Beredning av ett Kv Channel i lipidmembraner för strukturella och funktionella studier

* These authors contributed equally
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Rutiner för fullständig upplösning av en prototyp spänning-gated kalium kanal till lipidmembranen beskrivs. De ombildade kanaler är lämpliga för biokemiska analyser, elektriska inspelningar, ligand screening och elektron studier kristallografiska. Dessa metoder kan ha generella applikationer till de strukturella och funktionella studier av andra membranproteiner.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lee, S., Zheng, H., Shi, L., Jiang, Q. X. Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies. J. Vis. Exp. (77), e50436, doi:10.3791/50436 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

För att studera lipid-protein-interaktion i en reduktionistiska sätt, är det nödvändigt att införliva membranproteinerna till membran med väldefinierad lipidkomposition. Vi studerar lipidberoende slussning effekter i en prototyp spänning-gated kalium (Kv) kanal, och har utarbetat detaljerade förfaranden att rekonstruera kanalerna i olika membran system. Våra rekonstitutionslösningar förfaranden ta hänsyn till både tvättmedel-inducerad fusion av blåsor och fusion av protein / detergentmiceller med lipid / detergent blandade miceller samt vikten av att nå en jämvikt fördelning av lipider mellan protein / tvättmedel / lipid och tvättmedel / lipid-blandade miceller. Våra data tyder på att införandet av kanalerna i lipidvesiklarna är relativt slumpmässigt i orienteringar, och rekonstituering effektivitet är så hög att inga detekterbara proteinaggregat sågs i fraktionering experiment. Vi har utnyttjat rekonstruerad kanaler för att bestämma de konformationstillstånd av kanalerna i olika lipider, registrerar elektriska verksamheten i ett litet antal kanaler som ingår i plana lipidbiskikten, skärm för konformation-specifika ligander från en fag visas-peptid bibliotek och stödja framväxten av 2D-kristaller av kanalerna i membranen. Rekonstitutionslösningar som beskrivs här kan anpassas för att studera andra membranproteiner i lipidbiskikten, speciellt för undersökning av lipid effekter på eukaryota spänning-jonkanaler.

Introduction

Celler utbyta material och information med sin omgivning genom funktioner specifika membranproteiner 1. Membranproteiner i cellmembranen fungerar som pumpar, kanaler, receptorer, enzymer intramembrane, länkare och strukturella supportrar över membran. Mutationer som påverkar membranproteiner har anknytning till många mänskliga sjukdomar. I själva verket har många membranproteiner varit de främsta läkemedelsmål eftersom de är viktiga och lätt åtkomliga i cellmembran. Det är därför mycket viktigt att förstå strukturen och funktionen hos olika membranproteiner i membran, och göra det möjligt att ta fram nya metoder för att lindra de skadliga effekterna från de mutanta proteiner i mänskliga sjukdomar.

Lipider omger alla membranproteiner integrerade i dubbelskikten 2, 3. I eukaryota membran är de olika olika typer av lipider kända för att vara organiserade i mikroområdena 4, 5.Många membranproteiner visades att fördelas mellan dessa mikrodomäner samt skrymmande vätskefasen av membran 3, 6. Mekanismen bakom organisationen av mikroområdena och leverans av membranproteiner i dem och den fysiologiska betydelsen av dessa distributioner är självklart viktigt, men fortfarande dåligt kända. En stor teknisk svårighet studera lipid effekter på membranproteiner är tillförlitlig beredning av biokemiskt renade membranproteiner i membran av välkontrollerade lipidsammansättning så att nästan alla rekonstitueras proteiner är funktionella 7. Under de senaste åren har vi utvecklat metoder för att rekonstruera prototypen spänning-gated kalium kanal från A. Pernix (KvAP) i olika membran system för strukturella och funktionella studier 8-10. Data från andra och oss visade tillsammans att lipider är sannolikt en faktor i konformationsförändringarna av spänning-avkänningdomänerna av en spänning-jonkanal och kan forma strukturerna för några av dessa kanaler 11. I nästa, kommer vi att ge en detaljerad beskrivning av våra metoder och kommer att erbjuda kritiska tekniska tips som sannolikt kommer att säkerställa en framgångsrik reproduktion av våra resultat samt en förlängning av våra metoder för studier av andra membranproteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ett. Expression och rening av KvAP Channel (figur 1)

  1. Förberedelsearbete - Day 0
    1. Skölj glaskolvar för bakteriekulturen med avjoniserat vatten (DIH 2 O) och MilliQ H2O (MQH 2 O) för att avlägsna spår av detergent från allmän diskning.
    2. Autoklav 1,000 ml LB-medium i 2,8 L Erlenmeyerkolvar (totalt två-liters kulturen som ett exempel här). Låg hårdhet av vattnet visade sig vara viktigt för framgångsrik kultur av de transformerade bakterierna.
    3. Autoklav 100 ml LB-medium i 500 ml flaskor
    4. Transform 60 pl av XL1-Blue-kompetenta celler med 200 ng av pQE60-plasmiden innehållande genen för KvAP med en trombin skärningsställe och en His 6 tagg vid sin C-terminal, platta bakterierna på två LB-agarplattor innehållande 100 | ig / ml ampicillin och inkubera dem under 14-16 h i en 37 ° C inkubator.
  2. Expression av KvAP - Dag 1
    1. Kontrollera appenearance av de bakteriella kolonier på plattorna efter inkubering över natten. Kolonierna var oftast bara ca 0,2-0,5 mm i diameter, och det fanns en hel del av dem. Vi vill inte ha plattorna som härbärgerar stora kolonier omgivna av en massa satellit kolonier.
    2. Lägg 5,0 ml LB-medium till varje LB-agar plattan inkuberas över natten och skrot av kolonierna. Överför bakteriesuspensionen in i 100 ml LB-medium autoklaverades i en 500 ml kolv. Lägg ampicillin till en slutlig koncentration av 100 | ig / ml, inkubera den lilla kultur för ~ 1 h vid 37 ° C eller tills OD600 når 0,60.
    3. Under tiden, placera två kolvar med 1,0 L medium till ett 37 ° C skakande inkubator för att värma upp mediet, och förbereda 20 ml BaCl2 (1,0 M, 10 mM slutlig koncentration i varje 1,0 L kultur), 2,0 ml 0,4 M IPTG (isopropyl-tio-β-galaktosid) och 2,0 ml 100 mg / ml ampicillin lager i vatten.
    4. När den lilla kulturen är klar, tillsätt 10 ml av BaCl2, 1,0 ml ampiciLLIN lager, och 50 ml av små kulturen från steg 1.2.2 till förvärmda LB-media. OD600 bör ligga runt 0,05. Se upp för eventuella nederbörd på grund av hög hårdhet vattnet och motjonerna i LB-media. Ba 2 + är känd för att binda till den por domänen av kaliumkanaler och blockerar den joniska current, och innebär minskade toxiciteten hos högnivåexpression av kanalerna till bakterierna.
    5. Ta OD600 varje timme tills den når 0,70, och varje kvart tills den når 0,8-0,9. I vårt upplägg, tar det oftast ~ 5 timmar för att nå 0,8.
    6. Lägg 0,40 mM IPTG för att starta den inducerade expressionen av kanaliserar protein, och inkubera kulturen för en annan 4,0 h vid 37 ° C med 225 rpm skakning.
    7. Harvest bakterier i 1,0-liters centrifugflaskor genom spinning vid 4000 xg, 4,0 ° C under 15 min. Dekantera supernatanten så mycket som möjligt till ett slöseri bägare, tillsätt 10 ml 1,0 M Na-fosfat buffert för att fälla alla Ba 2 +, och sedan lägga till enliten volym av blekmedel för att döda bakterier. Håll den skördade bakterier i centrifugflaskor begravda i is i en 4,0 ° C kallt rum över natten.
  3. Rening av KvAP protein (Dag 2 och 3, Figur 1B)
    1. Återsuspendera bakterier pelleten i 15 ml IMAC lysbuffert per 1,0 L kultur. Tillsätt ~ 1,0 U DNas I, och tre proteashämmare av leupeptin, aprotinin och pepstatin A vid 1,0 | ig / ml. Den totala volymen för tvåliters kulturen var ~ 35 ml.
    2. Sonikera resuspenderade bakterierna i en metallbägare begravd i is under totalt 10 min av ON-tid. Den mikrosondanalys sonicator sattes i en 5 sek ON / 10 sek AV cykel med en 40% uteffekt i en 4,0 ° C kallt rum. Utgången effektinställning var empiriskt bestämt så att det mesta av bakterierna lyserades utan mycket värme i lösningen.
    3. Lägg 0,50 g n-decyl-β-D-maltosid (DM, Sol-Grade från Anatrace) i torr pulver till den sonikerade cellysat och inkubera blandningen under 30,5 h vid rumstemperatur (RT) med konstant horisontell skakning (~ 100 rpm) för att utvinna så mycket kanalproteiner som möjligt. Det är viktigt att se till att detergentpulvret helt upplöst under en period av 30-50 min.
    4. Efter detergentextraktion, avlägsna cellrester från lysatet genom centrifugering vid 20.000 x g under 30 min vid RT. I väntan på centrifugering för att avsluta, förbereda en His-tag-baserad LC (lågt-vätskekromatografi) kolonn som beskrivs i ruta 1.
    5. Ladda supernatanten från steg 1.3.4 på den färdigförpackade IMAC (i mmobilized m etal jon en ffinity c hromatography) kolonn vid en flödeshastighet av 1-2 ml / min som är driven av en peristaltisk pump. Alternativt kan den extraherade His-märkt protein kan inkuberas med IMAC harts för satsvis bindning.
    6. Tvätta IMAC harts genom att köra 5 bäddvolymer IMAC tvättbuffert, och 10 bäddvolymer IMAC tvätt buffER plus 20 mM imidazol. Ett in-line UV monitor används för att se till att tvätten är ren.
    7. Eluera KvAP proteinet genom att tillämpa IMAC elueringsbuffert innehållande 300 mM imidazol. Det mesta av det bundna KvAP elueras inom 6 ml elueringsbuffert genom kolonnen. Lägg trombin (1,0 U per 2-3 mg protein) i de poolade elueringsfraktionerna och inkubera proteinet natten på bänken att klyva His6 taggen.
    8. På nästa dag, koncentrera trombin-rötas protein lösning i en Centricon (MWCO = 30K) ner till 600 ^ för storlek-utanförskap FPLC (snabb protein vätskekromatografi). Under centrifugeringen Blanda provet var femte minut för att minimera protein aggregering. Eftersom proteinet är koncentrerat, blir den lokala koncentrationen vid membranfiltret högre, och det ibland är tydliga vita fällningar som annars skulle kunna täppa till filtermembranet. Även den höga koncentrationen av proteiner (~ 5-10 mg / ml) vid botten av koncentratorn leder till en pannanish färg och blandning hjälper verkligen till att minimera provförlust.
    9. Kör koncentrerade KvAP genom en Superdex 200 kolonn som är pre-jämvikt med FPLC jämviktningsbufferten. Typiskt toppen av tetramera KvAP kanalen i DM eluerar med en retentionsvolym av 12,3 ml. Det finns en liten bakre svans på runt 13,6 ml, som har en liten mängd av monomer KvAP. Tomrummet av kolonnen vi använde är vid 7,0 ml, och oftast provet ger upphov till en liten topp vid tomrummet, som innehåller mycket lite KvAP protein. Imidazolen kommer i slutet av elueringskurvan (~ 24 ml). Pool de fraktioner som innehåller KvAP tetramers ihop och koncentrera protein lösningen ned till 0,5 ml. Bestäm koncentrationen av provet med en bedömd släckningskoefficient (~ 1,2 E-5,0 M -1 cm -1, vilket har beräknats baserat på antalet aromatiska rester) av KvAP vid 280 nm [ref 12, URL: http:// web.expasy.org / protparam /].
      Vid rumstemperatur är den renade KvAP i DM stabil i minst en vecka utan väsentlig förlust av protein. Vid 4 ° C, kan det ännu längre. Aldrig frysa proteinet i tvätt-och rengöringsmedel. Det rekommenderas att lagra proteinet i DM vid 4 ° C, och proteinet i β-OG vid rumstemperatur. Men vi normalt vänta inte, och vidare till beredning steg omedelbart efter det att proteinerna är redo.
    10. Assay proverna i en 12% reducerande SDS-PAGE-gel.
      Proverna från varje steg som beskrivs ovan framställdes genom blandning av de 20 mikroliter av prover med 5x SDS-provbuffert (tabell 3 för buffertarna) kompletterat med 1,0% β-ME. Proverna var inte kokas. Efter geler var redo, proverna oftast varit i SDS-buffert för mer än 10 minuter vid rumstemperatur. Efter gelén kördes och färgades med Coomassie-blått visade vildtyp KvAP upp som ett enda band vid omkring 26 kDa (figur 1B

