ジャーナルを用いたヒト網膜手術標本のトランスクリプトーム解析

Medicine

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Summary

私たちは、網膜剥離のトランスクリプトーム解析のために網膜切除から網膜のサンプルを使用していました。我々は外科ブロックと実験室間のRNA保全を可能に手順を開発しました。我々は精製されたRNAはマイクロアレイ解析に適していることを保証するために、塩化セシウム遠心法によってRNAを精製するための標準化されたプロトコル。

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Delyfer, M. N., Aït-Ali, N., Camara, H., Clérin, E., Korobelnik, J. F., Sahel, J. A., Léveillard, T. Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl. J. Vis. Exp. (78), e50375, doi:10.3791/50375 (2013).

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Abstract

網膜剥離(RD)は、網膜色素上皮(RPE)から神経感覚網膜の分離を説明しています。 RPEは、光に敏感な神経細胞、光受容体の正常な機能に不可欠である。 RPEから網膜の剥離が細胞外液で満たされている物理的なギャップを作成します。 RDは、イオンと代謝物の生理的な交換がひどく乱されているので神経感覚網膜とRPEの両方に影響を与える細胞および分子有害事象を開始します。ビジョンのための結果は、ビジョン1の回復の2つの組織の結果を迅速にreapposition以来剥離の期間に関連しています。 RDの治療はもっぱら外科です。硝子体ゲル(硝子体)の除去は、網膜剥離を支持する戸建周辺網膜の除去、非本質的な部分が続いている。削除網膜標本は無主物 (1個)であり、その結果、通常は破棄。これらの手術標本からRNAを回復するには、我々は外科ブロックから実験室への転送時にRNAの保全を可能にする手順ジャーナルを開発しました。我々はまた、塩化セシウム遠心法によってRNAを精製するための標準化されたプロトコルは、精製されたRNAは全体的な遺伝子発現解析に適していることを保証する。 RNAの品質は、両方のRT-PCRおよびマイクロアレイ分析により検証した。データの分析は、RD間に炎症や変性体の同時関与を示しています。

Introduction

網膜剥離の主要な治療上の目的(RD)は、視細胞の損傷や網膜色素上皮細胞からの光受容体の分離から生じる網膜の炎症を制限する方法を見出すことである。 RDの間に、RPE細胞が活性化され、移行脱分化、及び合併症につながる収縮力を発揮し、網膜剥離の表面で増殖する。 RDのトランスクリプトーム解析は、RD、手術と組み合わせて最終的な視覚的な結果を改善することができ、したがって将来の治療用分子以下の修正式で標的遺伝子を同定するための方法です。デオキシリボ核酸(DNA)、遺伝学的研究のために広く使用され、後者であるのでこれはよく知られているリボ核酸(RNA)が安定していないが、その安定性は、古い30,000以上の年2の古生物学的サンプルからネアンデルタール人のゲノムのシーケンシングを可能にしていた。メッセンジャーRNAへのゲノムからの遺伝子のDNAの転写です主要な遺伝子発現のプロセス、およびmRNAが信号を構成するために不安定である。 RNAは信号を終端リボヌクレアーゼ酵素により急速に分解される。発現は研究室で研究される前に、組織が生物から分離されると、RNAは、非常に頻繁に分解される。分解されたRNAは、分析、遺伝子発現に適していない。研究室のスタッフは、手術に参加することはできませんので、我々は容易であり、唯一の外科医が適切なRNaseフリーソリューションに組織を回復することが必要手順を開発しました。組織のRNAが安定し、この溶液中、室温で72時間後の劣化の兆候なしに分析することができる。検体からRNAを実験室3に転送された後、塩化セシウム勾配超遠心分離を含む標準化された方法で精製されています。その後、RNAの品質はアガロースゲル電気泳動により及びRT-PCRによって評価される。 RNA精製プロトコルは有するDNAおよびRNAのために異なっており、RNA、遺伝子発現研究における人為信号を生成するDNA分子によって汚染されないことを保証し、その濃度に応じて分子を分離する利点。また、定量的に細胞内で最も豊富に存在するRNAであるトランスファーRNAは(たtRNA)は、リボソームRNA(rRNAs)とメッセンジャーRNA(mRNAの)、というこれら二つの最後のものから同じ物理的性質に応じて分離されている精製プロセスの生成を終了する。マイクロアレイ分析プロトコルのほとんどは逆転写酵素とtRNA 4-6によって阻害されるRNAポリメラーゼの使用が関与するので、調製からtRNAの除去に有用である。手術標本から精製されたRNAは、標準的なプロトコルを用いて標識し、マイクロアレイチップにハイブリダイズし、その結果、2つの相補的な方法が、偽発見率法を用いて、相互情報とvisualiに基づく新しい方法を用いて分析されているWebベースのサーバーRetinobase 7,8にアルファベットのゼット。

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Protocol

1。ジャーナル:手術ブロックから標本を回復する手順

ラボで

  1. 急行運送会社からの輸入契約を得る。
  2. 研究室で担当者を(電話番号及び電子メールアドレス)を示す実験室の住所と10(または25)出荷形態を記入してください。
  3. 10(または25)サンプルフォームは10(または25)に1の番号が準備します。これらのフォームは、患者の)匿名ID、手術のb)の日付と外科医が追加したいc)のいずれかの追加の発言に通知するために専用のスペースが含まれています。 10(または25)パッド入りの封筒を(150×210ミリメートル)を準備します。
  4. H 2 O(GHCL)はジエチル6 Mグアニジン塩化ML(DEPC)処理したRNaseフリー試薬25(または65)を用いて調製。
  5. 10または25を埋めるGHCL水溶液2.4ミリリットルで5 mlの滅菌ポリエチレン丸底チューブの番号。
  6. プレスチタニウムなく、これらの管の上の部分を埋めるためにアルゴンガスを使用したghtly外科用キャビネット内のストレージ数年間GHCL溶液の酸化を防ぐために、キャップに。
  7. スクリューキャップで50 mlの滅菌ポリプロピレンコニカルボトムチューブが5 mlチューブをご紹介します。を50mlチューブに5ミリリットルチューブを保持するためにきれいな紙の組織片を使用し、チューブを閉じます。
  8. パッド入りの封筒、出荷フォーム、サンプルフォームで段ボール箱にポリスチレンラックとラック上の50mlチューブを置きます。
  9. 彼らの読書を促進するために段ボール箱の蓋の内側:命令(1.12から1.19参照)を貼り付けます。
  10. 病院で担当者にメールで段ボール箱を送ってください。

入院して

  1. 手術室に手術キャビネットから段ボール箱を持参してください。注意注意:手順は免疫妥協患者が含まれた場合は、段ボールは、手術室に運ばれるべきではない。
  2. 手術中に、網膜SPECIMを配置番号5ミリリットル滅菌ポリプロピレンにENがGHCL溶液を充填。しっかりとチューブを閉じます。
  3. 簡単にチューブを返します。
  4. 10分間血管ロッカー上にチューブを置きます。
  5. 添付サンプル番号がフォームに入力します。
  6. 対応する番号を50mlチューブに識別番号を報告します。
  7. を50mlチューブに手術標本で5 mlチューブを導入し、ティッシュペーパーを交換してチューブを固定します。
  8. 添付パッド入りの封筒のいずれかでチューブとそれに充填サンプルフォームをご紹介します。それを閉じます。
  9. ピックアップのための明白な運送会社に電話。

2。 RNA精製

ラボで

  1. チューブを上下に移動しながら1分間ホモジナイザーGHCLソリューションとその5 mlチューブポリプロピレンで標本を均質化。
  2. 2 M酢酸カリウムのpH 5.0の270μLを加える。その中シェーカー上にチューブを配置することによって、10分間激しく振る水平位置(420分-1)。
  3. 20℃で5,000 rpmで(6,500×g)で10分間の遠心
  4. ペレットを乱すことなくスムーズに可溶性画分を吸引。
  5. 14ミリリットル滅菌チューブに移します。
  6. 100mMトリスpH8.0で、N-ラウロイルサルコシン1%5.3ミリリットルを追加します。
  7. 塩化セシウム(セシウム)の3.2グラムを加え、ボルテックスでチューブを混ぜる。
  8. 滅菌11ミリリットルのポリアロマー遠心管でのCsCl /エチレンジアミン四酢酸(EDTA)の1.8ミリリットルを追加します。
  9. 10ミリリットル滅菌パスツールピペットを用いて、密度クッションを乱すことを避けるためにチューブの端にゆっくりとスライドさせて、1.8ミリリットルのCsCl / EDTAにRNA溶液を移す。
  10. ローターにチューブを(必要に応じて網膜ずにバッファを含む第二の管)を置きます。
  11. 20℃で32,000 rpmで(225,000×g)で、24時間を遠心
  12. 滅菌したパスツールピペットを用いて、溶液の優れた部分を削除して、それを捨てる。
  13. 確認しながら、徐々に削除しますDNAは(粘性)は、第2の滅菌パスツールピペットで吸引し、それを破棄している瞬間。
  14. サード滅菌パスツールピペットを用いてRNAペレットを解放しないように注意しながら、残りの溶液を除去。
  15. メス火炎滅菌を持つセクション管の底には、その後チューブ逆さまに無菌の視線上にそれの残りの部分を置く。
  16. チューブを逆にしGHCL160μlのと微妙にすすいでください。
  17. 10分間ペレット乾燥してみましょう。
  18. 150μlの( - 1mMのEDTA - 0.1%SDS、10mMのトリスpH7.5)中でペレットを再懸濁します。
  19. 2ミリリットル滅菌マイクロチューブにソリューションを移し、その後30μlの( - 1mMのEDTA - 0.1%SDS、10mMのトリスpH7.5)で残留ペレットを収穫。
  20. 150μlのを( - 1mMのEDTA、10mMのトリスpHは7.5)を追加します。
  21. 3 M酢酸ナトリウムのpHは5.0、ボルテックスチューブ30μlのを追加します。
  22. エタノール100%(-20°C)、ボルテックスチューブの900μLを加える。
  23. 氷の融解でチューブ30分置きます。
  24. CEN4℃15,000 rpmでチューブ30分℃でtrifuge
  25. 微妙に可溶性画分を吸引し、それを捨てる。
  26. ボルテックスチューブ、500μlの70%エタノール(RT)を追加します。
  27. 4で15000回転(18,000×g)ででチューブ20分を遠心℃に
  28. リンス工程(70%エタノール)を繰り返す。
  29. 手短に遠心し、P200のピペットで残りのエタノールを除去する。
  30. 10分間ペレット空気乾燥してみましょう。
  31. 50μlのDEPC処理H 2 Oでペレットを再懸濁し
  32. ボルテックスで精力的に混ぜる。
  33. 水浴中で15分間45℃でインキュベートする。

3。ゲル電気泳動によるRNA解析

  1. 化学フード内側のアガロースゲルを注ぐ。
  2. 滅菌済み1.5ml微量遠心チューブに、分析されるRNA2μlのとサンプル前処理バッファーの6.4μLを加える。
  3. 第二の1.5 mlのチューブに、RNA基準3μlのとサンプル前処理バッファーの9.6μLを加える。
  4. 65℃で15分間チューブを加熱°C、氷の上に置く。
  5. RNAサンプル管とRNA基準チューブ内の色素で1μlのEBローディングバッファー中の色素なしで1μlのエチジウムブロマイド(EB)ローディングバッファーを追加します。
  6. 染料の1(ブロモフェノールブルー)ゲルの底の2/3に達するまでバッファを実行中の化学フードインサイド100 V、 - 80の下のゲルを実行します。
  7. ゲル250ミリリットルデDEPC処理2×SSCで2回15分を洗浄します。
  8. UV照射下でのデジタル化された画像を取る。
  9. 上のバンド(23S rRNAの)と低域(16S rRNAの)との比率を計算します。

4。 RNAの最終精製

  1. DEPC処理H 2 O(必要な場合)と100μlにRNAサンプルの音量を調整します。
  2. 100フェノール酸の液(1ミリリットルフェノール酢酸ナトリウム、pHが5.2の50 mMにDEPC処理H 2 O + 130μlの飽和)精力的に、ボルテックス。を追加
  3. 室温で13,000 rpmで(15,000×g)で10分間遠心します。
  4. カーヴrは小説滅菌済み1.5mlマイクロ遠心チューブに水相(上相)を慎重にして転送。
  5. 3 M酢酸ナトリウム、pHは5.2とエタノール250μlの100%(-20℃)10μlのを追加します。
  6. 溶ける氷にチューブ30分間インキュベート。
  7. 4℃14,000 rpmで(18,000×g)ででチューブ30分間遠心℃に
  8. 慎重に可溶性画分を吸引し、それを捨てる。
  9. 500 70%エタノール(室温)の添加、ボルテックスチューブを追加します。
  10. 4℃14,000 rpmで(18,000×g)ででチューブ20分を遠心℃に
  11. リンス工程(70%エタノール)を繰り返す。
  12. 手短に遠心し、P200のピペットで残りのエタノールを除去する。
  13. 空気は10分間ペレットを乾燥させてみましょう。
  14. DEPC処理H 2 O50μlの中にペレットを再懸濁し
  15. その後45時チューブ15分℃でインキュベート
  16. RNAサンプル2μlの上で260 nmおよび280 nmでの吸光度(ABS)を測定します。比Abs260/Abs280を計算した。
  17. <李>ストア-80 RNAサンプル°C(数年間安定した)。

5。ソリューションおよび清掃手順

  1. 酢酸カリウム2 M、pHは5.0:DEPC処理H 2 O 70mlの中に19.6グラム酢酸カリウムを溶解DEPC処理H 2 Oで5回洗浄し、続いて15分間1M NaOHでにそれを浸漬することによってpH計プローブを清掃酢酸でpHを5.0に調整し、次にDEPC処理したH 2 Oで100mlに音量を調整する
  2. トリス-HCl、100mMの、pHが8.0、N-ラウロイルサルコシン、1%:0.5 MトリスベースpH8.0の40mlのにN-ラウロイルサルコシン(ボンネットの下)の2グラムを溶かす。のCsCl / EDTA)DEPC処理H 2 Oで200ミリリットルにボリュームを調整する:50 CsClを96gのmlの10mMのEDTA pHを7.5 DEPC処理H 2 Oを用いて調製しオートクレーブDEPC処理H 2 Oで100mlに音量を調整するpH値<7.5をチェックします。
  3. アガロースゲルは1%:62ミリリットルDEPC処理したH 2 Oでアガロースの1グラムを入れて電子レンジで沸騰。 12.3 M 18mlのを追加ホルムアルデヒド、5倍MOPS 20mlの。化学フードの内側に注ぐ。
  4. サンプル前処理バッファ:俄仕立て準備する。 5倍MOPSの化学フード8μL、12.3 Mホルムアルデヒド及びホルムアミド40μlの16μlの内部ミックス。
  5. EBのローディングバッファー(染料なし):リハーサルなしの準備する。 DEPC処理したH 2 Oで調製した80%グリセロール中に20μlの4μlの10 mg / mlのエチジウムブロマイドを追加する
  6. EBのローディングバッファー(色素):リハーサルなしの準備する。 0.25%xylenシアノール、DEPC処理H 2 Oとの0.25%ブロモフェノールブルーを含む80%のグリセロールを10μlに2μlの10 mg / mlのエチジウムブロマイドを追加
  7. 、60ミリリットル5倍MOPSへ12.3 Mホルムアルデヒドの54ミリリットルを追加し、DEPC処理H 2 Oの186ミリリットル:バッファを実行している
  8. 攪拌しながら37℃で2時間で0.1%v / vのジエチルとインキュベート蒸留水°C:H 2 OをDEPC処理。オートクレーブで滅菌する。
  9. ホモジナイザーのクリーニング:1 Lに洗浄液を25ml(RBS)を追加DEPC-H 2 Oを処理し、撹拌しながら、軸1分飛び込む。 60で2時間インキュベートする℃にアルミにDEPC処理H 2 Oラップ楽器でよくすすぎ、計器箱に入れ。箱を包む。オートクレーブで滅菌する。
  10. 電気泳動装置のクリーニング:装置、トレイと15ウェルコームを洗う。 3%過酸化水素で15分間インキュベートする。 100%エタノールで一回すすいでください。乾燥した空気。
  11. ガラス皿のクリーニング:すべての夜ガラス皿をRBS 2%を清掃し、その後200℃で滅菌前蒸留水ですすぎ

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Representative Results

手順ジャーナル( 図1)は 、私たちは手術ブロックから精製したRNAに網膜の標本を回復し、網膜剥離のトランスクリプトームを分析することができます。単球走MCP1遺伝子CCL2のアップレギュレーション、および遺伝子GNAT1、短波コーンオプシンOPN1SW、及びhomeogene CRX( 図2)伝達棒感光体の発現の減少で網膜剥離の結果。 GNAT1、OPN1SWCRXの同時低減が光受容体の変性、ロッドとコーンの両方の結果である一方CCL2の誘導は、炎症9から生じている。コーンの損失がNXNL2遺伝子によりコードされるロッド由来コーン生存率7,10、またはそのパラログRdCVF2、をコードNXNL1の発現の喪失、から生じ得る。驚くべきことに、NXNL2メッセンジャーEXつの異なるバージョンでISTS。バージョン1(NM_001161625.1)系統発生解析から派生したコード配列であるが、以前のいくつかのESTが同定されたバージョン2(NM_145283.2)は、第二の異常を除外するmRNAである一方、11を発現することが報告されていない遺伝子のエクソンと反復のAlu配列を含む別の第二エクソン、3 'の方向に位置して40以上のKB( 図3a)を含んでいます。人間の網膜から精製したRNAを用いて、我々は今NXNL2のmRNAの2つのバージョンが(図3b)を発現していることを報告することができます。

図1
図1。ジャーナルが提供する材料を含む段ボール箱の写真。

図2
図2。 Retinobaseを用いた遺伝子のサブセットの発現の表現。これらのレーダーグラフに表示された遺伝子は、CCL2、GNAT1、OPN1SW、およびCRXについては、図の右側の部分は、(RD1-18)網膜剥離の検体からRNAに対応左部分ながら(NR1-18)事後網膜を用いて調製年齢をマッチさせたコントロールからのRNAである。レーダー·グラフ法は8に記載されている。

図3
図3。網膜におけるNXNL2遺伝子の2つのバージョンの発現。 9番染色体上のNXNL2遺伝子の概略図。NXNL2v1はNXNL2v2はその第二エクソンが欠落しています。マルチプルアライメントと系統学的解析によって予測されている2つのエクソンを持っており、別のエクソン2と方向'、位置を3で> 40キロバイト'。 T彼の矢印は、用いたプライマーの位置を示しています。B。RT-PCRは、網膜のNXNL2v1NXNL2v2両方の発現を示す。右レーンは逆転写酵素の非存在下での反応に対応しています。ACTB、細胞質アクチン。使用したプライマー:NXNL2v1:5'-GCATGAGCTGAGGAAGAGGT-3 '、5'-CTCA AACGGAGAAATTCTGGA-3'、NXNLv2:5'-TCTGCACCCCCACGTTTATT-3 '、5'-AGGGCCTCCT TTTCCATCTA-3'。

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Discussion

外科ブロックから組織回復のための手順の開発は、網膜剥離のトランスクリプトーム解析に不可欠となっています。ひとつは、手術のこのタイプは、緊急時にと眼科医がオペレーティング彼らが操作したときの生物学的な研究プログラムに参加するには少し時間を持っていることを実践されていることに気づくべきである。この網膜切除はまた、統計数値に到達するための簡単​​な方法は、ネットワークで動作するようになるように、各サービスには確率的に実行されます。そのようなネットワークでは、組織回収の標準化が生物学的解析の成功が不可欠である。 、非常に使いやすく、手術キャビネット内で室温で保存することができ、正確な命令、外科用ブロックに近い材料を提供することによって、我々は、外科医が本研究に参加することを奨励している。

また、RNAの精製の標準化は、これらの貴重なCLのベストを取得するには達成されたinical標本。純粋なRNAのコレクションを-80℃で年間保存することができ、新規なゲノミクス技術が出現するように、さらなる研究のために使用される。プロトコルは、網膜手術標本のために提供されるものではなく、切開後に、げっ歯類網膜からRNAを単離するために首尾よく使用することができる。 RNAが分解された場合は、)のCsCl / EDTA溶液のpHを確認してください。 b)の未使用の化学物質からすべてのソリューションを作る。技術の主な制限は、少なくとも50,000個の細胞に対応している必要があり、出発物質の量である。

何が全RNAを分離するために提供されるほとんどの市販の試薬からここに使用される方法は、純度で区別します。 RNAはそれ以上の手順に損傷を与えることができるDNase処理を使用する必要がなくなり、任意のDNAの混入が枯渇している。また、トータルRNA調製物は、ここで一般的に使用されるRNAポリメラーゼの強力な阻害剤であることが知られているtRNAは、に枯渇しているマイクロアレイチップへのハイブリダイゼーションの前に増幅工程。我々は、これらのRNA調製物から合成されたプローブは、非常に高い比活性を有することを観察した。ここで説明する方法に従って調製したRNAの純度は非常によくマイクロアレイハイブリダイゼーションのためだけでなく、高品質のcDNAライブラリーを構築するために、我々が観察したようにRNAはシーケンシングのために適しています。研究室では、RNaseを含まなければなりません。塩化セシウム/ EDTAのpHはアルカリ溶解によってRNAの分解を避けるために酸性にする必要があります。のCsCl / EDTAの濃度を注意深く高すぎるようにするとRNAの沈降を防止しないように確認してください。

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Disclosures

著者らは、開示することは何もありません。

Acknowledgments

私たちは、RNA精製プロトコルを編集中で彼らの助けのためにサシャライヒマンとドミニクSantiard-男爵に感謝します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Centrifuge Beckman Coulter Aventi J-E
Rotor Beckman Coulter JS-5.3
Ultracentrifuge Beckman Coulter LE 80K
Rotor Beckman Coulter SW41
Power supply Biorad Pac 3000
PolytronTM Kinematica PT 2100 Supplied with PT-DA 2105:2
Agarose gel electrophoresis device Biorad MiniGel Cell GT
Imaging System Biorad GelDoc-It Imager
5 ml sterile polyethylene tube Greiner 115261
Sterile polyallomer centrifuge tube Beckman Coulter 331372
Chemical reagents Sigma Molecular biology grade (RNase and DNase free products)
Cleaning Solution VWR RBS
Microarray chip Affymetrix Human U133 plus 2 array

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References

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