Rekonstitution eines Kv-Kanal in Lipidmembranen für Strukturelle und Funktionelle Studien

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Biology

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Summary

Verfahren zur vollständigen Auflösung des Prototyps spannungsabhängigen Kaliumkanal in Lipid-Membranen beschrieben. Die rekonstituierten Kanäle sind für biochemische Assays, elektrische Aufnahmen, Liganden-Screening und Elektronen kristallographische Untersuchungen geeignet. Diese Methoden können allgemeine Anwendungen auf die strukturelle und funktionelle Studien anderer Membranproteine.

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Lee, S., Zheng, H., Shi, L., Jiang, Q. X. Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies. J. Vis. Exp. (77), e50436, doi:10.3791/50436 (2013).

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Abstract

Um die Lipid-Protein-Interaktion in einer reductionistic Weise zu untersuchen, ist es notwendig, die Membranproteine ​​in Membranen von definierten Lipid-Zusammensetzung einzuarbeiten. Wir untersuchen die Lipid-Gating-Effekte in einem Prototyp spannungsabhängigen Kalium-(KV)-Kanal und haben detaillierte Verfahren zur Wiederherstellung der Kanäle in verschiedene Membran-Systemen gearbeitet. Unsere Rekonstitution Verfahren nehmen Berücksichtigung sowohl Waschmittel-induzierte Fusion von Vesikeln und die Fusion von Protein / Detergensmicellen mit der Lipid / Detergens gemischte Mizellen und der es wichtig ist, ein Gleichgewicht Verteilung von Lipiden bei der Protein / Detergens / Lipid-und Reinigungsmittel / Lipid-Mischmicellen. Unsere Daten deuten darauf hin, dass das Einfügen der Kanäle in der Lipidvesikel relativ zufällig in Ausrichtungen, und die Rekonstitution Wirkungsgrad ist so hoch, dass keine nachweisbaren Proteinaggregate in Fraktionierungsexperimente beobachtet. Wir haben die Rekonstitution verwendetd Kanäle, um die Konformationen der Kanäle in verschiedenen Lipiden zu bestimmen, notieren elektrischen Aktivitäten von einer kleinen Anzahl von Kanälen in planaren Lipiddoppelschichten eingebaut, Bildschirm für Exterieur-spezifischen Liganden aus einer Phagen-Peptid-Bibliothek angezeigt, und unterstützt das Wachstum von 2D-Kristallen der Kanäle in den Membranen. Die Rekonstitution hier beschriebenen Verfahren kann zur Untersuchung anderer Membranproteine ​​in Lipid-Doppelschichten, insbesondere für die Untersuchung der Lipid-Wirkungen auf den eukaryotischen spannungsgesteuerten Ionenkanälen angepasst werden.

Introduction

Cells Austausch Materialien und Informationen mit ihrer Umgebung durch die Funktionen bestimmter Membranproteine ​​1. Membranproteine ​​in Zellmembranen funktionieren wie Pumpen, Kanäle, Rezeptoren, Enzyme intramembrane, Linker und strukturelle Unterstützer über Membranen. Mutationen, die die Membranproteine ​​beeinflussen wurden im Zusammenhang mit vielen Krankheiten des Menschen. In der Tat haben viele Membranproteine ​​die primären Angriffspunkte für Arzneimittel, da sie wichtige und leicht zugänglich in Zellmembranen sind. Es ist daher sehr wichtig, die Struktur und Funktion der Membranproteine ​​in Membranen zu verstehen, und es ermöglichen, neue Verfahren zu entwickeln, um die schädlichen Wirkungen von den mutierten Proteinen in menschlichen Krankheiten zu lindern.

Lipide umgeben alle Membranproteine ​​in Doppelschichten 2, 3 integriert. In eukaryotischen Membranen werden die verschiedenen Arten von Lipiden bekannt, in Mikrodomänen 4, 5 durchgeführt werden.Viele Membranproteine ​​gezeigt, unter diesen Mikrodomänen sowie die sperrigen fluiden Phase Membranen 3, 6 verteilt werden. Der Mechanismus der Organisation der Mikrodomänen und die Lieferung von Membranproteinen in ihnen und der physiologischen Bedeutung dieser Distributionen sind zweifellos wichtig, sondern bleiben weitgehend unverstanden. Eine wichtige technische Schwierigkeit bei der Untersuchung der Auswirkungen auf die Lipid-Membran-Proteine ​​ist die zuverlässige Wiederherstellung der biochemisch gereinigten Membranproteinen in Membranen von gut kontrollierten Lipid-Zusammensetzung, so dass fast alle Proteine ​​funktionell rekonstituiert 7 sind. In den letzten Jahren haben wir Verfahren zur Wiederherstellung der Prototyp spannungsabhängigen Kaliumkanal von A. pernix (KvAP) in verschiedenen Membran-Systeme für die strukturelle und funktionelle Studien 8-10. Die Daten von anderen und uns zusammen zeigte, dass die Lipide sind wahrscheinlich ausschlaggebend für die Konformationsänderungen des SpannungsmessgerätDomänen eines spannungsabhängigen Ionenkanal kann formen die Strukturen einiger dieser Kanäle 11. In der nächsten, werden wir eine detaillierte Beschreibung unserer Methoden und kritischen technischen Tipps, die wahrscheinlich zu gewährleisten wird die erfolgreiche Reproduktion unserer Ergebnisse sowie die Erweiterung unserer Methoden zum Studium von anderen Membranproteinen bieten.

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Protocol

1. Expression und Reinigung von KvAP Channel (Abbildung 1)

  1. Vorbereitung der Arbeit - Tag 0
    1. Spülen Sie die Glasflaschen für die Bakterienkultur mit VE-Wasser (diH 2 O) und MilliQ H 2 O (MQH 2 O), um Spuren von Reinigungsmittel aus allgemeinen Geschirrspülmittel entfernen.
    2. Autoklav 1.000 ml LB-Medium in 2,8 L Erlenmeyerkolben (insgesamt zwei-Liter-Kultur hier als Beispiel). Geringe Härte des Wassers wurde festgestellt, dass für eine erfolgreiche Kultur der transformierten Bakterien wichtig.
    3. Autoklav 100 ml LB-Medium in 500 ml Flaschen
    4. Verwandeln Sie 60 ul XL1-Blue kompetente Zellen mit 200 ng des pQE60-Plasmid, das das Gen für KvAP mit einem Thrombin-Schneiden-Website und einem His 6-Tag am C-Terminus, Platte die Bakterien auf zwei LB-Agarplatten mit 100 ug / ml Ampicillin und bebrüten sie für 14-16 Stunden in einem 37 ° C Inkubator.
  2. Expression von KvAP - Tag 1
    1. Überprüfen Sie die Appearance der Bakterienkolonien auf den Platten nach Inkubation über Nacht. Die Kolonien waren in der Regel nur etwa 0,2-0,5 mm im Durchmesser, und es gab eine Menge von ihnen. Wir wollen nicht die Platten, die großen Kolonien von vielen Satelliten-Kolonien umgeben Hafen.
    2. 5,0 ml LB-Medium zu jedem LB-Agar-Platte über Nacht inkubiert und Schrott aus den Kolonien. Übertragen der Bakteriensuspension in 100 ml LB-Medium in einem 500 ml Kolben autoklaviert. In Ampicillin bis zu einer Endkonzentration von 100 ug / ml, bebrüten die kleine Kultur für ~ 1 h bei 37 ° C oder bis OD600 erreicht 0,60.
    3. In der Zwischenzeit, Platz zwei Flaschen mit 1,0 l Medium in einem 37 ° C Schüttelinkubator zum Aufwärmen das Medium, und bereiten 20 ml BaCl 2 (1,0 M; 10 mM Endkonzentration jeweils 1,0 L Kultur), 2,0 ml 0,4 M IPTG (Isopropyl-thio-β-galactosid) und 2,0 ml 100 mg / ml Ampicillin Lager in Wasser.
    4. Sobald die kleinen Kultur ist bereit, 10 ml BaCl 2, 1,0 ml ampicillin Lager, und 50 ml der kleinen Kultur aus Schritt 1.2.2 auf die vorgewärmten LB-Medium. OD600 sollte um 0.05 sein. Achten Sie auf mögliche Niederschläge aufgrund der hohen Härte des Wassers und der Gegenionen in den LB-Medien. Ba 2 + ist bekannt, die der Pore Domäne des Kalium-Kanal und blockiert den Ionenstrom zu binden, und damit sinkt die Toxizität der eine hohe Expression der Kanäle zu den Bakterien.
    5. Nehmen OD600 jede Stunde, bis sie 0,70 erreicht, und alle fünfzehn Minuten, bis sie 0,8 bis 0,9 erreicht. In unserem Set-up, es dauert in der Regel ca. 5 bis 0,8 Stunden zu erreichen.
    6. In 0,40 mM IPTG, die induzierte Expression von Kanalprotein starten, und Inkubieren der Kultur für weitere 4.0 h bei 37 ° C mit 225 rpm geschüttelt.
    7. Ernte-Bakterien in 1,0-Liter-Flaschen, durch Drehen Zentrifuge bei 4.000 xg, 4,0 ° C für 15 min. Den Überstand umfüllen so viel wie möglich in einen Abfallbehälter Becherglas, 10 ml 1,0 M Na-Phosphat-Puffer zu fällen alle Ba 2 +, und fügen Sie dann einkleines Volumen von Bleichmittel, um Bakterien abzutöten. Halten Sie die geernteten Bakterien in der Zentrifuge Flaschen im Eis in einem 4,0 ° C kalten Raum über Nacht begraben.
  3. Die Reinigung des Proteins KvAP (Tag 2 und 3, Fig. 1B)
    1. Resuspendieren Sie das Pellet Bakterien in 15 ml IMAC Lysepuffer pro 1,0 L Kultur. In ~ 1,0 U DNase I und drei Proteaseinhibitoren Leupeptin, Aprotinin und Pepstatin A bei 1,0 ug / ml. Das Gesamtvolumen für die Zwei-Liter-Kultur war ~ 35 ml.
    2. Beschallen die resuspendierten Bakterien in einem Metall Becherglas in Eis für insgesamt 10 min von ON-Zeit begraben. Die Mikrosonde Ultraschallgerät wurde in einem 5 Sek. EIN / AUS-Zyklus 10 sec mit 40% Leistung in einem 4,0 ° C kalten Raum gesetzt. Die Ausgangsleistung Einstellung wurde empirisch bestimmt, so dass die meisten der Bakterien ohne viel Erhitzen in Lösung lysiert wurden.
    3. In 0,50 g n-Decyl-β-D-Maltosid (DM; Sol-Grade von Anatrace) in trockenem Pulver auf die beschallte Zelllysat und inkubieren Sie die Mischung für 30,5 Stunden bei Raumtemperatur (RT) mit konstanten horizontalen Schütteln (~ 100 U), um so viel wie möglich Kanalproteinen extrahieren. Es ist wichtig, um sicherzustellen, dass das Waschmittel Pulver vollständig über einen Zeitraum von 30-50 min gelöst.
    4. Nach Detergensextraktion Entfernen Zelltrümmer aus dem Lysat durch Zentrifugieren bei 20.000 × g für 30 min bei RT. Während des Wartens auf die Zentrifugation zu beenden, bereiten Sie einen His-tag-basierte LC (Niederdruck-Flüssigkeits-Chromatographie) Spalte, wie in Box 1.
    5. Laden der Überstand aus Schritt 1.3.4 auf das abgepackte IMAC (i mmobilized m etal Ionen ein ffinity graphie)-Säule bei einer Fließgeschwindigkeit von 1-2 ml / min, die durch eine peristaltische Pumpe angetrieben wird. Alternativ kann die extrahierte His-markierte Protein kann mit dem IMAC Harz für diskontinuierlich Bindung inkubiert werden.
    6. Waschen Sie die IMAC Harz, indem Sie 5 Bettvolumina IMAC Waschpuffer und 10 Bettvolumina IMAC wash Buffer beträgt 20 mM Imidazol. Ein Inline-UV-Monitor verwendet wird, um sicherzustellen, dass das Waschen sauber ist.
    7. Eluieren KvAP Protein durch Anlegen IMAC Elutionspuffer mit 300 mM Imidazol. Die meisten der gebundenen KvAP innerhalb von 6 ml Elutionspuffer durch die Säule eluiert. In Thrombin (1,0 U pro 2-3 mg Protein) in den gepoolten Elutionsfraktionen und Inkubation des Proteins über Nacht auf der Bank zur Abspaltung des His 6-Tag.
    8. Am nächsten Tag, konzentrieren die Thrombin-verdauten Protein-Lösung in ein Centricon (MWCO = 30K) auf 600 ul für size-FPLC (Fast Protein Liquid Chromatographie). Während des Laufs, mischen Sie die Probe alle fünf Minuten, um Protein-Aggregation zu minimieren. Da das Protein konzentriert, wird die lokale Konzentration an der Membranfilter höher, und manchmal sind klare weiße Niederschläge, die sonst den Filter verstopfen Membran. Auch die hohe Konzentration von Proteinen (~ 5-10 mg / ml) an der Unterseite des Konzentrators zu einer StirnFinish Farbe und Mischen hilft wirklich, Probe zu minimieren.
    9. Führen Sie das konzentrierte KvAP durch eine Superdex 200-Säule, die voräquilibriert mit FPLC Equilibrierungspuffer ist. Typischerweise wird die Spitze des tetrameren KvAP Kanal in DM eluiert mit einer Retentionszeit von 12,3 ml. Es gibt eine kleine hintere Endstück bei etwa 13,6 ml, die eine kleine Menge an monomeren KvAP hat. Das Hohlraumvolumen der Säule wir verwendet wird bei 7,0 ml, und die Probe in der Regel führt zu einem kleinen Peak an der Lücke, die sehr wenig KvAP Protein enthält. Die Imidazol steht am Ende der Elution (~ 24 ml). Pool die Fraktionen KvAP Tetrameren zusammen und konzentrieren sich die Protein-Lösung auf 0,5 ml. Bestimmen Sie die Konzentration der Probe unter Verwendung eines geschätzten Extinktionskoeffizienten (~ 1.2D-5.0 M -1 cm -1, die auf der Basis der Anzahl der aromatischen Reste berechnet wurde) von KvAP bei 280 nm [ref 12; URL: http:// web.expasyorg / ProtParam /].
      Bei Raumtemperatur ist das gereinigte KvAP in DM für mindestens eine Woche ohne wesentlichen Verlust an Protein stabil. Bei 4 ° C, könnte es sogar noch länger dauern. Nie einfrieren das Protein in Waschmitteln. Es wird empfohlen, um das Protein in DM lagern bei 4 ° C, und das Protein in β-OG bei Raumtemperatur. Aber wir normalerweise nicht zu warten, und fahren Sie mit dem Schritt unmittelbar nach dem Auflösen die Proteine ​​bereit sind.
    10. Assay werden die Proben in einem 12% SDS-PAGE-Gel.
      Die Proben aus jedem Schritt beschrieben wurden durch Mischen der 20 Mikroliter Proben mit dem 5-fach SDS-Probenpuffer (Tabelle 3 für die Puffer) mit 1,0% β-ME supplementiert hergestellt. Die Proben wurden nicht gekocht. Nach Gele waren bereit, die Proben in der Regel hatte in der SDS-Puffer für mehr als 10 Minuten bei Raumtemperatur. Nachdem das Gel laufen und mit Coomassie-Blau, zeigte das Wildtyp-KvAP als eine einzige Bande bei etwa 26 kDa (Abb. 1B