2. Ion Channel Rekonstitution

2.1. Liposom förberedelse och detergent-inducerad fusion av vesiklar

Före lipid beredningen, tvätta en 14 ml engångsglas provrör, en skruvkork glasrör, och en 250 | il glasspruta med kloroform. Häll ut ~ 10 ml kloroform i TestTube.

  1. Framställning av Palmitoyl-oleoyl-fosfatidyl-etanolamin (POPE) och palmitoyl-oleoyl-fosfatidyl-glycerol (POPG) liposomer.
    1. Överför 3,75 mg påven och 1,25 mg POPG (påven POPG = 03:01 viktförhållande) i kloroform i förväg rengöras med skruvkork glasrör och torka lipider i en kontinuerlig ström av argongas. När ingen synlig kloroform är kvar, torka lipid vidare under rum vakuum under en timme.
    2. Lägg 440 pl av låg salt-buffert (10 mM HEPES, pH 7,4) Eller vatten till den torkade lipiden och skaka röret för att hydratisera lipider. Den lipidsuspensionen ser vitaktig och grumlig.
    3. Sonikera lipidsuspensionen i en iskall badsonikator tills vesikel lösningen blir genomskinlig (OD410 <0,2).
      Typiskt för 10 mg / ml POPE / POPG lösning i vatten eller buffert med låg salthalt, som drivs vi sonikator med 30 s PÅ och 30 sek AV (på is) för totalt 15-20 min. På grund av den värme som alstras under sonikering, är det tillrådligt att tillsätta 1,0 mM DTT i lipiden lösningen för att minimera lipidoxidation, och att kyla ner vattenbadet av sonikator till 10 ° C eller därunder. Den slutliga OD410 är lipid-beroende. För vissa lipider kan det vara mycket svårt att nå en sådan låg OD. Om det händer, använder vi oftast rengöringsmedel för att fullständigt solubilisera lipider och tillåter långa inkubationstiden för att nå god fördelning av lipider runt protein-haltiga miceller (se nästa).
      En hög kapacitet badsonikator är viktigt i order att nå OD410 <0,2. Vi har använt ett system som består av Laboratory Supplies Co, Inc (modell # G112SPIG, Hicksville, NY). Nyckeln för korrekt ultraljudsbehandling av blåsor är att se till att den resonant centrum i mitten av röret har en stark vibration. Vibrationen varierar med vatten volym och därför kan justeras. Också det har empiriskt visat sig att ökad viskositet av vattnet genom att tillsätta en liten mängd glycerol kan förbättra effektiviteten av sonikering.
      Alternativt har vi funnit att användning av en mikrosond sonikator i kontakt med lipidsuspensionen i en plast-eller metallrör kan ge samma resultat. Den mikrosondanalys måste rengöras och endast spetsen är fördjupa sig i det lipidlösningen. Eftersom lipidpartiklama bryts i små bitar på ytan av mikrosond, är det mycket viktigt att hålla provet kyls, och har en del reduktionsmedel runt för att förhindra oxidation av de omättade lipider.
      Under Cryo-elektron microscopy, majoriteten av de sonikerade unilamellära vesiklar är 30 till 50 nm i diameter (data ej visade). Krökningen av de små SUVs är så hög att en liten perturbation är tillräckligt för att inducera den pulserande fusion av dessa vesiklar till större de som är från 80 till 200 nm i diameter (se nästa).
    4. Lägg 50 pl av 3,0 M KCl och 10 | il av 0,50 M DM till blandningen så att den slutliga lipidsuspensionen har 300 mM KCl och 10 mM DM. Inkubera lösningen med horisontell rotation under 2 h vid RT för att bilda lipid / detergent blandade miceller. Efter inkubationen ska suspensionen blivit lite grumlig (figur 2A), vilket beror på den detergent-inducerad fusion av de små unilamellära vesiklar.
    5. När proteinet är koncentrerat till mer än 2,0 mg / ml, tillsätt 0,50 mg KvAP protein, 50 | il av 3,0 M KCl, 16 pl 0,50 M DM lager i vatten, och 10 mM HEPES, pH 7,4 till lipiden / detergentblandningen till göra 1 ml slutlig volym. Den slutliga lipid: protein-viktförhållandet är 10:01och den slutliga koncentrationen av DM är 18 mM (Figur 2A). Inkubera protein / lipid / detergent-blandningen i glasrör med horisontell rotation för en annan 2 timmar.
      Valet av detergentkoncentrationen styrs av detergent-inducerad vesikelfusion och vesikel solubilisering 13. När vesiklarna bildas genom stark sonikering är deras genomsnittliga diameter i området av 30 till 50 nm inom EM. Dessa vesiklar har mycket låg spridning vid 410 nm. Vid låga koncentrationer är detergenter först in i vesiklarna, destabilisera vesiklarna, och inducera fusionen av detergent-mättade vesiklar (OD410 går upp, se figur 2A). Vesikelfusion leder till ökningen av OD410 nm. För 10 mg / ml POPE / POPG vesiklar, de OD410 toppar på cirka 15 mM DM. När fler tvättmedel införs, blåsor börjar brytas i bitar och lipiderna blir uppdelade i tvättmedel / lipid blandade miceller. Denna senare process åtföljs avminskning av OD410 ned till en slutlig låg nivå (<0,1).
      På grund av de aktiva fusion händelser i den stigande fasen av den optiska densiteten på grund av detergent-inducerad fusion av små blåsor, är det mycket troligt att proteinet / detergent miceller aktivt kommer att vara kondenserad med detergent-mättade lipidvesiklar. Det är anledningen bakom valet av 18 mM DM vid framställning av protein / lipid / detergentblandning. Om tvättmedlet blir koncentrerad med mer än 4 veck, den mängd DM behov justeras så att den slutliga koncentrationen är fortfarande runt 18-20 mM. När proteinutbytet är mycket låg, är det svårt att bedöma hur mycket koncentrerade tvättmedel är i provet, skulle vi blanda istället proteinet med helt lösta lipider, och använd fullt jämvikt blandning för beredning. I våra händer, om inte tillräckligt med tid tilläts nå en god jämviktsfördelning av lipiderna mellan protein-innehållande och protein-fria miceller, den reconstitution effektivitet sjunkit avsevärt. Vi testar vanligtvis rekonstituering effektivitet genom två experiment: 1) undersöka samtidig migrering av proteinet med vesikeln fraktionen i en sackaros-densitetsgradient ultracentrifugering; 2) extrahera proteiner ur de rekonstituerade vesiklar, och fraktionera dem i en gel- filtreringskolonn att hitta hur mycket protein (KvAP i vårt fall) återstår att tetramert. Minsta tiden för inkubation av protein / lipid / detergenter är ett par timmar vid rumstemperatur eller över natten vid 4 grader.
      För ett nytt membranprotein som är stabil i en annan detergent, är det första steget att ta reda på solubiliseringen egenskapen av lipiderna genom en sådan detergent, liknande vad som visade i figur 2A. Därefter är det lämpligt att börja med PC extrakt, såsom E. coli polära extrakt PC, sojabönor PC extrakt etc, så att om det specifika proteinet behöver vissa fosfolipider för dess funktion, kan det redan ingår i utvinningented lipidblandning.
  2. Beredning av KvAP i blandning med detergent-solubiliserat 1,2-dioleoyl-3-trimetylammonium-propan (DOTAP) eller 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-succinat (HUNDAR) --- ett exempel på kompletta lipid solubilisering för beredning
    1. Den lipid preparatet är densamma som för Pope / POPG blåsor. Den ultraljudsbehandling av hydratiserade lipider i små enlamellvesiklar behöver längre tid (vanligtvis 45-60 min) än för Pope / POPG lipider (vanligtvis 5-10 min). Hundarna blåsor får långsamt smälta med varandra och bildar små oljiga droppar.
      På grund av svårigheten i att göra högkvalitativa stadsjeepar av DOTAP och hundar reproducerbart, lösa vi brukar dessa två lipider helt innan blandning med proteiner.
    2. För att solubilisera DOTAP eller DOGS fullständigt är sonikerade vesiklar blandades med 10 mM DM och 40 mM n-oktyl-β-D-glukosid (β-OG). Lipiden / detergentblandning inkuberas över natten (> 15 timmar)vid rumstemperatur, och blandningen bör inte ha några små partiklar eller droppar. Men istället är det ganska klart. Underlåtenhet att nå fullständig jämvikt i detta steg kommer att leda till bildandet av en betydande fraktion av multilamellära vesiklar.
    3. Blanda KvAP proteinet med detergent-solubiliserade DOTAP eller hundar i ett protein: lipid-förhållande som är mindre än eller lika med 1:10. Det protein / detergent / lipid-blandningen får inkubera vid rumstemperatur under 2-3 h med end-over-end rotation.

2.2. Borttagning av tvättmedel för att bilda proteoliposomer

  1. Dialys --- långsamt avlägsnande av detergenter, såsom DM och β-OG, som har relativt höga kritiska micell-koncentrationer (CMC ≥ 1,0 mM)
    Förbered två-liters dialysbuffert (tabell 3) för varje 1,0 ml blandning.
    Klipp ut en lämplig längd dialysslang (MWCO = 10K, 0,70 cm bred), och tvätta den med avjoniserat vatten. Det är viktigt att kontrollera och görasäker på att det inte finns någon läcka i slangen. För känsliga prover, kunde slangen först att behandlas med en buffert av 10 mM Tris-HCl pH 8,0 och 2,0 mM EDTA, och sedan rengöras i kokande vatten under 3-5 min. Slangen är sedan fast vid en ände och sköljdes med dialysbufferten.
    Fyll på protein-lipid-detergent blandningen i en dialysslang. Kläm fast båda ändarna av slangen med minimalt utrymme kvar ovanför lösningen. Sätt den laddade slangen i dialysbufferten, och använda en omröring platta för att röret roterar sakta i lösning. Ändra dialysbuffert gång per 8 tim. Efter den första buffertbyte bör lösningen bli grumlig om proteinet-lipid-detergent blandningen var fullständigt klar. Om dialys är för snabb, kan det finnas fasta vita fällningar längst ned i dialysslangen. Det rekommenderas att vid tidpunkten för buffertbyte, bör rören smörjas, och vändas flera gånger. Efter fem byten av dialysbuffert, blåsor är oftast klar.
    Vi kontrollerar den återstående mängden tvättmedel genom att skjuta blåsor på lipidbiskiktet. När det finns fortfarande betydande mängd kvar tvättmedel blir biskiktet sönder nästan omedelbart. Det är även möjligt att mäta den kvarvarande tvättmedlet med hjälp kolorimetrisk metod eller genom mätning av ytspänningen hos vesikelsuspensionen.
  2. Användning av polystyrenkulor för att ta bort rengöringsmedel som har låg CMC
    I många fall har vi att använda låga CMC rengöringsmedel, såsom DDM (CMC ~ 0,17 mM i vatten). Pärlor med små hydrofoba porer används för att avlägsna dessa detergenter 14.
    1. Framställning av pärlorna. Vikt ut 0,5 g torra kulor och lägg dem i en 50 ml Corning rör, tillsätt 20 ml metanol, sonikera lösningen i en badsonikator 5 min för att avlägsna fastnat bubblor, spinn ner kulorna vid 5000 rpm i 5 minuter, och sedan dekantera mest metanol. Upprepa tvätta med etanol och MilliQ vatten. De tvättade pärlorna lagras i 20% etanol vid 4 ° C, ochbehöver ändras till en detergent-fri buffert före användning.
    2. Uppskatta mängden tvättmedel i proteinet / lipid / detergentblandning som skall behandlas, och beräkna mängden av pärlor som krävs för att ta bort tvättmedel. För DDM och DM, är bindningskapaciteten ungefär 100 mg pärlor för 10 mg detergenter. De våta pärlor utan överflödigt vatten vägs upp, och sattes direkt till proteinblandningen. Minst 15-20 minuter krävs för pärlorna att vara fullt effektiva och minskningen av tvättmedel koncentrationen når en stadig nivå 14-16. För att ta bort 8,7 mg DDM (dodecyl-maltosid) i 1,0 ml lösning, motsvarande ~ 18 mM, totalt 87 mg polystyrenkulor, såsom Bio-Beads SM2, används i fem lika stora fraktioner. Blanda det protein / lipid / detergentblandning med varje fraktion i 20-30 min med konstant ände-över-ände rotation vid rumstemperatur, centrifugera ner kulorna, överför supernatanten till nästa fraktion av pärlor, och upprepa till slutet.
      När detergent concentration når sin CMC, förlänger vi avsiktligt tidsfristen för att till en timme så att den lilla mängden tvättmedel i lösningen kommer att underlätta fusion av små blåsor i stora.
    3. För att avlägsna spår mängden tvättmedel efter sista steget, tillsätt 35 mg Bio-Rad SM2 pärlor och inkubera med blåsor under 4 timmar.
      När förfaranden för detergentavlägsnande beskrivits ovan skall tillämpas på ett nytt protein, är det i allmänhet lämpligt att börja med proteinet / lipid-förhållande (vikt / vikt) av ~ 01:10. Den lipid / detergentblandning måste förberedas noggrant så att tillräckligt många tvättmedel läggs till helt solubilisera lipider (Figur 2A). Det är viktigt att inkubera lipid-detergentblandningen för mer än 2 timmar vid rumstemperatur (med 1-2 mM DTT) med konstant skakning (400 rpm) eller end-over-end rotation. När proteinet blandas med lipider, bör det protein / lipid / detergent-blandningen inkuberas tillräckligt länge (över natten om proteinet är stabilt och funtione) vid antingen rumstemperatur eller i ett kallt rum så att fördelningen av detergenter och lipider mellan protein-innehållande miceller och proteinfria miceller är relativt jämn. Dessutom, om snabb borttagning av tvätt genom att använda BIOBEADS används, är det viktigt att ta reda på tvättmedel-bindande kapacitet av pärlorna. Den långsamma avlägsnande av tvättmedel gör sannolikt att proteinerna kommer att ha tillräckligt lipider för att bibehålla sin integritet och bli insatt i relativt betydande blåsor.

2.3. Lagring av proteoliposome och kvalitetskontroll

  1. När blåsorna är redo, förbereda dem i 50 l alikvoter och flash-frysa portioner genom direkt kastar sig in i flytande kväve. De frusna vesiklar lagras sedan i en -80 ° C frys. För biokemiska analyser, använder vi inte frysta blåsor eftersom frys-tö cykel ibland befanns införa artefakter i vår cys-specifik reaktion. För elektrisk inspelnings, använder vi bara blåsor som lagras i -80 ° C under mindre än 6 månader.
  2. Flotation av vesiklarna i en densitetsgradient (Figur 2B)
    1. Ladda 50 | il av vesikelsuspensionen ovanpå skikten av sackarosgradient innehållande 0,3 ml vardera av 10, 35 och 55% sackaros som gjorts i 10 mM HEPES och centrifugering vid 200.000 g under 4 h vid 4 ° C. Accelerera och bromsa långsamt för att undvika störningar i gränsytan mellan skikten.
    2. Samla 100 | il fraktioner från topp till botten och köra dem på en icke-reducerande SDS-PAGE (Figur 2B). Den KvAP färgas väl med Coomassieblått så att ett band av 0,5-1,0 mikrogram protein syns tydligt. Den KvAP protein bör finnas vid gränsytan mellan 10 och 35% sackaros. Inga tunga aggregat av proteiner förekommer vid hög densitet intervallet, vilket tyder på att nästan alla proteiner i membranen.
  3. Kontrollera korrekt konformation av KvAP kanalen i vesiklar. <br /> Våra tidigare data visat att en enda Cysteinmutant (L125C/C247S) KvAP, då integreras ordentligt i bilayers, helt begravd i membran, och kan inte nås av cystein-specifika reagenser 8. Rekonstitutionslösningar rutiner testades med denna mutant kanal, och kontrolleras av en Cys-reagens, MTS-PEG5000. Den modifiering vid L125C med 1,0 pM MTS-reagens vid rumstemperatur införs ett 5 kDa förskjutning till KvAP bandet i en icke-reducerande SDS-PAGE-gel. Ett framgångsrikt genomförande av våra rekonstitueringssteg förfaranden bör leda till någon påvisbar reaktion för L125C muterade kanaler i fosfolipidmembran, vilket tyder nästan fullständig insättning av alla kanaler i bilayers. Som en positiv kontroll av reaktionen är 5,0 mM DM införts för att göra nästan alla L125C rester i de mutanta kanaler tillgängliga för MTS reagenset.
    Alternativt, en por-bindande toxin, såsom chrybdotoxin kan användas för att räkna de tetramera kanalerna. En antikropp-baserad bindning somsäger (se ruta 2, där Fv framställs som en konformation-specifik ligand för KvAP) kan användas för att kvantifiera de tillgängliga bindningsställen i de ombildade blåsor. Dessa bindningsanalyser kan sedan jämföras med en kvantitativ analys som mäter det totala proteinet för att räkna ut vilken del av de ombildade kanalerna är tetramers och vilken fraktion av proteinet har spänning-sensorn paddel (S3/S4 av spänningsavkännaren) korrekt vikas.
    För andra proteiner som skall beredas, är det lämpligt att införa en kvantitativ metod för att bedöma hur stor del av de ombildade proteiner ordentligt viks. Noggrann funktionell undersökning är alltså en förutsättning för att utveckla god kvalitetskontroll för lyckad beredning.

Tre. Tillämpningar av de ombildade Channel-haltiga Blåsor

3.1. Funktionell undersökning av jonkanaler aktiviteter i svarta lipidmembran.

Framställning av needed material.

  1. Lipid förberedelse
    1. Rengör ett glas provrör, en bärnstensfärgad flaska med Teflon surfaced-skruvlock, och en uppsättning glassprutor med kloroform. Torka bärnstensfärgad flaska under en ström av argongas.
    2. Överför 0,75 mg påven och 0,25 mg POPG i kloroform till bärnstensfärgad flaska och avdunsta kloroform med argongas.
    3. Tvätta de torkade lipiderna med 0,20 ml pentan, och torka helt för avlägsnande av kvarvarande kloroform. Slutligen upplösa lipider i 50 ^ dekan. Lipiderna i dekan (20 mg / ml) kommer att användas för att måla ett lipiddubbelskikt över ett 150-250 mikron hålet (figur 3B) borras i den uttunnade delen vid ena sidan av en experimentell dubbellager kopp (figur 3A).
  2. Lösning förberedelse
    1. Intracellulär lösning (träns): 10 mM HEPES / KOH, pH 7,4, 15 mM KCl
    2. Extracellulära lösning (cis): 10 mM HEPES / KOH, pH 7,4, 150 mM KCl
    3. Saltbrygga: Bend glaskapilläreri U-formade broar, och fylla dem med 1,0% smält agar upplöst i extracellulära lösning.
      Den osmotiska gradient etableras mellan trans och cis lösningar visade sig vara den främsta drivkraften för vesikelfusion på lipidbiskiktet 17. För negativt laddade lipider, var 15 mM CaCl2 eller positivt laddade poly-Arginin peptider befanns kunna inducera fusion händelser. Fusogena lipider, såsom DOTAP och hundar, etc, kan införas i lipidvesiklarna så att risken för fusion händelser är högre.

Elektriska inspelningar från KvAP kanaler i lipiddubbelskikten

  1. Pre-måla det runda hålet (diameter ~ 0,25 mm) som är borrat vid den cylindriska ytan av dubbelskiktet kopp (figur 3B). De lipider överförs med en kapillär mortelstöt som görs i labbet. Det runda huvudet av kapillären mortelstöt är polerad och inte skrapa på ytan av koppen. The liten mängd lipider transporteras genom kapillären mortelstöt sprids runt hålet i biskiktet cup, och lufttorkas.
  2. Vänta 1-2 minuter så att dekan kommer att avdunsta helt. Försiktighet bör vidtas för att undvika att lipidlösningen från att komma in i hålet.
  3. Sätt bägaren i inspelningen kammaren, och satte i saltbryggor och anslut elektroderna till de två sidorna av inspelningen cup (Figur 4A). Lägg till cis-och trans-lösning på de två sidorna av hålet. En osmotisk gradient etableras för att underlätta fusion av blåsor i lipiddubbelskiktet.
  4. Justera potentiella förskjutningen mellan två sidor av koppen till ~ 0 (vanligtvis <2 millivolt). Använd den kapillära mortelstöt för att överföra en liten mängd av lipidblandningen i dekan, och måla lipiden över hålet tills en tvåskiktsmembran former. Bildningen av dubbelskiktet detekteras genom registrering av kapacitans ström under avgivning av en ramp puls.
  5. Vänta tills membranettunnar ut och blir relativt stabil. Vi vänta tills det inte finns någon mer förändring i membranet kapacitans under 3-5 minuter.
    Den allmänna tänkandet om plana tvåskiktsmembran bildas över ett stort hål är att själva mittdelen av membranet är nära att vara ~ 4,0 nm tjock som en vanlig bilager, och membranet blir tjockare när det blir nära kanten av hålet, där det finns en ring runt och de flesta av dekan lösningsmedlet är 18, 19. Det är oundvikligt att det finns kvarvarande dekan kvar i den centrala dubbelskiktet delen av membranet. Tidigare uppskattning av volymen mellan n-dekan kontra PC var 0,35-0,45 efter gallring av dubbelskiktet 18, 20-22. EM undersökning av den uttunnade biskiktet visade att det fanns linser av dekan inklämt mellan de två broschyrer med ett dubbelskikt 22. Dessa data föreslog att membranproteinerna insatta i membranen lipiddubbelskikts samexistera med små öar (upp till 50 nm i diameter) av dekan. Den kvarvarande dekan jagn dubbelskiktet minskar också den elektriska kapacitet konstant till 0,4-0,5 mF / cm 2, vilket kan användas för att erhålla en grov uppskattning av storleken på den uttunnade dubbelskiktet baserat på den uppmätta kapacitansen. Ett dubbelskikt av 100 pF kapacitans kommer från en cirkulär tvåskiktsmembran av ~ 180 nm i diameter.
    För KvAP gjorde resterande dekan försämrar inte sin spänningsberoende slussning, trots att kanalen fungerar inte har noggrant granskats i en lösningsmedelsfri dubbelskikt. Detsamma visade sig vara sant för NaChBac kanalerna och Kv1.2 kanaler införda i BLMs 23. Det är fortfarande oklart om den betydande vänster-förskjutning av GV-kurvan mätt från Kv1.2 kanalerna i dekan-membranet i förhållande till kanaler i oocyter har något att göra med den kvarvarande dekan 23. Beroende på vilka lipider som användes vid bildning av dubbla skikten, kan beloppet av den återstående dekan i dubbelskiktet variera. Till exempel rapporterades det att bildandet av plana lipid MembrAnes av MGDG (mono-galaktosyl-diacylglycerol) kräver dekan, möjligen på grund av sprickorna mellan den koniska MGDG fylls med dekan molekyler. Huruvida den kvarvarande dekan har effekter på de proteiner som ska studeras är rent empirisk, och experimentella test för att avgöra om effekten är signifikant eller inte.
  6. Så snart membranet blir stabil, skjuta 0,5-1,0 pl kanal-innehållande vesiklar genom att positionera den fina änden av en P2-pipettspets precis ovanför hålet. Vesiklarna falla ner över hålet till botten av koppen.
    Under denna process, flera blåsor fastnar på membranet över hålet. Givet tillräckligt med tid, är en del smält in biskiktet delen så att ett litet antal KvAP kanaler är ordentligt insatt i den plana biskiktet i den centrala delen av membranet. Både osmotiska gradienten och elektrostatisk interaktion är viktiga i fusion av vesiklarna i de dubbla lipidskikten 17, 24.
  7. För att testade KvAP kanaler i biskiktet, är en kort puls av 80 mV levereras från anläggning potential -80 mV. På grund av den snabba inaktivering och långsam återhämtning från inaktivering, en lång intervall (~ 120 sek för kanaler i PE / PG membran) ges mellan två pulser. En typisk aktuella inspelningen från kanalerna i en påve / POPG membran visade i figur 3C. Om strömmen är liten, ta fler vesiklar. När strömmen ser bra i storlek, balansera jonkoncentrationer i lösningarna på båda sidor av membranet. Kanalerna är redo för elektrofysiologiska experiment.

3.2. Screening för konformation-specifika ligander mot kanaler i vesiklar

  1. Introduktion av fag-visade bibliotek.
    Fagen-visade 20-mer peptid biblioteket är närvarande vid N-terminalen av de fem-kopior av pIII proteiner vid ena änden av den trådlika bakteriofagen fd-tet 25. Biblioteket presenterar ca. 1 x 10 8 skiljerka typer av slumpmässiga 20-mer peptid sekvenser, var och vänligt till oss av Dr Kathlynn Brown laboratorium vid UT Southwestern Medical Center 26. Fag-infektion in i E. coli K91 gör bakterierna resistenta mot 12 ug / ml tetracyklin.
    Ett detaljerat förfarande för bakterieodling har förstärkning och titrering av fager och sekvensering av fag kolonier har beskrivits av McGuire et al. 26 Vi kommer att ge en kort beskrivning av de grundläggande funktionerna i nästa avsnitt. Läsarna kan hitta mer information i McGuire papper. Vi kommer istället fokusera på isoleringen av specifika kloner som binder tätt till jonkanalerna rekonstitueras i vesiklar (figur 4A).
    Den grundläggande idén bakom vår skärm är att de fager bundna till de ombildade kanaler specifikt kan dras ned med blåsor. Den bundna fagen kan amplifieras och testas mot kanalerna i lipidmembranen. Vår studie avkonformationsförändringarna av KvAP spänningssensorer i olika lipidmembran 8 visade att det är möjligt att hålla spänningssensorer i antingen "aktiverad" eller "vilande" tillstånd genom switchning av lipider från regelbundna fosfolipider till de som inte innehåller fosfater i de huvudgrupp regionerna (DOTAP och hundar i våra experiment). Dessa två lipid bestämda konformationer utnyttjas i vår screening av konformation-specifika ligander. Fagbiblioteket kommer först mättas genom kanalerna i fosfolipidvesiklarna (negativ selektion) innan de väljs för trånga pärmar till kanalerna i DOTAP och hundar membran (positiv selektion).
  2. Grundläggande rutiner bakom fagselektion
    Tillväxt av K91 bakterier i LB-medium: Den dubbleringstid av bakterierna är ca 20 min vid 37 ° C med 200 rpm skakning.
    Förstärkning av biblioteket: Blanda faglösning med bakterier K91 kl OD0.4. Efter 15 minuters inkubation vid 37° C, blandningarna sprids jämnt på -9,5 x 9.5 tum 2 agarplattor innehållande 12 pg / ml tetracyklin, hindrar användningen av stora plattor dominans av kulturen av bakterier som har högre tillväxt-takt. När mångfalden av biblioteket är mindre, är 10-cm petriskålar som används för urval och småskalig förstärkning.
    Storskalig amplifiering av individuella kloner: Inokulera en liten alikvot av fager (~ 100 miljoner) i 250 ml LB plus 5 mM MgSO 4 och 12 | ig / ml tetracyklin, Odla över natten vid 37 ° C. Samla cellerna med 6.000 rpm spinn i 10 min. Samla supernatanten och lägga in den 0,2 vol / vol utfällning-buffert (2,5 M NaCl, 20% PEG8000). Efter inkubering på is under 1,0 h, centrifugera lösningen vid 17.000 xg under 30 min för att pelletera alla fager. Ta bort alla supernatanten, tillsätt 1,0 ml PBS, inkubera på is i 30 minuter, försiktigt suspendera pelleten (ingen vortex). Flytta suspensionen till ett nytt rör och centrifugera vid 14,000 rpm under 2 min. Överför supernatanten till ett annat rör, och inkubera i 65 ° C vattenbad i 15 min för att döda alla bakterier. Centrifugera röret i 2 min vid 13000 rpm. Kassera pellet, alikvot och lagra faglösning vid -80 ° C.
  3. Panorering av fager mot KvAP kanaler i lipidvesikler.
    1. De peptid-visar fager måste amplifieras och titrerades före våra experiment så att antalet av fager per enhetsvolym är känd. KvAP rekonstituerades in POPE / POPG (03:01) plus 0,50% Biotin-DOPE vesiklar som negativ kontroll, och in HUNDAR: biotin-DOPE (199:1; Detsamma gjordes för DOTAP vesiklar) används som valet målet. Den slutliga koncentrationen av KvAP i vesiklar är 0,50 mg / ml, och lipiderna är 5,0 mg / ml. Panoreringsfunktionen bufferten innehöll 500 mM KCl, 100 mM HEPES / KOH pH 7,4, och 0,10 mg / ml BSA.
      För det första loppet var ~ 10 10 fager (100 exemplar för varje typ) utspädd till 0,050 ml LB-medium. För de efterföljande vaskningssteg, STArting fag justerades till att vara inom 10 juni-10 augusti.
    2. Negativt urval:
      Inkubera de utspädda fager i 50 | il LB med 100 | il NEUTRAVIDIN agarospärlor (kan binda 1-2 mg biotinylerad BSA per ml harts, Pierce) i 1,0 ml panorering buffert. Efter 10 minuters inkubation, separera pärlorna genom att snurra dem vid 100 xg under 1,0 min. Upprepa detta steg två gånger för att avlägsna eventuella fager som binder direkt till pärlorna.
      Blanda överblivna fager från föregående steg med 50 pl tomma vesiklar (POPE / POPG plus 0,5% biotin-DOPE) som inte innehåller några proteiner. Tillsätt 100 mikroliter neutravidin Pärlor som har tvättats med panorering bufferten till fag-vesikler blandning. Efter rotering av blandningen vid rumstemperatur under 5 min, avlägsna kulorna genom 100 xg centrifugera i 30 sek. Detta steg upprepas för tomma vesiklar of Dogs: biotin-DOPE (199:1) samt för KvAP kanaler i POPE / POPG vesiklar (med 0,5% biotin-DOPE). Supernatanten efter dessa behandlingar behållarenns det fullt rensas fager. Efter de första två cyklerna skärmen skulle preclearance endast utföras mot KvAP i POPE / POPG vesiklar.
    3. Positiv urval
      Inkubera fullt clearade fager med KvAP kanaler hos hundar: biotin-DOPE (199:1) vesiklar (samma för DOTAP vesiklar) i närvaro av 100 ^ neutravidin pärlor vid rumstemperatur i 10 min. Ta blandningens volym till 15 ml genom användning av panorering buffert före centrifugering vid 100 x g under 10 min. Samla pärlor, och tvätta dem tre gånger med 45 ml panorering buffert.
    4. Återsuspendera pärlorna i 500 | il LB-medium innehållande 5,0 ug / ml biotin, och inkubera blandningen vid rumstemperatur under två timmar för att frigöra en del av de bundna fager från neutravidin, som har lägre affinitet än den nativa biotin. Separera kulorna genom 100 xg spinn under en minut. Samla supernatanten och pärlorna i två olika rör för titrering.
    5. För att förstärka de valda fager, mix 200 l av supernatanten eller återuppslammade pärlorna i det sista steget med 500 l K91 bakteriekultur (OD600 ~ 0,4-0,6, odlade ~ 4 timmar innan det används). Efter inkubation vid 37 ° C under 15 min, plattan 50 pl av vardera på tetracyklinplattor för odling över natt.
      Under de två första skärmen cykler (Figur 4A), samla alla 500 xl supernatanten och pärlorna från det sista steget, blanda dem med 5 ml bakteriekultur, och plattan dem i 9.5 tums fyrkantiga plattor för att återhämta sig och förstärka alla fag kolonier . Detta steg är viktigt för att återvinna dessa fager som gör bakterierna växa långsammare än andra.
    6. Kolonierna från plattorna förstärks och titrerades före nästa cykel av panorering och urval (se McGuire, et al., 26).
    7. Undersök verksamheten i de positivt selekterade fager på kanalerna.
      Efter 10-12 cykler av val, testa totala förstärkta fager på KvAP kanalerna i lipid Bilayers gjord av Pope / POPG. Om det finns en betydande andel av positiva kloner, bör de utvalda fager vid 100-500 nM blockera en större del av kanalerna i dubbelskiktet (Figur 4B) som vi väljer mot kanaler stabiliserats i vilotillstånd. De positiva data tyder på att det finns kloner som kommer att visa starka bindning till kanalerna i vilotillstånd. Efter 16 cykler av val, plocka 50 positiva kolonier för singel-kolonin sekvensering. De identifierade dominerande fagklonerna väljs från jämföra sekvenserna, och förstärks och testas mot kanaler i bilayers. När de positiva kloner bekräftas, syntetisera peptider som bärs av de starka positiva kloner och testa dem på kanalerna samt att bekräfta sina konformation-specifika aktiviteter.

3.3. Kristallisation av KvAP kanaler i membran för struktur bestämning 27-29

  1. För att stabilisera konformationen avkanalen, en konformation-specifikt bindemedel av kanalen, 33H1 Fv-protein, används för att bilda den KvAP / Fv komplex. Framställningen av Fv-proteinet beskrivs i ruta 2. Rena komplexet i en Superdex 200-kolonn. De komplexa eluerar vid cirka 11,4 ml i vårt system.
  2. För den första skärmen, blanda proteinet med DMPC eller POPC som är helt upplöst i DM eller β-OG. Det protein / lipid / detergentblandning är blandade i mer än 15 timmar för att nå en termodynamisk jämvikt i fördelningen av de tre komponenterna bland de blandade miceller. Vi brukar testa först tre olika lipid / protein nyckeltal (LPR = 0.5, 1.5, 2.5) och tre olika nivåer pH (6,0, 7,0 och 8,0). Dialysen bufferten innehåller 20 mM K-fosfatbuffert, 100 mM KCl, och 3,0 mM NaN3. Dialysbufferten ändras varje 2-3 dagar. En liten alikvot av kristallerna tas ut var 2-3 dagar för att undersöka bildandet av vesiklar och den möjliga uppkomsten av kristallina gittret.
    En tabloid listaav LPR vs pH används för att bestämma beteendet hos det protein i de två olika typerna av lipider. Vi vill få relativt stor storlek (över 150 nm) vesiklar eller ark membran när dialys proverna undersöks av negativ-fläcken EM. En liten regelbundet mönster i membranen antyder en hit och kommer att användas för att styra ytterligare optimering.
    Negativ-Stain EM: Copper galler överdragna med kol film (~ 3-5 nm tjocka) glöd-ut i luften för att göra kol ythydrofil. En liten volym (2-3 mikroliter) av kristaller suspensionen laddas på kolytan, och inkuberades under 0,5 till 1,0 min. Blot gallren från sidan med en rivna kanten av en bit av Whatman # 4 filterpapper. Vänd på rutnätet och inkubera den för ~ 15 sek på toppen av en droppe av 150 mikroliter färgningslösning (2,0% PTA / KOH, pH 8,0 i vatten plus 0,5% trehalos, eller 6,0% ammoniummolybdat / KOH, pH6.3-6.5 , i vatten plus 0,5-1,0% trehalos). Blot så mycket som möjligt av lösningen från than rutnät yta, och låt gallret torka innan du sätter in en TEM för undersökning. Bilder av blåsor tas i låg dos skick för att undvika skador av någon kristallin packning av elektroner.
  3. Skärmen expanderas sedan för att undersöka mindre steg av LPR i syfte att nå en korrekt LPR. Om de proteiner är lämpliga för kristallisation, kan en liten galler av proteiner i membranen blir synliga. Runt dessa initiala förhållanden, ytterligare optimera kristallisation genom att variera de salta typer och koncentrationer, temperatur, hastighet och metoder för detergentavlägsnande, tvåvärda katjoner, tvättmedel som används för att framställa proteinerna, fällningsmedel, lipider sammansättning etc.
    De optimerade 2D kristaller av KvAPΔ36/Fv komplex växa till stora ark som sträcker sig från några mikrometer till 20-30 mikron (Figur 5A). Under cryoEM förhållanden, kristallerna visar tydligt kvadrat galler med uppenbara fyrfaldig symmetri som förväntat från fyrfaldigt symmetriskt chankanaler (figur 5B och C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det allmänna flödet av experimenten för rening av KvAP kanal till biokemisk homogenitet beskrivs i figur 1A. Typiska prover under expression och rening av proteinet visade i SDS-PAGE-gel i figur 1B. Proteinet efter IMAC reningen är relativt ren. Utbytet av KvAP kanalen är omkring 1,0 mg / liter kultur.

Solubilisering av lipidvesikler med tvättmedel måste utarbetas för varje par av lipid vs diskmedel. Solubiliseringen av små unilamellära vesiklar av POPE / POPE av DM presenteras i Figur 2A, resultaten från vesiklar floatation är vanligtvis tämligen enkel. Typiska resultat i SDS-PAGE-analys av fraktionerna från gradienterna är visade i figur 2B. I sackarosdensitetsgradient, oftast kanal-innehållande POPE / POPG blåsor koncentreras vid gränsytan mellan 10% lagret end den 35% skiktet. De KvAP-innehållande DOTAP eller HUNDAR vesiklar är lättare och vanligen vid gränsytan mellan 5% och 10% (något trängt in i 10% skikt). Om det finns en betydande andel av multilamellära vesiklar, de är oftast vitaktig och koncentrerat under 10-35% gränssnittet. Vi fann att detta vanligtvis händer när proteinet-detergent-lipid-blandning inte inkuberades lång nog att nå god fördelning av lipiderna.

Elektriska inspelningar från KvAP kanaler ingår i plana lipiddubbelskikt visas i figur 3. Den typiska aktuella kurvan visar att vid -80 mV, kanalerna är tyst. Växla till +80 mV leder till en snabb kapacitans topp (den skarp vid spänningsomkoppling). En långsam stigande fas av strömmen antyder att kanalerna blir aktiva och kan bedriva utåt kalium ström. Efter toppen av den stigande fasen, börjar strömmen att minska, ett steg som heter inaktivering. Den inactivatiden tar ett par hundra millisekunder att genomföra. När spänningen slås tillbaka till -80 mV, det finns en återkommande fas efter den nedåtgående kapacitans topp, vilket återspeglar den sista av de öppna kanalerna och kallas stopp (figur 3C).

I mitten av fag skärmen, testade vi aktiviteten hos de förstärkta fager på KvAP kanaler i de dubbla skikten av Pope / POPG. Efter 12 urvalscykler, hämmade de förstärkta fager kanalen verksamhet (Figur 4B, vald fag). Men det börjar fag-visas biblioteket inte visade någon effekt på kanalerna (Figur 4B, kontroll fag). Även om verksamheten i de utvalda fager var inte mycket hög eftersom endast en låg koncentration av de positiva fager runt, föreslog de klara, reproducerbara effekter som det finns aktiva, positiva kloner som uppvisar hög affinitet, bör selektivt berikas under Återstående screening cylarna och gång berikade, kommer sannolikt att ha starka hämmande aktiviteter på kanaler i membran.

I det tidiga skedet av screening 2D kristaller, såg vi små gitter i många små blåsor. Med optimering, visade några stora ark upp med en massa små blåsor runt (Figur 5A). De cryoEM bilder av dessa kristaller visade alltid en massa lokala defekter (Figur 5B), vilket tyder på att ytterligare optimering krävs för att erhålla bättre kristaller. När kristallerna väl optimerad, uppvisade de vassa kanter, och verkade som enstaka blad. Vid hög förstoring, är de enskilda enheterna klart mycket bättre beställt (figur 5C).

Namn på reagens / material Company Katalognummer Kommentarer
Trypton RPI Corp T60060
Jästextrakt RPI Corp Y20020
NaCl Fisher S271-3
Tris-bas RPI Corp T60040
Kaliumklorid Fisher BP366-500
n-dodecyl-β-D-maltosid Affymetrix D322S Sol-grade
n-oktyl-β-D-glukosid Affymetrix O311 Ana-grade
Aprotinin RPI Corp A20550-0,05
Leupeptin RPI Corp L22035-0,025
Pepstatin A RPI Corp P30100-0,025
PMSF P7626
DNas I Roche 13407000
Bio-Bead SM-2 Bio-Rad 152-3920
HEPES RPI Corp H75030
PÅVE Avanti Polar Lipids 850757C
POPG Avanti Polar Lipids 840457C
HUNDKAPPLÖPNING Avanti Polar Lipids 870314C
DMPC Avanti Polar Lipids 850345C
Biotin-DOPE Avanti Polar Lipids 870282C
DOTAP Avanti Polar Lipids 890890C
NEUTRAVIDIN agasteg pärlor Piercenet 29200
Dialysrör Spectrum Laboratories, Inc 132-570
Pentan Fisher R399-1
Dekan TCI America D0011
MTS-PEG5000 Toronto Research Chemicals M266501

Tabell 1. Lista med reagenser och material.

  • Bakteriell kultur skakinkubator
  • Spektrofotometer
  • Micro-sondsonikator
  • Rocker
  • Golv-modell centrifug för att samla bakterier kultur och för att koncentrera prover
  • Tomma kolumner
  • Superdex 200-kolonn ansluten till ett FPLC-system

Tabell 2. Utrustning som behövs.

Buffert namn Innehåll
IMAC Lysbuffert 50 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCl
IMAC Wash buffert 50 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCl, och 5,0 mM DM
IMAC Elueringsbuffert 50 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCl, 5,0 mM DM, och 300 mM imidazol
SDS-prov buffert (5X) (icke-reducerande) 60 mM Tris-HCl (pH 6,8), 25% glycerol, 2,0% SDS, 0,10% bromfenolblått. (1,0% 2-merkaptoetanol tillsattes för att göra den reducerande buffert).
Stacking gel buffert för SDS-PAGE (4X) 0,50 M Tris-HCl (pH 6,8), 0,40% SDS
Upplösning gelbuffert för SDS-PAGE (4X) 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8), 0,40% SDS
FPLC jämranson 20 mM Tris pH 8,0, 100 mM KCl, och 5,0 mM DM
Liposom dialys 10 mM HEPES, 100 mM KCl

Tabell 3. Buffert namn och innehåll.

Figur 1
Figur 1. Framställning av KvAP för beredning. A. Allmän arbete flöde av protein expression, rening och beredning. B. Biochemical rening av proteinet. Inducerad kultur av E. coli XL1-blå uttrycker KvAP bearbetades och KvAP renas. Tjugo mikroliter av cellkulturer före (spår 1) eller efter (spår 2) induktion, detergentextrakt (spår 3), genomströmning från IMAC-kromatografi (spår 4), två tvättsteg (spår 5,6), och 5,0 ^ g av total protein efter den300 mM imidazol elueringen (spår 7) och 5,0 pg av KvAP tetramer ur storleksuteslutnings FPLC (spår 8) underkastades icke-reducerande 12% SDS-PAGE och Coomassie blå färgning.

Figur 2
Figur 2. Rekonstituering av KvAP i POPE / POPG vesiklar. A. Vesikelfusion och solubilisering som en funktion av detergent-koncentrationer. Absorbans vid 410 nm användes för att övervaka ljusspridning av vesiklar (utgångsvärde subtraheras till ingen detergent fraktion). Lipider (PÅVEN / POPG 03:01) var 10 mg / ml. De små enlamellvesiklar efter stark ultraljudsbehandling, är monodispergerad och har svag spridning på grund av deras storlekar på 30-50 nm i diameter. När tvättmedel infördes, fördelade de mellan lösning fas och lipidmembranet fasen. På grund av den starka krökningen i den lilla enlamellvesiklar, den introducerade tvättmedel trigger vesikelfusion och frisläppandet av krökningen (alltså den låga ytan potentiella energi). De kondenserade blåsor är större i storlek och visa starkare spridning vid 410 nm. Den stigande fasen av toppen (grå-färgade området) återspeglar därför tvättmedel-inducerad fusion, ett bra system för protein micelle fusion till blåsor. Koncentrationen av detergent (DM här som exempel) höger vid absorptionstoppen verkligen var valdes för vår beredning process. Femtio mikroliter av rekonstituerade KvAP vesiklar (KvAP 0,5 mg / ml) B. separerades genom sackarosdensitetsgradient. Prover av 100 | il fraktioner från topp till botten (1 ~ 9) sackaros gradient analyserades i en 12% reducerande SDS-PAGE. Gelén var Coomassie blue färgade. Bana 3 innehöll ~ 2 | ig KvAP.

/ Files/ftp_upload/50436/50436fig3.jpg "/>
Figur 3. Elektrisk aktivitet av KvAP kanal i rekonstituerade dubbelskikt. A. Inspelnings Setup upp inuti en Faraday-bur, en, två elektroder, 2, trans sida, 3, cis sida, 4,. Saltbrygga B. Förstorad sektion av den uttunnade delen vid ena sidan av dubbelskiktet koppen som visar ett hål 5 , som används för framställning av membran. C. Elektrisk aktivitet av KvAP kanaler som fuserades in i det svarta lipidmembranet registrerades. Samtidigt hålls vid -80 mV, var membranet potential pulsad till 80 mV för 150 ms, och sedan bytt tillbaka till hållpotential. Jonströmmen spelades in i spänningen-clamp-läge med en Axopatch 200B förstärkare.

Figur 4
Figur 4. Screening för conformatipå specifika ligander från en fag-visas biblioteket. A. Scheme bakom screening mot jonkanaler rekonstrueras blåsor. Vesiklarna är dopade med biotin-DOPE, och de kan dras ut ur lösningen genom neutravidin pärlor. Konformationen av KvAP kanal styrs av specifika lipider. Negativa val mot kulor, tomma vesiklar och vesiklar med kanaler i en annan konformation görs innan fager inkuberas med kanalerna i målet konformationstillstånd (i DOTAP eller hundar som exempel här). De valda fager kan förstärkas och testas mot kanaler i bilayers.. B. Test av de utvalda fager i mitten av skärmen Elektrisk aktivitet KvAP i biskiktet vid olika tidpunkter efter tillsatsen av de utvalda fager: svart spår - före tillsatsen, gula spår - 2 min efter, red trace - 10 min efter tillsats Top: Utgångspunkten fagbiblioteket (totalt. ~ 10 10 fager tillsattestill biskiktet) testades på kanaler i tvåskiktsmembran, och befanns ha någon påvisbar aktivitet eftersom varje fagklon har endast cirka 100 exemplar Botten:. Efter 12 urvalscykler, var fager fortfarande en blandning av olika kloner. Lägga ca 10 10 fager till kanalerna i biskiktet leder till tydliga hämning av kanalens aktivitet, vilket tyder på att det finns positiva kloner som borde ha hög affinitet. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 5
Figur 5. Tvådimensionell kristallisation av KvAP i membran. A. Bild av negativt färgade enda lager 2D kristaller i mitten av kristall optimering. Kristallerna färgades med 6,0% ammonium-molybdat, pH 6,4 plus 0,50% trehalos. På grund av den socker, staplade de ibland upp med varandra. Den svarta rutan betecknar ett område som ger upphov till diffraktionsmönstret som visas på höger sida med diffrak fläckar går till ~ 20 Â. B. CryoEM bilden av en 2D-kristall från ett prov liknande det som användes i (A). Provet blandades med 3% trehalos och frystes genom direkt störta, och avbildas i en cryoEM. Bilden erhölls vid 50.000 x. Det var tydligt att det fanns lokala defekter i kristallen packning. C. CryoEM bilden av en ytterligare optimerad kristall. Exemplaret var inbäddad i 0,75% tannin och 10% trehalos och bilden togs på 50.000 X. De raka linjerna och tät packning föreslog att kanalerna var väl beställt i denna typ av kristaller. De två svarta pilar markerar torget gitter.

Lådor:

Ruta 1. Framställning av IMAC-kolonnen

  1. Resuspendera IMAC Resin grundligt.
  2. Överför omedelbart den önskade mängden harts i suspension till en 50 ml rör. Vi använder två volym ml bädd av harts för rening av KvAP från 2 L kultur.
  3. Centrifugera röret vid 700 xg under två minuter för att pelletera ner hartset.
  4. Avlägsna och kassera supernatanten.
  5. Lägg 10 bäddvolymer MQH 2 O och blanda kortvarigt att skölja hartset.
  6. Recentrifuge vid 700 xg under 2 minuter för att pelletera ned hartset. Kasta bort supernatanten.
  7. Lägg 10 bäddvolymer MQH 2 O och häll i tom kolumn.
  8. Vänta tills harts slår sig ner, och stäng kolonnen med ett flöde adapter för låg-vätskekromatografi.
  9. Kör 5 bäddvolymer MQH 2 O och 5 bäddvolymer av jämviktsbuffert genom kolonnen.

Box 2. Rening av Fv

Fv Transformation - Dag 1

  1. Förvandla100 ng av plasmiden innehållande Fv-His 6-60 | il av JM83 kompetenta celler, tallrik bakterierna på fyra LB-agarplattor innehållande 100 | ig / ml ampicillin och inkubera över natten i en 37 ° C inkubator.
  2. Förbered 6 X 1 L LB för bakterieodling.

Uttryck av Fv - Dag 2

  1. Skrot alla kolonierna från plattorna in i LB-medium. Lägg denna suspension av bakterier till 6 X 1 L LB i närvaro av ampicillin (100 mg / L) och inkubera tills OD600 når 0,5.
  2. När OD når 0,5, minska temperaturen till 20 ° C och varvtal till 115. När temperaturen sjunker till ~ 20 ° C, tillsätt anhydrotetracyklin (100 pl av 1mg/ml i DMF till en L) för att initiera induktion av proteinuttryck och inkubera ytterligare 5 h vid 20 ° C med normal skakning.
  3. Harvest bakterier i ett L centrifugflaska vid 4000 xg under 15 min. Häll ut supernatanten så mycket som möjligt. Håll skördade bakterier på is iett 4 ° C kallt rum över natten.

Släpper de Fv molekyler från bakterier - Dag 3

  1. Resuspendera bakterier i 150 ml Fv-releasing-buffert (50 mM Tris pH 8,0, 20% sackaros, 1,0 mM EDTA).
  2. Under omröring med en magnetisk omrörarstav, tillsätt lysozym till 0,1 mg / ml och hålla bakterierna på is under 30 min. Efteråt, tillsätt MgCl2 på 2,0 mm och hålla på is under ytterligare 10-15 min.
  3. Centrifugera de behandlade bakterierna vid 20000 xg under 30 min vid 4 ° C. De bakteriella spheroblasts bör alla gå ner till pelleten, och de flesta av Fv-molekyler frigörs i supematanten.
  4. Dialysera supernatanten mot 4,0 L tvättbuffert (20 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl) i kylrum i minst 4 timmar. Vid slutet av dagen, byt till färsk dialysbuffert och dialysera natten. På grund av den sackaros i lösningen, kommer volymen av dialysatet öka med cirka 50%. Överskott av dialysslang bör användas.

IMAC rening och FPLC - Dag 4

  1. Jämvikt 10 volym ml bädd av IMAC rening harts (se ruta 1) med dialysbufferten i 50 ml tub.
  2. Överför dialysatet från röret, tillsätt MgCl2 till 10 mM och öka volymen till 200 ml. Blanda med den förekvilibrerad harts och inkubera under 30 min vid 4 ° C.
  3. Packa tom kolumn med den inkuberade harts, och tvätta hartset med 5 bäddvolymer tvättbuffert, följt av 5 bäddvolymer tvättbuffert med 10 mM imidazol och 30 mM imidazol vardera.
  4. Eluera det bundna proteinet med 20 ml tvättbuffert plus 300 mM imidazol.
  5. Kör den koncentrerade Fv genom Superdex 200 kolonn förjämviktad med tvättbuffert. Pool de fraktioner som innehåller Fv (typiska toppar visar upp vid 17,6 ml retentionsvolymen) tillsammans och koncentrera den. Bestäm koncentrationen av provet med användning av extinktionskoefficienten för Fv vid 280 nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Rekonstruktionen av KvAP kanaler i olika membran har använts i flera studier 8-10. Efter idén av att säkerställa fördelningen av lipider mellan detergent / lipid blandade miceller och proteinet / tvättmedel / lipid blandade miceller, kan vi nå nästan fullständig upplösning av KvAP till membran tillverkade av mycket olika lipider. Varje tetramerisk KvAP kanal behöver ~ 100 lipidmolekyler till fullo täcker dess transmembrandomän. Det väsentliga kravet är att tillåta tillräckligt lipidmolekyler att smälta in i protein / lipid / detergentmiceller innan rengöringsmedel tas bort. Våra standardförhållanden (0,5 mg protein och 5,0 mg lipider) se till att det finns i genomsnitt ~ 1000 lipidmolekyler per proteinmolekyl. Vår flotation experiment och biokemiska experiment bekräftade att rekonstruktionen är nästan klar. Elektriska inspelningar från kanalerna insatta i svarta lipidmembran, screening av de ombildade kanalerna Amedelt en fag-visas peptidbiblioteket, och tillväxten av 2D-kristaller av kanalerna i membranen visar alla de framgångsrika tillämpningar av membran beredning för olika ändamål.

De lipidberoende konformationsförändringar hos de KvAP kanaler och screening mot en fag visas-peptidbibliotek visa upp en ny väg för att screena för kanalblockerare eller konservöppnare kanal med biokemiska metoder i stället för att förlita sig på elektrofysiologi att hålla kanalerna i specifika konformationer 8. Framgången i vår skärm för konformation-specifika bindemedel tyder på att samma strategi kan tillämpas för att finna specifika bindemedel för den aktiverade konformationen. Det är troligt att de ombildade kanaler i vesiklar kan användas mot enskilda Fv bibliotek, Fab bibliotek etc. Likaså kan andra membranproteiner köra igenom dessa operationer och säkra sina snäva bindemedel som kan vara användbara för olika ändamål. Vi tror att denna NEw metoden kommer att se mer generella tillämpningar i framtiden.

Rekonstituerade membran system kommer att tillåta klarlägga de kemiska detaljerna bakom lipid effekter på membranproteiner 11. Lipid-proteininteraktion har varit känt för att vara viktigt för många membranproteiner, och har utsatts för flera studier i det förflutna tre. I cellbaserade undersökningar, kan manipulationer genomföras för att ändra specifika komponenter i membranen och sedan de funktionella förändringar i membranproteiner är förknippade med de strukturella och kompositionella förändringar i membranen. Sådana anslutningar är indirekta och kan bero på flera faktorer i cellmembranen som ej är väl karakteriserade. I en rekonstituerad homogent membran, är det mer definitivt i att göra anslutningar mellan de strukturella och funktionella förändringar av membranproteiner och de förändringar i lipid-sammansättning och egenskaper membran. Ytterst för att förstå tHan kemiska principerna bakom lipid-protein växelverkan, måste vi beskriva fördelningen av lipider runt transmembrandomänen, och för att förstå de dynamiska förändringar av dessa lipider intill proteinerna. Med ombildad systemet verkar vara ett tillförlitligt sätt mot en sådan förståelse.

Ombildning av membranproteiner kräver ett kontrollerat bortförande av tvättmedel från protein / lipid / detergent blandade miceller, och sammansmältningen av de blandade miceller till stora företag som så småningom förvandlas till blåsor 30. Tre olika metoder används för att avlägsna detergenter, dialys, pärlor och cyklodextrin 14, 31, 32. Men det är fortfarande svårt att uppnå en väl kontrollerad, gradvis avveckling av rengöringsmedel från en liten volym 33, 34. En idealisk metod för detergentavlägsnande skulle ta tvättmedel ur vattenfasen jämnt över hela volymen i en styrbar takt, och bör inte utöva starka störningar on återuppbyggnad av tvåskiktsmembran membran. En sådan metod skulle kunna ändra hastigheten och effektiviteten av beredning, och kommer sannolikt att göra det möjligt för rekonstitution i en liten volym. En kombination av långsam utspädning och någon av tre konventionella metoder för detergentavlägsnande kan närma sig detta mål. Slow-utspädning genom att införa liten mängd vatten i proteinet / detergent / lipid-blandning är en kontrollerbar sätt att jämnt minska detergentkoncentrationen ner till dess CMC. Den detergentavlägsnande är efteråt mindre kritisk för vesikelbildning, men ändå viktigt för fusion av små blåsor i stora. Andra sätt att uppnå kontrollerad detergentavlägsnande behöver fortfarande utformas och utvecklas.

Vår Utspädningsproceduren tar hänsyn till lipid fördelning bland blandade miceller och rengöringsmedlet-inducerad fusion av blåsor samt blandade miceller. Dess framgång banar väg som leder till ett bredare spektrum av tillämpningar av reconstituted blåsor, mycket mer än de tre riktningar vi presenterade. Anpassningen av vårt förfarande till andra membranproteiner bör inte stöta på större tekniska gräns. Även om många membranproteiner har rekonstituerats ett eller annat sätt, har det varit svårt att uppnå nästan fullständig upplösning och för att utvärdera funktionaliteten av proteinerna från flera olika perspektiv. Våra insatser i KvAP beredning föreslår att våra metoder kan tillåta fullständig beredning och kommer att vara lämpliga för dessa ändamål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Studierna på KvAP i Jiang labbet har fått betydande hjälp från Dr Roderick MacKinnon laboratorium vid Rockefeller University. Speciella tack går till Dr Kathlynn Brown och Michael McQuire för deras råd och hjälp på våra fag-skärmen experiment. Detta arbete har finansierats med bidrag från NIH (GM088745 och GM093271 till Q-XJ) och AHA (12IRG9400019 till Q-XJ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptone RPI Corp. T60060
Yeast Extract RPI Corp. Y20020
NaCl Fisher S271-3
Tris Base RPI Corp. T60040
Potassium Chloride Fisher BP366-500
n-Dodecyl-β-D-Maltoside Affymetrix D322S Sol-grade
n-Octyl-β-D-Glucoside Affymetrix O311 Ana-grade
Aprotinin RPI Corp. A20550-0.05
Leupeptin RPI Corp. L22035-0.025
Pepstatin A RPI Corp. P30100-0.025
PMSF SIGMA P7626
Dnase I Roche 13407000
Bio-Bead SM-2 Bio-Rad 152-3920
HEPES RPI Corp. H75030
POPE Avanti Polar Lipids 850757C
POPG Avanti Polar Lipids 840457C
DOGS Avanti Polar Lipids 870314C
DMPC Avanti Polar Lipids 850345C
Biotin-DOPE Avanti Polar Lipids 870282C
DOTAP Avanti Polar Lipids 890890C
NeutrAvidin agarose beads Piercenet 29200
Dialysis Tubing Spectrum Laboratories, Inc 132-570
Pentane Fisher R399-1
Decane TCI America D0011
MTS-PEG5000 Toronto Research Cemicals M266501

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell. 5th edition, Galand Science. New York. (2007).
  2. Lee, A. G. How lipids and proteins interact in a membrane: a molecular approach. Mol. Biosyst. 1, 203 (2005).
  3. Lee, A. G. How lipids affect the activities of integral membrane proteins. Biochim. Biophys. Acta. 1666, 62 (2004).
  4. Anderson, R. G. The caveolae membrane system. Annu. Rev. Biochem. 67, 199 (1998).
  5. Simons, K., Vaz, W. L. Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 33, 269 (2004).
  6. Edidin, M. The state of lipid rafts: from model membranes to cells. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 257 (2003).
  7. Kapoor, R., Kim, J. H., Ingolfson, H., Andersen, O. S. Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments. J. Vis. Exp. (20), e1033 (2008).
  8. Zheng, H., Liu, W., Anderson, L. Y., Jiang, Q. X. Lipid-dependent gating of a voltage-gated potassium channel. Nat. Commun. 2, 250 (2011).
  9. Schmidt, D., Jiang, Q. X., MacKinnon, R. Phospholipids and the origin of cationic gating charges in voltage sensors. Nature. 444, 775 (2006).
  10. Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel. Nature. 422, 180 (2003).
  11. Jiang, Q. X., Gonen, T. The influence of lipids on voltage-gated ion channels. Curr. Opin. Struct. Biol. 3408884 (2012).
  12. Artimo, P., et al. ExPASy: SIB bioinformatics resource portal. Nucleic Acids Res. 40, W597 (2012).
  13. Cladera, J., Rigaud, J. L., Villaverde, J., Dunach, M. Liposome solubilization and membrane protein reconstitution using Chaps and Chapso. Eur. J. Biochem. 243, 798 (1997).
  14. Levy, D., Bluzat, A., Seigneuret, M., Rigaud, J. L. A systematic study of liposome and proteoliposome reconstitution involving Bio-Bead-mediated Triton X-100 removal. Biochim. Biophys. Acta. 1025, 179 (1990).
  15. Young, H. S., Rigaud, J. L., Lacapere, J. J., Reddy, L. G., Stokes, D. L. How to make tubular crystals by reconstitution of detergent-solubilized Ca2(+)-ATPase. Biophys. J. 72, 2545 (1997).
  16. Levy, D., Gulik, A., Bluzat, A., Rigaud, J. L. Reconstitution of the sarcoplasmic reticulum Ca(2+)-ATPase: mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents. Biochim. Biophys. Acta. 1107, 283 (1992).
  17. Cohen, F. S., Zimmerberg, J., Finkelstein, A. Fusion of phospholipid vesicles with planar phospholipid bilayer membranes. II. Incorporation of a vesicular membrane marker into the planar membrane. The Journal of General Physiology. 75, 251 (1980).
  18. Fuks, B., Homble, F. Permeability and electrical properties of planar lipid membranes from thylakoid lipids. Biophysical Journal. 66, 1404 (1994).
  19. Hanke, W., Schlue, W. -R. Planar Lipid Bilayers. Methods and Applications. Biological Techniques. Sattelle, D. B. Academic Press, Inc. San Diego. 133 (1993).
  20. Tien, H. T. Bilayer lipid membranes (BLM). Theory and Practice. Marcel Dekker, Inc. New York. 655-65 (1974).
  21. Pagano, R. E., Ruysschaert, J. M., Miller, I. R. The molecular composition of some lipid bilayer membranes in aqueous solution. The Journal of Membrane Biology. 10, 11 (1972).
  22. Henn, F. A., Thompson, T. E. Properties of lipid bilayer membranes separating two aqueous phases: composition studies. Journal of Molecular Biology. 31, 227 (1968).
  23. Tao, X., MacKinnon, R. Functional analysis of Kv1.2 and paddle chimera Kv channels in planar lipid bilayers. J. Mol. Biol. 382, 24 (2008).
  24. Cohen, F. S., Akabas, M. H., Zimmerberg, J., Finkelstein, A. Parameters affecting the fusion of unilamellar phospholipid vesicles with planar bilayer membranes. The Journal of Cell Biology. 98, 1054 (1984).
  25. Smith, G. P., Petrenko, V. A. Phage Display. Chem. Rev. 97, 391-39 (1997).
  26. McGuire, M. J., Li, S., Brown, K. C. Biopanning of phage displayed peptide libraries for the isolation of cell-specific ligands. Methods Mol. Biol. 504, 291 (2009).
  27. Rigaud, J. L. Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals. Braz. J. Med. Biol. Res. 35, 753 (2002).
  28. Chami, M., et al. Use of octyl beta-thioglucopyranoside in two-dimensional crystallization of membrane proteins. J. Struct. Biol. 133, 64 (2001).
  29. Kuhlbrandt, W. Two-dimensional crystallization of membrane proteins. Q. Rev. Biophys. 25, 1 (1992).
  30. Rigaud, J. L., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods Enzymol. 372, 65 (2003).
  31. Walz, T., Grigorieff, N. Electron Crystallography of Two-Dimensional Crystals of Membrane Proteins. J. Struct. Biol. 121, (2), 142 (1998).
  32. Signorell, G. A., Kaufmann, T. C., Kukulski, W., Engel, A., Remigy, H. W. Controlled 2D crystallization of membrane proteins using methyl-beta-cyclodextrin. J. Struct. Biol. 157, 321 (2007).
  33. Vink, M., Derr, K., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins. J. Struct. Biol. 160, 295 (2007).
  34. Iacovache, I., et al. The 2DX robot: a membrane protein 2D crystallization Swiss Army knife. J. Struct. Biol. 169, 370 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics