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Published 5/17/2013
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Neuroscience

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Summary

Wir beschreiben Methoden, um Aspekte der amylopathies in der Schnecke zu studieren

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Duan, Z., Sesti, F. A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study. J. Vis. Exp. (75), e50435, doi:10.3791/50435 (2013).

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Abstract

Amylopathy ist ein Begriff, der anomalen Synthese und Akkumulation von Amyloid-beta (Aß) im Gewebe mit der Zeit beschreibt. Aß ist ein Kennzeichen der Alzheimer-Krankheit (AD) und wird in Lewy-Körper-Demenz, Einschlusskörperchenmyositis und zerebrale Amyloid-Angiopathie 1-4 gefunden. Amylopathies schrittweise mit der Zeit entwickeln. Aus diesem Grund einfache Organismen mit kurzen Lebensdauer kann helfen, molekulare Aspekte dieser Bedingungen aufzuklären. Hier beschreiben wir experimentelle Protokolle zu Aß-vermittelte Neurodegeneration mit den Wurm Caenorhabditis elegans zu untersuchen. So konstruieren wir transgene Würmer durch Einspritzen kodierende DNA menschlichen Aß 42 in die Syncytial Keimdrüsen von erwachsenen Hermaphroditen. Transformantenlinien werden durch eine Mutagenese-induzierte Integration stabilisiert. Nematoden sind Alter durch das Sammeln und Säen ihre Eier synchronisiert. Die Funktion der Neuronen, Aß 42 ist in opportun Verhaltensstörungen Assays getestet (Chemotaxis Assays). Primäre neuronale Kulturen aus Embryonen gewonnen werden, um Verhaltensänderungen Daten zu ergänzen und die neuroprotektive Wirkung von anti-apoptotischen Verbindungen testen.

Introduction

Amyloid beta (Aß) ein Peptid mit 36-43 Aminosäuren, die nach sequentieller Spaltung des Amyloid-Vorläufer-Protein (APP) durch β und γ-Sekretase 1 gebildet wird. Die γ-Sekretase verarbeitet die C-terminalen Ende der Aß-Peptid und ist verantwortlich für die variable Längen 5. Die häufigsten Formen von Aß Aß sind 40 und 42 Aß, wobei letzteres häufiger pathologische Zustände wie AD 5 zugeordnet. Bei hohen Konzentrationen Aß Form β-Faltblättern, dass aggregieren zu bilden Amyloid-Fibrillen 6. Fibrillen Ablagerungen sind der Hauptbestandteil der senilen Plaques umliegenden Neuronen. Beide Plaketten und diffusionsfähig, nicht-Plaque Aß-Oligomere, wird angenommen, dass die zugrunde liegenden pathogenen Formen von Aß darstellen.

Laboruntersuchung der neuronalen amylopathies wird durch die Tatsache, dass diese Bedingungen Zeitlicher Verlauf kompliziert. Daher ist es important zu genetisch manipulierbaren Tiermodellen komplementären entwickeln Mäuse-mit kurzen Lebensdauer. Diese Modelle können verwendet werden, um bestimmte Aspekte der amylopathies-Regel zellulären und molekularen und aufgrund ihrer Einfachheit dazu beitragen, das Wesen des Problems zu erfassen aufzuklären. Der Wurm Caenorhabditis elegans ist diese Kategorie fällt. Es hat eine kurze Lebensdauer, ~ 20 Tage und darüber hinaus grundlegende zelluläre Prozesse einschließlich der Regulierung der Genexpression, Protein-Trafficking, neuronale Konnektivität, Synaptogenese, Zellkommunikation und Tod sind ähnlich wie Säugetierzellen 7. Einzigartige Merkmale des Wurms enthalten leistungsfähige Genetik und der Mangel an einem Schiff, das zu neuronalen Schäden unabhängig von Gefäßschäden studieren können. Andererseits begrenzt der Mangel eines Gehirns die Verwendung von C. elegans zu studieren viele Aspekte der Neurodegeneration. Darüber hinaus kann die Wiedergabe und Identifizierung der anatomischen Verteilung der Läsionen in diesem Organismus durchgeführt werden. Andere Limittionen wie die Schwierigkeit, sowohl Unterschiede in der Genexpression Profile und Wertminderungen von komplexen Verhalten und Memory-Funktion zu beurteilen. Hier beschreiben wir Methoden, um C zu erzeugen elegans Modelle amylopathies.

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Protocol

1. Bau von transgenen Worms

  1. Transformation.
    1. Bereiten Injektion Pads. Geben Sie einen Tropfen von heißem, 2% Agarose in Wasser gelöst, auf ein Deckglas. Schnell stellen ein zweites Deckglas auf dem Tropfen und klopfen es. Nachdem die Agarose erstarrt ist, Dia-Deckgläser auseinander, und backen das Deckglas-Pad in einem Vakuumofen bei 80 ° CO / N.
    2. Ziehen Pipetten. Wir verwenden eine Sutter P-97 Abzieher 1/0.5 mm OD / ID Borosilikatglas Kapillaren mit Faden ziehen. Pipetten mit geschlossener Spitze, die offen zu einem späteren Zeitpunkt unterbrochen geschmiedet.
    3. Bereiten Injektion mischen. Machen Sie das Gemisch, das die Einspritzung DNA von Interesse (20 ng / ul pro Konstrukt) zzgl. leer Plasmid-DNA zu einer endgültigen Konzentration von 150 ng / ul. Zentrifuge die Injektion Mischung, jede Verunreinigung zu entfernen. Dieser Schritt ist wichtig, weil Verunreinigungen reduzieren Transformationseffizienz. Übertragen Sie die Top-5-ul (Ablagerungen und andere Verunreinigungen sammeln sich im Boden) in ein frisches Röhrchen zu be in Injektion verwendet.
    4. Legen Injektion Mischung durch Kapillarwirkung. Der Boden der Pipette in der Injektion Mischung getaucht. Typischerweise 0,5 ul ausreichen, um 100 Würmer injizieren.
    5. Legen Injektionspipette. Legen Sie die Pipette auf den Halter des Mikromanipulators und brechen sie offen durch Reiben ihrer Spitze gegen die Kante eines Deckglas auf einem Objektträger aus Glas oder alternativ gegen Schmutz auf der Agarose-Pad angebracht. Dies ist ein entscheidender Schritt, da zu groß Tipps Schäden der Wurm zu klein und Tipps sind leicht verstopft. Die Qualität der abgebrochene Spitze kann durch die Form und vor allem durch die Strömungsgeschwindigkeit gemessen werden. Die Fließgeschwindigkeit kann durch die Größe der Blasen, die sich aus der offenen Spitze in einem Tropfen Halogenkohlenstoff 700 Öl in Reaktion auf einen Einspritzdruck eingetaucht beurteilt werden.
    6. Übertragen Würmer Injektion Pad. Geben Sie einen Tropfen von 700 Halocarbonöl auf einer Spritzgießmaschine Pad und übertragen mehrere (1 oder 2 für Anfänger) Würmer auf das Öl. Verwenden Sie einen Wurm holen, um die Würmer nach unten drücken, auf das Kissen, bis diey auf der Agarose haften. Worms sollte in Reihen mit ventralen Seiten in die gleiche Richtung orientiert. Berühren Wurm den Kopf. Wenn nach mehreren Versuchen die Würmer auf dem Pad nicht einhalten, mit einem frischen Pad ersetzen oder erhöhen Agarose Dicke und / oder Konzentration.
    7. Legen Sie die Pipette in die Wurm. Durch Bewegen der Bühne, positionieren Sie den Wurm unter der Pipette. Positionieren Sie die Pipette in den zentralen Kern der Gonade, weil seine Zytoplasma von vielen Keimzelle Kernen gemeinsam genutzt wird. Dies erhöht die Wahrscheinlichkeit, die injiziert DNA viele Nachkommen zu liefern. Die Pipette sollte liegen fast parallel zu der Schnecke (~ 15 ° -25 ° Winkel). Drücken Sie vertikal die Spitze der Pipette nach unten des Wurms Körper, bis die Haut gedrückt wird. Dann vorsichtig am Manipulator tippen, um die Spitze Einsetzen induzieren. Für beste Ergebnisse spritzen beide Keimdrüsen.
    8. Injizieren Sie die DNA-Lösung. Üben Sie Druck auf die Pipette, bis die Gonade schwillt an. Stoppen Sie den Fluss und ziehen Sie den Wurm aus der Pipette. Testen Sie die Nadel für Durchfluss und verschieben Sie dannzum nächsten Wurm, und wiederholen Sie die Schritte Injektion.
    9. Recover die Würmer: Fügen Sie einen Tropfen (~ 10 ul) Erholung Puffer auf die Würmer und inkubieren, bis die Würmer schwimmen beginnen. In das gleiche Volumen M9, warten, bis wieder Würmer Schwimmen und mehrmals wiederholen, bis die Lösung ist meist M9. Individuell übertragen Würmer gesetzten Platten.
  2. Integration.
    1. Zeigen 40 gesund, wohlgenährt, L4 Würmer in eine frische Platte
    2. Irradiate mit γ-ray mit 4.000 rad für 40 min. Übertragen bestrahlten Würmer (P0) in frischen, OP50 ausgesät Platten (4 Würmer / Platte). Worms kann alternativ mit einer Dosis von 300 J / m 2 UV-Vertices bestrahlt werden.
    3. Übertragen 10-20 F1 Transformanten von jeder Platte zu einzelnen Platten bezeichnen die Platten mit dem entsprechenden P0 Ursprungs.
    4. Einzel-out 2-4 F2 Transformanten für jeden F1 zu getrennten Platten. Überprüfen Sie die F3 Nachkommen für 100% Transmission der Transformation Marker. Typischerweise 1-3% der Nachkommen einer bestrahlten Wurm will eine Integration Veranstaltung.
    5. Machen Bestände von drei oder mehr unabhängigen Transformantenlinien.

2. Behavioral Assays

  1. Alter-Synchronisation.
    1. Wachsen Würmer in Standard 10 cm NGM-Platten + OP50 E. coli, bis eine große Population von schwangeren Erwachsenen erreicht ist (3-5 Tage).
    2. Sammeln Sie die Würmer in 50 ml Falcon-Röhrchen durch die Aussetzung in 1 ml M9-Puffer.
    3. 5 ml M9-Puffer und Zentrifuge bei 450 xg für 3 min. Überstand verwerfen. Wiederholen Sie 3-4x.
    4. Am Ende der letzten Zentrifugation den Überstand entfernen und hinzufügen 10 Bände der grundlegenden Natriumhypochlorit-Lösung (0,5 M NaOH, 1% Natriumhypochlorit frisch gemischt) zu den pelletierten Würmer. Inkubation bei RT für ~ 10 min. Die Lyse Reaktion kann, indem ein Tropfen der Lysereaktion auf einem Deckglas und Prüfung der Würmer unter dem Mikroskop beobachtet werden. Bei rund 80% der Würmer gebrochen werden sollte die Reaktion gestoppt werden.
    5. Stoppen Sie die Reaktion durch Lyse adding das gleiche Volumen an sterilem Puffer Ei.
    6. Sammeln Sie die Eier (und Karkassen) durch Zentrifugation bei 450 xg für 5 min.
    7. Waschen Sie die Eier mit sterilem Ei Puffer 2-3x.
    8. Inkubieren Sie die Eier O / N in M9-Puffer und Samen sie auf Standard NGM-Platten.
  2. Chemotaxis-Assay.
    1. Bereiten Sie mehrere Stücke von Agar etwa 0.5x0.5x0.5 cm. Wir deponieren die Agar in einer 10-cm-Platte und wir schneiden die Agar Brocken von dort.
    2. Einweichen Agar Chunk in einer Lösung, die das gewünschte Lockstoff (bei Sättigung nahe-sättigenden Konzentrationen) für 2 Stunden. Typische Lockstoffe Lysin (0,5 M), Biotin (0,2 M).
    3. Deposit ein Agar-Stück in einer 10 cm Testplatte in dem der Ort einer Test-Ort und ein Kontrollfeld markiert wurden (Abb. 1A). Erlauben Äquilibrierung und Bildung eines Gradienten O / N (1B). Bereiten Sie 5 Platten für ein einzelnes Experiment.
    4. Vor dem Experiment werden 10 ul 20 mM NaN 3 (anesthetic) an jedem Punkt.
    5. Platz 20 Jahren synchronisiert Würmer in der Mitte der Platte. Die Platte wird in den Inkubator bei 20 ° C.
    6. Nach 1 Stunde, zählen die Tiere auf den Test / Kontrolle Flecken und berechnen Sie die Chemotaxis-Index (CI) wie folgt: Gleichung 1 wobei N, N-Test und N Cnt., geben Sie die Gesamtzahl der Tiere, die Zahl der Tiere in der Prüfung vor Ort und die Anzahl der Tiere in der Kontrollgruppe vor Ort.

3. Primäre embryonale Zellkultur

  1. Lyse Würmer wie im Alter-Synchronisation beschrieben.
  2. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von Lyse das gleiche Volumen an sterilem Ei Puffer und Zentrifuge bei 450 xg für 5 min. Sanft Überstand verwerfen dabei darauf achten, nicht zu verlieren pelletiert Eier. Wiederholen Sie 2-3x oder bis Überstand klar ist.
  3. Sedimentierte Eier (und Karkassen) In 2 ml sterile Ei-Puffer und 2 ml sterile 60% Saccharose in Ei-Puffer. Mischen Sie diese Lösung, bis Eier vollständig resuspendiert (wie sie zu Klumpen unter Zentrifugation neigen) von Hand oder durch Vortexen.
  4. Zentrifuge bei 450 xg für 15 min.
  5. Vorsichtig den Überstand (mit den Eiern) in ein steriles Röhrchen. Verwerfen Pellet enthält die Kadaver und andere Nebenprodukte der Lyse.
  6. Rückstände von Saccharose durch Resuspendieren die Eier in Ei-Puffer und Zentrifugieren bei 450 xg für 5 min. Vorsichtig sammeln und den Überstand verwerfen. 3x wiederholen.
  7. Unter einer laminaren Haube resuspendieren pelletiert Eier in sterile Ei-Puffer mit 1 U / ml Chitinase bei RT, um die Eierschalen zu verdauen. Nach 30 min beginnen, um die Reaktion (unter einem inversen Mikroskop Zellkultur) zu überwachen. Jede Charge von Chitinase hat eine etwas andere Tätigkeit. Typischerweise Verdauung in 1 h abgeschlossen.
  8. Bei etwa 70-80% Eierschalen werden von Chitinase Add CM-15 (L-15 Zellkultur med. verdautium enthaltend 10% fötales Rinderserum, 50 U / ml Penicillin und 50 ug / ml Streptomycin). Dissociate Zellen unter Verwendung einer Spritze mit einer 27-Gauge. Filtern Sie die Zellsuspension mit einer 5,0 um Filter zu intakten Embryonen zu entfernen, Klumpen von Zellen und Larven.
  9. Pellet das dissoziierte Zellsuspension durch Zentrifugation bei 450 xg für 15 min. Entfernen Sie den Überstand und das Pellet in CM-15 Zellkulturmedium.
  10. . Platte dissoziierten Zellen auf Glas-Deckgläschen zuvor mit Erdnuss-Lectin (0,1 mg / ml) in Wasser gelöst beschichtet Hinweis: Zellen müssen an dem Substrat, um zu differenzieren.
  11. Die Zellen können bei RT (16-20 ° C) in Luft für mehr als 2 Wochen aufrechterhalten werden.

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Representative Results

Mit unserem Protokolle untersuchen wir die Auswirkungen der menschlichen Aß 42 Oligomer auf die neuronale Funktion 8. Ein Fragment, das menschliche Aß 42 und der künstlichen Signalpeptid kodierende Sequenz von Feuer Vektor pPD50.52 Konstrukt wurde aus PCL12 9 unter Verwendung der Primer, die eine Sma 1 Restriktionsendonukleasestelle an den Enden eingeführt. Das Fragment wurde dann in einem Konstrukt, das ein 2.481 bp FLP-6-Promotor-Sequenz in den Vektor pPD95.75 Feuer zwischen dem eindeutigen Sma 1 Seite 10 eingesetzt. Mit den Techniken Transformation in Protokoll 1 beschrieben konstruierten wir eine transgene Wurm exprimiert Aß 42 in der ASE Neuronen (FDX (SES25) Stamm) 8. Um positive Transformanten markieren verwendeten wir die P-5 GCY :: GFP-Reporter die speziell treibt GFP-Expression in der ASE rechts (ASER) Neuron 11. Worms Stick mit dem Pad, weil die trockene Agarose absorbiert ihr Wasser. Deshalb ist es crusoziale, dass die Tiere auf die Injektion Pad platziert sind und injiziert relativ schnell, weil sie sonst austrocknen werden und sterben. Der Anteil der F1-Nachkommen, die eine übertragbare extrachromosomalen Array trägt variieren. Typische Werte liegen im Bereich 3-7%. Es ist wichtig, dass die Injektion Mischung (1.1.3) nicht-kodierende DNA-Sharing Sequenzhomologie mit der transgenen DNA (normalerweise leerer Vektor) enthält, da die DNA homologe Rekombination durchlaufen miteinander. Allerdings, wenn die Überexpression des Transgens ist ein Problem der Injektion Mischung sollte mit 50-100 ng / ul genomische DNA mit Sca 1 verdaut ergänzt werden. ASE Neuronen erkennen wasserlöslichen Lockstoffe wie Biotin und damit ihre Funktion kann in Verhaltens-Assays (Chemotaxis Assay-Protokoll 2 und 1A und 1B) 12 beurteilt werden. In einem typischen Experiment testeten wir 7 Tage alt Würmer Ausdruck P GCY-5 :: GFP allein (DA1262 Stamm) oder mit 42 Aß (FDX (SES25)) fürChemotaxis Biotin. In jungen Würmer (3-4 Tage alt) die Effekte von Aß 42 Ausdruck bescheiden, aber bereits nachweisbar sind (~ 10% ige Abnahme der Chemotaxis Index finden ref. 8). Repräsentative Ergebnisse dieses Experiments sind in den Figuren 1C und 1D gezeigt. Die meisten DA1262 Würmer wurden gefunden, oder in der Nähe, das Lockmittel Stelle (Abbildung 1C). Im Gegensatz dazu nur ein paar Würmer Ausdruck Aß 42 finden konnte das Lockmittel spot (1D). Wir testeten 100 Tiere / Genotyp in 5 Testplatten / Genotyp Erhalt einer Chemotaxis Index für Biotin 0,68 ± 0,09 und 0,12 ± 0,04 für verteilte DA1262 und FDX (SES25), beziehungsweise. Aktive Würmer wurden einzeln aufgenommen und an der Mitte der Testplatte. Es ist wichtig, nicht nur schnell, sondern auch schonend übertragen die Würmer denn sonst bleiben sie möglicherweise für einige Minuten inaktiv und nicht die Lockstoff verfolgen. Am Ende des Experiments empfehlen wir Würmer Monitor einctivity, indem du ihre Pfade. Wenn nur noch wenige Spuren sichtbar sind wir in der Regel verwerfen die Platte.

GFP-Fluoreszenz in den Neuronen des ASER FDX (SES25) Würmer verschwindet innerhalb der ersten 11 Tage des Lebens (nicht gezeigt). Dies deutet darauf hin, dass diese Zellen Apoptose durch die Anwesenheit von Aß 42 zu unterziehen. Deshalb bestimmt, ob ein Breitspektrum-Inhibitor der Apoptose, wie Caspase-Inhibitor N-(2-Chinolyl) valyl-Aspartyl-(2,6-difluorphenoxy)-methyl-keton (Q-VD-OPh) 13 kann den Verlust von Zellen stoppen ASER . Zu diesem Zweck verwendeten wir kultivierten primären ASER Neuronen aus Embryonen 14, welches wie in Protokoll 3 beschrieben wurden. Repräsentative Bilder eines ASER Neuron in einem jungen (4 Tage alt) FDX (SES25) Wurm zusammen mit Bildern von Neuronen in Kultur sind in 2A-C gezeigt. Kultivierte ASER Zellen waren kurzlebig (2D). Wie erwartet Inkubation mit 0,3 ug / ml Q-VD-OPh frisch ergänzt täglich, c ompletely stoppte den Verlust von fluoreszierenden ASER Neuronen. Beim Arbeiten mit primären Neuronen in Kultur ist es wichtig, ein günstiger Zelldichte zu halten. Dieser Parameter hängt hauptsächlich von der Anzahl der Würmer verwendet, um die Eier zu extrahieren. Wir messen Zelldichte mit einem Standard-Zählkammer und insbesondere darauf zu Zelldichte konstant aus Zellkultur Zellkultur zu halten. Für pharmakologische Experimente wie die hier beschriebenen arbeiteten wir mit ~ 200.000 Zellen / cm 2, die durch die Ernte vier konfluenten 10 cm Platten erhalten wurde. Die Zellen wurden in 12 Vertiefungen einer 24-Well-Platte plattiert. Für optimale Ergebnisse ist es auch wichtig, die embryonalen Zellen vor der Aussaat dissoziieren, wie sie zum Verklumpen neigen. Wir verwenden eine Spritze mit einer 27-Gauge-Nadel und Adel absaugen Suspension hin und her ein paar mal. Dies ist in der Regel ausreichend, um die meisten der Zellen (vor allem am Anfang empfehlen wir, die Aussetzung unter dem Mikroskop prüfen) distanzieren.

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Abbildung 1. Chemotaxis-Assay. A. Repräsentative Chemotaxis Platte. Lockstoff (Biotin) und Kontrollflecken mit einem hohlen und einem gefüllten Kreis markiert. B. A Chemotaxis Platte mit einer 0,5-cm Durchmesser Stück Agar ein Gradient von Biotin herzustellen geladen. Das Stück Agar wurde aus einer 10-cm-Platte mit der Oberseite einer Pasteurpipette aus Glas. C. repräsentative Verteilung von Würmern um das Lockmittel Ort geschnitten. In diesem Beispiel wird die Mehrheit der DA1262 Würmer konnten Lokalisierung der Quelle der Lockstoff (Biotin). D. Wie in C FDX (SES25) Würmer. Diese Biotin-und Kleinschreibung Würmer zeigten eine gestreute Verteilung um die Platte und nur wenige waren in der Nähe der Lockstoff Ort gefunden.

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Abbildung 2. Kultur von C. elegans embryonalen Zellen. A. Fluoreszenzmikroskopie Bild (Bild links) und helles Licht (Bild rechts) aus einem FDX (SES25) transgene Wurm Kopf gemacht. Dieser Wurm drückt GFP in der ASER Neuron vom GCY-5-Promotor gesteuert. B. Helles Licht Bild einer Kultur des FDX (SES25) embryonalen Zellen. Maßstab ist 5 um. C. Fluoreszenzmikroskopie Bild eines kultivierten FDX (SES25) ASER Neurons. Die Bilder wurden mit einer Olympus BX61 Mikroskop mit einer Digitalkamera ausgestattet gemacht. D. Repräsentative Experiment testet die Lebensfähigkeit von kultivierten, altersbedingte synchronisiert ASER Neuronen. Die Zellen wurden aus DA1262 Embryonen (hohle Kreise) oder FDX (SES25) Embryonen gewartet erhalten das Fehlen / Vorhandensein von 300 ng / ml Q-VD-Oph (hohlen und gefüllten Quadrate, jeweils). Das Verschwinden der GFP-Fluoreszenz wurde als Maß für eines Neurons Lebensfähigkeit verwendet. Der ExExperiment begann mit ~ 300 fluoreszierende ASER Neuronen. Die Lebensfähigkeit wurde als 100 * (Anzahl der fluoreszierenden Zellen am Tag X nach der Anzahl der fluoreszierenden Zellen am Tag 1 geteilt) berechnet. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

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Discussion

Hier beschreiben wir einen kombinierten Ansatz, um zelluläre und molekulare Aspekte der amylopathies mit C. studieren elegans. Die Vorteile dieses Ansatzes sind:. 1) niedrige Kosten C.elegans im normalen Petrischale mit Bakterien geimpft gehalten, bei Raumtemperatur. 2) Leistungsstarke Genetik. Transgene Tiere können in wenigen Monaten erreicht werden und eine Vielzahl von Promotorsequenzen ist, um die Expression des gewünschten Gens in spezifischen Neuronen fahren. 3) Einfach, gut charakterisierten, Nervensystem. C. elegans besitzt eine bemerkenswert einfache Nervensystem (302 Neuronen). Diese Einfachheit hat umfangreiche Charakterisierung des Wurms Nervensystems einschließlich Zelllinie, spezifische Funktion / Rolle der einzelnen Neurons und seiner synaptischer Verbindungen lieferte. Die Grenzen C. elegans sind die geringe Größe der Zellen, die die Anwendung von Standard-biochemischen Techniken wie Immunhistochemie und eine dicke Haut (Epidermis), die neu isoliert behindertNeuronen bilden die äußere Umgebung. Daher können pharmakologische Ansätze von beschränkter Wirksamkeit in C betragen elegans. Kulturen von primären Zellen repräsentieren eine gültige Strategie teilweise mildern dieses Problem.

Die kritischen Schritte in dieser experimentellen Protokolle umfassen, beginnend mit großen Mengen von Würmern und Überwachung der Vorbereitungen, um nicht zu verlieren Eiern, Embryonen etc. Es ist auch wichtig zu lernen, wie die Tiere während der Injektion zu behandeln. Keeping Würmer in der Agarose-Pad zu lange, Stanzen sie mit einer großen Pipette oder Injektion zu viel DNA Mix kann irreversibel schädigen. Die Transformationseffizienz, Reproduzierbarkeit und Transgenexpression variieren. Die Effizienz wird die Reinheit der Einspritzung Mischung und seine Zusammensetzung (Vorhandensein von nicht-kodierenden DNA) in Zusammenhang stehen. Extrachromosomale Arrays variieren von Tier zu Tier daher ist es wichtig, mindestens 2-3 unabhängige transgene Linien pro herzustellen. Auf der anderen Seite, verdaut die Zugabe vongenomische DNA, um den Mix für einen gültigen Strategie zur Verringerung transgene Überexpression. Chemotaxis-Assays sind relativ störungsfrei. Allerdings ist es von entscheidender Bedeutung, um die Konsistenz in den Konzentrationsgradienten zu halten, um falsche Ergebnisse zu vermeiden. Verwenden Agarstückchen der gleichen Größe zum Beispiel schneiden Sie sie mit einer Pasteurpipette-und pflegen die Gleichgewichtszeit konstant. Wenn überhaupt, entfernen überschüssige Lösung mit einem Wattestäbchen.

Zusammenfassend hier bieten wir ein Beispiel dafür, wie ein einfaches, genetisch manipulierbaren Organismus kann ausgenutzt werden, um molekulare Aspekte der amylopathies zu untersuchen. Die gleichen experimentellen Techniken könnten zum Studium der andere neuronale Proteine ​​und zur Generierung neuer Tiermodelle von Krankheiten angewendet werden.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Acknowledgements

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. NGM
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 3 g
Bacteriological agar AMRESCO J637 17 g
Bacto-peptone AMRESCO J636 2.5 g
Distilled Water Bring to 975 ml
Sterilized by autoclaving, then add the following items and mix well
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M2643 1 ml of 1 M stock
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C5670 1 ml of 1 M stock
Cholesterol Sigma-Aldrich C3045 1 ml of 5 mg/ml stock( in ethanol)
Potassium phosphate buffer 25 ml of 1M stock
2. Potassium phosphate buffer
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655 108.3 g
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich P3786 35.6 g
Distilled Water Bring to 1 L
Sterilized by autoclaving
3. M9 buffer
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655 3 g
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S5136 6 g
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 5 g
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M2643 1 ml of 1 M stock
Distilled Water Bring to 1 L
Sterilized by autoclaving
4. Egg buffer (pH 7.3, 340 mOsm)
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 118 mM
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P5405 48 mM
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C5670 2 mM
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M4880 2 mM
HEPES Fisher Scientific BP310 25 mM
Distilled Water Bring to 1 L
Sterilized by autoclaving
5. CM-15
L-15 culture medium Gibco 11415 450 ml
Fetal Bovine Serum Gibco 10437-028 50 ml
Penicillin Gibco 15140 50 units/ml
Streptomycin Gibco 15140 50 g/ml
Adjust to 340 mOsm with sucrose then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4 °C
6. Other Reagents
Halocarbon 700 oil Halocarbon Products 9002-83-9
5 μm Acrodisc Syringe Filter PALL Co. 4199
Chitinase Sigma-Aldrich C6137-5UN
Lectin (peanut) Sigma-Aldrich L0881-10MG
Sodium hydroxide Fisher Scientific S320
Lysine Sigma-Aldrich L5501
Biotin Sigma-Aldrich B4639
Sodium hypochlorite solution Sigma-Aldrich 425044
Sodium azide Sigma-Aldrich 71289
Sucrose Sigma-Aldrich S0389

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References

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