2. Ionenkanal Reconstitution

2.1. Liposomen-Zubereitung und Reinigungsmittel-induzierte Fusion von Vesikeln

Vor der Lipid-Vorbereitung, waschen ein 14 ml Einweg-Glas Reagenzglas, eine Schraube-Glasröhrchen und ein 250 ul Glas Spritze mit Chloroform. Gieße ~ 10 ml Chloroform in das Reagenzglas.

  1. Herstellung von Palmitoyl-oleoyl-Phosphatidylethanolamin (PAPST) und Palmitoyl-oleoyl-Phosphatidylglycerin (POPG) Liposomen.
    1. Übertragen von 3,75 mg und 1,25 mg PAPST von POPG (PAPST: POPG = 3.01 Gewichtsverhältnis) in Chloroform in die vorgereinigte Schraubverschluss Glasrohr und trocknen die Lipide unter einem kontinuierlichen Strom von Argon-Gas. Wenn keine sichtbare Chloroform gelassen wird, trocknen die Lipid-Raum weiter unter Vakuum für eine Stunde.
    2. In 440 ul salzarme-Puffer (10 mM HEPES, pH 7,4) Oder Wasser in dem getrockneten Lipids und Wirbel der Schlauch Hydratisierung der Lipide. Die Lipidsuspension sieht weißlich und trüb.
    3. Beschallen die Lipid-Suspension in einem eiskalten Ultraschallbad bis die Vesikel-Lösung wird durchscheinend (OD410 <0,2).
      Typisch für die 10 mg / ml Papst / POPG Lösung in Wasser oder Puffer mit niedrigem Salzgehalt, betrieben wir das Ultraschallgerät mit 30 sec und 30 sec ON OFF (auf Eis) für einen Gesamtbetrag von 15-20 min. Wegen der Hitze während der Beschallung erzeugt, ist es ratsam, 1,0 mM DTT in der Lipid-Lösung hinzufügen, um Lipid-Oxidation zu minimieren, und zur Abkühlung des Wasser-Bad der Ultraschallgerät bis 10 ° C oder darunter. Die endgültige OD410 ist lipidabhängigen. Für bestimmte Lipide kann es sehr schwierig, solche niedrigen OD erreichen. Wenn das passiert, haben wir in der Regel Reinigungsmittel verwenden, um vollständig zu lösen die Lipide und ermöglichen lange Inkubationszeit um eine gute Verteilung der Lipide um die Protein enthaltenden Mizellen (siehe nächste) zu erreichen.
      Ein Hochleistungs-Ultraschallbad ist in ord wichtiger zu erreichen OD410 <0,2. Wir haben nach einer von Laboratory Supplies Co., Inc (Model # G112SPIG, Hicksville, NY) gemacht. Der Schlüssel für die ordnungsgemäße Beschallung der Bläschen ist, um sicherzustellen, daß die Resonanz-Zentrum in der Mitte des Rohres starken Vibrationen aufweist. Die Schwingung variiert mit der Wassermenge und damit angepasst werden. Auch ist es empirisch gefunden, dass eine erhöhte Viskosität des Wassers durch Zugabe einer kleinen Menge an Glycerin kann die Wirksamkeit der Beschallung zu verbessern.
      Alternativ haben wir gefunden, dass die Verwendung einer Mikrosonde Ultraschallgerät in Kontakt mit der Lipid-Suspension in einem Kunststoff-oder Metallrohr können die gleichen Ergebnisse zu erzielen. Die Mikrosonde muss gereinigt werden und ist nur die Spitze eintauchen in die Lipid-Lösung. Da die Lipid-Teilchen in kleine Stücke auf der Oberfläche der Mikrosonde gebrochen sind, ist es sehr wichtig, dass die Probe abgekühlt und haben einige Reduktionsmittel um die Oxidation der ungesättigten Lipiden zu verhindern.
      Unter Kryo-Elektronenmikroskopie microscopy, sind die meisten der beschallten unilamellare Vesikel 30-50 nm im Durchmesser (Daten nicht gezeigt). Die Krümmung der kleinen SUVs ist so hoch, dass eine kleine Störung zur pulsierenden Fusion dieser Vesikel in größere, die 80-200 nm im Durchmesser (siehe nächster) sind induzieren.
    4. In 50 ul von 3,0 M KCl und 10 ul 0,50 M DM zu der Mischung, so dass die endgültige Lipidsuspension 300 mM KCl und 10 mM DM hat. Inkubieren der Lösung mit horizontalen Drehung für 2 h bei RT zu Lipid / Detergens gemischte Mizellen zu bilden. Nach der Inkubation ist die Suspension in etwas trübe (2A), die durch die Detergens-induzierte Verschmelzung der kleine unilamellare Vesikel werden.
    5. Wenn das Protein um mehr als 2,0 konzentriert mg / ml, 0,50 mg KvAP Eiweiß, 50 ul von 3,0 M KCl, 16 ul 0,50 M DM stock in Wasser und 10 mM HEPES, pH 7,4, der Lipid / Detergensmischung zu machen 1 ml Endvolumen. Die endgültige Lipid: Protein Gewichtsverhältnis 10:1und die Endkonzentration von DM 18 mM (Abbildung 2A). Inkubieren der Protein / Lipid / Detergens-Mischung in das Glasrohr mit horizontaler Rotation für weitere 2 Stunden.
      Die Wahl des Detergens Konzentration durch die Reinigungsmittel-induzierte Fusion von Vesikeln und Vesikel Solubilisierung 13 geführt. Wenn die Vesikel durch starke Beschallung gebildet werden, ist ihr mittlerer Durchmesser im Bereich von 30-50 nm unter EM. Diese Vesikel haben eine sehr geringe Streuung bei 410 nm. In niedrigen Konzentrationen, Reinigungsmittel zunächst in den Vesikeln eingeführt wird, zu einer Destabilisierung der Vesikel, und induzieren die Fusion von Waschmittel-gesättigten Vesikel (OD410 steigt, siehe Abbildung 2A). Vesikelfusion führt zur Erhöhung der OD410 nm. Für 10 mg / ml Papst / POPG Vesikel, die OD410 Peaks bei etwa 15 mM DM. Wenn mehr Waschmittel eingeführt werden, beginnen die Bläschen in Stücke brechen und in die Lipide geworden Reinigungsmittel / Lipid Mischmizellen verteilt. Dieser Prozess wird durch die beigefügtenAbnahme der OD410 bis zu einer endgültigen niedrigen Niveau (<0,1).
      Aufgrund der aktiven Fusionsereignissen in der steigenden Phase der optischen Dichte aufgrund des Reinigungsmittel-induzierte Fusion von kleinen Bläschen, ist es sehr wahrscheinlich, dass das Protein / Detergensmicellen aktiv wird mit dem Waschmittel-gesättigten Lipidvesikel fusioniert werden. Das ist der Grund für die Auswahl von 18 mM DM zum Zeitpunkt der Herstellung des Proteins / Lipid / Detergensmischung. Wenn das Waschmittel wird konzentriert um mehr als 4 Falten, um die Menge der DM Bedürfnisse angepasst, so dass die endgültige Konzentration noch rund 18-20 mM. Wenn das Protein Ausbeute sehr gering ist, ist es schwierig zu beurteilen, wie viel konzentrierte Waschmittel in der Probe vorhanden sind, würden wir stattdessen mischen das Protein mit komplett löslich Lipide, und verwenden Sie den vollständig äquilibriert Mischung für die Zubereitung. In unseren Händen, wenn nicht genug Zeit ließ, um eine gute Gleichverteilung der Lipide zwischen Protein-haltigen und Protein-freien Mizellen, die reconstitut erreichenIonen-Effizienz deutlich gesunken. Wir testen normalerweise die Wiederherstellung Effizienz von zwei Experimenten: 1) Prüfung der Co-Migration des Proteins mit der Vesikelfraktion in einem Saccharose-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation, 2) Extraktion der Proteine ​​aus den wiederhergestellten Vesikeln und fraktionieren sie in einem Gel- Filtration Spalte zu finden, wie viel Protein (KvAP in unserem Fall) bleibt zu tetrameren. Minimale Dauer der Inkubation der Protein / Lipid / Reinigungsmittel ist ein paar Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 Grad.
      Für einen neuen Membranproteins, die stabil in einem anderen Reinigungsmittel ist, ist der erste Schritt, wo der Solubilisierung Eigenschaft der Lipide durch eine solche Waschmittel, ähnlich dem, was in 2A gezeigt. Als nächstes ist es ratsam, mit der PC-Extrakte, wie der E. starten coli polaren Extrakt PC, die Soja-Extrakt PC usw., so dass, wenn die spezifische Protein benötigt bestimmte Phospholipide für seine Funktion, kann es bereits bei der Extraktion enthaltented Lipidgemisch.
  2. Herstellung des KvAP in Mischung mit gelöstem Reinigungsmittel 1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-propan (DOTAP) oder 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-Succinat (DOGS) --- ein Beispiel einer vollständigen Solubilisierung Lipid zum Auflösen
    1. Die Lipid-Vorbereitung ist die gleiche wie für Papst / POPG Vesikel. Die Beschallung von hydratisierten Lipiden in kleine einschichtigen Vesikeln benötigt längere Zeit (in der Regel 45-60 Minuten) als bei Papst / POPG Lipide (in der Regel 5-10 min). Die Hunde Vesikel können langsam miteinander verschmelzen und bilden kleine Öltröpfchen.
      Wegen der Schwierigkeiten bei der Herstellung hochwertiger SUVs aus DOTAP und DOGS reproduzierbar, wir in der Regel lösen diese beiden Lipide vollständig vor dem Mischen mit den Proteinen.
    2. Um die DOTAP oder DOGS vollständig zu lösen, werden die beschallten Vesikel mit 10 mM DM und 40 mM n-Octyl-β-D-glucosid (β-OG) gemischt. Die Lipid / Reinigungsmittel Mischung über Nacht inkubiert (> 15 h)bei Raumtemperatur, und die Mischung sollte keine kleinen Teilchen oder Tröpfchen. Aber stattdessen ist es ziemlich klar. Andernfalls vollständiges Gleichgewicht in diesem Schritt erreicht wird, um die Bildung eines beträchtlichen Teil multilamellaren Vesikeln führen.
    3. Mischen der KvAP Protein mit dem Waschmittel mit gelöstem DOTAP oder Hunde in einem Protein: Lipid-Verhältnis von kleiner oder gleich 1:10. Das Protein / Detergens / Lipid-Mischung wird bei Raumtemperatur für 2-3 Stunden mit end-over-end Rotation inkubiert.

2.2. Die Entfernung der Reinigungsmittel zur Proteoliposomen bilden

  1. Dialyse --- langsames Entfernen der Waschmittel, wie z. B. DM und β-OG, die relativ hohe kritische Micellbildungskonzentrationen (CMC ≥ 1,0 mm) haben
    Bereiten 2-Liter Dialyse-Puffer (Tabelle 3) für jede 1,0 ml Mischung.
    Schneiden Sie eine geeignete Länge von Dialyseschlauch (MWCO = 10K; 0,70 cm breit), und waschen Sie es mit DI-Wasser. Es ist wichtig, zu überprüfen und zudarauf, dass kein Leck vorhanden ist in der Rohrleitung. Für Proben, wie könnte der Schlauch zuerst mit einem Puffer von 10 mM Tris-HCl pH 8,0 und 2,0 mM EDTA behandelt und dann in kochendem Wasser für 3-5 min gereinigt werden. Der Schlauch wird dann an einem Ende eingespannt und spült mit dem Dialyse-Puffer.
    Laden Sie die Protein-Lipid-Detergens-Mischung in einen Dialyseschlauch. Spannen beider Enden des Rohrs auf kleinstem Raum über der Lösung gelassen. Setzen Sie den geladenen Schlauch in die Dialyse-Puffer, und verwenden Sie einen Rühren Platte, so dass der Schlauch dreht sich langsam in Lösung. Ändern Sie den Dialysepuffer einmal 8 Stunden. Nach dem ersten Puffer Änderung sollte die Lösung trüb, wenn die Protein-Lipid-Detergens-Gemisch war völlig klar. Wenn die Dialyse zu schnell ist, kann es feste weiße Niederschlag an der Unterseite der Dialyseschlauch sein. Es wird empfohlen, dass zum Zeitpunkt der Änderung Puffer, der Schlauch gerieben werden sollte, und mehrere Male umgedreht. Nach fünf Änderungen Dialysepuffer sind die Vesikel idR.
    Wir überprüfen die Restmenge von Waschmitteln durch Erschießen die Vesikel auf die Lipid-Doppelschicht. Wenn es immer noch erhebliche Menge an Reinigungsmittel nach links, wird die Doppelschicht gebrochen fast augenblicklich. Es ist auch möglich, den Rest-Detergens durch kolorimetrische Methode oder die Messung der Oberflächenspannung der Vesikelsuspension messen.
  2. Verwendung von Polystyrol-Kügelchen zur Beseitigung von Reinigungsmitteln, die niedrige CMC haben
    In vielen Fällen haben wir niedrige CMC Waschmitteln, wie DDM (CMC ~ 0,17 mM in Wasser) zu verwenden. Beads mit winzigen Poren hydrophob werden verwendet, um diese zu entfernen Waschmittel 14.
    1. Herstellung der Perlen. Gewicht aus 0,5 g trockenen Kügelchen und legte sie in eine 50 ml Corning Rohr, mit 20 ml Methanol, beschallen die Lösung in einem Ultraschallbad für 5 min, um eingeschlossene Luftblasen zu entfernen, Spin-down die Perlen bei 5.000 rpm für 5 min, und dann Dekantieren meisten Methanol. Wiederholen Sie die Wäsche mit Ethanol und Wasser MilliQ. Die gewaschenen Kügelchen wurden in 20% Ethanol bei 4 ° C gelagert, undmüssen ein Wasch-freien Puffer vor der Verwendung verändert werden.
    2. Schätzen Sie die Menge von Waschmitteln in der Protein / Lipid / Detergensmischung behandelt zu werden, und die Berechnung der Menge von Perlen benötigt, um die Reinigungsmittel zu entfernen. Für DDM und DM, ist die Bindung Kapazität etwa 100 mg 10 mg Perlen für Waschmittel. Die feuchten Perlen ohne überschüssiges Wasser aus, gewogen und direkt an das Protein Mischung. Mindestens 15-20 min ist für die Perlen benötigt, um voll wirksam zu sein und die Abnahme von Detergenskonzentration einen Gleichgewichtszustand erreicht Stufe 14-16. Auf 8,7 mg DDM (Dodecylmaltosid) in 1,0 ml Lösung, entsprechend ~ 18 mm, insgesamt 87 mg von Polystyrol-Kügelchen, wie Bio-Beads SM2 zu entfernen, wird in fünf gleiche Teile verwendet. Mischen Sie die Protein / Lipid / Detergensmischung mit jeder Fraktion für 20-30 min mit konstanter end-over-end Rotation bei Raumtemperatur, Spin-down die Perlen, den Überstand auf den nächsten Teil der Perlen, und wiederholen Sie bis zum Ende.
      Wenn das Waschmittel konzentration erreicht seine CMC, wir absichtlich verlängern den Zeitraum für die bis zu einer Stunde, so dass die kleine Menge von Waschmitteln in der Lösung wird die Fusion von kleinen Bläschen in Großen erleichtern.
    3. Um die Spuren von Reinigungsmitteln nach dem letzten Schritt entfernen, fügen Sie 35 mg Bio-Rad SM2 Perlen und Inkubation mit den Vesikeln für 4 Stunden.
      Wenn die Verfahren für die Entfernung des Detergens oben beschrieben sind, zu einem neuen Protein angewendet werden, ist es in der Regel empfehlenswert, mit dem Protein / Lipid-Verhältnis (Gew. / Gew.) von ~ 1.10 starten. Das Lipid / Detergens-Mischung muss sorgfältig vorbereitet werden, damit genügend Reinigungsmittel zugesetzt werden, um vollständig zu lösen die Lipide (Abbildung 2A). Es ist wichtig, um die Lipid-Detergens-Mischung für mehr als 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren (mit 1-2 mM DTT) unter konstantem Schütteln (400 rpm) oder End-Over-End-Drehung. Wenn das Protein mit Lipiden gemischt wird, sollte die Protein / Lipid / Detergensmischung inkubiert lang genug sein (über Nacht, wenn das Protein STABLe) entweder bei Raumtemperatur oder in einem kalten Raum, so dass die Verteilung der Wasch-und Lipiden zwischen dem Protein enthaltenden Mizellen und proteinfreien Mizellen relativ gerade ist. Darüber hinaus, wenn schnell Entfernung von Waschmitteln mit BioBeads eingesetzt wird, ist es wichtig, herauszufinden, die Waschmittel-Bindungskapazität der Perlen. Die langsame Entfernung von Waschmitteln wahrscheinlich sorgt dafür, dass die Proteine ​​genügend Lipide haben, um ihre Integrität zu erhalten und werden eingeführt in relativ ansehnliche Vesikel.

2.3. Speicherung der Proteoliposom und die Qualitätskontrolle

  1. Sobald die Vesikel bereit sind, bereiten sie in 50 ul Aliquots und Flash-einfrieren Aliquots durch direkte Eintauchen in flüssigen Stickstoff. Die gefrorenen Vesikel werden dann in einem -80 ° C-Gefrierschrank gelagert. Für biochemische Assays, verwenden wir keine gefrorenen Vesikel, weil die Gefrier-Tau-Zyklus manchmal gefunden wurde, um Artefakte in unsere Cys-spezifische Reaktion einzuführen. Für elektrische Aufnahmes, verwenden wir nur Vesikel, die in -80 ° C für weniger als 6 Monate gespeichert werden.
  2. Floatation der Vesikel in einem Dichtegradienten (2B)
    1. Legen Sie 50 ul der Vesikelsuspension oben auf den Schichten des Saccharose-Gradienten mit 0,3 ml je 10, 35 und 55% Saccharose in 10 mM HEPES und Spin bei 200.000 g gemacht für 4 Stunden bei 4 ° C. Beschleunigen und abzubremsen langsam, um die Störung der Grenzfläche zwischen den Schichten zu vermeiden.
    2. Sammeln Sie 100 ul Fraktionen von oben nach unten und führen Sie sie auf einem nicht-reduzierenden SDS-PAGE (Abbildung 2B). Die KvAP ist gut mit dem Coomassie blau, so dass ein Band von 0,5 bis 1,0 Mikrogramm Protein deutlich sichtbar ist gefärbt. Die KvAP Protein sollte an der Schnittstelle zwischen 10 und 35% Saccharose ermittelt werden. Keine schwere Aggregate von Proteinen bei der hohen Dichte im Bereich gesehen, die anzeigt, dass fast alle Proteine ​​in den Membranen sind.
  3. Überprüfen Sie die richtige Konformation des KvAP Kanal in Vesikeln. <br /> Die bisherigen Daten ermittelt, dass eine einzige Cystein-Mutante (L125C/C247S) KvAP, wenn sie richtig in Doppelschichten integriert, vollständig in Membranen begraben und kann nicht durch Cystein-spezifische Reagenzien 8 zugegriffen werden kann. Die Rekonstitution Verfahren wurden mit dieser Mutante Kanal getestet und geprüft durch eine Cys-Reagenz, MTS-PEG5000. Die Modifikation bei L125C mit 1,0 uM MTS Reagenz bei Raumtemperatur führt eine 5 kDa Verschiebung nach KvAP Band in einer nicht reduzierenden SDS-PAGE-Gel. Die erfolgreiche Umsetzung unserer Rekonstitution Verfahren sollten zu keiner nachweisbaren Reaktion für die L125C mutierten Kanäle in Phospholipidmembranen führen, was fast vollständige Einführung aller Kanäle in Doppelschichten. Als positive Kontrolle der Reaktion wird 5,0 mM DM eingeführt, um fast alle L125C Rückstände in den mutierten Kanäle zugänglich MTS Reagenz machen.
    Alternativ kann ein Poren-bindenden Toxin, wie chrybdotoxin, verwendet werden, um die tetramere Kanäle zu zählen. Antikörper-Basis verbindlichsagen (siehe Kasten 2, wo Fv als konformationsspezifische Ligand für KvAP bereit ist) kann verwendet werden, um die verfügbaren Bindungsstellen in der rekonstituierten Vesikeln zu quantifizieren. Diese Bindungstests kann dann mit einem quantitativen Assay die Messung der Gesamt-Protein verglichen werden, um herauszufinden, welcher Anteil der rekonstituierten Kanäle Tetrameren und welcher Anteil des Proteins hat die Spannung-Sensor Paddel (S3/S4 des Spannungssensors) richtig sind gefaltet.
    Für andere Proteine ​​rekonstituiert werden, ist es ratsam, eine quantitative Methode zu bewerten, was Bruchteil der rekonstituierten Proteine ​​korrekt gefaltet einzuführen. Sorgfältige funktionelle Untersuchung ist somit eine Voraussetzung für die Entwicklung einer guten Qualitätskontrolle für eine erfolgreiche Wiederherstellung.

3. Anwendungen der rekonstituierten Kanal-haltige Vesikel

3.1. Funktionelle Untersuchung der Ionenkanal-Aktivitäten in schwarz Lipidmembranen.

Herstellung von needed Materialien.

  1. Lipid Vorbereitung
    1. Reinigen Sie ein Glas Reagenzglas, eine bernsteinfarbene Flasche mit Teflon-beschichtete Schraubverschluss, und einen Satz von Glas Spritzen mit Chloroform. Trocknen Sie die Bernsteinfläschchen unter einem Strom von Argon-Gas.
    2. Übertragen 0,75 mg und 0,25 mg PAPST POPG in Chloroform in die Bernsteinfläschchen und dampft das Chloroform mit dem Edelgas Argon.
    3. Waschen Sie die getrockneten Lipide mit 0,20 ml Pentan und vollständig trocknen, um das restliche Chloroform zu entfernen. Schließlich lösen sich die Lipide in 50 ul Dekan. Die Lipide in Decan (20 mg / ml) wird zum Lackieren eines Lipid-Doppelschicht in einem 150-250 Mikron Loch (3B) in dem verdünnten Abschnitt an einer Seite einer experimentellen Doppelschicht Tasse (3A) gebohrt werden.
  2. Lösung Vorbereitung
    1. Intrazelluläre Lösung (trans): 10 mM HEPES / KOH, pH 7,4, 15 mM KCl
    2. Extrazelluläre Lösung (cis): 10 mM HEPES / KOH, pH 7,4, 150 mM KCl
    3. Salzbrücke: Schlaufe Glaskapillarenin U-förmigen Brücken, und füllen sie mit 1,0% in geschmolzenem Agar extrazellulären Lösung gelöst.
      Die osmotischen Gradienten zwischen den trans-und cis-Lösungen etabliert wurde festgestellt, dass die wichtigste treibende Kraft für Vesikelfusion auf die Lipid-Doppelschicht 17 sein. Für negativ geladene Lipide, 15 mM CaCl 2 oder positiv geladenen Poly-Arginin Peptide gefunden wird in der Lage sein Fusionsereignissen induzieren. Fusogene Lipide wie DOTAP und DOGS, etc, könnte in die Lipid-Vesikel eingeführt werden, so dass die Chance, Fusion Ereignissen höher ist.

Elektrische Aufnahmen von KvAP Kanäle in Lipid-Doppelschichten

  1. Pre-malen das runde Loch (Durchmesser ~ 0,25 mm), die an der zylindrischen Oberfläche der Doppelschicht Tasse (3B) gebohrt wird. Die Lipide werden mit einer Kapillare, der Stößel im Labor hergestellt übertragen. Der runde Kopf der Kapillare Stößel ist poliert und nicht an der Oberfläche kratzen der Tasse. The kleine Menge von Lipiden durch die Kapillare Stößel getragen wird, um das Loch in der Doppelschicht Schale verteilt und an der Luft getrocknet.
  2. Warten Sie 1-2 Minuten, so dass der Dekan vollständig verdampfen. Es sollte darauf geachtet, um die Lipid-Lösung ab, in das Loch zu vermeiden.
  3. Legen Sie die Tasse in die Aufnahme Kammer, und legte in den Salz Brücken und die Elektroden an den beiden Seiten der Aufnahme cup (Abbildung 4A). In dem cis-und trans-Lösung zu den beiden Seiten der Bohrung. Ein osmotischer Gradient hergestellt wird, um die Fusion der Vesikel in der Lipid-Doppelschicht zu erleichtern.
  4. Stellen Sie die Spannung zwischen beiden Seiten der Schale zu ~ 0 (in der Regel <2 Millivolt) ausgeglichen. Verwenden Sie die Kapillare Stößel um eine kleine Menge von Lipid-Gemisch in Dekan zu übertragen, und malen Sie die Lipid über das Loch, bis ein Bilayermembran Formen. Die Bildung der Doppelschicht wird durch die Erfassung der aktuellen Kapazität während der Abgabe einer Rampe Impuls detektiert.
  5. Warten Sie, bis die Membranlichtet sich und wird relativ stabil. Wir warten, bis es keine weitere Veränderung in der Membran Kapazität für 3-5 min.
    Die allgemeinen Gedanken über die planare Doppelschicht über eine große Öffnung ausgebildet ist, dass die sehr Mittelabschnitt der Membran in der Nähe von ~ 4,0 nm dick wie eine regelmäßige Doppelschicht sein soll, und die Membran dicker, wenn es nahe an den Rand des Loches kommt, wo es einen Ring um und die meisten der decan Lösungsmittel 18, 19. Es ist unvermeidlich, dass es einen bleibenden decan in dem zentralen Abschnitt der Doppelschicht der Membran verlassen. Letzten Schätzung des Volumenverhältnis von n-Decan im Vergleich zu PC war 0,35-0,45 nach der Verdünnung der Doppelschicht 18, 20-22. EM Prüfung des ausgedünnten Doppelschicht zeigten, dass es Linsen Decan zwischen den beiden Broschüren einer Doppelschicht 22 eingeklemmt. Diese Daten deuten darauf hin, dass die Membranproteine ​​in die Lipid-Doppelschicht-Membranen eingesetzt werden, mit kleinen Inseln (bis zu 50 nm Durchmesser) Decan koexistieren. Die restliche Decan in die Doppelschicht verringert auch die elektrische Leistung konstant 0,4-0,5 uF / cm 2, die verwendet werden, um eine grobe Schätzung der Größe des verdünnten Doppelschicht auf der Basis der gemessenen Kapazität erhalten werden kann. Eine Doppelschicht aus 100 pF Kapazität stammt aus einer kreisförmigen Bilayermembran von ~ 180 um im Durchmesser.
    Für KvAP hat der Rest decan nicht beeinträchtigen seine Spannung-Gating, obwohl der Kanal Funktion nicht wurde sorgfältig in einem lösungsmittelfreien Doppelschicht untersucht. Das gleiche zu sein schien für die NaChBac Kanäle und die Kanäle Kv1.2 in die BLMs 23 eingeführt wahr. Es ist noch unklar, ob die signifikante Linksverschiebung der GV-Kurve aus den Kv1.2 Kanäle in der Dekan-Lipid-Doppelschicht gegenüber Kanäle in Oozyten gemessen nichts mit dem Rest-Decan 23 zu tun hat. Je nach der Lipide bei der Bildung der Doppelschichten verwendet, kann die Menge der restlichen Dekan in der Doppelschicht variieren. Zum Beispiel wurde berichtet, dass die Bildung von planaren Lipid membranes von MGDG (mono-Galactosyltransferase Diacylglycerol) bedarf der Dekan, die möglicherweise durch die Ritzen zwischen den konischen MGDG mit Dekan Molekülen gefüllt. Ob das restliche decan hat Auswirkungen auf die zu untersuchenden Proteine ​​ist rein empirisch und die experimentellen Tests erforderlich ist zu sagen, ob der Effekt signifikant ist oder nicht.
  6. Sobald die Membran stabil wird, schießen 0,5-1,0 ul Kanal-enthaltenden Vesikeln, indem das feine Ende eines P2-Pipettenspitze direkt über dem Loch. Die Vesikel fallen in das Loch an der Unterseite des Bechers.
    Dabei werden mehrere Vesikel befestigt, um die Membran über der Öffnung. Mit genügend Zeit, einige in die Doppelschicht Abschnitt, so dass eine kleine Anzahl von Kanälen KvAP ordnungsgemäß in die planare Doppelschicht in dem mittleren Teil der Membran eingefügt fusioniert. Sowohl osmotischen Gradienten und elektrostatische Wechselwirkungen sind in der Fusion der Vesikel in die Lipid-Doppelschichten 17, 24 wichtig.
  7. Um zu testen,die KvAP Kanäle in der Doppelschicht ist ein kurzer Impuls von 80 mV vom Haltepotential von -80 mV geliefert. Aufgrund der schnellen Inaktivierung und langsame Erholung von der Inaktivierung, ein langes Intervall (~ 120 sec für die Kanäle in PE / PG Membranen) zwischen zwei Impulsen gegeben. Eine typische aktuelle Aufnahme aus den Kanälen in einem Papst / POPG Membran ist in 3C gezeigt. Wenn der Strom klein ist, schießen mehr Bläschen. Sobald der aktuelle schaut in Größe, das Gleichgewicht der Ionen in den Lösungen auf beiden Seiten der Membran. Die Kanäle sind bereit für elektrophysiologische Experimente.

3.2. Screening für Exterieur-spezifischen Liganden gegen Kanäle in Vesikeln

  1. Einführung des Phagen-Bibliothek angezeigt.
    Die Phagen präsentierten 20-mer-Peptid-Bibliothek ist am N-Terminus der fünf Kopien von pIII-Proteine ​​an einem Ende des filamentösen Bakteriophagen fd-tet-25. Die Bibliothek präsentiert ca.. 1 x 10 8 unterscheidenent Arten von zufälligen 20-mer-Peptid-Sequenzen, und wurde uns freundlicherweise von Dr. Kathlynn Browns Labor am UT Southwestern Medical Center 26 vorgesehen. Die Phagen-Infektion in den E. coli K91 macht die Bakterien resistent bis 12 pg / ml Tetracyclin.
    Ein detailliertes Verfahren für die Bakterienkultur wurde die Amplifikation und Titerung der Phagen und der Sequenzierung des Phagen Kolonien von McGuire et al. Beschrieben worden 26 Wir werden eine kurze Beschreibung der grundlegenden Vorgänge im nächsten Abschnitt geben. Die Leser finden weitere Informationen auf der McGuire Papier. Wir werden stattdessen auf die Isolierung spezifischer Klone, die fest zu binden, um die Ionenkanäle rekonstituiert in Vesikel (4A) zu konzentrieren.
    Die Grundidee hinter unserem Bildschirm ist, dass die Phagen gebunden an die rekonstituierten Kanäle speziell nach unten kann mit den Vesikeln gezogen werden. Die gebundenen Phagen können verstärkt und an den Kanälen in Lipid-Membranen getestet werden. Unsere Studie vondie Konformationsänderungen KvAP Spannungssensoren in verschiedenen Lipidmembranen 8 zeigte, dass es möglich ist, die Spannungssensoren entweder im "aktivierten" oder "Ruhe"-Zustände zu halten durch Umschalten der Lipide aus regelmäßigen Phospholipide zu denen, die keine Phosphate in der Kopfgruppe Regionen (DOTAP und Hunden in unseren Experimenten). Diese beiden Lipid festgelegten Konformationen sind in unserem Screening-Konformation spezifischen Liganden genutzt. Die Phagen-Bibliothek wird zunächst durch die Kanäle in den Phospholipid-Vesikel (negative Selektion), bevor sie auf festen Bindemittel zu den Kanälen in DOTAP und Hunde Membranen (positive Selektion) ausgewählt gesättigt.
  2. Basic-Prozeduren hinter dem Phagen Auswahl
    Wachstum von K91 Bakterien in LB-Medium: Die Verdopplungszeit der Bakterien ungefähr 20 Minuten bei 37 ° C mit 200 rpm geschüttelt.
    Verstärkung der Bibliothek: Mischen Sie die Lösung mit dem Phagen-Bakterien K91 bei OD0.4. Nach 15 min Inkubation bei 37° C werden die Mischungen gleichmäßig auf -9.5 x 9.5 inch 2 Agarplatten mit 12 ug / ml Tetracyclin verteilt, verhindert die Verwendung von großen Platten, die Dominanz der Kultur durch Bakterien, die ein höheres Wachstum-Rate haben. Sobald die Diversität der Bibliothek kleiner ist, sind 10 cm Petrischalen für Auswahl und kleine Amplifikation verwendet.
    Groß angelegte Verstärkung der einzelnen Klone: ​​Impfen eine kleine Teilmenge von Phagen (~ 100 Millionen) in 250 ml LB + 5 mM MgSO 4 und 12 ug / ml Tetracyclin, wachsen über Nacht bei 37 ° C. Sammeln Zellen durch 6.000 rpm Spin für 10 min. Sammeln Sie den Überstand und fügen Sie es in 0,2 vol / vol der Fällung Puffer (2,5 M NaCl, 20% PEG8000). Nach Inkubation auf Eis für 1,0 h, zentrifugiert die Lösung bei 17.000 xg für 30 min zur Pelletierung allen Phagen. Entfernen Sie alle Überstand 1,0 ml PBS, auf Eis für 30 min inkubieren, sanft das Pellet (kein Vortex). Übertragen Sie die Suspension in ein frisches Röhrchen und zentrifugieren bei 14,000 rpm für 2 min. Den Überstand in ein anderes Röhrchen und Inkubation in 65 ° C Wasserbad für 15 min, um alle Bakterien abzutöten. Das Röhrchen für 2 min bei 13.000 Umdrehungen pro Minute. Entsorgen Sie die Pellet Aliquot und speichern Sie die Phagen-Lösung bei -80 ° C
  3. Schwenk der Phagen gegen KvAP Kanäle in Lipid-Vesikel.
    1. Die Peptid-präsentierenden Phagen müssen verstärkt und titriert vor unseren Experimenten so dass die Anzahl der Phagen pro Volumen bekannt ist. KvAP wurde in Papst / POPG (3:1) zzgl. 0,50% Biotin-DOPE Vesikel als negative Kontrolle und in DOGS rekonstituiert: Biotin-DOPE (199:1; gleiche galt für DOTAP Vesikel getan) als Auswahl-Target verwendet. Die Endkonzentration KvAP in Vesikeln 0,50 mg / ml, und die Lipide 5,0 mg / ml. Die Schwenkfunktion Puffer enthielt 500 mM KCl, 100 mM HEPES / KOH pH 7,4 und 0,10 mg / ml BSA.
      Zum ersten Lauf wurden ~ 10 10 Phagen (100 Kopien für jeden Typ) bis 0,050 ml LB-Medium verdünnt. Für die nachfolgenden Schritte Panning, der starting Phagen wurde eingestellt, um im 6. Oktober-8. Oktober sein.
    2. Negative Auswahl:
      Inkubation der verdünnten Phagen in 50 ul LB mit 100 ul NeutrAvidin Agarosekügelchen (binden 1-2 mg biotinylierten BSA pro ml Harz; Pierce) in 1,0 ml Puffer Panning. Nach 10 min Inkubation, trennen Sie die Perlen durch Spinnen sie bei 100 xg für 1,0 min. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal, um alle Phagen, die direkte Bindung an die Beads zu entfernen.
      Mischen Sie die links-over Phagen aus dem vorherigen Schritt mit 50 ul leeren Vesikel (Papst / POPG plus 0,5% Biotin-DOPE), die keine Proteine ​​enthalten. 100 l NeutrAvidin Beads, die mit dem Panning Puffer auf die Phagen-Vesikel Mischung gewaschen wurden. Nach dem Drehen des Gemisches bei Raumtemperatur für 5 min, entfernen Sie die Perlen von 100 xg für 30 sec Spin. Biotin-DOPE (199:1) sowie für KvAP Kanäle in PAPST / POPG Vesikel (mit 0,5% Biotin-DOPE): Dieser Schritt ist für leere Vesikel DOGS wiederholt. Der Überstand nach diesen Behandlungen contains die Phagen vollständig gelöscht. Nach den ersten beiden Zyklen Bildschirm könnte die PrePass nur gegen KvAP durchgeführt werden, PAPST / POPG Vesikel.
    3. Positive Selektion
      Inkubieren Sie die komplett gelöscht Phagen mit KvAP Kanäle in DOGS: Biotin-DOPE (199:1) Vesikel (das gleiche für die DOTAP Vesikel) in Gegenwart von 100 ul NeutrAvidin Perlen bei Raumtemperatur für 10 min. Bringen Sie das Volumen der Mischung auf 15 ml mit dem Panning-Puffer vor der Zentrifugation bei 100 g für 10 min. Sammeln Sie die Perlen, und waschen Sie sie dreimal mit 45 ml Puffer Panning.
    4. Dynabeads in 500 ul LB-Medium mit 5,0 g / ml Biotin und Inkubieren der Mischung bei Raumtemperatur für zwei Stunden, um einen Teil des gebundenen Phagen aus NeutrAvidin, die eine geringere Affinität als das native Biotin hat freizugeben. Trennen Sie die Perlen von 100 xg Spin für eine Minute. Sammeln Sie den Überstand und die Perlen in zwei verschiedene Röhren für Titerung.
    5. Um die ausgewählten Phagen m verstärkenix 200 ul des Überstandes oder der resuspendierten Perlen im letzten Schritt mit 500 ul K91 Bakterienkultur (OD600 ~ 0,4-0,6, kultivierten ~ 4 Stunden, bevor es verwendet wird). Nach Inkubation bei 37 ° C für 15 min, Platte 50 ul jeweils auf Tetracyclin-Platten für Übernacht-Kultur.
      Während der ersten beiden Zyklen Bildschirm (4A), sammeln Sie alle 500 ul Überstand und die Perlen aus dem letzten Schritt, mischen sie mit dem 5 ml Bakterienkultur und Platte sie in 9,5 Zoll quadratischen Platten, um sich zu erholen und verstärken alle Phagen Kolonien . Dieser Schritt ist für die Wiederherstellung dieser Phagen, die die Bakterien langsamer wachsen als andere wichtig.
    6. Die Kolonien von den Platten verstärkt werden und vor dem nächsten Zyklus des Schwenk-und Auswahl (siehe McGuire et al., 26) titriert.
    7. Untersuchen Sie die Aktivitäten der positiv selektierten Phagen auf den Kanälen.
      Nach 10-12 Zyklen von Selektion, testen Sie die insgesamt verstärkt auf den Phagen KvAP Kanäle in Lipid Bilayers aus PAPST / POPG. Wenn ein signifikanter Anteil von positiven Klonen, sollten die ausgewählten Phagen bei 100-500 nM einen erheblichen Teil der Kanäle in der Doppelschicht zu blockieren (4B) wie gegen Kanäle im Ruhezustand stabilisiert wurden Auswahl. Die positiven Daten legen nahe, dass es Klone, die eine starke Bindung an den Kanälen im Ruhezustand zeigt. Nach 16 Zyklen von Selektion, Abholung 50 positive Kolonien für Single-Kolonie-Sequenzierung. Die identifizierten dominierenden Phagen-Klone werden aus dem Vergleich der Sequenzen ausgewählt ist, und verstärkt und getestet gegen Kanäle in Doppelschichten. Sobald die positiven Klone bestätigt werden, synthetisieren die Peptide durch die starken positiven Klone durchgeführt und testen sie auf den Kanälen sowie ihre konformationsspezifische Aktivitäten bestätigen.

3.3. Kristallisation von KvAP Kanäle in Membranen zur Strukturbestimmung 27-29

  1. Um die Konformation stabilisierender Kanal eine konformationsspezifische Bindemittel des Kanals, 33H1 Fv Protein, wird die KvAP / Fv-Komplex zu bilden. Die Herstellung des Fv Protein wird in Kasten 2 aufgeführt. Reinigen des Komplexes in einer Superdex 200-Säule. Der Komplex eluiert bei rund 11,4 ml in unserem System.
  2. Für den ersten Bildschirm, mischen das Protein mit DMPC oder POPC, die vollständig in DM oder β-OG ist gelöst. Das Protein / Lipid / Detergens-Mischung für mehr als 15 Stunden gemischt, um ein thermodynamisches Gleichgewicht in der Verteilung der drei Komponenten, die auf gemischte Mizellen zu erreichen. Normalerweise haben wir erst einmal testen drei verschiedene Lipid / Protein-Verhältnissen (LPR = 0.5, 1.5, 2.5) und drei unterschiedlichen pH-Werten (6.0, 7.0 und 8.0). Die Dialyse-Puffer enthält 20 mM K-Phosphat-Puffer, 100 mM KCl und 3,0 mM NaN3. Die Dialyse-Puffer wird jeder geänderte 2-3 Tage. Ein kleines Aliquot der Kristalle werden alle 2-3 Tage, um die Bildung von Vesikeln und die mögliche Auftreten von Kristallgitter zu untersuchen.
    Eine Boulevardzeitung Listevon LPR vs pH wird verwendet, um das Verhalten des Proteins in den beiden verschiedenen Arten von Lipiden zu bestimmen. Wir wollen relativ großformatige (mehr als 150 nm) oder Vesikel Membran Blatt zu erhalten, wenn die Dialyse Proben durch Negativ-Fleck EM untersucht. Ein kleiner regelmäßigen Muster in Membranen schlägt einen Hit und wird zur weiteren Optimierung zu führen.
    Negative-Fleck EM: Kupfer Raster mit Kohlenstoffschichten (~ 3-5 nm dick) beschichtet sind, glow-in Luft abgelassen, um die Kohlenstoff-Oberfläche hydrophil. Ein kleines Volumen (2-3 Mikroliter) der Kristalle Suspension wird auf der Carbon-Oberfläche geladen, gewaschen und für 0,5-1,0 min. Tupfen Sie die Gitter von der Seite mit einer Abrisskante von einem Stück Whatman Nr. 4 Filterpapier. Klappen Sie den Netz-und bebrüten sie für ~ 15 sec auf der Oberseite eines Tropfens 150 Mikroliter Färbelösung (2,0% PTA / KOH, pH 8,0 in Wasser plus 0,5% Trehalose, oder 6,0% Ammoniummolybdat / KOH, pH6.3-6.5 , in Wasser sowie 0,5-1,0% Trehalose). Tupfen Sie so viel wie möglich für die Lösung von ter Raster Oberfläche und ermöglichen das Gitter vor dem Einfügen in einem TEM zur Untersuchung trocknen. Bilder von Vesikeln unter niedrig dosiertem Zustand getroffen, um die Schäden irgendwelcher kristalline Packung von den Elektronen zu vermeiden.
  3. Der Bildschirm wird dann erweitert, um kleinere Schritte von LPR zu untersuchen, um eine korrekte LPR erreichen. Wenn die Proteine ​​für die Kristallisation geeignet sind, kann eine kleine Gitter von Proteinen in Membranen sichtbar. Um diese Randbedingungen, eine weitere Optimierung der Kristallisation durch Variation der Salz Arten und Konzentrationen, die Temperatur, die Geschwindigkeit und die Methoden der Entfernung des Detergens, divalente Kationen, Detergenzien verwendet werden, um die Proteine ​​vorzubereiten, Fällungsmittel, Lipide Zusammensetzung usw.
    Die optimierte 2D-Kristallen von KvAPΔ36/Fv Komplexes in großen Bögen, dass Bereich wachsen von einigen Mikrometern bis zu 20-30 Mikron (5A). Unter Kryo-EM Bedingungen zeigen die Kristalle klar quadratischen Gitter mit offensichtlichen Vierfachsymmetrie ab dem vierfach symmetrischen chan erwartetKanäle (Fig. 5B und C).

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Representative Results

Der allgemeine Ablauf der Versuche zur Reinigung des KvAP Kanal in biochemischen Homogenität ist in 1A beschrieben. Typische Proben, die während der Expression und Reinigung des Proteins wird in der SDS-PAGE-Gel in 1B gezeigt. Das Protein nach der IMAC Reinigung relativ rein ist. Die Ausbeute des KvAP Kanal ist etwa 1,0 mg / Liter Kultur.

Solubilisierung von Lipidvesikeln mit Detergenzien muss für jedes Paar von Lipid gegen Reinigungsmittel eingearbeitet werden. Die Solubilisierung von kleinen einschichtigen Vesikeln von Papst / PAPST von DM in 2A dargestellt, sind die Ergebnisse aus dem Vesikel Flotation in der Regel recht einfach. Typische Ergebnisse in der SDS-PAGE-Assay der Fraktionen aus den Gradienten in 2B gezeigt. Im Saccharosedichtegradienten, die Kanal-haltigen PAPST / POPG Vesikel sind in der Regel an der Schnittstelle zwischen dem 10% einer Schicht konzentriertd 35% der Schicht. Die KvAP enthaltende DOTAP oder DOGS Vesikel sind leichter und in der Regel an der Grenzfläche zwischen 5% und 10% (in etwas 10% durchdrungen). Wenn es eine signifikante Fraktion von multilamellaren Vesikeln, sie sind in der Regel weißlich und konzentrierte 10-35% unterhalb der Oberfläche. Wir fanden, dass dies in der Regel, wenn das Protein-Detergens-Lipid-Mischung inkubiert nicht lang genug, um eine gute Verteilung der Lipide zu erreichen.

Elektrische Aufnahmen von KvAP Kanäle in planaren Lipiddoppelschichten eingebaut sind in Abbildung 3 dargestellt. Der typische aktuelle Trace zeigt, dass bei -80 mV, die Kanäle ruhig. Umschalten auf +80 mV führt zu einer schnellen Kapazität Spitze (die Scharfe zum Zeitpunkt der Voltage-Switching). Ein langsamer ansteigenden Phase des Stroms zeigt, dass die Kanäle aktiv werden und sind in der Lage, nach außen Kalium Strom zu leiten. Nach dem Höhepunkt der ansteigenden Phase beginnt der Strom zu verringern, einen Schritt genannt Inaktivierung. Die inactivation dauert nur wenige hundert Millisekunden dauern. Sobald die Spannung wieder auf -80 mV geschaltet, gibt es eine Phase nach der Rückkehr nach unten Kapazität Peak, der das Schließen der offenen Kanäle reflektiert und wird als das Deaktivierungssignal (3C).

In der Mitte des Phagen Bildschirm, testeten wir die Aktivität der Phagen verstärkt auf den KvAP Kanäle in den Doppelschichten der Papst / POPG. Nach 12 Zyklen Auswahl hemmte die verstärkten Phagen die Channel-Aktivitäten (4B, ausgewählte Phagen). Aber der Ausgangspunkt Phagen-Bibliothek angezeigt zeigten keine Wirkung auf den Kanälen (4B, Kontrolle Phagen). Auch wenn die Aktivitäten der ausgewählten Phagen waren nicht sehr hoch, da nur eine geringe Konzentration der positiven Phagen waren um die klare, reproduzierbare Effekte vorgeschlagen, dass es aktive, positive Klone, die High-Affinität aufweisen, sollten selektiv während die angereichert werden restlichen Screening cyzeuge und einmal bereichert, nicht selten auf starke hemmende Wirkung auf den Kanälen in Membranen haben.

In der frühen Phase der Durchmusterung der 2D-Kristallen, sahen wir kleine Gitter in viele kleine Bläschen. Mit Optimierung zeigten einige große Blätter mit vielen kleinen Bläschen rund (5A). Die Kryo-EM-Bilder dieser Kristalle zeigte stets eine Menge von lokalen Defekten (5B), was darauf hindeutet, dass eine weitere Optimierung erforderlich ist, um eine bessere Kristalle zu erhalten. Sobald die Kristalle gut optimiert wurden, zeigten sie scharfe Kanten, und erschien als Einzelblätter. Bei hoher Vergrößerung werden die einzelnen Einheiten eindeutig viel besser bestellt (5C).

Name des Reagenz / Material Gesellschaft Katalog-Zahl Kommentare
Tryptone RPI Corp T60060
Hefeextrakt RPI Corp Y20020
NaCl Fischer S271-3
Tris-Base RPI Corp T60040
Kaliumchlorid Fischer BP366-500
n-Dodecyl-β-D-Maltosid Affymetrix D322S Sol-grade
n-Octyl-β-D-Glucoside Affymetrix O311 Ana-grade
Aprotinin RPI Corp A20550-0.05
Leupeptin RPI Corp L22035-0.025
Pepstatin A RPI Corp P30100-0.025
PMSF P7626
DNase I Roche 13407000
Bio-Korn-SM-2 Bio-Rad 152-3920
HEPES RPI Corp H75030
PAPST Avanti Polar Lipids 850757C
POPG Avanti Polar Lipids 840457C
HUNDE Avanti Polar Lipids 870314C
DMPC Avanti Polar Lipids 850345C
Biotin-DOPE Avanti Polar Lipids 870282C
DOTAP Avanti Polar Lipids 890890C
NeutrAvidin agarose Perlen Piercenet 29200
Dialyseschlauch Spectrum Laboratories, Inc 132-570
Pentan Fischer R399-1
Decane TCI America D0011
MTS-PEG5000 Toronto Research Chemicals M266501

Tabelle 1. Liste von Reagenzien und Materialien.

  • Bakterienkultur Schüttelinkubator
  • Spektralphotometer
  • Micro-Ultraschallsonde
  • Rocker
  • Fußboden-Modell Zentrifuge zum Sammeln Bakterienkultur und zur Konzentration Proben
  • Leere Spalten
  • Superdex 200 Säule mit einem FPLC-System angeschlossen

Tabelle 2. Benötigte Ausrüstung.

Buffer Namen Inhalt
IMAC Lysepuffer 50 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCl
IMAC Waschpuffer 50 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCl und 5,0 mM DM
IMAC Elutionspuffer 50 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCl, 5,0 mM DM und 300 mM Imidazol
SDS-Probenpuffer (5X) (reduzierenden) 60 mM Tris-HCl (pH 6,8), 25% Glycerin, 2,0% SDS, 0,10% Bromphenolblau. (1,0% 2-Mercaptoethanol zugegeben, um die Verringerung der Puffer zu machen).
Stacking-Gel für die SDS-PAGE (4X) 0,50 M Tris-HCl (pH 6,8), 0,40% SDS
Auflösung Gel für die SDS-PAGE (4x) 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8), 0,40% SDS
FPLC Gleichgewichtrationieren 20 mM Tris pH 8,0, 100 mM KCl und 5,0 mM DM
Liposomen Dialyse 10 mM HEPES, 100 mM KCl

Tabelle 3. Buffer Name und Inhalt.

Abbildung 1
Abbildung 1. Herstellung von KvAP zum Auflösen. A. Allgemeine Arbeitsablauf der Proteinexpression, Reinigung und Rekonstitution. B. Biochemische Reinigung des Proteins. Induzierten Kultur von E. coli XL1-blue Ausdruck KvAP wurde verarbeitet und KvAP gereinigt. Zwanzig Mikroliter Zellkulturen vor (Spur 1) oder nach (Spur 2) Induktion, das Waschmittel Extrakt (Spur 3), Flow-Through von IMAC-Chromatographie (Bahn 4), zwei Waschschritten (Spuren 5,6) und 5,0 ug Gesamt- Protein nach dem300 mM Imidazol eluiert (Spur 7) und 5,0 ug des KvAP Tetramer von der Größe FPLC (Spur 8), die auf nicht-reduzierenden 12% SDS-PAGE und Coomassie-Blau-Färbung unterworfen.

Abbildung 2
Abbildung 2. Rekonstitution KvAP in PAPST / POPG Vesikel. A. Vesikelfusion und Solubilisierung in Abhängigkeit von Detergenzkonzentrationen. Die Absorption bei 410 nm wurde verwendet, um die Lichtstreuung von Vesikeln (Ausgangswert subtrahiert wird, um kein Reinigungsmittel Fraktion) zu überwachen. Lipide (Papst / POPG 3:1) waren 10 mg / ml. Die kleinen einschichtigen Vesikeln nach starker Beschallung wird monodispergiert und hat schwache Streuung aufgrund ihrer Größe von 30-50 nm im Durchmesser. Wenn die Waschmittel eingeführt wurden, sie zwischen Phase und Lösung der Lipidmembran Phase verteilt. Aufgrund der starken Krümmung in den kleinen einschichtigen Vesikeln, die eingeführte Waschmittel Trigger Vesikelfusion und die Freisetzung der Krümmung (also die geringe Oberfläche potentielle Energie). Die fusionierten Vesikel sind größer und zeigen stärkere Streuung bei 410 nm. Die steigende Phase der Spitze (graue Fläche) spiegelt daher die Waschmittel-induzierte Fusion, eine gute Regelung für Protein Mizellen Fusion der Vesikel. Die Konzentration des Waschmittels (DM hier als Beispiel) direkt an der Absorptions-Peak war in der Tat für unsere Rekonstitutionsprozess gewählt. B. Fünfzig Mikroliter rekonstituierten KvAP Vesikel (KvAP 0,5 mg / ml) wurde durch Saccharose-Dichtegradienten getrennt. Proben von 100 ul Fraktionen von oben nach unten (1 ~ 9) der Saccharose-Gradienten wurden in einem 12% SDS-PAGE untersucht. Das Gel wurde mit Coomassie-Blau gefärbt. Lane 3 enthaltenen ~ 2 ug KvAP.

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Abbildung 3. Elektrische Aktivität KvAP Kanal in Doppelschichten rekonstituierten. A. Aufnahme Aufbau in einem Faraday-Käfig, 1, zwei Elektroden, 2, trans-Seite, 3, cis-Seite, 4;. Salzbrücke B. vergrößerten Bereich des verdünnten Abschnitt an einer Seite der Doppelschicht Schale, die eine Öffnung 5 , welches zur Herstellung von Membranen verwendet. C. elektrische Aktivität KvAP Kanäle, die in den schwarzen Lipidmembran fusioniert wurden aufgezeichnet. Während er bei -80 mV gehalten wurde das Membranpotential bis 80 mV für 150 ms gepulst, und dann zurück in die Haltepotenzial geändert. Der Ionenstrom in der Voltage-Clamp-Modus unter Verwendung eines Axopatch 200B Verstärkers erfasst.

Fig. 4
Abbildung 4. Screening für conformation-spezifischen Liganden aus einer Phagendisplay-Bibliothek. A. Schema hinter der Abschirmung gegen Ionenkanäle rekonstituiert in Vesikel. Die Vesikel werden mit Biotin-DOPE dotiert, und sie können aus der Lösung herausgezogen werden NeutrAvidin Perlen. Die Konformation der KvAP Kanal wird durch spezifische Lipide gesteuert. Negative Auswahl gegen Perlen, leere Vesikel und Vesikel mit Kanälen in einer anderen Konformation sind fertig, bevor die Phagen mit den Kanälen in der Ziel-Konformation (in DOTAP oder DOGS hier als Beispiel) bebrütet werden. Die ausgewählten Phagen verstärkt und gegen Kanäle in Doppelschichten getestet werden. B. Prüfung der ausgewählten Phagen in der Mitte des Bildschirms. Elektrische Aktivität KvAP in der Doppelschicht zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Zugabe der ausgewählten Phagen: schwarz trace - vor der Zugabe, gelbe Kurve - 2 min nach; rote Kurve - 10 min nach der Zugabe Top: Der Ausgangspunkt Phagen-Bibliothek (gesamt. ~ 10 10 Phagen hinzugefügtdie Doppelschicht) auf Kanälen in Doppelschicht getestet und zeigte keinen nachweisbaren Aktivität haben, weil jede Phagenclon nur etwa 100 Kopien. Unten: Nach 12 Selektionsrunden wurden die Phagen noch ein Gemisch aus verschiedenen Klonen. Hinzufügen etwa 10 10 Phagen zu den Kanälen in der Doppelschicht führen zu der klaren Hemmung der Kanal-Aktivität, was darauf hindeutet, dass es positive Klone, die eine hohe Affinität haben sollte. Klicke hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Abbildung 5
Abbildung 5. Zweidimensionale Kristallisation KvAP in Membranen. A. Bild von negativ gefärbten einlagig 2D-Kristallen in der Mitte des Kristalls Optimierung. Die Kristalle wurden mit 6,0% igem gefärbtMolybdat, pH 6,4 sowie 0,50% Trehalose. Aufgrund der Zucker, manchmal aufgestapelt miteinander. Die schwarze quadratische Box bezeichnet einen Bereich, der zur Entstehung des Beugungsmusters auf der rechten Seite mit Beugungsflecken werde ~ 20 a gezeigt. B. Kryo-EM-Bild eines 2D-Kristall aus einer Probe, ähnlich dem in (A) verwendet. Die Probe wurde mit 3% Trehalose gemischt und durch direktes Eintauchen eingefroren und unter einem Kryo-EM abgebildet. Das Bild wurde bei 50.000 x erhalten. Es war klar, dass es lokale Defekte im Kristall Verpackung. C. Kryo-EM-Bild von einer weiter optimierten Kristall. Die Probe wurde in 0,75% Tannin und 10% Trehalose eingebettet und das Bild aufgenommen wurde bei 50.000 X. Die geraden Linien und die dichte Packung vorgeschlagen, dass die Kanäle und wurden in dieser Art von Kristallen bestellt. Die beiden schwarzen Pfeile markieren die quadratischen Gitter.

Boxen:

Box 1. Vorbereitung der IMAC-Säule

  1. Resuspendieren IMAC Resin gründlich.
  2. Sofort in die erforderliche Menge des Harzes in der Suspension in einen 50-ml-Röhrchen. Wir verwenden 2 ml Bettvolumen von Harz für die Reinigung von KvAP von 2 l Kultur.
  3. Das Röhrchen bei 700 xg für zwei Minuten auf Pellet nach dem Harz.
  4. Entfernen und den Überstand verwerfen.
  5. In 10 Bettvolumina MQH 2 O und kurz mischen, um das Harz zu spülen.
  6. Zentrifugieren bei 700 xg für 2 min zur Pelletierung unten des Harzes. Überstand verwerfen.
  7. In 10 Bettvolumina MQH 2 O und gießen in leere Spalte.
  8. Warten Sie, bis Harz beruhigt sich, und schließen Sie die Säule mit einem Fluss-Adapter für die Niederdruck-Flüssigkeits-Chromatographie.
  9. Führen Sie 5 Bettvolumina MQH 2 O und 5-Bett-Äquilibrierungspuffer durch die Säule.

Box 2. Reinigung von Fv

Fv Transformation - Tag 1

  1. Transform100 ng der Plasmid Fv-His 6 bis 60 ul JM83 kompetente Zellen, die Bakterien auf Platte vier LB-Agar-Platten mit 100 ug / ml Ampicillin, und Inkubation über Nacht in einem 37 ° C Inkubator.
  2. Bereiten 6 X 1 L LB für die Bakterienkultur.

Expression von FV - Tag 2

  1. Scrap alle Kolonien von den Platten in LB-Medium. In diese Suspension der Bakterien bis 6 × 1 l LB in Gegenwart von Ampicillin (100 mg / L) und inkubieren, bis OD600 0,5 erreicht.
  2. Bei OD 0,5 erreicht, verringern Sie die Temperatur auf 20 ° C und 115 RPM. Wenn der Temperaturabfall auf ~ 20 ° C, Hinzufügen Anhydrotetracyclin (100 ul DMF 1mg/ml in Anspruch 1 L) zur Einleitung der Induktion der Proteinexpression und Inkubation weitere 5 h bei 20 ° C in Verbindung mit Schütteln.
  3. Ernte-Bakterien in 1 L Flasche Zentrifuge bei 4.000 xg für 15 min. Gieße den Überstand so viel wie möglich. Halten Sie die geernteten Bakterien auf Eis ina 4 ° C kalten Raum über Nacht.

Loslassen der Fv-Moleküle aus den Bakterien - Tag 3

  1. Resuspendieren Bakterien in 150 ml Fv-Releasing-Puffer (50 mM Tris pH 8.0, 20% Saccharose, 1,0 mM EDTA).
  2. Unter Rühren mit einem magnetischen Rührstab, fügen Lysozym bis 0,1 mg / ml und halten die Bakterien auf Eis für 30 min. Danach fügen MgCl2 bis 2,0 mm und halten auf dem Eis für einen weiteren 10-15 min.
  3. Zentrifuge die behandelten Bakterien bei 20.000 g für 30 min bei 4 ° C. Die bakteriellen Sphäroblasten sollten alle gehen, um die Pellets, und die meisten der Fv-Moleküle in den Überstand freigesetzt.
  4. Dialysieren den Überstand gegen 4,0 l Waschpuffer (20 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl) in Kühlraum für mindestens 4 Stunden. Am Ende des Tages, an die frische Dialysepuffer ändern und Dialyse über Nacht. Aufgrund der Saccharose in der Lösung wird das Volumen des Dialysats um etwa 50% zu erhöhen. Überschuss der Dialyseschlauch verwendet werden sollte.

IMAC Reinigung und FPLC - Tag 4

  1. Equilibrieren 10 ml Bettvolumens IMAC Reinigung Harz (siehe Kasten 1) mit dem Dialysepuffer in 50-ml-Tube.
  2. Übertragen Sie das Dialysat aus dem Schlauch, fügen MgCl 2 bis 10 mm und erhöhen Sie die Lautstärke auf 200 ml. Mischen mit dem pre-äquilibriert Harz und Inkubation für 30 min bei 4 ° C.
  3. Verpacken Sie die leere Spalte mit der inkubierten Harz und waschen das Harz mit 5 Bett-Volumina Waschpuffer durch 5-Bett-Volumina Waschpuffer mit 10 mM Imidazol und 30 mM Imidazol jeder gefolgt.
  4. Eluieren des gebundenen Proteins mit 20 ml Waschpuffer plus 300 mM Imidazol.
  5. Führen Sie das konzentrierte Fv durch Superdex 200-Säule voräquilibriert mit Waschpuffer. Pool die Fraktionen Fv (typisch Gipfel zeigt sich bei 17,6 ml Retentionsvolumen) zusammen und konzentrieren sich darauf. Bestimmen Sie die Konzentration der Probe unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten von Fv bei 280 nm.

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Discussion

Die Wiederherstellung der KvAP Kanäle in unterschiedlichen Membranen wurde in mehreren Studien 8-10 verwendet worden. Nach der Idee der Sicherstellung der Verteilung der Lipide zwischen Reinigungsmittel / Lipid Mischmizellen und die Protein / Reinigungsmittel / Lipid Mischmizellen, sind wir in der Lage, nahezu vollständige Wiederherstellung der KvAP in Membranen von sehr unterschiedlichen Lipiden zu erreichen. Jeder tetrameren KvAP Kanal benötigt ~ 100 Lipidmolekülen zur Deckung seiner Transmembrandomäne. Die wesentliche Voraussetzung ist, um genügend Lipid-Moleküle in die Protein / Lipid / Detergensmicellen verschmelzen, bevor die Reinigungsmittel entfernt werden. Unsere Standard-Bedingungen (0,5 mg Protein und 5,0 mg Lipide) sicherzustellen, dass es im Durchschnitt ~ 1.000 Lipid-Moleküle pro Protein-Molekül. Unser Experiment Flotation und biochemische Experimente bestätigten, dass die Wiederherstellung fast abgeschlossen ist. Elektrische Aufnahmen aus den Kanälen in schwarzen Lipidmembranen eingesetzt, das Screening der rekonstituierten Kanäle eingainst eine Phagendisplay-Peptid-Bibliothek, und das Wachstum von 2D-Kristallen der Kanäle in allen Membranen zeigen die erfolgreiche Anwendung der Membran Rekonstitution für verschiedene Zwecke.

Die Lipid-abhängige Konformationsänderungen der KvAP Kanäle und das Screening gegen eine Phagen-Peptid-Bibliothek angezeigt präsentieren einen neuen Weg, um Bildschirm für Kanal-Blocker oder Kanalöffner durch biochemische Methoden, anstatt sich auf Elektrophysiologie, um die Kanäle in bestimmten Konformationen 8 zu halten. Der Erfolg in unserem Bildschirm für konformationsspezifische Bindemittel schlägt vor, dass die gleiche Strategie angewendet werden können, um spezifische Binder für die aktivierte Konformation zu finden. Es ist absehbar, dass die Kanäle in Vesikeln rekonstituierten gegen single chain Fv Bibliotheken, Fab Bibliotheken usw. Ebenso kann verwendet werden, können auch andere Membranproteine ​​durch diese Operationen ausführen und sichern ihre engen Bindemittel, die nützlich sein können für verschiedene Zwecke. Wir glauben, dass dies new Verfahren werden mehr allgemeine Anwendungen in der Zukunft.

Rekonstituierte Membran-Systeme ermöglicht die Aufklärung der chemischen Details hinter den Lipid Auswirkungen auf Membranproteine ​​11. Lipid-Protein-Wechselwirkung ist bekannt, für viele Membranproteine ​​wichtig, und hat mehrere Studien in den vergangenen 3 unterzogen. In den zellbasierten Studien können Manipulationen eingeführt, um die einzelnen Komponenten, die in den Membranen zu ändern und dann die funktionellen Veränderungen der Membranproteine ​​mit der Struktur und der Zusammensetzung Änderungen in den Membranen verbunden sind. Solche Verbindungen sind indirekt und möglicherweise von mehreren Faktoren in den Zellmembranen, die nicht gut charakterisiert führen. In einem wiederhergestellten homogene Membran, ist es endgültig in Herstellung von Verbindungen zwischen den strukturellen und funktionellen Veränderungen der Membranproteine ​​und die Veränderungen in Lipid-Zusammensetzung und Eigenschaften der Membran. Letztendlich verstehen ter chemische Prinzipien der Lipid-Protein-Wechselwirkung, müssen wir die Verteilung von Lipiden auf der Transmembrandomäne abzugrenzen, und um die dynamischen Änderungen dieser Lipide direkt neben den Proteinen zu verstehen. Eine wiederhergestellte System scheint ein zuverlässiger Weg in Richtung einer solchen Verständnis.

Rekonstitution von Membranproteinen erfordert die kontrollierte Entfernung von Detergentien aus der Protein / Lipid / Detergens gemischte Micellen und die Verschmelzung der gemischten Mizellen in große diejenigen, die schließlich in Vesikeln 30 drehen. Drei verschiedene Methoden werden zum Entfernen von Wasch-, Dialyse-, Perlen und Cyclodextrin 14, 31, 32 verwendet. Es bleibt jedoch schwierig, eine gut kontrollierte, schrittweise Entfernung des Reinigungsmittels aus einem kleinen Volumen 33, 34 zu erreichen. Eine ideale Methode für die Entfernung des Detergens würde die Waschmittel aus der wässrigen Phase gleichmäßig nehmen über das gesamte Volumen in einem steuerbaren Tempo, und sollte nicht ausüben starke Störungen on die Wiederherstellung der Doppelschicht-Membranen. Ein solches Verfahren kann in der Lage, die Geschwindigkeit und die Wirksamkeit der Zubereitung zu ändern, und wird wahrscheinlich ermöglichen die Rekonstitution in einem kleinen Volumen. Eine Kombination aus Slow-Verdünnung und jeder von drei herkömmlichen Verfahren zur Entfernung des Detergens kann sich an dieses Ziel. Langsam Verdünnung durch Einführen kleine Menge Wasser in das Protein / Detergens / Lipid-Mischung eine kontrollierbare Weise gleichmäßig zu verringern Detergens-Konzentration auf die CMC. Die Entfernung des Detergens danach weniger kritisch für die Bildung von Vesikeln, obwohl immer noch wichtig für die Fusion von kleinen Bläschen in großen. Andere Möglichkeiten zum kontrollierten Detergensentfernung erreichen müssen noch konzipiert und entwickelt werden.

Unsere Rekonstitution nimmt Berücksichtigung Lipid Verteilung gemischte Mizellen und Reinigungsmittel-induzierte Fusion von Vesikeln, sowie die gemischten Mizellen. Sein Erfolg ebnet den Weg zu einem breiteren Spektrum von Anwendungen der reconstituted Vesikel, viel mehr als die drei Richtungen, die wir vorgestellt. Die Anpassung unseres Verfahrens auf andere Membranproteine ​​sollte nicht auf erhebliche technische Grenze. Auch wenn viele Membranproteine ​​haben rekonstituiert wurden eine oder andere Weise, ist es schwierig gewesen, um nahezu vollständige Wiederherstellung zu erreichen und die Funktionalität der Proteine ​​aus mehreren unterschiedlichen Perspektiven zu bewerten. Unsere Bemühungen in der KvAP Rekonstitution vermuten, dass unsere Methoden können volle Wiederherstellung zu ermöglichen und werden für diese Zwecke geeignet.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Die Studien über KvAP im Jiang Labor haben erhebliche Hilfe von Dr. Roderick MacKinnon Labor erhalten an der Rockefeller University. Besonderer Dank geht an Dr. Kathlynn Brown und Michael McQuire gehen für ihre Beratung und Hilfe auf unserem Phagen-Display Experimente. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus NIH (GM088745 und GM093271 zu Q-XJ) und AHA (12IRG9400019 zu Q-XJ) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptone RPI Corp. T60060
Yeast Extract RPI Corp. Y20020
NaCl Fisher S271-3
Tris Base RPI Corp. T60040
Potassium Chloride Fisher BP366-500
n-Dodecyl-β-D-Maltoside Affymetrix D322S Sol-grade
n-Octyl-β-D-Glucoside Affymetrix O311 Ana-grade
Aprotinin RPI Corp. A20550-0.05
Leupeptin RPI Corp. L22035-0.025
Pepstatin A RPI Corp. P30100-0.025
PMSF SIGMA P7626
Dnase I Roche 13407000
Bio-Bead SM-2 Bio-Rad 152-3920
HEPES RPI Corp. H75030
POPE Avanti Polar Lipids 850757C
POPG Avanti Polar Lipids 840457C
DOGS Avanti Polar Lipids 870314C
DMPC Avanti Polar Lipids 850345C
Biotin-DOPE Avanti Polar Lipids 870282C
DOTAP Avanti Polar Lipids 890890C
NeutrAvidin agarose beads Piercenet 29200
Dialysis Tubing Spectrum Laboratories, Inc 132-570
Pentane Fisher R399-1
Decane TCI America D0011
MTS-PEG5000 Toronto Research Cemicals M266501

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References

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