Journal kullanarak İnsan Retina Cerrahi Örneklerinin transkriptomik Analizi

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Biz retina dekolmanı bir transkriptomik analizi için retinektomi gelen retina örnekleri kullanılır. Ayrıca, cerrahi blokları ve laboratuar arasında RNA koruma sağlayan bir işlem geliştirilmiştir. Biz saflaştırılmış RNA mikroarray analizi için uygun olduğunu sağlamak için sezyum klorür Ultrasantrifügasyon RNA arındırmak için standart bir protokol.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Delyfer, M. N., Aït-Ali, N., Camara, H., Clérin, E., Korobelnik, J. F., Sahel, J. A., Léveillard, T. Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl. J. Vis. Exp. (78), e50375, doi:10.3791/50375 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Retina dekolmanı (RD) retina pigment epiteli (RPE) gelen nörosensöriyel retinanın bir ayrılık açıklar. RPE ışığa duyarlı nöronlar, fotoreseptör normal fonksiyonu için gereklidir. RPE, retina dekolmanı hücre dışı sıvı ile dolu bir fiziksel boşluk oluşturur. RD nörosensöriyel retina ve iyonları ve metabolitleri fizyolojik değişim ciddi tedirgin çünkü RPE hem etkileyen hücresel ve moleküler yan etkiler başlatır. Vizyonu için sonucu vizyonu 1 restorasyon iki doku sonuçları hızlı bir reapposition beri dekolmanı süresi ile ilgilidir. RD tedavisi sadece cerrahidir. Vitreus jeli (vitrektomi) çıkarılması retina dekolmanı lehine müstakil alanı çevresinde retina kaldırılması olmayan parçası takip eder. Kaldırılan retina örnekleri res nullius (bir şey) ve dolayısıyla normal atılır.Bu cerrahi örneklerden RNA kurtarmak için, laboratuvara cerrahi blok aktarımı sırasında RNA koruma sağlar prosedürü dergi geliştirdi. Ayrıca sezyum klorür Ultrasantrifügasyon RNA arındırmak için standart bir protokol saflaştırılmış RNA'lar küresel gen ekspresyon analizi için uygun olduğunu sağlamak için. RNA kalitesi hem RT-PCR ve mikroarray analizi ile doğrulandı. Verilerin analizi RD iltihap ve fotoreseptör dejenerasyonunun bir anda tutulumu görülmektedir.

Introduction

Retina dekolmanı temel tedavi amacı (RD) retina pigment epitel hücrelerinden fotoreseptör ayrılması kaynaklanan fotoreseptör hücre hasarı ve retina iltihabı sınırlamak için bir yol bulmaktır. RD sırasında, RPE hücreleri dediferansiye, göç, aktive edilir ve komplikasyonlara yol açabilir kasılma güçleri uygulamakla, müstakil retina yüzeyinde çoğalırlar. RD transkriptomik analizi RD ve cerrahi ile birlikte son görme sonucu geliştirmek dolayısıyla gelecekteki tedavi molekülleri takip modifiye ifade ile hedef genleri tanımlamak için bir yoldur. İyi deoksiribonükleik asit (DNA) olarak ribonükleik asit (RNA) sabit değil bilinen, genetik çalışmalar için yaygın olarak kullanılmaktadır ikincisi, istikrarı 2 eski 30.000 'den fazla yıllık paleontolojik örneklerinden Neandertal genomunun diziliminin izin vardı. Haberci RNA'ya genomundan genlerin DNA transkripsiyonbüyük gen ifadesinde süreci ve mRNA bir sinyal teşkil için kararsızdır. RNA'lar sinyal sona RNAse enzimler tarafından çok hızlı bir şekilde bozulmuş. Ifade bir araştırma laboratuvarında incelenmiştir önce dokularının organizma izole zaman, RNA'lar çok sık bozulmuş. Bozulmuş RNA analizi gen ekspresyonu için uygun değildir. Laboratuvar personeli ameliyat katılamazlar çünkü, biz kolay bir prosedür geliştirdiği ve sadece cerrah uygun RNAse-ücretsiz bir çözüm içine dokuları kurtarmak için gerektirir. Dokuların RNA stabildir ve bu çözelti, oda sıcaklığında, 72 saat sonra herhangi bir bozulma işareti olmadan analiz edilebilir. Örneklerden RNA'lar laboratuar 3 aktarıldıktan sonra, bir sezyum klorür gradyanı üzerinde ultrasantrifügasyon, bir içeren bir standart yöntem ile saflaştırılır. Daha sonra, RNA kalitesi agaroz jel elektroforezi ve RT-PCR ile incelenmiştir. RNA saflaştırma protokolü vardırDNA ve RNA için farklıdır ve RNA geni ekspresyon çalışmalarında yapısından sinyaller üretecek bir DNA molekülü tarafından kirlenmemesini sağlar kendi yoğunluğuna göre moleküllerin ayrılması avantaj sağlar. Buna ek olarak, sayısal olarak bir hücre içinde en bol RNA olan transferi RNA'lar (tRNA), ribozomal RNA (rRNA) ve haberci RNA'lar (mRNA), olmak bu iki sonuncusu, aynı fiziksel özelliğine göre ayrılır arıtma sürecinin ürünü sonunda. Mikrodizi analitik protokolleri en tRNA, 4-6 tarafından inhibe ters transkriptazlar, ve RNA polimerazlarının kullanımının, çünkü dahil hazırlanmasından tRNA kaldırılması yararlıdır. Cerrahi örneklerden saf RNA standart bir protokol kullanarak etiketli ve bir mikroarray çip melezleşmiştir ve sonuçları iki tamamlayıcı yöntem, yanlış keşif oranı yöntemi kullanılarak ve karşılıklı bilgi ve visuali dayalı yeni bir yöntem kullanılarak analiz edilmektedir edilirWeb-tabanlı sunucu Retinobase 7,8 üzerinde zed.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Journal: Cerrahi Blok gelen örnekler yeniden elde etmek Prosedürü

Laboratuarda

  1. Ekspres kargo şirketi bir ithalat sözleşme alın.
  2. Laboratuvar (Telefon numarası ve E-posta adresi) olarak kişi gösteren laboratuvarın posta adresi ile (veya 25) nakliye formları 10 doldurun.
  3. (Veya 25) 10 hazırlayın örnek formlar 10 (veya 25) 1 sayılı. Bu formlar), hastanın bir) anonim kimlik hakkında bilgi vermek cerrahi tarih ve c) herhangi bir ek açıklamalar cerrah eklemek istiyorum b özel boşluk. 10 (veya 25) yastıklı zarflar (150 x 210 mm) hazırlayın.
  4. (DEPC) H2O (GHCl) ile tedavi edilen dietilpirokarbonat içinde 6 M guanidin klorür, RNaz içermeyen reaktifler 25 (veya 65), her ml kullanılarak hazırlandı.
  5. Dolgu 10 veya 25 GHCl çözüm 2.4 ml 5 ml steril polietilen yuvarlak alt tüpler sayılı.
  6. Basın ti daha, bu tüplerin üst kısmı doldurmak için argon gazı kullanılırghtly cerrahi kabininde depolama birkaç yıldır GHCl çözeltisi oksidasyonunu önlemek için kap.
  7. 50 ml steril polipropilen konik alt tüp vidalı kapaklı her 5 ml tüpler tanıtmak. 50 ml tüp içine 5 ml tüp tutmak için temiz bir kağıt doku parçası kullanın, tüp kapatın.
  8. Yastıklı zarflar, nakliye formları, örnekleri formları ile bir karton kutu içine bir polistiren raf ve raf 50 ml tüpler yerleştirin.
  9. Onların okuma kolaylaştırmak için karton kutusunun kapağının iç: talimatları (1,12-1,19 bakınız) yapıştırın.
  10. Hastanede kişi posta ile karton kutu gönder.

Hastanede

  1. Cerrahi odasına cerrahi kabinden karton kutu getirin. Not Dikkat: prosedürü bir bağışıklık sistemi zayıflamış hasta içeriyorsa, karton cerrahi odasına getirildi olmamalıdır.
  2. Ameliyat sırasında, retina specim yersayılı 5 ml steril polipropilen içine en GHCl çözümü ile dolu. Tüpü sıkıca kapatın.
  3. Kısaca Tüp tekrar.
  4. 10 dakika boyunca kan tüpü külbütör tüp yerleştirin.
  5. Ekteki örnek numaralı formu doldurun.
  6. İlgili sayılı 50 ml tüp üzerine kimlik numarası bildirin.
  7. 50 ml tüp içine cerrahi örnek ile 5 ml tüp tanıtmak, kağıt mendil yerine ve tüp vida.
  8. Ekteki yastıklı zarf birinde tüp ve içine doldurulmuş örnek form tanıtmak. Kapatın.
  9. Almak için ekspres kargo şirketi arayın.

2. RNA Arıtma

Laboratuarda

  1. Tüp yukarı ve aşağı hareket ederken 1 dakika bir homojenizatör ile GHCl çözümü ile 5 ml tüp polipropilen numune homojenize.
  2. 2 M potasyum asetat, pH 5.0, 270 ul ekleyin. Onun bir çalkalayıcı tüpü yerleştirilerek 10 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalanıryatay konumda (420 min-1).
  3. 20 ° C'de 5000 rpm (6500 xg) 10 dakika santrifüj
  4. Pelet bozmadan düzgün çözünür fraksiyon aspire.
  5. Bir 14 ml'lik steril bir tüpe aktarın.
  6. 100 mM Tris, pH 8.0, N-Lauroylsarcosine 1% 5.3 ml ilave edilir.
  7. Sezyum Klorür (CsCl) 3.2 g ekleyin ve karıştırın tarafından tüp karıştırın.
  8. , Steril bir 11 ml'lik santrifüj tüpüne polyallomer CsCI / etilen-diamintetraasetik asit (EDTA), 1.8 ml ilave edilir.
  9. 10 ml'lik steril bir Pasteur pipeti ile, yoğunluk yastık rahatsız etmemek için tüpün kenarına yavaş kaydırarak 1.8 mi CsCI / EDTA üzerine RNA çözeltisi aktarın.
  10. Rotor içine tüpler (retina gerekirse olmadan tampon içeren ikinci bir tüp) yerleştirin.
  11. 20 ° C'de 32.000 rpm (225,000 xg) 24 saat santrifüj
  12. Steril bir Pasteur pipeti ile çözüm üstün parçası kaldırmak, ve atın.
  13. Kontrol ederken yavaş yavaş çıkarınDNA (viskoz) ikinci bir steril Pasteur pipet ile aspire, ve atın bir an.
  14. Üçüncü bir steril Pasteur pipeti ile RNA pelet serbest bırakmak için özen kalan çözüm çıkarın.
  15. Ile tüp bölümü altındaki bir neşter alev sterilize edilmiş, sonra steril bir ters bakışları borunun geri kalan kısmı koydu.
  16. Tüp ters ve GHCl 160 ul ile ince durulayın.
  17. 10 dakika pelet kurumaya bırakın.
  18. 150 ul (- 1 mM EDTA -% 0.1 SDS, 10 mM Tris, pH 7.5) içinde pelet yeniden süspanse edin.
  19. 2 ml steril mikrosantrifüj tüpü içine transfer çözeltisi, daha sonra 30 ul (- 1 mM EDTA -% 0.1 SDS, 10 mM Tris, pH 7.5) ile kalıntı pelet hasat.
  20. 150 ul (- 1 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 7.5) ilave edilir.
  21. 3 M sodyum asetat, pH 5.0, girdap tüpün 30 ul ekle.
  22. Etanol% 100 (-20 ° C), vorteks tüpün 900 ul ekleyin.
  23. Erime buz tüpü 30 dakika yerleştirin.
  24. Cen4 ile 15,000 rpm'de 30 dakika tüp ° C trifuge
  25. Ince çözünür fraksiyon aspire, ve atın.
  26. 500 ul% 70 etanol (RT), girdap tüp ekleyin.
  27. 4 az 15.000 rpm (18.000 xg) tüp 20 dakika ° C santrifüj
  28. Durulama basamağı (% 70 etanol) tekrarlayın.
  29. Kısaca santrifüj ve bir P200 pipet ile kalan etanol ortadan kaldırır.
  30. 10 dakika için pelet hava kurumasını bekleyin.
  31. 50 ul DEPC ile tedavi edilen H 2 O içinde pelletini tekrar
  32. Vorteks şiddetle karıştırın.
  33. Bir su banyosu içinde 45 ° C'de 15 dakika ° C'de inkübe edin.

3. Jel Elektroforez RNA Analizi

  1. Bir kimyasal kaput içinde bir agaroz jel dökün.
  2. Steril bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içinde, analiz edilecek RNA 2 ul ve örnek hazırlık tampon 6.4 ul ekleyin.
  3. Ikinci bir 1.5 ml lik tüp içinde, RNA standartları 3 ul ve örnek hazırlık tamponu 9.6 ul ekleyin.
  4. 65, tüpler 15 dakika ısıtın ° C, Buz koydu.
  5. RNA örnek tüpü ve RNA standartları tüp boya ile 1 ul EB yükleme tampon boya olmadan 1 ul etidyum bromür (EB) yükleme tamponu ekleyin.
  6. Bir boya (bromofenol mavisi) jelin alt 2/3 ulaşıncaya kadar akan tampon kimyasal bir başlık içinde 100 V, - 80 altında jel çalıştırın.
  7. Jel 250 ml iyonu DEPC işlenmiş 2x SSC ile iki kere 15 dakika çalkalayın.
  8. UV aydınlatma altında dijitalize edilen görüntü almak.
  9. Üst bant (23S rRNA) ve alt bant (16S rRNA) arasındaki oranı hesaplar.

4. RNA son saflaştırma

  1. DEPC ile tedavi edilen H 2 O (gerekirse) ile 100 ul RNA örnek hacmi ayarlayın.
  2. 100 ul fenol asit (1 mi fenol sodyum asetat, pH 5.2, 50 mM DEPC işlenmiş H2O + 130 ul içinde doyurulmuş) kuvvetli bir şekilde karıştırın. Ekleme
  3. Oda sıcaklığında 13.000 rpm'de (15000 x g) de 10 dakika santrifüj yapılır.
  4. RecoveR, yeni bir steril 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü içine sulu faz (üst faz) ve dikkatli bir şekilde aktarılır.
  5. 3 M sodyum asetat, pH 5.2 ve etanol içindeki 250 ul% 100 (-20 ° C) 10 ul ekle.
  6. Erime buz içine tüp 30 dakika inkübe edilir.
  7. 4 de 14.000 rpm (18,000 xg), tüp 30 ° C dakika santrifüj
  8. Dikkatlice aspire çözünebilir fraksiyon ve atın.
  9. 500% 70 etanol ul (oda sıcaklığı) ve tüp vorteks ekleyin.
  10. 4 de 14.000 rpm (18,000 xg), tüp 20 ° C dakika santrifüj
  11. Durulama basamağı (% 70 etanol) tekrarlayın.
  12. Kısaca santrifüj ve bir P200 pipet ile kalan etanol ortadan kaldırır.
  13. Hava 10 dakika süre ile pellet kuruması beklenir.
  14. DEPC işlenmiş H 2 O. 50 ul içine pelletini
  15. Sonra 45 tüp 15 dakika ° C inkübe
  16. RNA numunesinin üzerine 2 ul 260 nm ve 280 nm'de absorbans (ABS) ölçün. Oranı Abs260/Abs280 hesaplanmıştır.
  17. <li> Mağaza -80 RNA örnek ° C (birkaç yıldır istikrarlı).

5. Çözümler ve Temizleme Prosedürleri

  1. Potasyum asetat 2 M, pH 5.0: DEPC ile muamele H 2 O., 70 ml içine 19.6 g potasyum asetat çözülür DEPC işlenmiş H 2 O ile 5 durulama ardından, 15 dakika boyunca 1 M NaOH ile içine ıslatarak pH metre prob temizlemek Asetik asit ile pH 5.0 'a ayarlayın ardından DEPC ile muamele H 2 O ile 100 ml hacim ayarlama
  2. Tris-HCl, 100 mM, pH 8.0, N-Lauroylsarcosine 1:% 0.5 M Tris-bazlı bir pH 8.0 40 ml N-Lauroylsarcosine 2 g (bir davlumbaz altında) çözülür. ) DEPC tedavi H 2 O ile 200 ml ses seviyesini ayarlamak CSCL / EDTA: DEPC tedavi H 2 O ile hazırlanan 50 ml 10 mM EDTA pH 7.5 CSCL 96 g Otoklav ve DEPC ile tedavi edilen H 2 O ile 100 ml ses seviyesini ayarlamak PH <7.5 olup olmadığını kontrol edin.
  3. Agaroz jel% 1: 62 ml DEPC tedavi H 2 O içinde agaroz 1 g koyun Bir mikrodalga fırında kaynatın. 12.3 M, 18 mlformaldehit, 5x MOPS 20 mi. Bir kimyasal kaput içinde dökün.
  4. Örnek hazırlık Tampon: hazırlanan hazırlıksız olmak. 5x MOPS, 12.3 M formaldehit ve formamidin 40 ul 16 ul arasında kimyasal bir kaput 8 ul içinde karıştırın.
  5. EB yükleme tamponu (boya olmadan): hazırlanan hazırlıksız olmak. DEPC işlenmiş H 2 O. ile hazırlanan% 80 gliserol, 20 ul halinde 4 ul 10 mg / ml etidyum bromür ekleyin
  6. EB yükleme tamponu (boya ile): hazırlanan hazırlıksız olmak. % 0.25 ksilen cyanol, DEPC ile muamele H 2 O ile% 0.25 bromofenol mavisi ihtiva eden% 80 gliserol, 10 ul içine 2 ul 10 mg / ml etidyum bromür ekleyin
  7. Tampon Koşu: 60 ml 5x MOPS için, 12.3 M formaldehit 54 ml DEPC ile tedavi edilen H 2 O 186 ml
  8. Karıştırarak, 37 ° C'de 2 saat boyunca% 0.1 v / v dietilpirokarbonatla inkübe damıtılmış su ° C: H 2 O DEPC ile muamele edildi. Otoklav ile sterilize edin.
  9. Homojenleştiriciyi temizlenmesi: 1 L temizlik çözeltisi, 25 ml (RBS) ekleyin DEPCH2O muamele edilmiş ve karıştırma ile eksen 1 dakika immerge. 60 ° C'de 2 saat inkübe ° C. Alüminyum içine DEPC ile tedavi edilen H 2 O Wrap aracı ile iyice durulayın ve alet kutusuna koydu. Kutusu sarın. Otoklav ile sterilize edin.
  10. Elektroforez cihazı Temizleme: cihazı, tepsi ve 15-kuyu tarak yıkayın. % 3 hidrojen peroksit oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir. % 100 etanol ile bir kez yıkayın. Hava kuru.
  11. Cam temizlik yemekler: tüm gece cam yemekleri RBS 2% temizleyin, daha sonra 200 ° C'de sterilize edilmeden önce distile su ile durulayın

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Prosedür Dergisi (Şekil 1) bize saflaştırılmış RNA için cerrahi blok retina örnekleri kurtarmak ve retina dekolmanı transcriptome analiz etmeyi sağlar. Monosit kemotaktik MCP1 gen CCL2, en upregülasyonu ve gen GNAT1, kısa dalga koni opsin OPN1SW ve homeogene CRX (Şekil 2) iletici çubuk fotoreseptör ifade azalma retina dekolmanı sonuçları. GNAT1, OPN1SW ve CRX eş zamanlı olarak indirgenmesi fotoreseptör dejenerasyonu, çubuk ve koni her ikisinin birden sonucudur iken CCL2 ve indüksiyon, enflamasyon 9 elde edilir. Koni kaybı NXNL2 geni tarafından kodlanan bir Rod-türetilmiş Koni Canlılık Faktörü 7,10, ya da paralogue RdCVF2, için kodlar NXNL1 ifade kaybı, kaynaklanabilir. Şaşırtıcı bir şekilde, NXNL2 haberci eskiiki farklı versiyonu ists. Sürüm 1 (NM_001161625.1) filojenetik analizinden türetilen bir kodlama sekansı ancak birkaç EST belirlemiştir edilmiş olduğu sürüm 2 (NM_145283.2), ikinci dışlayan bir anormal mRNA ise, daha önce 11 ifade edilmesi bildirilmemiştir geninin ekson ve 3 'yönünde (Şekil 3a)' den fazla 40 kb bulunan bir tekrarlayan Alu sırası içeren, alternatif bir ikinci ekson içerir. İnsan retina arındırılmalıdır RNA kullanarak, artık NXNL2 mRNA iki sürümü (Şekil 3b) ifade olduğunu bildirdi olabilir.

Şekil 1
Şekil 1. Journal tarafından sağlanan malzeme içeren karton kutu resmi.

Şekil 2,
Şekil 2. Retinobase kullanarak genlerin bir alt kümesi ifade gösterimi. Bu radar grafiksel olarak gösterilir genler, CCL2, GNAT1, OPN1SW ve CRX için, şeklin sağ tarafında, (RD1-18) retina dekolmanı bir örneklerinden RNA karşılık sol kısmında (NR1-18) ölüm sonrası retina kullanılarak hazırlanmıştır gelen yaş eşleştirilmiş kontrol RNA ise. Radar Grafik 8'in yöntemi tarif edilmektedir.

Şekil 3,
Şekil 3,. Retinada NXNL2 genin iki versiyonu ifadesi. kromozom 9 NXNL2 genin bir. şematik. NXNL2v1 NXNL2v2 bu ikinci ekson kayıp. birden fazla uyum ve evrimsel soy analizi ile tahmin iki ekson vardır ve alternatif ekson 2 içerir yönünde ', bulunan 3> 40 kb'. TO oklar kullanılan primerin konumunu gösterir. b. RT-PCR, retinada NXNL2v1 NXNL2v2 ve hem de ekspresyonu gösteren. Sağ şerit ters transkriptaz yokluğunda reaksiyona karşılık gelir. ACTB, sitoplazmik aktin. El Primerler: NXNL2v1: 5'-GCATGAGCTGAGGAAGAGGT-3 ', 5'-CTCA AACGGAGAAATTCTGGA-3', NXNLv2: 5'-TCTGCACCCCCACGTTTATT-3 ', 5'-AGGGCCTCCT TTTCCATCTA-3'.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Cerrahi blok doku kurtarma için bir prosedürün geliştirilmesi retina dekolmanı transcriptome analizi için gerekli olmuştur. Bir cerrahi bu tip acil durumlarda ve göz doktorlarının çalışma, faaliyet zaman biyolojik bir araştırma programına katılmak için çok az zaman var uygulanan olduğunu dikkate almalıyız. Bu retinektomi da istatistiksel numaraları ulaşmak için daha kolay bir şekilde bir ağ ile çalışmak, böylece her hizmet stokastik gerçekleştirilir. Bu ağ olarak, doku toplama standardizasyon biyolojik analiz başarısı gereklidir. , Kullanımı çok kolay ve bir ameliyat kabin içinde oda sıcaklığında saklanabilir kesin talimatlar, cerrahi blok yakın bir malzeme sağlayarak, biz cerrahlar bizim çalışmaya katılmayı teşvik etmiştir.

Buna ek olarak, RNA saflaştırma standardizasyon bu değerli cl en iyi şekilde elde edildiinical örnekleri. Saf RNA'lar koleksiyonları -80 ° C'de yıllarca saklanabilir ve yeni genomik teknolojiler ortaya çıkacak çalışmalar için kullanılacak. Protokol retina cerrahi numune sağlanır hem de diseksiyon sonra kemirgen retina RNA izole etmek için başarılı bir şekilde kullanılabilir. RNA bozulmuş ise, a) CsCI / EDTA çözeltisi pH'ı kontrol edin. b) Kullanılmayan kimyasallar tüm ihtiyaçlarına cevap verir. Bu tekniğin başlıca sınırlaması en az 50.000 hücre ile ilişkili olmalıdır başlangıç ​​materyali miktarıdır.

Ne toplam RNA izole etmek için sağlanan en ticari reajanlar burada kullanılan yöntem saflık derecesidir ayırır. RNA daha fazla işlem için zararlı olabilir DNAz tedavi kullanmanın ihtiyacını ortadan kaldırır herhangi bir DNA kontaminasyon tükenmiştir. Buna ek olarak, toplam RNA preparatları Burada sık kullanılan RNA polimeraz inhibitörleri olarak bilinmektedir ki, tRNA, tüketilmiştirmikroarray cips için melezleme önce amplifikasyon adım. Biz, bu RNA preparatları sentezlenir probları çok yüksek bir özgül etkinliğe sahip olduğunu gözlemledik. RNA saflık derecesi değil, aynı zamanda yüksek kalitede cDNA kitaplıkları oluşturmak ve gözlemledik gibi RNA için sıralama için, çok iyi bir mikrodizi hibridizasyon için uygundur, burada açıklanan yöntem izlenerek hazırlandı. Laboratuvar RNAse arındırılmış olmalıdır. CsCl / EDTA pH alkalin lisis yoluyla RNA bozulmasını önlemek için asidik olmalıdır. CSCL / EDTA yoğunluğu dikkatli bir şekilde çok yüksek olduğu ve RNA sedimantasyon önlemek etmemek için kontrol edilmelidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Biz RNA arıtma protokolü düzenleme katkılarından dolayı Sacha Reichman ve Dominique Santiard-Baron teşekkür ederim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Centrifuge Beckman Coulter Aventi J-E
Rotor Beckman Coulter JS-5.3
Ultracentrifuge Beckman Coulter LE 80K
Rotor Beckman Coulter SW41
Power supply Biorad Pac 3000
PolytronTM Kinematica PT 2100 Supplied with PT-DA 2105:2
Agarose gel electrophoresis device Biorad MiniGel Cell GT
Imaging System Biorad GelDoc-It Imager
5 ml sterile polyethylene tube Greiner 115261
Sterile polyallomer centrifuge tube Beckman Coulter 331372
Chemical reagents Sigma Molecular biology grade (RNase and DNase free products)
Cleaning Solution VWR RBS
Microarray chip Affymetrix Human U133 plus 2 array

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mitry, D., Charteris, D. G., et al. The epidemiology of rhegmatogenous retinal detachment: geographical variation and clinical associations. The British Journal of Ophthalmology. 94, (6), 678 (2010).
  2. Green, R. E., Krause, J., et al. A draft sequence of the Neandertal genome. Science. 328, (5979), 710 (2010).
  3. Glisin, V., Crkvenjakov, R., et al. Ribonucleic acid isolated by cesium chloride centrifugation. Biochemistry. 13, (12), 2633 (1974).
  4. Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., et al. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87, (5), 1663 (1990).
  5. Cavalieri, L. F., Yamaura, I. E. coli tRNAs as inhibitors of viral reverse transcription in vitro. Nucleic Acids Research. 2, (12), 2315 (1975).
  6. Sawadogo, M. On the inhibition of yeast RNA polymerases A and B by tRNA and alpha-amanitin. Biochemical and biophysical research communications. 98, (1), 261 (1981).
  7. Delyfer, M. N., Raffelsberger, W., et al. Transcriptomic analysis of human retinal detachment reveals both inflammatory response and photoreceptor death. PloS ONE. 6, (12), e28791 (2011).
  8. Kalathur, R. K., Gagniere, N., et al. RETINOBASE: a web database, data mining and analysis platform for gene expression data on retina. BMC Genomics. 9, 208 (2008).
  9. Nakazawa, T., Hisatomi, T., et al. Monocyte chemoattractant protein 1 mediates retinal detachment-induced photoreceptor apoptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, (7), 2425 (2007).
  10. Leveillard, T., Sahel, J. A. Rod-derived cone viability factor for treating blinding diseases: from clinic to redox signaling. Science Translational Medicine. 2, (26), 26ps16 (2010).
  11. Chalmel, F., Leveillard, T., et al. Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential. BMC Molecular Biology. 8, 74 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics