح ترغب في إضافته. إعداد 10 (أو 25) أظرف (150 × 210 ملم).
  4. أعدت باستخدام ريبونوكلياز خالية من الكواشف 25 (أو 65) مل من 6 M غوانيدين كلوريد في diethylpyrocarbonate (DEPC) المعاملة H 2 O (GHCl).
  5. ملء 10 أو 25 مرقمة 5 مل العقيمة البولي ايثيلين جولة أنابيب أسفل مع 2.4 مل من محلول GHCl.
  6. يستخدم غاز الأرجون لملء الجزء العلوي من هذه الأنابيب، من الصحافة TIghtly على الغطاء لمنع الأكسدة من الحل GHCl على مدى عدة سنوات من التخزين في مجلس الوزراء الجراحية.
  7. أعرض كل 5 أنابيب مل في 50 مل العقيمة أنبوب البولي بروبلين أسفل المخروطية مع غطاء المسمار. استخدام قطعة من المناديل الورقية النظيفة لعقد أنبوب 5 مل في أنبوب مل 50، إغلاق الأنبوب.
  8. وضع أنابيب مل 50 على رف البوليسترين ورف في صندوق من الورق المقوى مع أظرف، وأشكال الشحن، وأشكال العينات.
  9. لصق تعليمات (انظر: 1،12-1،19) داخل غطاء صندوق من الورق المقوى لتسهيل القراءة.
  10. إرسال صندوق من الورق المقوى عن طريق البريد إلى الشخص المسؤول عن الاتصال في المستشفى.

في المستشفى

  1. إحضار صندوق من الورق المقوى من مجلس الوزراء الجراحية إلى غرفة العمليات الجراحية. ملاحظة تنبيه: إذا ينطوي الإجراء على المريض للخطر المناعي، لا ينبغي أن أحضر من الورق المقوى إلى غرفة العمليات الجراحية.
  2. أثناء الجراحة، ضع specim الشبكيةEN في مرقمة 5 مل البولي بروبلين عقيمة مليئة حل GHCl. إغلاق بإحكام الأنبوب.
  3. عودة الأنبوب لفترة وجيزة.
  4. وضع أنبوب على الروك أنبوب الدم لمدة 10 دقيقة.
  5. ملء استمارة مرقمة عينة المرافق له.
  6. تقرير رقم الهوية على المقابلة مرقمة 50 مل أنبوب.
  7. إدخال أنبوب مل 5 مع عينة جراحية في أنبوب مل 50، استبدال المناديل الورقية والمسمار الأنبوب.
  8. إدخال الأنبوب وشكل عينة ملأت في ذلك في واحدة من أظرف المرافق له. إغلاقه.
  9. استدعاء شركة الشحن السريع لالتقاط.

2. تنقية الحمض النووي الريبي

في المختبر

  1. تجانس العينة في أنبوب البولي بروبلين في 5 مل مع حل GHCl مع الخالط لمدة 1 دقيقة في حين تحريك أنبوب صعودا وهبوطا.
  2. إضافة 270 ميكرولتر من 2 M البوتاسيوم خلات 5.0 درجة الحموضة. هزة بقوة لمدة 10 دقيقة عن طريق وضع أنبوب على شاكر في تقريرهاالوضع الأفقي (420 دقيقة -1).
  3. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 5،000 دورة في الدقيقة (6،500 x ج) في 20 درجة مئوية.
  4. نضح بسلاسة الكسر للذوبان دون الإخلال بيليه.
  5. نقل إلى 14 مل أنبوب العقيمة.
  6. إضافة 5.3 مل من 100 ملي تريس درجة الحموضة 8.0، N-Lauroylsarcosine 1٪.
  7. إضافة 3.2 غرام من كلوريد السيزيوم (CSCL) وتخلط الأنبوب قبل vortexing.
  8. إضافة 1.8 مل من CSCL / ethylenediaminetetraacetic حامض (EDTA) في العقيمة 11 مل أنبوب الطرد المركزي polyallomer.
  9. مع 10 مل العقيمة باستور ماصة، ونقل الحل RNA على 1.8 مل CSCL / EDTA من الانزلاق ببطء على حافة الأنبوب لتجنب إزعاج سادة كثافة.
  10. وضع أنابيب (أنبوب الثاني يحتوي على مخازن بدون شبكية العين إذا لزم الأمر) في الدوار.
  11. أجهزة الطرد المركزي 24 ساعة عند 32،000 دورة في الدقيقة (225،000 x ج) في 20 درجة مئوية.
  12. إزالة الجزء العلوي من الحل مع ماصة باستير العقيمة، وتجاهل ذلك.
  13. إزالة تدريجيا أثناء التحقق منلحظة عندما يستنشق الحمض النووي (لزج) مع الثاني معقمة باستور ماصة، وتخلص منه.
  14. إزالة الحل المتبقية مع الحرص على عدم الإفراج عن بيليه RNA مع ثلث العقيمة باستور ماصة.
  15. القسم السفلي من أنبوب مع مشرط لهب تعقيمها، ثم وضع الجزء المتبقي من الأنبوب ذلك رأسا على عقب على النظرة العقيمة.
  16. عكس أنبوب وشطف بدقة مع 160 ميكرولتر من GHCl.
  17. السماح للبيليه جافة لمدة 10 دقيقة.
  18. Resuspend وبيليه في 150 ميكرولتر من (10 ملي تريس الرقم الهيدروجيني 7،5-1 ملي EDTA - 0.1٪ SDS).
  19. نقل الحل إلى 2 مل العقيمة أنبوب microcentrifuge، ثم حصاد بيليه المتبقية مع 30 ميكرولتر من (10 ملي تريس الرقم الهيدروجيني 7،5-1 ملي EDTA - 0.1٪ SDS).
  20. إضافة 150 ميكرولتر من (10 ملي تريس الرقم الهيدروجيني 7،5-1 ملي EDTA).
  21. إضافة 30 ميكرولتر من 3 M الصوديوم خلات درجة الحموضة 5.0، دوامة الأنبوب.
  22. إضافة 900 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ (-20 ° C)، دوامة الأنبوب.
  23. وضع أنبوب 30 دقيقة في ذوبان الجليد.
  24. CENtrifuge الأنبوب 30 دقيقة في 15،000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية.
  25. نضح بدقة الكسر القابلة للذوبان، وتخلص منه.
  26. إضافة 500 ميكرولتر الإيثانول 70٪ (RT)، دوامة الأنبوب.
  27. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب 20 دقيقة في 15،000 دورة في الدقيقة (18،000 XG) في 4 درجات مئوية.
  28. كرر الخطوة الشطف (70٪ من الإيثانول).
  29. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة، والقضاء على الإيثانول المتبقية مع ماصة P200.
  30. السماح الهواء الجاف بيليه لمدة 10 دقيقة.
  31. Resuspend وبيليه في 50 ميكرولتر DEPC المعاملة H 2 O.
  32. مزج بقوة قبل vortexing.
  33. احتضان 15 دقيقة عند 45 درجة مئوية في حمام مائي.

3. تحليل الحمض النووي الريبي من قبل الكهربائي جل

  1. صب agarose هلام داخل غطاء الكيميائية.
  2. في العقيمة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge، إضافة 2 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي ليتم تحليلها و 6.4 ميكرولتر من العازلة الإعدادية عينة.
  3. في الثانية 1.5 مل أنبوب، إضافة 3 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي المعايير و 9.6 ميكرولتر من العازلة الإعدادية عينة.
  4. تسخين أنابيب 15 دقيقة عند 65 درجة مئوية، ووضعها على الجليد.
  5. إضافة 1 ميكرولتر إيثيديوم بروميد (EB) العازلة تحميل دون صبغ في عينة الحمض النووي الريبي أنبوب و 1 ميكرولتر EB تحميل العازلة مع الصبغة في أنبوب المعايير الحمض النووي الريبي.
  6. تشغيل هلام تحت 80-100 V داخل غطاء الكيميائية في تشغيل المخزن المؤقت، حتى واحد من الأصباغ (برموفينول الأزرق) تصل إلى 2/3 من الجزء السفلي من هلام.
  7. شطف الجل مرتين 15 دقيقة مع 250 مل دي المعالجة DEPC 2X SSC.
  8. التقاط صورة رقمية تحت إضاءة فوق البنفسجية.
  9. حساب النسبة بين الشريط العلوي (23S الرنا الريباسي) وانخفاض الفرقة (16S الرنا الريباسي).

4. تنقية النهائي من الحمض النووي الريبي

  1. ضبط مستوى الصوت من عينة الحمض النووي الريبي إلى 100 ​​ميكرولتر مع DEPC المعاملة H 2 O (إذا لزم الأمر).
  2. إضافة 100 ميكرولتر من حمض الفينول (1 مل ​​الفينول المشبعة في DEPC المعاملة H 2 O + 130 ميكرولتر من 50 ملم من خلات الصوديوم، ودرجة الحموضة 5.2)، دوامة بقوة.
  3. أجهزة الطرد المركزي في 10 دقيقة في 13،000 دورة في الدقيقة (15،000 XG) في درجة حرارة الغرفة.
  4. يتعافىR بعناية ونقل المرحلة المائية (المرحلة العليا) في رواية العقيمة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge.
  5. إضافة 10 ميكرولتر من 3 M خلات الصوديوم، ودرجة الحموضة 5.2 و 250 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ (-20 ° C).
  6. احتضان الأنبوب 30 دقيقة إلى ذوبان الجليد.
  7. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب 30 دقيقة في 14،000 دورة في الدقيقة (18،000 XG) في 4 درجات مئوية.
  8. نضح بعناية الكسر القابلة للذوبان، وتخلص منه.
  9. إضافة 500 ميكرولتر من الايثانول 70٪ (درجة حرارة الغرفة)، ودوامة الأنبوب.
  10. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب 20 دقيقة في 14،000 دورة في الدقيقة (18،000 XG) في 4 درجات مئوية.
  11. كرر الخطوة الشطف (70٪ من الإيثانول).
  12. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة، والقضاء على الإيثانول المتبقية مع ماصة P200.
  13. السماح الهواء الجاف بيليه لمدة 10 دقيقة.
  14. Resuspend وبيليه في 50 ميكرولتر من DEPC المعاملة H 2 O.
  15. احتضان أنبوب ثم 15 دقيقة في 45 درجة مئوية.
  16. قياس الامتصاصية (عبس) في 260 نانومتر و 280 نانومتر في 2 ميكرولتر من عينة الحمض النووي الريبي. احتساب نسبة Abs260/Abs280.
  17. <لى> المتجر عينة الحمض النووي الريبي في -80 ° C (مستقر لعدة سنوات).

5. حلول وإجراءات التنظيف

  1. خلات البوتاسيوم 2 M، ودرجة الحموضة 5.0: ذوب 19.6 غرام خلات البوتاسيوم في 70 مل من DEPC المعاملة H 2 O. التنظيف التحقيق متر الرقم الهيدروجيني عن طريق نقع عليه في مع هيدروكسيد الصوديوم 1M لمدة 15 دقيقة، تليها 5 يشطف مع DEPC المعاملة H 2 O. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 5.0 مع حمض الخليك ثم ضبط مستوى الصوت إلى 100 ​​مل مع DEPC المعاملة H 2 O.
  2. تريس، حمض الهيدروكلوريك 100 ملم، ودرجة الحموضة 8.0، N-Lauroylsarcosine 1٪: ذوب 2 غرام من N-Lauroylsarcosine (تحت غطاء محرك السيارة) في 40 مل من 0.5 M تريس، ودرجة الحموضة 8.0 قاعدة. ضبط مستوى الصوت إلى 200 مل مع DEPC المعاملة H 2 O.) CSCL / EDTA: 96 غرام من CSCL في 50 مل 10 ملي EDTA 7.5 درجة الحموضة أعدت مع DEPC المعاملة H 2 O. الأوتوكلاف وضبط مستوى الصوت إلى 100 ​​مل مع DEPC المعاملة H 2 O. تحقق من درجة الحموضة <7.5.
  3. agarose هلام 1٪: ضع 1 غرام من الاغاروز في 62 مل DEPC المعاملة H 2 O. تغلي في فرن الميكروويف. إضافة 18 مل من 12.3 Mالفورمالديهايد، 20 مل من اجتماعات الأطراف 5X. صب داخل غطاء الكيميائية.
  4. العازلة عينة الإعدادية: أن تكون على استعداد مرتجل. مزج مادة كيميائية داخل غطاء محرك السيارة 8 ميكرولتر من اجتماعات الأطراف 5X، 16 ميكرولتر من 12.3 M الفورمالديهايد و 40 ميكرولتر من الفورماميد.
  5. EB تحميل العازلة (بدون صبغ): أن تكون على استعداد مرتجل. إضافة 4 ميكرولتر 10 ملغ / مل بروميد إيثيديوم إلى 20 ميكرولتر من 80٪ الجلسرين أعدت مع DEPC المعاملة H 2 O.
  6. EB تحميل العازلة (مع صبغ): أن تكون على استعداد مرتجل. إضافة 2 ميكرولتر 10 ملغ / مل بروميد إيثيديوم إلى 10 ميكرولتر من 80٪ الجلسرين تحتوي على 0.25٪ xylen cyanol، 0.25٪ الزرقاء برموفينول مع المعاملة DEPC H 2 O.
  7. تشغيل المخزن المؤقت: إلى 60 مل MOPS 5X، إضافة 54 مل من 12.3 M الفورمالديهايد و 186 مل من DEPC المعاملة H 2 O.
  8. DEPC المعاملة H 2 O: الماء المقطر احتضان مع 0.1٪ V / V diethylpyrocarbonate لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية مع التحريك. تعقيم بواسطة الأوتوكلاف.
  9. تنظيف الخالط: إضافة 25 مل من محلول التنظيف (RBS) إلى 1 L من DEPC-تعامل H 2 O، وimmerge محور 1 دقيقة مع التحريك. احتضان 2 ساعة على 60 درجة مئوية. شطف جيدا مع DEPC المعاملة H 2 O التفاف الصك إلى الألمنيوم ووضعها في مربع الصك. التفاف مربع. تعقيم بواسطة الأوتوكلاف.
  10. تنظيف الجهاز الكهربائي: اغسل الجهاز، الدرج والمشط 15 بئرا. احتضان 15 دقيقة في 3٪ بيروكسيد الهيدروجين. شطف مرة واحدة مع الإيثانول بنسبة 100٪. الهواء الجاف.
  11. تنظيف الأطباق الزجاجية: تنظيف الأطباق الزجاجية RBS 2٪ كل ليلة، ثم يشطف بالماء المقطر قبل التعقيم عند 200 درجة مئوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الإجراء مجلة (الشكل 1) يسمح لنا استعادة عينات من شبكية العين من كتلة جراحية لتنقية الحمض النووي الريبي، وتحليل Transcriptome على انفصال الشبكية. نتائج انفصال الشبكية في upregulation من الانجذاب الكيميائي الوحيدات MCP1 الجين CCL2، وانخفاض في التعبير عن قضيب مبصرة transducing الجين GNAT1، مخروط موجة قصيرة أوبسين OPN1SW، وhomeogene CRX (الشكل 2). تحريض CCL2 والناتجة عن التهاب في حين أن الحد يصاحب ذلك من GNAT1، OPN1SW وCRX هو نتيجة لانحطاط مبصرة، على حد سواء قضبان ومخاريط. فقدان المخاريط قد تنجم عن فقدان التعبير عن NXNL1، الذي يشفر لقابلية المخروط رود المستمدة عامل 7،10، أو RdCVF2 لها paralogue، الذي المشفرة بواسطة الجينات NXNL2. من المستغرب أن رسول السابقين NXNL2ISTS في نسختين مختلفتين. الإصدار 1 (NM_001161625.1) هو تسلسل الترميز المستمدة من تحليل تطور السلالات ولكن لم يتم ذكر سابقا أن أعرب عن 11، في حين الإصدار 2 (NM_145283.2)، التي تم تحديد العديد من التكنولوجيات السليمة بيئيا هو مرنا الشاذة التي تستثني الثاني اكسون من الجين ويحتوي على اكسون الثانية البديلة، التي تحتوي على ألو تسلسل المتكررة، وتقع أكثر من 40 كيلو بايت في 3 'الاتجاه (الشكل 3A). باستخدام الحمض النووي الريبي تنقيته من شبكية العين البشرية، يمكننا الآن أن ذكرت أن الإصدارات اثنين من مرنا NXNL2 يتم التعبير (الشكل 3B).

الشكل 1
الشكل 1. صورة للصندوق من الورق المقوى يحتوي على المواد المقدمة من قبل مجلة.

الشكل 2
الشكل 2. التمثيل للتعبير عن مجموعة فرعية من الجينات باستخدام Retinobase. للجينات المعروضة في هذه الرسوم البيانية الرادار، CCL2، GNAT1، OPN1SW، وCRX، والجزء الأيمن من الرقم يتوافق مع الحمض النووي الريبي من عينات من انفصال الشبكية (RD1-18)، في حين أن الجزء الأيسر (NR1-18) هي الضوابط RNA من العمر المتطابقة إعدادها باستخدام شبكية العين بعد الوفاة. يتم وصف أسلوب الرسم البياني الرادار في 8.

الشكل (3)
الشكل (3). التعبير عن إصدار اثنين من الجينات NXNL2 في شبكية العين. تمثيل. تخطيطي من الجينات على الكروموسوم 9 NXNL2. NXNL2v1 اثنين الإكسونات التي تنبأ بها محاذاة متعددة وتحليل تطور السلالات. NXNL2v2 مفقود أن اكسون الثاني ويتضمن البديل اكسون 2 ل'، وتقع> 40 كيلو بايت في 3' الاتجاه. Tاظهار انه السهام موقف التمهيدي المستخدمة. ب. RT-PCR يظهر التعبير عن كلا NXNL2v1 وNXNL2v2 في شبكية العين. الممرات حق تتوافق مع رد الفعل في حالة عدم وجود الناسخ العكسي. ACTB، الأكتين حشوية. البادئات المستخدمة: NXNL2v1: 5'-GCATGAGCTGAGGAAGAGGT-3 '، 5'-اقول AACGGAGAAATTCTGGA-3'، NXNLv2: 5'-TCTGCACCCCCACGTTTATT-3 '، 5'-AGGGCCTCCT TTTCCATCTA-3'.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد تم وضع إجراءات لاستعادة الأنسجة من كتلة الجراحية الأساسية لتحليل Transcriptome على انفصال الشبكية. ينبغي للمرء أن تلاحظ أن هذا النوع من الجراحة يمارس في حالات الطوارئ وأن أطباء العيون التشغيل لديك القليل من الوقت للمشاركة في برنامج الأبحاث البيولوجية عندما تعمل. يتم تنفيذ هذا retinectomy أيضا عشوائيا في كل خدمة، بحيث أسهل طريقة للوصول إلى أرقام إحصائية هو العمل مع شبكة. في مثل هذه الشبكة، وتوحيد جمع الأنسجة أمر ضروري لنجاح التحليل البيولوجي. من خلال توفير المواد، من السهل جدا للاستخدام، وتعليمات دقيقة، والتي يمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة في مجلس الوزراء عملية جراحية، على مقربة من كتلة الجراحية، لقد شجعت الجراحين على المشاركة في دراستنا.

وبالإضافة إلى ذلك، تم تحقيق توحيد تنقية الحمض النووي الريبي للحصول على أفضل من هذه CL الثمينةالعينات inical. ويمكن تخزين مجموعات من الرنا نقية لسنوات في -80 درجة مئوية، وستستخدم لمزيد من الدراسات مع ظهور تقنيات علم الجينوم الرواية. يتم توفير بروتوكول للعينة جراحية في شبكية العين ولكن يمكن أيضا أن تستخدم بنجاح لعزل الحمض النووي الريبي من شبكية العين القوارض بعد تشريح. إذا كان الحمض النووي الريبي هي المتدهورة، أ) التحقق من الرقم الهيدروجيني من الحل CSCL / EDTA. ب) تقديم جميع الحلول من المواد الكيميائية غير المستخدمة. القيد الرئيسي لهذه التقنية هي كمية بدءا المواد التي يجب أن تتوافق مع ما لا يقل عن 50،000 الخلايا.

ما يميز الطريقة المستخدمة هنا من معظم الكواشف التجارية المقدمة لعزل الحمض النووي الريبي مجموع هو درجة من النقاء. يتم استنفاد RNA من أي تلوث الحمض النووي الذي يلغي الحاجة لاستخدام العلاج الدناز التي يمكن الإضرار إلى أي إجراء آخر. وبالإضافة إلى ذلك، وهنا المنضب مجموع الاستعدادات الحمض النووي الريبي في الحمض الريبي النووي النقال، التي هي معروفة لتكون مثبطات قوية من بلمرة RNA التي يشيع استخدامها فيالخطوة التضخيم قبل التهجين لرقائق ميكروأري. وقد لاحظنا أن تحقيقات توليفها من هذه الاستعدادات الحمض النووي الريبي لديهم نشاط محدد عالية جدا. درجة نقاء من الحمض النووي الريبي أعدت وفقا للطريقة الموصوفة هنا هي مناسبة بشكل جيد للغاية لميكروأري التهجين، ولكن أيضا لبناء مكتبات [كدنا] من جودة عالية وعن الحمض النووي الريبي التسلسل كما لاحظنا. يجب أن يكون المختبر ريبونوكلياز الحرة. الرقم الهيدروجيني للCSCL / EDTA ينبغي أن تكون حمضية لتجنب تدهور الحمض النووي الريبي التي تحلل القلوية. وينبغي التحقق من كثافة CSCL / EDTA بعناية حتى لا تكون مرتفعة للغاية، ومنع ترسب الحمض النووي الريبي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

نشكر ساشا رايخمان ودومينيك Santiard-البارون لمساعدتهم في تحرير بروتوكول تنقية الحمض النووي الريبي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Centrifuge Beckman Coulter Aventi J-E
Rotor Beckman Coulter JS-5.3
Ultracentrifuge Beckman Coulter LE 80K
Rotor Beckman Coulter SW41
Power supply Biorad Pac 3000
PolytronTM Kinematica PT 2100 Supplied with PT-DA 2105:2
Agarose gel electrophoresis device Biorad MiniGel Cell GT
Imaging System Biorad GelDoc-It Imager
5 ml sterile polyethylene tube Greiner 115261
Sterile polyallomer centrifuge tube Beckman Coulter 331372
Chemical reagents Sigma Molecular biology grade (RNase and DNase free products)
Cleaning Solution VWR RBS
Microarray chip Affymetrix Human U133 plus 2 array

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mitry, D., Charteris, D. G., et al. The epidemiology of rhegmatogenous retinal detachment: geographical variation and clinical associations. The British Journal of Ophthalmology. 94, (6), 678 (2010).
  2. Green, R. E., Krause, J., et al. A draft sequence of the Neandertal genome. Science. 328, (5979), 710 (2010).
  3. Glisin, V., Crkvenjakov, R., et al. Ribonucleic acid isolated by cesium chloride centrifugation. Biochemistry. 13, (12), 2633 (1974).
  4. Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., et al. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87, (5), 1663 (1990).
  5. Cavalieri, L. F., Yamaura, I. E. coli tRNAs as inhibitors of viral reverse transcription in vitro. Nucleic Acids Research. 2, (12), 2315 (1975).
  6. Sawadogo, M. On the inhibition of yeast RNA polymerases A and B by tRNA and alpha-amanitin. Biochemical and biophysical research communications. 98, (1), 261 (1981).
  7. Delyfer, M. N., Raffelsberger, W., et al. Transcriptomic analysis of human retinal detachment reveals both inflammatory response and photoreceptor death. PloS ONE. 6, (12), e28791 (2011).
  8. Kalathur, R. K., Gagniere, N., et al. RETINOBASE: a web database, data mining and analysis platform for gene expression data on retina. BMC Genomics. 9, 208 (2008).
  9. Nakazawa, T., Hisatomi, T., et al. Monocyte chemoattractant protein 1 mediates retinal detachment-induced photoreceptor apoptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, (7), 2425 (2007).
  10. Leveillard, T., Sahel, J. A. Rod-derived cone viability factor for treating blinding diseases: from clinic to redox signaling. Science Translational Medicine. 2, (26), 26ps16 (2010).
  11. Chalmel, F., Leveillard, T., et al. Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential. BMC Molecular Biology. 8, 74 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics