Published 5/17/2013
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Мы опишем методы для изучения аспектов amylopathies в червя

Cite this Article

Copy Citation

Duan, Z., Sesti, F. A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study. J. Vis. Exp. (75), e50435, doi:10.3791/50435 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Amylopathy это термин, который характеризует ненормальное синтез и накопление бета-амилоида (Ар) в тканях со временем. Ар является отличительной чертой болезни Альцгеймера (БА) и находится в деменцию с тельцами Леви, миозит включения тела и церебральной амилоидной ангиопатии 1-4. Amylopathies постепенно развиваются с течением времени. По этой причине простые организмы с короткой продолжительностью жизни может помочь выяснить молекулярные аспекты этих условий. Здесь мы описываем экспериментальных протоколов для изучения Ар-опосредованной нейродегенерацию помощью червя Caenorhabditis Элеганс. Таким образом, мы построим трансгенных червей путем инъекции ДНК, кодирующей человеческий Ар 42 в синцитиальный гонад взрослых гермафродитов. Трансформированных линий стабилизируются индуцированного мутагенеза интеграции. Нематоды возраста синхронизированы путем сбора и посева их яйца. Функции нейронов выражения Ар 42 испытывается в подходящее поведенческого анализа (хемотаксисас). Первичных нейронов культур, полученных из эмбрионов, которые используются для дополнения и поведенческие данные для проверки нейропротекторное действие антиапоптотических соединений.

Introduction

Амилоида бета (Ар) представляет собой пептид из 36-43 аминокислот, которая образуется после последовательного расщепления белка-предшественника амилоида (APP) по β и γ секретазы 1. Γ секретазы обрабатывает C-конца пептида и отвечает за его переменной длины 5. Наиболее распространенными формами являются Ар Ар Ар 40 и 42, причем последний чаще ассоциируется к патологическим состояниям, таким как рекламы 5. При высоких концентрациях Ар форме β-листов для агрегации с образованием амилоидных фибрилл 6. Фибриллы депозиты являются основным компонентом старческих бляшек окружающих нейронов. Оба бляшек и диффузии, не доска олигомеров Ар, как полагают, являются основными формами патогенных Ар.

Лаборатория исследования нейронной amylopathies осложняется тем фактом, что эти условия прогресса с течением времени. Поэтому важнымиT развиваться генетически послушный животных моделях, комплементарные к мышам-с коротким сроком службы. Эти модели могут быть использованы для выяснения конкретных аспектов обычно amylopathies-клеточном и молекулярном и в силу своей простоты, помогают уловить суть проблемы. Червь Caenorhabditis Элеганс водопада эту категорию. Он имеет короткий срок службы, ~ 20 дней, а в дополнение основных клеточных процессах, включая регуляцию экспрессии генов, белков торговли, нейронные связи, синаптогенезе, клеточной сигнализации и смерти подобны млекопитающих 7. Уникальные особенности червя включают в себя мощные генетика и отсутствие сосудистой системы, которая дает возможность изучить повреждения нейронов независимо от сосудистых повреждений. С другой стороны, отсутствие мозга ограничивает применение С. Элеганс к изучению многих аспектов нейродегенерацию. Кроме того, воспроизведение и идентификации анатомических распределения повреждений не может быть выполнена в этом организме. Другой пределобъема отнести сложность для оценки как различия в профили экспрессии генов и обесценения сложное поведение и функции памяти. Здесь мы опишем методы генерирования C. Элеганс моделей amylopathies.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Строительство трансгенные черви

  1. Трансформации.
    1. Приготовления инъекции колодки. Поместите каплю горячей, 2% агарозном растворяется в воде, на покровное стекло. Быстро разместить второй покровное на каплю и слегка коснитесь его. После того, как агароза затвердеет, покровные слайд друг от друга, и выпекать покровное площадкой в ​​вакуумной печи при 80 ° CO / N.
    2. Потяните пипеток. Мы используем Саттер Р-97 Съемник тянуть 1/0.5 мм OD / ID боросиликатного капилляров с нитью. Пипетки кованые с закрытыми наконечник, который взломан на более позднем этапе.
    3. Приготовления инъекции смеси. Сделать инъекции смеси, содержащей интерес ДНК (20 нг / мкл в конструкции) плюс пустой плазмидой ДНК в конечной концентрации 150 нг / мкл. Центрифуга инъекции смеси для удаления любых загрязнений. Этот шаг имеет решающее значение, потому что загрязнители уменьшить эффективность трансформации. Передача Топ 5 мкл (мусора и других загрязнений собираются в нижней части) в чистую пробирку биспользуется в электронной инъекции.
    4. Загрузите инъекции смеси капиллярным. В нижней части пипетки погружен в инъекции смеси. Обычно 0,5 мкл достаточно, чтобы придать 100 червей.
    5. Загрузите инъекционной пипетки. Вставьте пипетки на держателе микроманипулятора и разорвать его открытым, потерев его кончик к краю покровного стекла установлены на стекло или же от космического мусора на площадку агарозы. Это очень важный шаг, поскольку слишком велики повреждения Советы червя и слишком маленькие чаевые легко засориться. Качество сломанный наконечник можно судить по форме и самое главное по расходу. Скорость потока может быть оценена по размеру пузырьки, вытекающих из открытый конец погружен в капли масла хладон 700 в ответ на давление нагнетания.
    6. Передача червей инъекции площадку. Поместить каплю 700 Галокарбоновое масло на инъекции площадку и передать несколько (1 или 2 для начинающих) червей к маслу. Используйте червя выбрать не подтолкнуть червей вниз на площадку, покау придерживаться агарозы. Черви должны быть ориентированы в ряд с вентральной сторон смотрят в одном направлении. Старайтесь не прикасаться голова червя. Если после нескольких попыток черви не соблюдают колодки, замените ее свежей площадку или увеличить толщину агарозы и / или концентрации.
    7. Вставьте пипетки в червя. При движении ступени, позиционировать червя под пипеткой. Поместите пипетку в центральном ядре гонад, потому что его цитоплазма разделяется многими ядер половых клеток. Это увеличивает вероятность того, чтобы доставить вводили ДНК многим потомства. Пипетки должны лежать почти параллельно червя (~ 15 ° -25 °). Нажмите вертикально кончик пипетки вниз тело червя, пока кожа не нажата. Затем осторожно нажмите на манипуляторе, чтобы вызвать вставку наконечника. Для достижения наилучших результатов как инъекционные половых желез.
    8. Введите раствора ДНК. Надавите на пипетку до гонаду набухает. Остановить поток и вытащить червя от пипетки. Проверьте иглу для потока, а затем перейтик следующему червя и повторите шаги инъекции.
    9. Восстановление черви: Добавить каплю (~ 10 мкл) буфера восстановления на червей и инкубировать, пока черви не начнут плавать. Добавить равный объем M9, подождите, пока черви не возобновить плавание и повторить несколько раз, пока раствор не в основном M9. Индивидуально передать червей семенами пластин.
  2. Интеграции.
    1. Налейте 40 здоровых, сытых, L4 червей в свежем пластины
    2. Облучают γ-лучей с 4000 рад в течение 40 мин. Передача облученных червей (P0) в свежем, OP50 пластин семенами (4 червей / пластина). Черви альтернативно может быть облучен дозой 300 Дж / ​​м 2 координат.
    3. Трансфер F1 10-20 трансформантах из каждой чашки на отдельные пластины, маркировать пластин с соответствующей P0 происхождения.
    4. Выделить 2-4 F2 трансформантах для каждого F1 для отдельных пластин. Проверьте F3 потомства на 100% передачи преобразование маркера. Как правило, 1-3% потомства от облученных Виль червяУ меня интеграции события.
    5. Сделать запасы из трех или более независимых линий трансформантом.

2. Поведенческие Анализы

  1. Возраст-синхронизации.
    1. Расти червей в стандартных 10 см NGM пластин OP50 + E. палочки до большой популяции беременных взрослых достигается (3-5 дней).
    2. Соберите червей в 50 мл труб Сокол, приостановив их в 1 мл буфера M9.
    3. Добавить 5 мл M9 буфера и центрифуге при 450 мкг в течение 3 мин. Удалите супернатант. Повторите 3-4х.
    4. В конце последнего центрифугирования, удаления супернатанта и добавляют 10 объемов основной раствор гипохлорита (0,5 М NaOH, 1% гипохлорита свежеприготовленный) к гранулированным червей. Инкубируют при комнатной температуре в течение ~ 10 мин. Лизис Реакцию можно контролировать путем размещения капли реакции лизиса на покровное и изучение червей под микроскопом. Когда около 80% червей разбиты реакция должна быть остановлена.
    5. Остановить реакцию лизиса надстройкаг того же объема стерильного буфера яйца.
    6. Собирают яйца (и туши) центрифугированием при 450 х г в течение 5 мин.
    7. Мойте яйца с стерильном буфере яйцо 2-3х.
    8. Выдержите яйца O / N в M9 буфера и семя их на стандартные пластины NGM.
  2. Хемотаксиса.
    1. Подготовьте несколько частей агар 0.5x0.5x0.5 см примерно. Мы кладем на депозит агар, в 10-см пластины и режем кусками агар оттуда.
    2. Замачивание кусок агара в раствор, содержащий желаемую аттрактант (при насыщающих, почти насыщающей концентрации) в течение 2 часов. Типичные аттрактанты лизин (0,5 М), биотин (0,2 М).
    3. Депозит агар кусок в 10 см испытательной пластины, в которых расположение тест месте и контроль местная были отмечены (рис. 1А). Разрешить уравновешивания и формирование градиента O / N (фиг.1В). Подготовить 5 тарелок для одного эксперимента.
    4. До эксперимента добавить 10 мкл 20 мМ NaN 3 (Anesthetic) в каждом месте.
    5. Поместите 20 возрастных синхронизированы червей в центре пластины. Место пластины в инкубатор при 20 ° С.
    6. Через 1 ч рассчитывать животных на тест / контроль пятна и расчета индекса хемотаксиса, (CI) следующим образом: Уравнение 1 где N, N испытаний и N Центр., указывают на общее количество животных, количество животных в тесте месте и количество животных в контрольной точке.

3. Первичных эмбриональных клеточных культур

  1. Lyse червей, как описано в возрастной синхронизации.
  2. Стоп лизис реакцию добавлением такого же объема стерильного буфера яйцо и центрифугируют при 450 х г в течение 5 мин. Аккуратно отбросить супернатант соблюдая осторожность, чтобы не потерять гранулированные яиц. Повторите 2-3х или пока супернатант не ясно.
  3. Ресуспендируйте гранулированные яйца (и туши) В 2 мл стерильного буфера яйцо и добавить 2 мл стерильного 60% сахарозы в яйце буфера. Смешайте это решение, пока яйца не будут полностью ресуспендировали (поскольку они имеют тенденцию к образованию комков при центрифугировании) вручную или при помощи вортекса.
  4. Центрифуга при 450 мкг в течение 15 мин.
  5. Тщательно передачи надосадочной жидкости (содержащей яиц) в стерильную пробирку. Отменить гранул, которая содержит туши и другие побочные продукты лизиса.
  6. Удалить остаточной сахарозы путем ресуспендирования яйца в яйцо буфере и центрифугируют при 450 х г в течение 5 мин. Аккуратно собираем и отбросить супернатант. Повторить 3 раза.
  7. Под капотом ламинарного ресуспендируйте гранулированные яйца в яйца стерильном буфере, содержащем 1 Ед / мл хитиназе при комнатной температуре, чтобы переварить яичную скорлупу. Через 30 мин начинают осуществлять мониторинг реакции (под инвертированным микроскопом культуры клеток). Каждая партия хитиназе имеет несколько иную деятельность. Обычно пищеварения завершен в 1 час.
  8. Когда примерно 70-80% яичной скорлупы усваиваются хитиназе Добавить CM-15 (L-15 клеточной культуре Medбария, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 50 ед / мл пенициллина и 50 мкг / мл стрептомицина). Диссоциируют клетки, используя шприц с калибра 27. Фильтр клеточной суспензии с 5,0 мкм фильтр для удаления нетронутыми эмбрионов, группы клеток и личинок.
  9. Гранул диссоциированной клеточной суспензии центрифугированием при 450 х г в течение 15 мин. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в CM-15 клеточной культуральной среды.
  10. Пластина диссоциированных клеток на стеклянные покровные стекла, предварительно покрытые арахисовое лектинов (0,1 мг / мл), растворенных в воде. Примечание: клетки должны придерживаться подложки, чтобы отличать.
  11. Клетки могут быть выдерживают при комнатной температуре (16-20 ° C) на воздухе в течение более 2 недель.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

С нашим протоколам, которые мы изучаем последствия человеческой Ар 42 олигомеров на функцию нейронов 8. Фрагмент, кодирующий человеческий Ар 42 и искусственные кодирующую последовательность сигнального пептида из своих вектор pPD50.52 амплифицировали из конструкции PCL12 9 с использованием праймеров, которые введены Sma один сайт эндонуклеазы рестрикции на концах. Затем фрагмент вставляется в конструкцию, содержащую 2481 п.н. FLP-6 последовательность промотора в pPD95.75 своих вектор между уникальными один сайт Sma 10. С помощью преобразования методов, описанных в протоколе 1 мы построили трансгенных червей выражения Ар 42 в АСЭ нейронов (FDX (ses25) деформации) 8. Чтобы отметить положительную трансформантах мы использовали репортер ПОКМ P-5 :: GFP, который специфически диски GFP выражение в правой ASE (ASER) нейронов 11. Черви придерживаться площадку, потому что сухой агарозы поглощает их водой. Поэтому CRUсоциального, что животные находятся на инжекторный площадку и вводят относительно быстро, потому что в противном случае они пересушивают и умирают. Процент потомства F1, который несет передаваемых внехромосомными массив может изменяться. Типичные значения находятся в диапазоне 3-7%. Важно, что введение смеси (1.1.3) содержит не-кодирующей ДНК обмена гомологии последовательности с трансгенной ДНК (обычно пустой вектор), потому что ДНК подвергаться гомологичной рекомбинации друг с другом. Однако, если избыточная экспрессия трансгена проблема инъекции смеси должна быть дополнена 50-100 нг / мкл геномной ДНК расщепляли с помощью Sca +1. ASE нейронов обнаружить водорастворимые аттрактанты, такие как биотин и, следовательно, их функции могут быть оценены в поведенческий анализ (хемотаксиса, схемы 2 и фиг.1А и 1В) 12. В типичном эксперименте мы тестировали семь дневных червей выражения P ПОКМ-5 :: GFP один (DA1262 штамм) или с Ар 42 (FDX (ses25)) прихемотаксис биотина. В молодые черви (3-4 дневных) влияние Ар 42 выражение скромные, но уже обнаруживается (~ 10% снижение индекса хемотаксиса, см. ссылку. 8). Представитель Результаты этого эксперимента показаны на фиг 1C и 1D. Большинство DA1262 черви были найдены в или рядом, аттрактантом пятна (рис. 1в). В отличие от этого только несколько червей выражения Ар 42 мог найти аттрактантом месте (рис. 1D). Мы протестировали 100 животных / генотип распространяется в 5 тестовых пластин / генотип получения индекса хемотаксиса для биотин 0,68 ± 0,09 и 0,12 ± 0,04 для DA1262 и FDX (ses25) соответственно. Активный червей определена индивидуально и передаются в центре испытательной пластине. Важно не только быстро, но и аккуратно передать червей, потому что в противном случае они могут оставаться неактивными в течение нескольких минут и не отслеживать аттрактанта. В конце эксперимента мы предлагаем монитор червиctivity, глядя на их пути. Если еще несколько треков видны мы обычно отказаться от пластины.

GFP флуоресценции в ASER нейронов FDX (ses25) червей исчезает в течение первых одиннадцати дней жизни (не показано). Это говорит о том, что эти клетки претерпевают апоптоз в связи с наличием Ар 42. Поэтому определить, является ли широкого спектра действия ингибитора апоптоза, таких как ингибитор каспазы N-(2-хинолил)-валил-аспартил-(2,6-дифторфенокси) метил кетон (Q-VD-OPh) 13 может остановить потерю ASER клетки . Для этого используют культивированный первичных нейронов ASER из эмбрионов 14, которые были получены, как описано в протоколе 3. Представитель изображения нейрона ASER в молодом (4 дневных) FDX (ses25) червя вместе с изображениями в культуре нейронов показаны на рисунках 2а-с. Искусственный клетки ASER были недолговечны (Рис. 2d). Как и ожидалось инкубации с 0,3 мкг / мл Q-VD-OPh недавно дополнена ежедневно, C ompletely остановили потерю нейронов ASER флуоресцентные. При работе с первичных нейронов в культуре важно поддерживать благоприятный плотности клеток. Этот параметр зависит главным образом от количества червей используется для извлечения яиц. Мы измеряем плотность клеток со стандартным гемоцитометром и уделять особое внимание для поддержания постоянной плотности клеток из культуры клеток в культуре клеток. Для фармакологических экспериментов, таких как описанные здесь мы работали с ~ 200000 клеток / см 2, который был получен путем сбора четыре сливной 10 см пластинах. Клетки высевали в 12 лунки 24-луночного планшета. Для получения оптимальных результатов важно также отделить эмбриональных клеток перед посевом, поскольку они имеют тенденцию к образованию сгустков. Мы используем шприц с иглой 27 и дворянства аспирации подвески туда и обратно несколько раз. Это как правило, достаточно отделить большинство клеток (особенно в начале, мы предлагаем, чтобы проверить подвески под микроскопом).

Т "FO: держать-together.within-страницы =" всегда "> Рисунок 1
Рисунок 1. Хемотаксиса. А. Представитель хемотаксисе пластины. Аттрактант (биотин), а также контроль пятна обозначены полым и заполненный круг. B. пластина хемотаксис загружен 0,5 см в диаметре кусок агара используется для установления градиента биотина. Кусок агара была снижена с 10-см диск с помощью верхней стороне стеклянной пипетки Пастера. С. Характерное распределение червей вокруг аттрактант месте. В этом примере большинство DA1262 черви смогли локализовать источник аттрактанта (биотин). D. Как и в С в течение FDX (ses25) червей. Эти биотин-нечувствительной червей выставлены разбросаны распределения вокруг плиты, и лишь немногие были найдены около аттрактантом месте.

tp_upload/50435/50435fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Культура C. Элеганс эмбриональных клеток. А. люминесцентной микроскопии изображение (рисунок слева) и яркий свет (правая картинка), взятые из FDX (ses25) трансгенных голова червя. Этот червь выражает GFP в нейроне ASER обусловлен ПОКМ-5 промоутера. B. Яркое изображение свете культуры FDX (ses25) эмбриональных клеток. Шкала бар составляет 5 мкм. C. люминесцентной микроскопии образ культурной FDX (ses25) ASER нейрона. Снимки были сделаны с Olympus BX61 микроскоп с цифровой камерой. D. Представитель эксперимента тестирования жизнеспособности культурным, возрастным синхронизированы, нейроны ASER. Клетки были получены из DA1262 эмбрионов (светлые кружки) или FDX (ses25) эмбрионов поддерживается в отсутствие / наличие 300 нг / мл Q-VD-Oph (полые и закрашенными квадратами, соответственно). Исчезновение GFP флуоресценции была использована как мера жизнеспособности нейронов. ЭксЭксперимент начался с ~ 300 флуоресцентных ASER нейронов. Жизнеспособность в пересчете на 100 * (количество флуоресцирующих клеток в день х, деленное на количество флуоресцирующих клеток в 1-й день). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы опишем комбинированный подход, изучать клеточные и молекулярные аспекты amylopathies использованием C. Элеганс. Преимущества этого подхода включают: 1.) Низкая стоимость C.elegans поддерживается в нормальном чашку Петри засевают бактерии, при комнатной температуре. 2) Мощный генетики. Трансгенные животные могут быть получены в несколько месяцев, и широкий спектр последовательности промотора доступно для управления экспрессией нужного гена в определенных нейронах. 3) простые, хорошо характеризуется, нервной системы. C. Элеганс обладает удивительно простой нервной системы (302 нейронов). Эта простота предоставил обширную характеристику нервной системы червя в том числе клеточной линии, определенной функции / роли каждого нейрона и его синаптических связей. Ограничения С. Элеганс включать в себя небольшой размер ячеек, что затрудняет применение стандартных биохимических методов, таких как иммуногистохимии и толстым (эпидермис), который изолирует нейтроновадроны образуют внешнюю среду. Таким образом, фармакологические подходы могут иметь ограниченную эффективность в C. Элеганс. культур первичных клеток представляет допустимую стратегию частично улучшить эту проблему.

Критические шаги в этих экспериментальных протоколов включают начиная с большого количества червей и мониторинга подготовку для того, чтобы не потерять яйца, эмбрионы и т.д.. Очень важно также, чтобы узнать, как обращаться с животными во время инъекции. Хранение червей в агарозном площадку слишком долго, пробивая их с большой пипетки или инъекционных слишком много ДНК смесь может необратимо повредить их. Трансформация эффективности, воспроизводимости и экспрессию трансгенов может изменяться. Эффективность связана с чистотой инъекции смеси и ее состав (наличие некодирующей ДНК). Внехромосомными массивы отличаются от животного к животному, поэтому крайне важно, чтобы создать по крайней мере 2-3, в независимых линий трансгенных. С другой стороны, добавление перевариваетсягеномной ДНК в смесь представляет собой допустимое стратегия сокращения трансгенных сверхэкспрессию. Хемотаксиса относительно бесперебойной. Однако очень важно сохранять последовательность в градиенту концентрации для того, чтобы избежать ложных результатов. Использование частей агар того же размера, например отрезать их с помощью пастеровской пипетки и поддерживать равновесие постоянной времени. Если таковые имеются, удалите излишки раствора с помощью ватного тампона.

В заключении, здесь мы приведем пример того, как простое, генетически послушный организм может быть использован для исследования молекулярных аспектов amylopathies. То же экспериментальные методы могут быть применены к изучению других нейронов белки и к генерации новых животных моделей болезни.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgements

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. NGM
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 3 g
Bacteriological agar AMRESCO J637 17 g
Bacto-peptone AMRESCO J636 2.5 g
Distilled Water Bring to 975 ml
Sterilized by autoclaving, then add the following items and mix well
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M2643 1 ml of 1 M stock
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C5670 1 ml of 1 M stock
Cholesterol Sigma-Aldrich C3045 1 ml of 5 mg/ml stock( in ethanol)
Potassium phosphate buffer 25 ml of 1M stock
2. Potassium phosphate buffer
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655 108.3 g
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich P3786 35.6 g
Distilled Water Bring to 1 L
Sterilized by autoclaving
3. M9 buffer
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655 3 g
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S5136 6 g
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 5 g
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M2643 1 ml of 1 M stock
Distilled Water Bring to 1 L
Sterilized by autoclaving
4. Egg buffer (pH 7.3, 340 mOsm)
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 118 mM
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P5405 48 mM
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C5670 2 mM
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M4880 2 mM
HEPES Fisher Scientific BP310 25 mM
Distilled Water Bring to 1 L
Sterilized by autoclaving
5. CM-15
L-15 culture medium Gibco 11415 450 ml
Fetal Bovine Serum Gibco 10437-028 50 ml
Penicillin Gibco 15140 50 units/ml
Streptomycin Gibco 15140 50 g/ml
Adjust to 340 mOsm with sucrose then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4 °C
6. Other Reagents
Halocarbon 700 oil Halocarbon Products 9002-83-9
5 μm Acrodisc Syringe Filter PALL Co. 4199
Chitinase Sigma-Aldrich C6137-5UN
Lectin (peanut) Sigma-Aldrich L0881-10MG
Sodium hydroxide Fisher Scientific S320
Lysine Sigma-Aldrich L5501
Biotin Sigma-Aldrich B4639
Sodium hypochlorite solution Sigma-Aldrich 425044
Sodium azide Sigma-Aldrich 71289
Sucrose Sigma-Aldrich S0389

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hardy, J., Allsop, D. Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer's disease. Trends in Pharmacological Sciences. 12, (10), 383-388 (1991).
  2. Kotzbauer, P. T., Trojanowsk, J. Q., Lee, V. M. Lewy body pathology in Alzheimer's disease. Journal of Molecular Neuroscience. 17, (2), 225-232 (2001).
  3. Greenberg, S. A. Inclusion body myositis: review of recent literature. Current Neurology and Neuroscience Reports. 9, (1), 83-89 (2009).
  4. Revesz, T., et al. Sporadic and familial cerebral amyloid angiopathies. Brain Pathology. 12, (3), 343-357 (2002).
  5. Hartmann, T., et al. Distinct sites of intracellular production for Alzheimer's disease A beta40/42 amyloid peptides. Nature Medicine. 3, (9), 1016-1020 (1997).
  6. Ohnishi, S., Takano, K. Amyloid fibrils from the viewpoint of protein folding. Cellular and Molecular Life sciences: CMLS. 61, (5), 511-524 (2004).
  7. C. elegans II. Cold Spring Harbor Monograph. DL, R. iddle, et al. 1, M. 33, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 1222 (1997).
  8. Cotella, D., et al. Toxic role of k+ channel oxidation in Mammalian brain. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 32, (12), 4133-4144 (2012).
  9. Link, C. D. Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, (20), 9368-9372 (1995).
  10. Cai, S. Q., Sesti, F. Oxidation of a potassium channel causes progressive sensory function loss during aging. Nature Neuroscience. 12, (5), 611-617 (2009).
  11. Yu, S., et al. Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons: a new family of chemosensory receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 3384-3387 (1997).
  12. Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans. Neuron. 7, (5), 729-742 (1991).
  13. Caserta, T. M., et al. Q-VD-OPh, a broad spectrum caspase inhibitor with potent antiapoptotic properties. Apoptosis : an international journal on programmed cell death. 8, (4), 345-352 (2003).
  14. Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33, (4), 503-514 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats