Yapısal ve İşlevsel Araştırmalar için Lipid Membranlar bir Kv Kanal Sulandırma

* These authors contributed equally
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Lipid membranlar bir prototip voltaj kapılı potasyum kanalı tam sulandırılması için prosedürler açıklanmıştır. Sulandırılmış kanallar biyokimyasal testler, elektrik kayıtları, ligand ve tarama elektron kristalografik çalışmalar için uygundur. Bu yöntemler, başka zar proteinlerinin yapısal ve fonksiyonel çalışmalar için genel uygulamalar olabilir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lee, S., Zheng, H., Shi, L., Jiang, Q. X. Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies. J. Vis. Exp. (77), e50436, doi:10.3791/50436 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Indirgeyici bir şekilde lipid protein etkileşimi araştırmak için, iyi tanımlanmış bir lipid kompozisyonu membran içine membran proteinleri de dahil için gereklidir. Biz bir prototip voltaj bağımlı potasyum (Kv) kanalında lipid bağlı yolluk etkilerini araştırıyor ve farklı membran sistemlerine sulandırmak kanallarına detaylı işlemleri çalıştım. Bizim sulandırma prosedürler deterjan indüklenen veziküllerin füzyon proteini ve / deterjan lipid / deterjan karışık miseller ile miseller gibi protein / deterjan / lipid ve deterjan arasında lipitlerin bir denge dağılımı ulaşma önemi füzyon hem de dikkate almak / lipid karışık miseller. Bizim veri lipid veziküller içinde kanallarının ekleme yönelimleri nispeten rastgele önerdi ve sulandırma verimliliği saptanabilir protein agrega fraksiyon deneylerde görüldü o kadar yüksektir. Biz sulandırmak kullanmış olmasıFarklı lipid kanalların yapısal durumları belirlemek için d kanalları, düzlemsel çift katlı lipit katmanını dahil kanalları az sayıda, bir faj görüntülenir peptid kütüphane uyum özgü ligandlar için ekranın elektrik faaliyetleri kayıt ve 2D kristallerin büyümesini desteklemek zarlarında kanalları. Burada anlatılan sulandırılması prosedürleri, özellikle ökaryotik voltaj kapılı iyon kanalları lipid etkilerinin araştırılması için, lipid tabakalarıdır Diğer zar proteinleri çalışmak için adapte edilebilir.

Introduction

Hücreler Döviz malzemeler ve spesifik membran proteinlerin 1 fonksiyonları yoluyla çevre ile bilgiler. Hücre zarlarında membran proteinlerinin pompalar, kanallar, reseptörler, intramembrane enzimler, bağlayıcı ve membranlar arasında yapısal destekçileri olarak işlev. Membran proteinleri etkileyen mutasyonların birçok insan hastalıkları ile ilgili olmuştur. Bu önemli ve hücre zarlarında kolayca erişilebilir olduğu için Aslında, birçok membran protein birincil ilaç hedefleri olmuştur. Bu membranlar çeşitli membran proteinlerinin yapısı ve işlevini anlamak ve mümkün insan hastalıklarda mutant proteinlerden zararlı etkileri hafifletmek için yeni yöntemler bulmak için yapmak bu nedenle çok önemlidir.

Lipidler bilayers 2, 3 entegre tüm membran proteinleri çevreleyen. Ökaryotik membranlar, lipidlerin çeşitli farklı türleri microdomains 4, 5 halinde organize edilebilir olduğu bilinmektedir.Birçok zar proteinleri, bu microdomains yanı sıra membran 3, 6, hacimli sıvı faz olarak dağıtılmak üzere gösterilmiştir. Microdomains ve membran proteinlerinin teslim onlara ve bu dağılımlar fizyolojik önemi organizasyonu altında yatan mekanizma açıkça önemlidir ama tam olarak anlaşılamamıştır kalır. Membran proteinleri üzerinde lipid etkileri okuyan bir önemli teknik zorluk hemen hemen tüm yeniden proteinlerin fonksiyonel 7 böylece biyokimyasal iyi kontrollü lipid kompozisyon membranlar içine membran proteinlerinin saflaştırılmış güvenilir sulandırma olduğunu. Son birkaç yıl içinde, biz sulandırmak için A. prototip voltaj bağımlı potasyum kanal yöntemleri geliştirdi yapısal ve fonksiyonel çalışmalar için çeşitli 8-10 membran sistemleri içine pernix (KvAP). Diğerlerinden verileri ve hep birlikte lipid muhtemel voltaj algılama konformasyonel değişiklikler belirleyici olduğunu gösterdiBir voltaj kapılı bir iyon kanalı ve etki bu kanallar 11 bazı yapıları şekli olabilir. Bir sonraki, bizim yöntemleri ayrıntılı bir açıklama sağlayacak ve büyük olasılıkla bizim sonuçlarının başarılı üreme ve diğer membran proteinlerinin çalışmalara bizim yöntemlerin uzantısı sağlayacak kritik teknik ipuçları sunacak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. İfade ve KvAP Kanal saflaştırma (Şekil 1)

  1. Hazırlık Çalışması - Day 0
    1. Genel bulaşık deterjan eser çıkarmak için deiyonize su (diH 2 O) ve MilliQ H 2 O (MQH 2 O) ile bakteri kültürü için cam şişeler durulayın.
    2. 2.8 L Erlenmeyer şişeler otoklav 1000 ml LB ortamı (toplam iki litre burada örnek olarak kültür). Suyun sertlik derecesi düşük dönüştürülmüş bakteri kültürü başarılı için önemli olduğu bulunmuştur.
    3. 500 ml'lik şişeler içinde Otoklav 100 ml LB vasatı
    4. 200 ng XL1-Mavi yetkili hücreleri 60 ul Transform pQE60 plazmid / 100 ug içeren iki LB ağar plakaları üzerinde C-ucunda, levha bakterilere bir trombin kesme site ve bir 6 His etiketi ile KvAP için geni içeren ml ampisilin ve 37 ° C inkübatör 14-16 saat için onları kuluçkaya yatmaktadır.
  2. KvAP ifadesi - 1. Gün
    1. App kontrol edinGece boyunca inkübasyondan sonra, plakalar üzerinde bakteri kolonilerinin earance. Koloniler genellikle çapı sadece 0.2-0.5 mm vardı ve onları bir sürü vardı. Biz uydu koloniler bir çok çevrili büyük koloniler liman plakaları istemiyorum.
    2. Gece inkübe her LB-agar plaka 5.0 ml LB orta ekleyin ve koloniler kapalı hurda. 500 ml bir şişede, 100 ml otoklava LB ortamı içine bakteri süspansiyonu aktarın. 100 ug / ml 'lik nihai bir konsantrasyona kadar ampisilin ekleme, 37 ° C de yaklaşık 1 saat boyunca inkübe edilir ve küçük bir kültür OD600 0.60 kadar ulaşır.
    3. Bu arada, bir yerde bir 37 içine 1.0 L ortamı ile iki şişeler ° C inkübatör orta ısınır ve BaCl 2 (1.0 M, 1.0 M, her kültür, 10 mM nihai konsantrasyon), 20 ml hazırlamak için sallama, 2.0 ml 0.4 M IPTG (izopropil-tiyo-β-galaktosit) ve su içinde 100 mg / ml ampisilin stok, 2.0 ml.
    4. Küçük kültürün hazır olduğunda, ampici 1.0 ml BaCl 2 10 mladım 1.2.2 den önceden ısıtılmış LB medya için küçük kültür hız, Min stok, ve 50 ml. OD600 0.05 civarında olmalıdır. Suyun yüksek sertlik ve LB medyada karşı iyonları nedeniyle mümkün yağış için izleyin. Ba 2 + potasyum kanalı ve bloklar iyonik akımın gözenek etki bağladığı bilinen ve bu nedenle bakteriler için kanalların yüksek düzeyde ifade edilir toksisitesini azaltır.
    5. Bu 0,9-0,8 ulaşana kadar 0.70 ulaşır ve her on beş dakika kadar her saat OD600 alın. Bizim de set-up, genellikle 0.8 ulaşmak için ~ 5 saat sürer.
    6. Kanal proteininin uyarılan ekspresyonu başlar ve 225 rpm'de çalkalama ile 37 ° C 'de bir 4.0 saat boyunca kültür inkübe IPTG 0.40 mm ekleyin.
    7. Hasat 15 dakika boyunca 4,000 x g, 4.0 ° C de iplik ile 1.0 litre santrifüj şişelerine bakteriler. Bir atık beher içine mümkün olduğu kadar süpernatant süzün, tüm Ba 2 çökeltmek için 10 ml 1.0 M Na-fosfat tampon maddesi eklemek + ve daha sonra bir eklemebakterileri öldürmek için çamaşır suyu küçük hacimli. Bir gecede 4.0 ° C soğuk odada buz gömülü santrifüj şişelerde hasat bakteri tutun.
  3. KvAP protein saflaştırma (2. ve 3. gün, Şekil 1B)
    1. 1.0 L kültür başına IMAC lizis tamponu ile 15 ml bakteri pelletini. ~ 1.0 U, DNase I, ve löpeptin, üç, proteaz inhibitörleri aprotinin ve 1.0 ug / ml pepstatin A ekleyin. İki litre kültür hacmi ~ 35 ml idi.
    2. ON-zaman toplam 10 dakika buz gömülü bir metal beher süspanse bakteri sonikasyon. Mikroprob sonikatör bir 4.0 ° C soğuk odada% 40 çıkış gücü ile çevrimi KAPALI / 10 sn ON 5 saniye kuruldu. Bakterilerin çoğu çözelti içinde çok ısıtmadan lize edildi, böylece söz konusu çıkış güç ayarı ampirik bir şekilde tespit edilmiştir.
    3. Sonike edilen hücre lizatı ile kuru toz formunda, ve 3 için inkübe karışımı, n-desil-β-D-maltoside (Anatrace arasından Sol-Sınıf DM), 0.50 g eklemeSabit yatay bir çalkalama (~ 100 rpm) mümkün olduğu kadar çok kanallı proteinlerini ekstre etmek için, oda sıcaklığında (RT) .5 sa. Bu deterjan tozu tamamen 30-50 dakikalık bir süre içinde eritildi olduğundan emin olmak önemlidir.
    4. Deterjan ekstraksiyondan sonra, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 20,000 x g'de santrifüj ile lizatından hücre kalıntılarını uzaklaştırmak. Bitirmek için santrifüj beklerken, Kutu 1'de ayrıntılı olarak His-etiket tabanlı LC (düşük basınçlı sıvı kromatografisi) sütun hazırlar.
    5. 1-2, bir peristaltik pompa vasıtası ile tahrik edilir ml / dk 'lık bir akış oranında, ön-paketlenmiş IMAC (I M ve ark iyon ffinity C hromatography mmobilized) sütunu üzerine adım 1.3.4 süpernatant yükleyin. Alternatif olarak ekstre His etiketli protein, kesintili bağlanma için IMAC reçinesi ile inkübe edilebilir.
    6. IMAC yıkama tamponu 5 yatak hacmi çalıştırarak IMAC reçine yıkayın ve IMAC yıkama tutkunu 10 yatak hacmiER ve 20 mM imidazol. Bir in-line UV monitörü yıkama, temiz olduğundan emin olmak için kullanılır.
    7. 300 mM imidazol ihtiva eden tampon maddesi IMAC uygulayarak KvAP proteini Zehir. Bağlı KvAP çoğu kolonu boyunca tampon 6 ml içinde yıkanır. Toplanmış elüsyon fraksiyonları içine trombin (protein 2-3 mg başına 1.0 U) ekleyin ve tutunmaya O'nun 6 etiketi bankta gecede protein kuluçkaya yatmaktadır.
    8. Ertesi gün, en trombin-sindirilmiş protein çözüm konsantre bir Centricon (MWCO = 30K) aşağı boyut dışlama FPLC (hızlı protein sıvı kromatografisi) için 600 ul. Santrifüj sırasında protein topaklanma en aza indirmek için, örnek her beş dakika karıştırılır. Protein konsantre edilir olarak, membran filtre de lokal konsantrasyonu daha yüksek olur, ve bazen açık beyaz aksi filtre membranı yapışmasına neden olabilir çökelir vardır. Aynı zamanda konsantratör altındaki proteinlerinin yüksek bir konsantrasyon (~ 5-10 mg / ml), bir kaş yol açarNiş renk ve karıştırma gerçekten örnek kaybını en aza indirmek için yardımcı olur.
    9. FPLC dengeleme tampon maddesi ile önceden dengelenmiş olan bir Superdex 200 kolonu yoluyla konsantre edildi KvAP çalıştırın. Tipik olarak 12.3 ml bir tutma hacmi ile DM Yıkamalar olarak tetramerik KvAP kanalının zirve. Monomerik KvAP arasında küçük bir miktar yaklaşık 13.6 mi, küçük bir eğik kuyruğu vardır. Kullandığımız sütunun boşluğu 7.0 ml 'de ve genellikle çok az örnek KvAP protein içerir, boşluğu, bir küçük tepe yol açmaktadır. Imidazol elüsyon (~ 24 mi) sonunda gelir. Birlikte KvAP tetramers içeren kesirler ve aşağı 0.5 ml protein solüsyonu konsantre Havuzu. : URL 280 nm [Ref 12 KvAP tahmini bir sönüm katsayısı (aromatik kalıntılar sayısına göre hesaplanmıştır ~ 1,2 E-5.0 M -1 cm-1, İN) kullanılarak numunenin konsantrasyonunu belirlemek http:// web.expasyorg / protparam /].
      Oda sıcaklığında, DM KvAP saflaştırılmış proteinin önemli bir kayıp olmaksızın, en az bir hafta sabittir. 4 ° C'de, hatta daha uzun son verebilir. Deterjanlarda protein dondurma asla. Bu, 4 ° C de DM protein saklamak için tavsiye ve oda sıcaklığında β-OG 'de proteindir. Ama biz normalde bekleyin ve proteinler hazır hemen sonra çözme işlemi için devam etmeyin.
    10. Tahlil, SDS-PAGE jel azaltıcı% 12 örnekleri.
      Yukarıda anlatılan her bir aşama örnekleri% 1.0 β-ME ile takviye 5x SDS numune tampon maddesi (tampon Tablo 3) ile numunelerin 20 mikrolitre karıştırmak suretiyle hazırlandı. Numuneler kaynatıldı değildi. Jeller hazır sonra, numuneler, oda sıcaklığında genellikle fazla 10 dakika için SDS tamponu içinde olmuştur. Jel çalıştırın ve Coomassie mavisi ile boyandı sonra, vahşi tip KvAP yaklaşık 26 kDa (Şekil 1B tek bir grup olarak geldi

2. İyon Kanal Sulandırma

2.1. Veziküllerin lipozom preparatı ve deterjan ile indüklenen füzyon

Lipid hazırlanması öncesinde, bir 14 ml'lik atılabilir bir cam test tüpü, bir vidalı kapaklı cam tüp, ve kloroform ile 250 ul bir cam şırınga yıkayın. TestTube içine ~ 10 ml kloroform dökmek.

  1. Palmitoyl-oleoil fosfatidil-etanolamin (Papa) ve palmitoil-oleoil fosfatidil-gliserol (POPG) lipozomların hazırlanması.
    1. Papa 3.75 mg POPG 1.25 mg (Papa: POPG = 03:01 ağırlık oranında) transfer önceden temizlenmiş vidalı kapaklı cam tüp içine kloroform içinde ve argon gazı sürekli bir akış altında lipid kurutun. Görünür bir kloroform bırakıldığında, bir saat boyunca oda vakum altında daha fazla lipit kurutun.
    2. Tuz tamponu düşük 440 ul (10 mM HEPES, pH 7.4, ekleme) Veya su ve kuru lipit vorteks hidrat lipidler tüpe. Lipid süspansiyon beyazımsı ve bulanık görünüyor.
    3. Vezikül çözeltisi (OD410 <0.2) yarı saydam hale gelinceye kadar bir buz-soğuk banyo sonikatörü içinde lipid süspansiyonu sonikasyon.
      Genellikle su veya düşük tuz tamponu 10 mg / ml PAPA / POPG çözüm için, biz 15-20 dakika olmak üzere toplam 30 saniye ON ve 30 saniye OFF (buz üzerinde) ile sonikatör işletilmektedir. Çünkü sonication sırasında üretilen ısının, bu yağ oksidasyonunu en aza indirmek için, ve ° C veya altında 10 sonikatör arasında su banyosunda soğutmak için lipid çözeltisi içinde 1.0 mM DTT eklemek için tavsiye edilir. Nihai OD410 lipid bağlıdır. Bazı yağlar için böyle düşük OD ulaşmak çok zor olabilir. Eğer bu gerçekleşirse, genellikle tamamen lipid çözünür ve uzun kuluçka protein içeren miseller (sonraki bakınız) etrafında lipidlerin iyi bir dağıtım ulaşmak için izin için deterjan kullanın.
      Yüksek kapasiteli banyo sonikatör ord önemlidirer OD410 <0,2 ulaşmak için. Biz Laboratuvar Malzemeleri Co, Inc (Model # G112SPIG, Hicksville, NY) tarafından yapılan bir sistem kullanıyoruz. Veziküllerin uygun sonication için önemli tüpün orta rezonans merkezine güçlü titreşim olduğundan emin olmaktır. Titreşim su hacmi ile değişir ve bu nedenle ayarlanabilir. Ayrıca deneysel olarak gliserol, küçük bir miktarda eklenmesi ile suyun viskozitesini arttıran sonication etkinliğini artırabilir olduğu bulunmuştur.
      Alternatif olarak bir plastik ya da metal bir tüp içinde lipid süspansiyonu ile temas halinde bir mikroprob sonikatör kullanılarak aynı sonuç olduğunu bulduk. Mikroprob temizlenmesi gerekiyor ve sadece ucu lipid çözüm batırmayın olduğunu. Lipid parçacıkları mikroprob yüzeyinde küçük parçalar halinde kırılır için, örnek soğutuldu tutmak için çok önemlidir ve bazı doymamış lipid oksidasyonunu engellemek için bir indirgeyici ajanlar var.
      Kriyo-elektron MICR altındaoscopy, sonike tek lamelli vesiküller çoğunluğu çapı 30-50 nm (veriler gösterilmemiştir). Küçük SUV eğriliği küçük bir pertürbasyon çapı 80-200 nm (sonraki bakınız) daha büyük olanları içine bu veziküllerin canlı füzyon ikna etmek için yeterli o kadar yüksektir.
    4. 3.0 M KCI ve 50 ul nihai yağ süspansiyonu, 300 mM KCI, 10 mM ve DM sahip olacak şekilde bir karışımı, DM 0.50 M, 10 ul. Lipid / deterjan karışık miseller oluşturacak şekilde, oda sıcaklığında 2 saat boyunca yatay bir dönme çözeltisi ile inkübe edilir. İnkübasyondan sonra süspansiyon küçük tek katmanlı veziküller, deterjan indüklenen füzyon nedeniyle biraz bulanık (Şekil 2A), olmalıdır.
    5. Daha fazla protein 2.0 kadar konsantre edildiğinde mg / ml seviyesinde, lipit / deterjan karışımına 0,50 mg KvAP proteini, 3.0 M KCI 50 ul, su içinde 0.50 M stok DM 16 ul ve 10 mM HEPES, pH 7.4, ekleme son hacmi 1 ml yapmak. Nihai yağ: Protein ağırlık oranı 10:1 olanve DM nihai konsantrasyon 18 mM (Şekil 2A) 'dir. Başka bir 2 saat boyunca yatay bir dönme ile cam tüp içinde protein / yağ / deterjan karışımı inkübe edin.
      Deterjan konsantrasyonunun seçimi deterjan indüklenen füzyon vezikül ve vezikül çözündürme 13 tarafından yönlendirilir. Veziküller güçlü sonikasyon oluşturduğu zaman, bunların ortalama çapı EM ile 30-50 nm arasında olan erim içinde bulunmaktadır. Bu veziküller 410 nm de çok düşük saçılma var. Düşük konsantrasyonlarda, deterjan ilk veziküller eklenir, veziküller destabilize ve deterjan doymuş veziküller (OD410 kadar gider; Şekil 2A) arasında füzyon neden olur. Vezikül füzyon OD410 nm artışa yol açar. 10 mg / ml 'POPE / POPG veziküller için, DM yaklaşık 15 mM'lik OD410 tepe noktasını gösterir. Daha fazla deterjan tanıtıldı zaman, veziküller parçalar halinde kırmak için ve lipidler deterjan / lipid karışık misel içine bölümlenmiş hale başlar. Bu ikinci işlem, eşlikson bir düşük düzeyde (<0.1) aşağı OD410 azalması.
      Çünkü nedeniyle vesiküller deterjan indüklenen füzyon için optik yoğunluk yükselen fazında aktif füzyon etkinlikleri, bu protein / deterjan miselleri aktif deterjan doymuş lipid veziküllerin ile birleştirilebilir olması kuvvetle muhtemeldir. Protein / yağ / deterjan karışımının hazırlanması esnasında DM 18 mM seçimi arkasındaki nedeni budur. Deterjan 4 kat daha fazla konsantre hale gelmesi durumunda, DM ihtiyaç miktarı nihai konsantrasyon 18-20 mM etrafında hala böylece ayarlanır. Protein verimi çok düşük olduğu zaman, konsantre deterjan numunede ne kadar değerlendirilmesi zor olduğu için, bunun yerine tamamen çözündürülmüş lipidler ile protein karışımı ve sulandırma için tamamen dengelenmiş karışımı kullanmak. Bizim ellerde, yeterli bir süre protein içeren ve proteinsiz miselleri, reconstitut arasındaki lipidlerin iyi bir denge dağılımı ulaşmaya izin verildiiyon verimi önemli ölçüde düştü. Genellikle iki deney ile sulandırma etkinliğinin test: 1) bir sükroz yoğunluk gradyan santrifüjü içinde vezikül fraksiyonu ile proteinin eş göç incelemek, 2) bir akışkanlardaki bunların sulandırılmış veziküllerin proteinlerin özü ve jel- (bizim durumumuzda KvAP) tetramerik olmaya devam etmektedir ne kadar protein bulmak için filtrasyon sütun. Protein / yağ / deterjan inkübasyon minimum zaman oda sıcaklığında veya gece 4 derece birkaç saat olduğunu.
      Farklı bir deterjan stabil olan yeni bir zar proteini için, ilk adım Şekil 2A gösterdi ne benzer bir deterjan ile lipidlerin çözünürleştirme özelliği, bulmaktır. Daha sonra, örneğin E. olarak PC ekstreler ile başlamak için tavsiye edilir belirli bir proteinin işlevi için bazı fosfolipidlerin gerekiyorsa coli kutup özü bilgisayar, soya fasulyesi ekstrakt bilgisayar vb, bu yüzden, daha önce bu ekstraksiyonu dahil olabilirted lipit karışımı.
  2. Deterjan-çözünür ile karışım içinde tercihen KvAP hazırlanması 1,2-dioleoil-3-trimetilamonyum propan (DOTAP), ya da 1,2-dioleoil-sn-glisero-3-sukkinat (KÖPEK) --- tam lipit çözündürme bir örnek sulandırılacak
    1. Lipid hazırlanması POPE / POPG veziküller için aynıdır. Küçük tek tabakalı veziküller içine sulu lipidlerin sonication PAPA / POPG lipid (genellikle 5-10 dakika) için daha uzun zaman (genellikle 45-60 dk) ihtiyacı var. KÖPEK veziküller yavaş yavaş birbirleriyle kaynaştırmak ve küçük yağlı damlacıklar oluşturabilir.
      Çünkü DOTAP ve KÖPEKLER kaliteli Arazi dışarı yapımında zorluk tekrarlanabilir, genellikle tamamen proteinleri ile karıştırmadan önce bu iki lipit çözünür.
    2. Tamamen ya da köpek DOTAP çözündürülmesi için sonike edilmiş vesiküller DM 10 mM ve 40 mM N-oktil-β-D-glükoz (β-OG) ile karıştırılır. Lipit / deterjan karışımı (> 15 saat) bir gece boyunca inkübe ediliroda sıcaklığında eklenmiş ve karışım herhangi bir küçük tanecikler ya da damlacıklar olmamalıdır. Ama bunun yerine oldukça açıktır. Bu adımda, tam bir dengeye ulaşmak için başarısızlık çok katmanlı veziküller çok büyük bir bölümü oluşmasına yol açacaktır.
    3. Daha az veya 1:10 eşittir yağ oranı: bir protein deterjan-çözünür ya da DOTAP köpeklerle KvAP proteini karıştırın. Protein / deterjan / yağ karışımı uç üzerinde uç dönme ile 2-3 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edilmesine imkan verilir.

2.2. Proteoliposomes oluşturmak üzere deterjan çıkarılması

  1. Diyaliz --- nispeten yüksek kritik misel konsantrasyonu (CMC ≥ 1.0 mM) var gibi DM ve β-OG olarak deterjanların yavaş kaldırılması,
    Her karışım için, 1.0 ml 2-Litre diyaliz tampon maddesi (Tablo 3) hazırlayın.
    Diyaliz boru uygun uzunlukta kesip (MWCO = 10K; 0.70 cm genişliğinde) ve DI su ile yıkayın. Bu kontrol ve yapmak önemlidirboru hiçbir sızıntı olmadığından emin. Hassas örnekleri için, borunun ilk 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 ve 2.0 mM EDTA tampon maddesi ile muamele edilebilir, ve daha sonra 3-5 dakika boyunca kaynamakta olan suda temizlenebilir. Bundan sonra, boru bir ucunda kenetlenmiş ve diyaliz tamponu ile durulanır.
    Bir diyaliz tüp içine protein-lipid-deterjan karışımı yükleyin. Solüsyonu üzerinde kalan az alan madde ile boru, her iki ucunda sıkıştırma parçası. Diyaliz tampon içine yüklenen boru koyun ve boru yavaş yavaş çözüm döner böylece karıştırma tabak kullanın. Her 8 saatte bir kez diyaliz tamponu değiştirin. Protein-lipit-deterjan karışımı tamamen açık olduğu durumunda, ilk tampon değişiklik yapıldıktan sonra, çözelti bulanık hale gerekir. Diyaliz çok hızlı ise, beyaz katı madde diyaliz boru tabanında çöker olabilir. Bu tampon değişim zamanda, boru, aşınmış bir ve birden çok kez ters gerektiğini tavsiye edilir. Diyaliz tampon beş değişikliklerden sonra, veziküller genellikle hazır.
    Biz çift katlı lipid üzerine veziküller vurarak deterjan kalıntı miktarını kontrol. Sol deterjan halen önemli miktarda olduğu zaman, iki tabakalı neredeyse anında kopar. Bu kolorimetrik yöntem kullanılarak ya da vezikül süspansiyonunun yüzey gerilimi ölçerek artık deterjan ölçülmesi de mümkündür.
  2. Düşük CMC sahip deterjan kaldırmak için polistiren boncuklar kullanımı
    Birçok durumda, bu tür DDM (su içinde CMC ~ 0.17 mM) ve düşük CMC deterjanlar kullanmak zorunda. Küçük hidrofobik gözenekli Boncuk Bu deterjanların 14 kaldırmak için kullanılır.
    1. Tanelerin hazırlanması. 0.5 kuru boncuk g ve 50 ml Corning tüp içine koymak dışarı ağırlığı, 20 ml metanol ekleyin 5 dakika boyunca 5000 rpm'de boncuk aşağı doğru döndürün, tuzak kabarcıklarını çıkarmak için 5 dakika boyunca banyo sonikatör çözüm sonikasyon ve sonra süzün en metanol. MilliQ etanol ve su ile yıkama tekrarlayın. Yıkanan boncuklar ile 4 ° C'de% 20 etanol içinde saklanır veKullanmadan önce bir deterjan-ücretsiz tampon için değiştirilmesi gerekir.
    2. Tedavi edilecek olan protein / yağ / deterjan karışımı içinde deterjan miktarı tahmin ve deterjanların aynlması için gerekli boncuk miktarını hesaplar. DDM ve DM için, bağlama kapasitesi 10 mg deterjan için 100 mg boncuk olduğunu. Fazla su olmadan ıslak boncuk tartılır ve protein karışımına doğrudan ilave edilir. En az 15-20 dakika tam olarak etkili olması için boncuk için gerekli ve deterjan konsantrasyon azalması sabit bir düzeyde 14-16 ulaşır. Böyle bir Bio-Boncuk SM2 olarak ~ 18 mM'ye eşdeğer 1.0 ml çözelti, polistiren boncuklar 87 mg toplam bölgesi DDM (dodesil-maltoside) 8.7 mg kaldırmak için, beş eşit parçalar kullanılır. Oda sıcaklığında sabit sonu aşırı uç rotasyon ile 20-30 dakika her fraksiyonu ile protein / yağ / deterjan karışımı karıştırın, boncuk aşağı spin boncuk bir sonraki bölümü için süpernatant transferi, ve sonuna kadar tekrarlayın.
      , Deterjan concentrtirme onun CMC ulaşır, böylece kasıtlı deterjan çözeltisi içinde az miktarda büyük olanları içine vesiküller füzyon kolaylaştıracak şekilde, bir saat için bu süre boyunca uzanır.
    3. Son adımdan sonra deterjan kalıntılarını uzaklaştırmak için, 35 mg, Bio-Rad SM2 boncuklar ilave ediniz ve 4 saat boyunca veziküller ile inkübe edin.
      Deterjan çıkarılması için işlemler yeni bir protein için uygulanacak olan yukarıda tarif edildiği zaman, o ~ 1:10 protein / yağ oranı (ağırlık / ağırlık) ile başlamak genellikle tavsiye edilir. Lipit / deterjan karışımı dikkatle yeterli deterjan tamamen lipid (Şekil 2A) çözünür hale getirmek için eklenir, böylece hazırlanmış olması gerekir. Bu sürekli çalkalanarak (400 rpm) veya uç üzerinde uç dönme ile oda sıcaklığında (1-2 mM DTT) ile birden fazla 2 saat süreyle lipid deterjan karışımı inkübe önemlidir. Protein lipidler ile karıştırıldığında, protein / yağ / deterjan karışımı (gece boyunca proteinin stabl olduğu kadar uzun olursa, inkübe edilmelidire) protein içeren miseller ve proteinsiz miseller arasında deterjan ve lipit dağılımı nispeten eşit olduğunu, oda sıcaklığında ya da ya da soğuk bir odada. Biobeads kullanılarak deterjan hızlı çıkarılması kullanılır, buna ek olarak, bu boncuk deterjan bağlama kapasitelerinin belirlenmesi önemlidir. Deterjanların yavaş kaldırılması muhtemelen proteinler bütünlüğünü korumak ve nispeten büyük hacimli veziküller yerleştirildiğinde olmak için yeterli lipidler sahip olmasını sağlar.

2.3. Proteoliposome depolanması ve kalite kontrol

  1. Veziküller hazır sonra sıvı azot içine doğrudan daldırma ile hacimde, 50 ul kısma hazırlamak ve flash-dondurma. Dondurulmuş veziküller daha sonra -80 ° C'de derin dondurucuda saklanır. Donma-çözülme döngüsü bazen cys özel reaksiyon içine eserleri tanıtmak bulunmuştur çünkü biyokimyasal testlerde, biz dondurulmuş veziküller kullanmayın. Elektrik kayıt içins, sadece en az 6 ay süreyle -80 ° C'de saklanır veziküller kullanın.
  2. Bir yoğunluk gradyanı içinde veziküllerin flotasyon (Şekil 2B)
    1. 4, 4 saat boyunca 200,000 g'de 10 mM HEPES ve sıkma yapılan 0.3 ml 10, 35 her biri ve% 55 sükroz içeren sukroz gradyanı tabakalarının üst ° C. vezikül süspansiyonunun 50 ul yük Hızlandırın ve katmanlar arasındaki arayüzün kesintileri önlemek için yavaş yavaş yavaşlatmak.
    2. Alt üst 100 ul kesirler toplamak ve bir indirgeyici olmayan SDS-PAGE (Şekil 2B) bunları çalıştırın. KvAP 0.5-1.0 mikrogram protein bir grup açıkça görülebilir şekilde Coomassie mavi ile iyi lekeli. KvAP protein 10 ve% 35 sakaroz arasındaki ara yüzeyde bulunan edilmelidir. Proteinlerin Resim ağır agrega hemen hemen tüm proteinlerin membran olduğunu gösterirken, yüksek yoğunluk aralığında görülür.
  3. Veziküllerinde KvAP kanalının doğru şeklinin. <Girişbr /> Daha önceki veri düzgün bilayers entegre tek bir sistein mutant (L125C/C247S) KvAP, tam membranlar gömüldü ve sistein özel reaktifler 8 tarafından erişilemez tespit. Sulandırma işlemleri bu mutant kanalı ile test ve Cys özgü reaktif, MTS-PEG5000 tarafından kontrol edildi. Oda sıcaklığında 1.0 uM MTS reaktif ile L125C az bir değişiklik bir indirgeyici olmayan SDS-PAGE jel KvAP grup için bir 5kDa kayma getirmektedir. Bizim sulandırma prosedürlerin başarılı bir şekilde uygulanması bilayers tüm kanalların neredeyse tam ekleme düşündüren, fosfolipid zarları L125C mutant kanallar için bir tespit tepki yol açacaktır. Reaksiyonun Bir pozitif kontrol olarak, 5.0 mM DM MTS reaktif erişilebilir mutant kanallarda hemen hemen tüm L125C kalıntıları işlemek için eklenir.
    Alternatif olarak, bu tür chrybdotoxin gibi bir gözenek bağlayıcı toksin, tetramerik kanalları saymak için kullanılabilir. Gibi bir antikor-bazlı bağlanma(Fv KvAP için bir biçimi spesifik bir ligand olarak hazırlanır Kutu 2, bkz) demek sulandırılmış veziküllerinde mevcut bağlanma ölçmek için kullanılabilir. Bu bağlama deneyleri daha sonra sulandırılmış kanalları fraksiyonu tetramerleri ve proteinin hangi bir kısmı düzgün bir voltaj sensörü kanadı (gerilim sensörünün S3/S4) sahiptir anlamaya için toplam proteinin ölçen bir nicel analiz ile karşılaştırılabilir katlanmış.
    Diğer proteinlerin yeniden olması için, ne sulandırılmış proteinlerin kısmı düzgün bir şekilde katlandığı değerlendirmek için nicel bir yöntem sunmak için tavsiye edilir. Dikkatli fonksiyonel inceleme böylece başarılı sulandırma için iyi bir kalite kontrol geliştirmek için bir ön koşuldur.

3. Sulandırılmış Kanal içeren veziküller Uygulamaları

3.1. Fonksiyonel siyah lipid zarlarında iyon kanalı faaliyetleri çalışma.

N hazırlanmasıeeded malzemeleri.

  1. Lipid Preparasyonu
    1. Bir cam test tüpü, teflon yüzeyli vidalı kapaklı bir kehribar küçük şişeye, ve kloroform ile cam şırıngalar bir dizi temizleyin. Argon gazı akışı altında kehribar küçük şişeye kurutun.
    2. Transferi 0.75 mg PAPA ve 0.25 mg kehribar şişeye kloroform POPG ve argon gazı ile kloroform buharlaşır.
    3. 0.20 mL pentan ve kalıntı kloroform çıkarmak için tamamen kuru ile kurutuldu lipidler yıkayın. Son olarak 50 ul dekan içinde lipidler çözülür. Dekan (20 mg / ml) içinde lipidler deneysel bir iki tabakalı bir kap (Şekil 3A), bir tarafında inceltilmiş kısmı delinen 150-250 mikron deliği (Şekil 3B) arasında bir lipid iki-tabakalı boyama için kullanılır.
  2. Çözelti hazırlama
    1. Hücre içi çözeltisi (trans): 10 mM HEPES / KOH, pH 7.4, 15 mM KCI
    2. Hücre dışı çözelti (sis): 10 mM HEPES / KOH, pH 7.4, 150 mM KCI
    3. Tuz köprüsü: Bend cam kılcalU-şekilli bir köprü olarak, ve hücre dışı çözelti içinde çözünmüş% 1.0 erimiş agar ile doldurun.
      Trans ve cis çözümleri arasında kurulan ozmotik degrade çift katlı lipid 17 vezikül füzyon için ana itici güç olarak bulunmuştur. Negatif yüklü lipidler için, 15 mM CaCl2 ya da pozitif yüklü poli-arginin füzyon peptidler Olayları uyarabildiği bulunmuştur. Bu tür DOTAP ve köpekler, vb gibi füzyojenik lipidler, lipid içine olabilir füzyon olayların olasılığı yüksektir, böylece veziküller.

Çift katlı lipit katmanını içinde KvAP kanallardan Elektrik kayıtları

  1. Çift katlı fincan (Şekil 3B) silindirik yüzeyinde açılmış olan yuvarlak delik (çap ~ 0,25 mm) Ön boya. Lipidler Laboratuarda yapılan bir kılcal havan tokmağı ile aktarılır. Kılcal havan eli turunda Kafa parlatılmış ve fincan yuzeysel değildir. ThKılcal havan eli tarafından taşınan lipit e az miktarda çift katlı kap içinde deliğin çevresinde yayılır ve hava ile kurutulur.
  2. Dekan tamamen buharlaşması böylece 1-2 dakika bekleyin. Bakım delikten girmesini lipid çözüm önlemek için alınmalıdır.
  3. Kayıt odasına fincan yerleştirin ve tuz köprüleri koymak ve kayıt fincan iki taraf (Şekil 4A) için elektrotlar bağlayın. Cis-ve deliğin her iki tarafına da ötesi solüsyonu eklenir. Bir ozmotik degrade çift katlı lipid içine veziküllerin füzyon kolaylaştırmak için kurulmuştur.
  4. ~ 0 (genellikle <2 milivolt) için fincan iki taraf arasındaki ofset potansiyel ayarlayın. Dekan lipid karışımı, küçük bir miktar aktarımı ve bir iki katmanlı membran oluşana kadar deliğin karşısında lipid boyamak için kılcal havaneli kullanın. Iki tabakalı oluşumu bir rampa darbe teslimatı sırasında elektrostatik kapasite akımını kayıt ile tespit edilir.
  5. Membran kadar bekleincelir ve nispeten istikrarlı hale gelir. 3-5 dakika membran kapasitans daha değişiklik yoktur kadar beklemek.
    , Büyük bir delik üzerinde oluşturulan düzlemsel çift katlı hakkında genel düşünce zarının çok orta kısmı normal bir iki tabakalı olarak kalın ~ 4.0 nm olarak yakın olmasıdır, ve bu deliğin kenarına yakın aldığında membran kalın haline orada bir halka çevresinde ve dekan çözücünün çoğu, 19 18 olduğu. Bu zarın iki tabakalı merkez kısmında kalan artık dekan var olması kaçınılmazdır. N-dekan karşı PC hacminin oranının tahmini geçmiş iki tabakalı 18, 20-22 inceltilerek 0,35-0,45 oldu. EM inceltilmiş çift katlı incelenmesi bir çift katlı 22 iki broşürler arasında sıkışmış dekan lensler olduğunu gösterdi. Bu veriler, iki tabakalı lipid membranlar takılı olan membran proteinlerinin dekan küçük ada (çapı en fazla 50 mil) ile bir arada önerdi. Kalıntı dekan in iki tabakalı de 0.4-0.5 ölçülen elektrostatik kapasite göre inceltilmiş iki tabakalı büyüklüğü kaba bir tahminini elde etmek için kullanılabilir μF / cm 2, sabit elektrik kapasitesi azalır. 100 pF kapasitans bir iki tabakalı çapı ~ 180 um arasında dairesel bir iki tabakalı bir zar gelmektedir.
    KvAP için, artık dekan kanal fonksiyonu dikkatle, solvent içermeyen iki tabakalı incelenmiştir değil olsa bile, kendi voltaj bağımlı yolluk zarar vermedi. Aynı NaChBac kanalları ve BLMs 23 takılı Kv1.2 kanallar için de geçerli olduğu ortaya çıktı. Bu oosit kanalları için dekan-çift katlı lipid göreli olarak Kv1.2 kanallarından ölçülen GV eğrisinin önemli sol-shift artık dekan 23 ile ilgisi olup olmadığı henüz belli değil. Iki tabakanın oluşturulmasında kullanılan lipid bağlı olarak, iki tabakalı olarak kalıntı dekan miktarı değişebilir. Örneğin ettiği rapor edilmiştir düzlemsel lipit membr oluşumunuMGDG bölgesinin anestezi (mono-galaktosil-diasilgliserol) dekan molekülleri ile dolu olan konik MGDG arasındaki yarıklar nedeniyle muhtemelen dekan gerektirir. Artık dekan incelenecek proteinler üzerindeki etkileri olup olmadığı tamamen ampirik ve deneysel etkisinin önemsiz olup olmadığını söylemek için gereklidir.
  6. En kısa sürede membran istikrarlı olduğunda, 0.5-1.0 ul kanal içeren sağ delik üzerinde bir P2-pipet ince sonuna konumlandırarak veziküller ateş. Veziküller fincan altına delik boyunca aşağı düşer.
    Bu işlem sırasında, birden fazla veziküller delik boyunca membrana bağlı hale gelir. Yeterli zaman göz önüne alındığında, bir KvAP kanalları az sayıda düzgün membran merkezine kısmen düzlemsel iki tabakalı eklenir, böylece iki tabakalı bir kısmına birleştirilir. Ozmotik eğimi ve elektrostatik etkileşim hem de ikili lipid tabakalarıdır 17, 24 içine veziküllerin füzyon önemlidir.
  7. Test etmek içinçift ​​katlı olarak KvAP kanalları, 80 mV kısa bir darbe -80 mV tutarak potansiyelinden teslim edilir. Hızlı inaktivasyonu inaktive eden yavaş iyileşme, uzun bir aradan (PE / PG zarlarında kanallar için ~ 120 sn) nedeniyle iki darbe arasında verilir. Bir PAPA / POPG zarındaki kanallar tipik bir geçerli kayıt Şekil 3C gösterdi. Mevcut küçükse, daha veziküller ateş. Mevcut boyutu iyi görünüyor sonra, zarın her iki tarafında Çözeltilerin iyon konsantrasyonu dengesi. Kanallar elektrofizyolojik deneyler için hazır bulunmaktadır.

3.2. Veziküllerinde kanallarına karşı konformasyon spesifik ligandlar için tarama

  1. Faj görüntülemeli kütüphane giriş.
    Faj görüntülemeli 20-mer peptit kitaplığı filamanlı bakteriyofajın FD-tet 25, bir ucunda plll proteinlerin beş kopya N-ucunda bulunur. Kütüphane yaklaşık sunulur. 1 x 10 8 farklıdırrastgele 20-mer peptid dizilerinin ent türleri ve nazik UT Güneybatı Tıp Merkezi 26 Dr Kathlynn Brown laboratuvar tarafından bize verilmiştir. E. içine faj enfeksiyonu coli K91 12 mg / ml tetrasiklin için bakterilerin dirençli hale getirir.
    Bakteri kültürü için ayrıntılı bir prosedür, fajlar ve faj kolonilerin dizi güçlendirme ve titering Bir sonraki bölümde temel işlemleri kısa bir açıklama verecek McGuire ve ark. 26 tarafından tarif edilmiştir. Okuyucular McGuire kağıt daha fazla bilgi bulabilirsiniz. Bunun yerine veziküllerde yeniden iyon kanalları (Şekil 4A) sıkıca bağlamak özel klonların izolasyonu üzerinde durulacak.
    Bizim ekran arkasındaki temel fikir özellikle sulandırılmış kanalları bağlı faj veziküller ile aşağı çekilebilir olmasıdır. Bağlı faj lipid membranlarda kanalları karşı güçlendirilmiş ve test edilebilir. Bizim çalışmafarklı lipid membran KvAP gerilim sensörleri konformasyonel değişiklikler 8 bu ana grup bölgelerde fosfat içermeyen kişilerce normal fosfolipidlerden lipidler geçiş "aktive edilmiş" ya da "istirahat" durumları ya da gerilim sensörleri tutmak mümkün olduğunu göstermiştir (DOTAP ve deneylerde KÖPEK). Bu iki lipid belirlenmiş konformasyonları konformasyon spesifik ligandlar eden taramasında kullanılır. Faj kütüphanesi ilk DOTAP ve KÖPEKLER membran (pozitif seçim) kanallara sıkı bağlayıcı için seçilen önce fosfolipid veziküllerde kanalları (negatif seçim) ile doymuş olacak.
  2. Faj seçimi arkasında temel işlemleri
    LB ortamda K91 bakteri Büyüme: bakterilerin iki katına çıkma süresi 37 20 dk ° sallayarak 200 rpm ile C.
    Kütüphanenin amplifikasyonu: OD0.4, bakteriler K91 ile faj solüsyonu karıştırın. 37 C'de 15 dakika inkübasyondan sonra° C, karışımları 12 mg / ml tetrasiklin içeren -9.5 x 9.5 inç 2 agar plakaları üzerine eşit yayılır, büyük tabak kullanılması daha yüksek büyüme oranlı sahip bakterilerin kültür egemenliği önler. Kütüphane çeşitliliği küçük bir kez, 10 cm'lik petri seçimi ve küçük ölçekli amplifikasyonu için kullanılır.
    Bireysel klonların Büyük ölçekli amplifikasyon: 250 ml LB artı 5 mM MgSO 4 ve 12 ug / ml tetrasiklin içine fajları (~ 100 milyon) çok küçük bir kısım inoküle 37 ° C gece boyunca büyümeye 10 dakika için 6000 rpm dönüş hücreleri toplayın. Süpernatan toplamak ve 0.2 hacim / hacim Çöktürme tamponu (2.5 M NaCl,% 20 PEG8000) ilave edin. 1.0 saat boyunca buz üzerinde inkübasyondan sonra, pelet tüm fajlar 30 dakika boyunca 17,000 x g'de santrifüj çözeltisi. 30 dakika buz üzerinde inkübe 1.0 ml PBS, yavaşça pelet (yok vorteks) tekrar süspansiyon ekleyin, tüm süpernatantı. Yeni bir tüp süspansiyonu aktarın ve 14,00 de santrifüj2 dakika boyunca 0 dak. Başka bir tüp süpernatant aktarın ve 65 inkübe ° C tüm bakterileri öldürmek için 15 dakika su banyosu. 13.000 rpm'de 2 dakika için tüp santrifüj. Pelet, kısım atılır ve -80 ° C 'de faj solüsyonu depolamak
  3. Lipid veziküller içinde KvAP kanalları karşı faj kaydırma.
    1. Peptid-görüntüleme fajlar yükseltilir ve deneyler çok birim hacim başına faj sayısı bilinmektedir daha önce titre edilmesi gerekir. KvAP negatif kontrol olarak ve köpeklere POPE / POPG (3:1) artı% 0.50 Biotin-DOPE veziküller içine yeniden oluşturuldu: DOPE-biyotin (199:1; aynı DOTAP kesesi ile yapıldı) seçimi hedef olarak kullanılır. Veziküllerinde KvAP nihai konsantrasyonu 0.50 mg / ml 'dir, ve lipitlerin 5,0 mg / ml' dir. Kaydırma tamponu 500 mM KCI, 100 mM HEPES / KOH, pH 7.4, ve 0.10 mg / ml BSA içeriyordu.
      Ilk çalıştırma için, ~ 10 fajlar 10 (her bir tipi için 100 kopya) 0.050 ml LB vasatı ile seyreltildi. Sonraki kaydırma adımları, st içinarting faj 10 Haziran - 10 Ağustos içinde olması ayarlandı.
    2. Negatif seçimi:
      1.0 mL kaydırma tamponu içinde, 100 ml NeutrAvidin agaroz boncukları (Pierce reçine ml'si başına bağlayıcı, 1-2 mg biyotinile edilmiş BSA yeteneğine sahip) ile 50 ul LB seyreltilmiş fajlar inkübe edin. 10 dakika inkübasyondan sonra, 1.0 dakika boyunca 100 xg'de onları iplik ve boncukları ayırın. Iki kez boncuk doğrudan bağlamak herhangi bir faj kaldırmak için bu adımı yineleyin.
      Hiçbir protein içeren 50 ul boş veziküller ile bir önceki adımda (PAPA / POPG artı% 0.5 biotin-DOPE) gelen sol-over faj karıştırın. Bir başka faj vezikül karışımına kaydırma tamponu ile yıkanmış olan 100 ul NeutrAvidin boncuk ekleyin. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında karışım döndürdükten sonra, 30 saniye boyunca 100 x g ile sıkma boncuk kaldırmak. Biyotin-DOPE (199:1) yanı sıra, Papa / POPG veziküllerinde KvAP kanalı (% 0.5 biyotin-DOPE ile): Bu adım, köpekler boş veziküller için tekrarlanır. Bu tedavilerin konteyneri sonra süpernatantns faj tam temizlenir. İlk iki ekran döngüsünden sonra, ön onay PAPA / POPG veziküllerde KvAP karşı gerçekleştirilmelidir olabilir.
    3. Pozitif seçimi
      10 dakika süre ile oda sıcaklığında 100 ul boncuk NeutrAvidin varlığında biyotin-DOPE (199:1) veziküller (DOTAP veziküller için aynıdır): köpeklerde KvAP kanalları tamamen temizlenmiş fajlar inkübe edin. 10 dakika boyunca 100 x g'de santrifüj önce kaydırma tampon kullanılarak 15 ml karışım hacmi getirin. Boncuk toplayın ve 45 ml kaydırma tampon ile üç kez yıkayın.
    4. 5.0 ug / ml biyotin içeren 500 ul LB ortamı içinde yeniden süspanse boncuklar ve yerli biyotin daha düşük bir afiniteye sahiptir NeutrAvidin, ikinci bağlanmış fajlar bazı serbest bırakmak için, iki saat boyunca oda sıcaklığında karışım inkübe edin. Bir dakika için 100 xg dönüş ile boncuk ayırın. Titering için iki farklı tüp içine süpernatan ve boncuk toplayın.
    5. Seçilen fajlar, m amplifiye etmek için500 ul K91 bakteri kültürü ile son adım (OD600 ~ 0.4-0.6, kültürlü ~ kullanıldığı 4 saat önce) içinde yüzen ya da süspanse boncuk ix 200 ul. 37 saat kuluçkaya yatırıldıktan sonra ° C de bir gece kültürü için tetrasiklin plakalar üzerinde her biri 15 dakika, levha 50 ul için.
      Tüm faj kolonileri kurtarmak ve yükseltmek için ilk iki ekran döngüsü sırasında (Şekil 4A), son adım tüm 500 ul süpernatant ve boncuklar toplamak 5 ml bakteri kültürü ile karıştırın ve 9.5 inç kare plakaları plaka bunları . Bu adım, bakteri diğerlerine göre daha yavaş büyür yapmak bu fajların yeniden elde etmek için önemlidir.
    6. Plakalardan koloniler (McGuire ve ark., 26) kaydırma ve seçimi bir sonraki döngü önce yükseltilir ve titre edilir.
    7. Kanallarda olumlu seçilen faj faaliyetleri inceleyin.
      Seçim 10-12 döngüsünden sonra, lipid bila en KvAP kanallarında toplam güçlendirilmiş faj testiyers PAPA / POPG yapılmıştır. Pozitif klonların önemli bir kısmı ise gerekli dinlenme durumunda stabilize kanallarına karşı seçme gibi, 100-500 nM'de seçilen fajları (Şekil 4B), iki tabakalı bir kanallar önemli bir kısmını bloke edilmelidir. Pozitif veri dinlenme durumunda kanallara güçlü bağlayıcı gösterecektir klonlar olduğunu göstermektedir. Seçim 16 döngüsünden sonra, tek koloni sıralama için 50 pozitif koloniler almak. Tespit görünen faj klonlarının dizilerinin kıyaslanması seçilir ve amplifiye edilmiş ve iki tabakanın kanalları karşı test edilir. Olumlu klonlar teyit edildikten sonra, güçlü pozitif klonlar taşıdığı peptidler sentez ve uyum özgü faaliyetleri onaylamak için de kanallarında test edin.

3.3. Yapı tayini 27-29 için zarlarında KvAP kanallarının kristalleşme

  1. Bölgesinin yapısını kararlı hale getiren Tokanalı, kanal, 33H1 Fv bir protein konformasyonu spesifik bağlayıcı, KvAP / Fv kompleks oluşturmak için kullanılır. Fv protein hazırlanması kutu 2'de ayrıntılı olarak verilmiştir. Bir Superdex 200 kolonu içinde karmaşık arındırın. Sistemimizde 11,4 civarında ml karmaşık Yıkamalar.
  2. Başlangıç ​​ekranı için, tamamen DM veya β-OG içinde çözünür hale DMPC veya POPC ile protein karıştırın. Protein / yağ / deterjan karışımı karışık miseller arasında üç bileşenden dağılımında bir termodinamik dengeye ulaşmak amacıyla en fazla 15 saat boyunca karıştırılır. Genellikle ilk üç farklı yağ / protein oranları (LPR = 0.5, 1.5, 2.5) ve üç farklı pH seviyeleri (6.0, 7.0, ve 8.0) test edin. Diyaliz tamponu, 20 mM K-fosfat tamponu, 100 mM KCI, 3.0 mM ve NaN3 içerir. Diyaliz tamponu 2-3 günde bir değiştirilir. Kristaller küçük bir kısım veziküller oluşması ve kristalimsi kafes olası görünümünü incelemek için her 2-3 günde bir dışarı alınır.
    Bir tabloid listesiLPR'nin genel pH lipid iki farklı proteinin özelliklerini belirlemek için kullanılır. Biz diyaliz örnekleri negatif leke EM incelendiğinde (fazla 150 nm) nispeten büyük ölçekli kesecikler veya membran yaprak elde etmek istiyorum. Zarlarında küçük bir düzenli desen bir hit göstermektedir ve daha fazla optimizasyon yol kullanılacaktır.
    Negatif-leke EM: karbon film (~ 3-5 nm kalınlığında) ile kaplı Bakır ızgaraları vardır kızdırma-taburcu karbon yüzeyi hidrofilik yapmak için havada. Kristallerin süspansiyon küçük bir miktarda (2-3 mikrolitre) karbon yüzeyi üzerine yüklendi ve 0.5-1.0 dakika boyunca inkübe edilir. Whatman # 4 filtre kağıt parçası bir yırtık kenarı ile yan ızgaraları kurulayın. Izgara Flip ve 150 mikrolitre boyama solüsyonu (% 2.0 bir damla üst ~ 15 sn için inkübe PTA / KOH, suda pH 8.0 artı 0.5% trehaloz; veya 6.0% amonyum molibdat / KOH, pH6.3-6.5 , su artı% 0.5-1.0 trehaloz). Mümkün olduğu kadar t çözüm Bloto ızgara yüzeyi ve ızgara muayene için bir TEM yerleştirmeden önce kurumasını bekleyin. Veziküllerin Görüntüler elektronlar herhangi bir kristal ambalaj zarar görmemesi için düşük doz koşul altında alınır.
  3. Ekranı doğru bir LPR ulaşmak için LPR'nin küçük adımlar incelemek için genişletilir. Protein kristalleştirme için uygun ise, membran proteinlerin küçük bir kafes görünür hale gelebilir. Başlangıçtaki bu koşulların civarında, daha da tuz türleri ve konsantrasyonları, sıcaklık, hız ve deterjan temizleme, iki değerlikli katyonlar, proteinlerin hazırlanması için kullanılan deterjanlar, çöktürücü, lipid bileşimin vb yöntemleri değişen kristalleştirme optimize
    KvAPΔ36/Fv kompleksinin optimize edilmiş 2D kristalleri 20-30 mikron (Şekil 5A) için birkaç mikron büyük levhalar bu aralığı içine büyür. Dört kat simetrik chan beklendiği gibi cryoEM koşullar altında, kristalleri belirgin dört kat simetri ile açık kare örgü göstermeknels (Şekil 5B ve C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Biyokimyasal homojenlik içine KvAP kanalın üretilmesi için deneyler genel akışı Şekil 1A tarif edilmektedir. Proteinin ekspresyonu ve saflaştırılması sırasında tipik örnekleri, Şekil 1B 'de SDS-PAGE jel gösterdi. IMAC saflaştırmadan sonra proteinin nispeten saf. KvAP kanalın verimi yaklaşık 1.0 mg / litre cinsinden bir kültürdür.

Deterjanlarla lipid veziküllerin çözünmüş lipid vs deterjan her çift için çok çaba harcanması gerekiyor. DM tarafından PAPA / PAPA küçük tek lamelli veziküllerin çözünürleştirme Şekil 2A sunulmuştur, veziküller flotasyon elde edilen sonuçlar genellikle oldukça açıktır. Gradyanlar elde edilen kısımların SDS-PAGE analizi Tipik sonuçlar, Şekil 2B'de gösterilmektedir. Sükroz yoğunluk gradyeni, kanal içeren POPE / POPG veziküller genellikle% 10 tabakası arasındaki ara yüzeyde yoğunlaşmıştırd% 35 katmanı. KvAP içeren DOTAP veya köpek veziküller hafif ve genellikle arabirim ara% 5 ve% 10 (% 10 hafif tabaka içine nüfuz) vardır. Çok katmanlı veziküller önemli bir kısmı vardır, bunlar, genellikle% 10-35 arayüzü altında konsantre edildi ve beyaz vardır. Bu genellikle protein-deterjan-lipid karışımı yeterince uzun lipidlerin iyi bir dağıtım ulaşmak için inkübe değildi olur bulundu.

Düzlemsel lipid tabakalarıdır dahil KvAP kanallardan elektrik kayıtları Şekil 3 'de gösterilmiştir. Tipik akım iz -80 mV, kanalları sessiz olduğunu göstermektedir. +80 MV arasında geçiş hızlı bir kapasitans tepe (voltaj anahtarlama zaman keskin bir) yol açar. Mevcut bir yavaş yükselen faz kanalları etkin olmak ve dışa potasyum mevcut yapmak mümkün olduğunu göstermektedir. Yükselen fazın tepe sonra, akım, inaktivasyon adlı bir adım azalmaya başlar. Inactivatitamamlamak için birkaç yüz milisaniye sürer. Voltaj -80 mV tekrar açıldığında sonra, açık kanallar kapanış yansıtır ve devreden çıkarma (Şekil 3C) denir aşağı kapasitans zirvesinden sonra geri faz vardır.

Faj ekranı ortasında, böylece POPE / POPG arasında iki tabakanın en KvAP kanallarında güçlendirilmiş faj aktivitesi test edilmiştir. 12 seçim döngüsünden sonra, amplifiye fajlar kanal aktiviteleri (Şekil 4B, seçilen faj) inhibe etti. Ancak başlangıç ​​faj görüntülemeli kitaplığı kanalların (Şekil 4B, kontrol faj) üzerinde herhangi bir etki göstermemiştir. Pozitif fajlar, sadece düşük bir konsantrasyonu, yaklaşık çünkü seçilen faj aktiviteleri çok yüksek değildi rağmen, net, tekrarlanabilir etkileri, yüksek bağlanma afinitesi sergiler aktif, pozitif klonların var olduğunu ispat etmiştir, seçici esnasında zenginleştirilmiş olmalıdır Kalan tarama cycles ve bir kez zenginleştirilmiş, membran kanallarında güçlü inhibitör aktiviteler olması muhtemeldir.

2D kristalleri tarama erken aşamasında, birçok küçük kesecikler küçük kafesler gördüm. Optimizasyonu ile, bazı büyük yaprak çevresinde küçük veziküller (Şekil 5A) bir sürü geldi. Bu kristallerin cryoEM görüntüleri her zaman daha optimizasyonu daha iyi kristaller elde etmek için gerekli olduğunu düşündüren, yerel kusurları (Şekil 5B) bir sürü gösterdi. Kristalleri iyi optimize edildiğinde, keskin kenarları sergilenen ve tek yaprak olarak ortaya çıktı. Yüksek büyütmede, tek tek birimler açıkça çok daha iyi (Şekil 5C) sıralanmıştır.

Reaktif / Malzeme Adı Şirket Katalog Numarası Yorumlar
Tripton RPI Corp T60060
Maya Özü RPI Corp Y20020
NaCl Balıkçı S271-3
Tris Baz RPI Corp T60040
Potasyum Klorür Balıkçı BP366-500
N-Dodesil-β-D-maltoside Affymetrix D322S Sol-sınıf
N-oktil-β-D-glukozid'in Affymetrix O311 Ana sınıfı
Aprotinin RPI Corp A20550-0.05
Leupeptin RPI Corp L22035-0.025
Pepstatin A RPI Corp P30100-0.025
PMSF P7626
DNase I Roche 13407000
Biyo-Boncuk SM-2 Bio-Rad 152-3920
HEPES RPI Corp H75030
PAPA Avanti Polar Lipids 850757C
POPG Avanti Polar Lipids 840457C
KÖPEK Avanti Polar Lipids 870314C
DMPC Avanti Polar Lipids 850345C
Biotin-DOPE Avanti Polar Lipids 870282C
DOTAP Avanti Polar Lipids 890890C
NeutrAvidin agagül boncuk Piercenet 29200
Diyaliz Boru Spektrum Laboratories, Inc 132-570
Pentan Balıkçı R399-1
Dekan TCI America D0011
MTS-PEG5000 Toronto Araştırma Kimyasalları M266501

Tablo 1. Reaktifleri ve materyalleri listesi.

  • Inkübatör sallayarak bakteri kültürü
  • Spektrofotometre
  • Mikro-prob sonikatör
  • Rock'çı
  • Bakteri kültürü toplamak için ve konsantre örnekleri için zemin modeli santrifüj
  • Boş sütunlar
  • Superdex 200 kolonu, bir FPLC sistemine bağlı

Tablo 2'de. Ekipman gerekli.

Tampon adı Içindekiler
IMAC Lizis tampon 50 mM Tris (pH 8.0), 100 mM KCI
IMAC yıkama tamponu 50 mM Tris (pH 8.0), 100 mM KCI, 5.0 mM DM
IMAC yıkama tamponu 50 mM Tris (pH 8.0), 100 mM KCI, 5.0 mM DM ve 300 mM imidazol
SDS numune tamponu (5X) (indirgeyici olmayan) 60 mM Tris-HCl (pH 6.8),% 25 gliserol,% 2.0 SDS,% 0.10 bromofenol mavisi. (% 1.0 2-mersaptoetanol indirgeyici tampon olmak için eklenmiştir).
SDS-PAGE (4X) için jel tamponu İstifleme 0.50 M Tris-HCl (pH 6.8),% 0.40 SDS
SDS-PAGE (4X) için çözüm jel tamponu 1.5 M Tris-HCI (pH 8.8),% 0.40 SDS
FPLC equilibtayın 20 mM Tris, pH 8.0, 100 mM KCI, 5.0 mM DM
Lipozom diyaliz 10 mM HEPES, 100 mM KCI

Tablo 3. Tampon İsim ve içerik.

Şekil 1
Şekil 1. Sulandırılacak KvAP hazırlanması. Protein ekspresyonu, saflaştırılması ve sulandırma bir. Genel iş akışı. Proteinin B. Biyokimyasal arıtma. E. Bağlı kültürü coli XL1-Blue ifade KvAP işlenir ve KvAP saflaştırılmıştır. Hücre kültürlerinin yirmi mikrolitre önce (şerit 1) veya sonra (şerit 2) indüksiyon, deterjan özü (yol 3), IMAC kromatografisi ikinci akış yoluyla (hat 4), iki adet yıkama adımları (şerit 5.6) ve toplam olarak 5.0 mikrogram sonra, proteinin300 mM imidazol elüsyon (şerit 7) ve boyut dışlama, FPLC ve KvAP tetramer üzerinden (şerit 8) 5.0 mg% 12 SDS-PAGE ve Coomassie mavi boyama olmayan azaltmaya tabi tutulmuştur.

Şekil 2,
Şekil 2. PAPA / POPG veziküllerde KvAP bir Sulandırma. Deterjan konsantrasyonlarının bir fonksiyonu olarak. Veziküllü füzyon ve çözündürme. 410 nm'de absorbans veziküller (bazal hiçbir deterjan fraksiyonuna çıkarılır) ışık yayılması izlemek için kullanılmıştır. Lipidler (PAPA / POPG 3:1), 10 mg / ml idi. Güçlü Sonication sonra küçük tek tabakalı veziküller, monodispers ve çapı 30-50 nm kendi boyutları nedeniyle zayıf saçılması vardır. Deterjanlar tanıtıldı, onlar çözüm faz ve lipid membran fazı arasında dağıtılmıştır. Küçük içinde güçlü bir eğriliği nedeniyle tek lamelli vesiküller, katılan deterjan tetik vezikül füzyonu ve eğrilik salım (bu nedenle düşük yüzey potansiyel enerji). Erimiş veziküller boyutu büyük olan ve 410 nm dalga boyunda güçlü saçılma göstermektedir. Tepe yükselen fazı (gri renkli alan) bu nedenle, deterjan indüklenen füzyon, veziküller protein misel füzyon için iyi bir rejim yansıtır. Sağ emme zirve bir deterjan (burada örnek olarak DM) konsantrasyonu, gerçekten eden sulandırma işlemi için seçildi. B. sulandırılmış KvAP veziküllerin elli mikrolitre (KvAP 0.5 mg / ml), sükroz yoğunluk gradyeni ile ayrılmıştır. Sukroz gradyanı alt üst (1 ~ 9) ile 100 ul fraksiyon Numuneler, SDS-PAGE% 12 azaltan bir kez tahlil edildi. Jel Coomassie Blue lekeli. Şerit 3 ~ 2 mg KvAP içeriyordu.

/ Files/ftp_upload/50436/50436fig3.jpg "/>
Şekil 3,. Sulandırılmış bilayers içinde KvAP kanalın elektriksel aktivite. Kurulumu bir Faraday kafesi, 1 içindeki A. Kayıt, iki elektrot, 2, trans yan, 3, cis yan, 4;. Tuz köprüsü B. deliği 5 arası çift-katlı fincan bir tarafında inceltilmiş kısmının büyütülmüş bölümünü , membran yapmak için kullanılan edilmektedir. siyah lipit zarı içine kaynaşmıştır KvAP kanalları C. Elektriksel aktivitesi kaydedildi. -80 MV tutulmakta iken, membran potansiyeli 150 ms boyunca 80 mV darbeli ve ardından tutma potansiyeli 'ye geri döndürülmüştür. Iyonik akımı Axopatch 200B amplifikatör kullanarak gerilim-kelepçe modunda kaydedilmiş.

Şekil 4,
Şekil 4. Conformati için taramaBir faj görüntülemeli kütüphane itibaren spesifik ligandlar. Iyon kanalları karşı tarama arkasında. Programı veziküllerde yeniden. Veziküller biotin-DOPE ile katkılı ve bunlar NeutrAvidin boncuk tarafından çözüm dışarı çekilebilir. KvAP kanalın belirli bir konformasyon lipidler ile kontrol edilir. Fajlar hedef yapısal durumu olarak, kanalların (burada örnek olarak DOTAP veya köpeklerde) ile inkübe edilmeden önce boncuklar, boş veziküller ve farklı bir şekle sahip kanalları veziküller karşı negatif seçim yapılır. Seçilen fajlar iki tabakanın kanal karşı yükseltilir ve test edilebilir. Ekran ortasına seçilen faj B Testi. Başlangıç ​​faj kütüphanesi (toplam:., Sarı iz - - ardından 2 dakika sonra, kırmızı iz ilave edildikten sonra 10 dakika ilave edilmeden önce en - siyah iz: seçilen faj ilave edildikten sonra farklı zaman noktalarında iki tabakalı olarak KvAP elektriksel aktivitesi 10 ~ 10 fajlar eklendiiki tabakalı kadar) iki tabakalı bir kanal üzerinde test edilmiştir ve her bir klonun sadece yaklaşık 100 adet alt sahip olmadığından, saptanabilir aktiviteye sahip olduğu tespit edilmiştir:. 12 seçim döngüsünden sonra, fajlar de farklı klonlarının bir karışımı idi. , Kanal aktivitesinin açık engellenmesi için çift katlı kurşun kanallara 10 10 faj ekleme yüksek afinite olmalıdır pozitif klonlar olduğunu düşündürmektedir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 5,
Şekil 5,. Zarlarında KvAP iki boyutlu kristalleşme. Kristal optimizasyonu ortasında olumsuz lekeli tek kat 2D kristallerin A. görüntüsü. Kristaller,% 6.0 amonyum ile boyandımolibdat, pH 6.4 artı% 0.50 trehaloz. Şeker nedeniyle, bazen birbirleriyle yığılı. Siyah kare kutu ~ 20 Â olacak kırınım noktalar ile sağ tarafta gösterilen kırınım deseni yol açar bir alan belirler. (A) kullanılan benzer bir örnek bir 2D kristal B. cryoEM görüntü. Örnek 3% trehaloz ile karıştırılır ve doğrudan daldırma yöntemi ile dondurulmuş ve bir cryoEM altında görüntülendi. Dosyasını 50,000 x elde edilmiştir. Bu kristal ambalaj yerel kusurları vardı açıktı. Daha optimize edilmiş kristal C. cryoEM görüntü. Numune,% 0.75 ve% 10 tanen trehaloz gömülmüş ve görüntü 50,000 X. düz çizgiler ve sıkı paketleme kanallarının de bir kristal olarak dizilmiş olduğu ileri sürülmektedir alındı. İki siyah ok kare örgü işaretleyin.

Kutular:

Kutu 1. IMAC sütun hazırlanması

  1. Iyice IMAC Reçine tekrar.
  2. Derhal bir 50 ml tüp içinde süspansiyon reçine gerekli miktarda aktarın. Biz, 2 L'lik kültür KvAP temizlenmesi için reçine 2 ml yatak hacmi kullanın.
  3. Reçine aşağı pelet için iki dakika boyunca 700 x g tüp santrifüj.
  4. Süpernatantı ve atın.
  5. MQH 2 O 10 yatak hacmi ekleyin ve reçine durulama kısaca karıştırın.
  6. Reçine aşağı pelet 2 dakika süreyle 700 xg Recentrifuge. Süpernatantı atın.
  7. MQH 2 O 10 yatak hacmi ekleyin ve boş sütun dökün.
  8. Reçine yerleşir kadar bekleyin ve düşük basınçlı sıvı kromatografisi için bir akış adaptörü ile sütun kapatın.
  9. Sütun ile MQH 2 O ve dengeleme tamponu 5 yatak hacmi 5 yatak hacmi çalıştırın.

Kutu 2. Fv saflaştırılması

Fv Dönüşüm - 1. Gün

  1. Dönüştürmek100 ug / ml ampisilin ve 37 ° C inkübatör içinde bir gece inkübe içeren dört LB-agar plakaları üzerine Fv-His JM83 yetenekli hücrelerin 6-60 ul, levha, bakteri içeren plazmid 100 ng.
  2. Bakteri kültürü için 6 X 1 L LB hazırlayın.

Fv ifadesi - 2. Gün

  1. LB ortamı içine plakalardan tüm koloniler hurda. Ampisilin (100 mg / L) varlığında, 6 x 1 L LB bakterilerin bu süspansiyon, ekleme ve OD600 0.5 ulaşıncaya kadar inkübe edilir.
  2. OD 0.5 ulaştığında 115 20 ° C ve RPM için sıcaklık azalır. Ne ~ 20 ° C sıcaklık düşüşü, 20 protein ekspresyonu ve bir 5 saat daha inkübe edilir ve indüksiyon başlatılması için bir eklenti anhydrotetracycline (DMF içinde 1mg/ml 100 ul 1 L) ° C, normal çalkalama ile.
  3. Hasat 15 dakika boyunca 4000 x g'de santrifüj 1 L şişe içinde bakteri. Mümkün olduğunca süpernatant dökmek. Buz üzerinde hasat bakteri Olbir gecede 4 ° C soğuk oda.

Gün 3 - bakterilerden Fv molekülleri serbest

  1. Fv salan tamponu, 150 ml (50 mM Tris, pH 8.0,% 20 sukroz, 1.0 mM EDTA) içinde yeniden süspanse bakteri.
  2. Manyetik bir karıştırma çubuğu ile karıştırılırken, 0.1 mg / ml lizozim ekleyin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde bakteri tutun. Daha sonra, 2.0 mM MgCl2 ile ekleyin ve bir 10-15 dakika boyunca buz üzerinde tutmak.
  3. 4, 30 dakika için 20,000 x g'de santrifüjleyin işlenmiş bakteri ° C Bakteriyel spheroblasts tüm pelet aşağı gitmeli ve Fv moleküllerin çoğu süpernatant olarak yayımlanır.
  4. En az 4 saat boyunca soğuk bir odada yıkama tamponu 4.0 M (20 mM Tris, pH 8.0, 100 mM NaCI) karşı süpernatant Dialyze. Günün sonunda, taze diyaliz tamponu değiştirmek ve gece boyunca dialyze. Çözelti içinde sakaroz nedeniyle, diyalizat hacmi yaklaşık% 50 oranında artırır. Diyaliz tübü fazlalığı kullanılır.

IMAC arıtma ve FPLC - 4. Gün

  1. 50 ml'lik bir tüp içinde, diyaliz tamponu ile saflaştırma IMAC reçinesi (Kutu 1 'e bakınız), 10 ml yatak hacmi dengelenmesi.
  2. 10 mM kadar MgCl2 ekleyin ve 200 ml hacmini arttırmak, borudan diyalizat aktarın. 4 ° C de 30 dakika boyunca ön-dengelenmiş reçine ve inkübe ile karıştırın
  3. Inkübe reçine ile boş kolon paketi ve 10 mM imidazol, 30 mM imidazol, her yıkama tamponu ile 5 yatak hacmi ardından yıkama tamponu 5 yatak hacimleri ile reçine yıkayın.
  4. Yıkama tamponu, 20 ml artı 300 mM imidazol ile bağlı protein Zehir.
  5. Yıkama tamponu ile önceden dengelenmiş Superdex 200 kolonu ile konsantre edildi Fv çalıştırın. Havuz birlikte Fv (tipik tepe 17.6 ml tutma ses seviyesinde gösterir) içeren kesirler ve konsantre. 280 nm'de Fv'nin sönüm katsayısı kullanarak numunenin konsantrasyonunu belirler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Farklı membranlar içine KvAP kanalları sulandırma çeşitli çalışmalar 8-10 kullanılmıştır. Deterjan / lipid karışık miselleri ve protein / deterjan / lipid karışık misel arasında lipid dağılımı sağlanması fikri ardından, çok farklı lipid yapılmış membranlar içine KvAP yaklaşık tam sulandırma ulaşabiliyorlar. Her tetramerik KvAP kanalı tam olarak transmembran alanı kapsayacak şekilde ~ 100 lipid molekülleri ihtiyacı var. Temel gereksinim deterjan kaldırılmadan önce yeterli lipit molekülleri protein / yağ / deterjan miseller kaynaşmasına izin vermektir. Standart koşullar (0.5 mg protein ve 5.0 mg lipidler) ortalama olduğu ~ protein molekülü başına 1.000 lipit molekülleri sağlar. Bizim flotasyon deney ve biyokimyasal deneyler sulandırma neredeyse tam olduğunu onaylamıştır. Siyah lipid membranlar takılı kanallardan Elektrik kayıtları, sulandırılmış kanalların tarama biraykırı bir faj görüntülemeli peptid kütüphanesi, ve membranlar olarak, kanalların 2B kristallerinin büyümesini tüm çeşitli amaçlar için membran rekonstitüsyon başarılı uygulamaları göstermektedir.

Bir faj görüntülenir peptid kütüphanesi karşı KvAP kanalları ve Taramanın lipid bağımlı yapı değişiklikleri yerine belirli konformasyonlar 8 kanal tutmak için elektrofizyoloji güvenmek biyokimyasal yöntemlerle kanal blokerleri ya da kanal açıcılar için ekrana yeni bir yol vitrin. Konformasyon spesifik bağlayıcı yönelik ekranında başarısı aynı strateji aktif konformasyon için özel bağlayıcı maddeler bulmak için uygulanabilir olduğunu göstermektedir. Bu veziküller içinde sulandırılmış kanalları tek zincir Fv kütüphaneleri, Fab kütüphaneler, vb Aynı şekilde karşı kullanılabilir olması öngörülebilir olduğunu, diğer membran proteinleri bu işlemleri üzerinden çalıştırmak ve çeşitli amaçlar için yararlı olabilir onların sıkı bağlayıcı güvence altına alabilirsiniz. İnanıyoruz ki bu new yöntem gelecekte daha genel uygulamalar göreceksiniz.

Sulandırılmış membran sistemleri membran proteinleri 11 lipid etkileri arkasında kimyasal ayrıntıları aydınlatılması sağlayacaktır. Lipid-protein etkileşimi çok zar proteinleri için önemli olduğu bilinmektedir, ve son 3 birden çalışmalara tabi tutulmuştur. Hücre tabanlı çalışmalarda, manipülasyon zarlarında belirli bileşenleri değiştirmek için uygulanabilir ve daha sonra zar proteinlerdeki işlevsel değişiklikler zarlarında yapısal ve bileşimsel değişikliklerle ilişkilidir. Bu tür bağlantılar, dolaylı ve iyi karakterize değildir hücre zarlarında birçok faktörün sonucu olabilir. Bir sulandırılmış homojen membran olarak, membran proteinlerinin yapısal ve fonksiyonel değişiklikler ve lipid kompozisyonu ve membran özelliklerinde değişiklikler arasında bağlantı yapımında daha kesindir. Sonuçta, t anlamako lipid-protein etkileşim arkasında kimyasal prensipleri, biz transmembran alanı etrafında lipid dağılımı tanımlamak için, ve proteinler hemen yanında bu lipidlerin dinamik değişiklikleri anlamak gerekir. Bir sulandırılmış sistem, bir anlayış doğru güvenilir bir yol gibi görünüyor.

Membran proteinlerinin Sulandırma protein / yağ / deterjan karışık miseller gelen deterjan kontrollü olarak çıkarılmasını ve sonunda veziküller 30 dönüşür büyük olanları içine karışık miseller füzyon gerektirir. Üç farklı yöntemler kaldırma deterjanlar, diyaliz, boncuklar ve siklodekstrin 14, 31, 32 için kullanılmaktadır. Ama küçük bir hacim 33, 34 deterjanların iyi kontrollü, kademeli kaldırma elde etmek güçtür. Deterjan kaldırılması için ideal bir yöntem kontrol edilebilir bir hızda tüm hacmi eşit olarak sulu faz dışında deterjanlar alacağını ve güçlü bir girişim o uygulamayın gerekiriki katmanlı membran sulandırma n. Böyle bir yöntem sulandırma hızını ve etkinliğini değiştirmek mümkün olabilir, ve büyük olasılıkla küçük bir hacimde sulandırma sağlayacaktır. Yavaş-seyreltme ve deterjan çıkarılması için üç geleneksel yöntemlerin herhangi bir kombinasyonu bu hedefe bir yaklaşım olabilir. Protein / deterjan / lipid karışımı içine su az miktarda tanıtarak yavaş seyreltme eşit olarak CMC için deterjan konsantrasyonu aşağı azaltmak için kontrol edilebilir bir yoldur. Deterjan kaldırma sonra büyük olanları içine küçük vezikül füzyon için hala önemli olmasına rağmen, vezikül oluşumu için daha az önemlidir. Kontrollü deterjan kaldırma elde etmek için başka yollar hala tasarlanmış ve geliştirilmesi gerekmektedir.

Bizim sulandırma işlemi karışık miseller ve kabarcıklar yanı sıra karışık miseller deterjan indüklenen füzyon arasında yağ dağılımının dikkate alır. Başarısı r uygulamaları daha geniş bir spektrum giden yol açıyorbiz sunulan üç yönde çok daha fazla econstituted veziküller,. Diğer membran proteinleri için prosedürün uyum önemli teknik sınırı karşılaşma olmamalıdır. Birçok membran proteinlerinin bir yol ya da diğer yeniden olsa bile, bu tam bir sulandırma yakın elde etmek ve birden fazla farklı açılardan proteinlerin işlevselliğini değerlendirmek zor olmuştur. KvAP sulandırma çabalarımızı bizim yöntemleri tam sulandırma izin verebilir ve bu amaçlar için uygun olacağını göstermektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Jiang laboratuarında KvAP üzerinde çalışmalar Rockefeller Üniversitesi Dr Roderick MacKinnon en laboratuvarından önemli yardım almış. Özel teşekkür onların tavsiyelerini Dr Kathlynn Brown ve Michael McQuire gidip bizim faj ekran deneylere yardımcı olur. Bu çalışma NIH (Q-XJ için GM088745 ve GM093271) ve AHA (Q-XJ için 12IRG9400019) hibe tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptone RPI Corp. T60060
Yeast Extract RPI Corp. Y20020
NaCl Fisher S271-3
Tris Base RPI Corp. T60040
Potassium Chloride Fisher BP366-500
n-Dodecyl-β-D-Maltoside Affymetrix D322S Sol-grade
n-Octyl-β-D-Glucoside Affymetrix O311 Ana-grade
Aprotinin RPI Corp. A20550-0.05
Leupeptin RPI Corp. L22035-0.025
Pepstatin A RPI Corp. P30100-0.025
PMSF SIGMA P7626
Dnase I Roche 13407000
Bio-Bead SM-2 Bio-Rad 152-3920
HEPES RPI Corp. H75030
POPE Avanti Polar Lipids 850757C
POPG Avanti Polar Lipids 840457C
DOGS Avanti Polar Lipids 870314C
DMPC Avanti Polar Lipids 850345C
Biotin-DOPE Avanti Polar Lipids 870282C
DOTAP Avanti Polar Lipids 890890C
NeutrAvidin agarose beads Piercenet 29200
Dialysis Tubing Spectrum Laboratories, Inc 132-570
Pentane Fisher R399-1
Decane TCI America D0011
MTS-PEG5000 Toronto Research Cemicals M266501

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell. 5th edition, Galand Science. New York. (2007).
  2. Lee, A. G. How lipids and proteins interact in a membrane: a molecular approach. Mol. Biosyst. 1, 203 (2005).
  3. Lee, A. G. How lipids affect the activities of integral membrane proteins. Biochim. Biophys. Acta. 1666, 62 (2004).
  4. Anderson, R. G. The caveolae membrane system. Annu. Rev. Biochem. 67, 199 (1998).
  5. Simons, K., Vaz, W. L. Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 33, 269 (2004).
  6. Edidin, M. The state of lipid rafts: from model membranes to cells. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 257 (2003).
  7. Kapoor, R., Kim, J. H., Ingolfson, H., Andersen, O. S. Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments. J. Vis. Exp. (20), e1033 (2008).
  8. Zheng, H., Liu, W., Anderson, L. Y., Jiang, Q. X. Lipid-dependent gating of a voltage-gated potassium channel. Nat. Commun. 2, 250 (2011).
  9. Schmidt, D., Jiang, Q. X., MacKinnon, R. Phospholipids and the origin of cationic gating charges in voltage sensors. Nature. 444, 775 (2006).
  10. Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel. Nature. 422, 180 (2003).
  11. Jiang, Q. X., Gonen, T. The influence of lipids on voltage-gated ion channels. Curr. Opin. Struct. Biol. 3408884 (2012).
  12. Artimo, P., et al. ExPASy: SIB bioinformatics resource portal. Nucleic Acids Res. 40, W597 (2012).
  13. Cladera, J., Rigaud, J. L., Villaverde, J., Dunach, M. Liposome solubilization and membrane protein reconstitution using Chaps and Chapso. Eur. J. Biochem. 243, 798 (1997).
  14. Levy, D., Bluzat, A., Seigneuret, M., Rigaud, J. L. A systematic study of liposome and proteoliposome reconstitution involving Bio-Bead-mediated Triton X-100 removal. Biochim. Biophys. Acta. 1025, 179 (1990).
  15. Young, H. S., Rigaud, J. L., Lacapere, J. J., Reddy, L. G., Stokes, D. L. How to make tubular crystals by reconstitution of detergent-solubilized Ca2(+)-ATPase. Biophys. J. 72, 2545 (1997).
  16. Levy, D., Gulik, A., Bluzat, A., Rigaud, J. L. Reconstitution of the sarcoplasmic reticulum Ca(2+)-ATPase: mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents. Biochim. Biophys. Acta. 1107, 283 (1992).
  17. Cohen, F. S., Zimmerberg, J., Finkelstein, A. Fusion of phospholipid vesicles with planar phospholipid bilayer membranes. II. Incorporation of a vesicular membrane marker into the planar membrane. The Journal of General Physiology. 75, 251 (1980).
  18. Fuks, B., Homble, F. Permeability and electrical properties of planar lipid membranes from thylakoid lipids. Biophysical Journal. 66, 1404 (1994).
  19. Hanke, W., Schlue, W. -R. Planar Lipid Bilayers. Methods and Applications. Biological Techniques. Sattelle, D. B. Academic Press, Inc. San Diego. 133 (1993).
  20. Tien, H. T. Bilayer lipid membranes (BLM). Theory and Practice. Marcel Dekker, Inc. New York. 655-65 (1974).
  21. Pagano, R. E., Ruysschaert, J. M., Miller, I. R. The molecular composition of some lipid bilayer membranes in aqueous solution. The Journal of Membrane Biology. 10, 11 (1972).
  22. Henn, F. A., Thompson, T. E. Properties of lipid bilayer membranes separating two aqueous phases: composition studies. Journal of Molecular Biology. 31, 227 (1968).
  23. Tao, X., MacKinnon, R. Functional analysis of Kv1.2 and paddle chimera Kv channels in planar lipid bilayers. J. Mol. Biol. 382, 24 (2008).
  24. Cohen, F. S., Akabas, M. H., Zimmerberg, J., Finkelstein, A. Parameters affecting the fusion of unilamellar phospholipid vesicles with planar bilayer membranes. The Journal of Cell Biology. 98, 1054 (1984).
  25. Smith, G. P., Petrenko, V. A. Phage Display. Chem. Rev. 97, 391-39 (1997).
  26. McGuire, M. J., Li, S., Brown, K. C. Biopanning of phage displayed peptide libraries for the isolation of cell-specific ligands. Methods Mol. Biol. 504, 291 (2009).
  27. Rigaud, J. L. Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals. Braz. J. Med. Biol. Res. 35, 753 (2002).
  28. Chami, M., et al. Use of octyl beta-thioglucopyranoside in two-dimensional crystallization of membrane proteins. J. Struct. Biol. 133, 64 (2001).
  29. Kuhlbrandt, W. Two-dimensional crystallization of membrane proteins. Q. Rev. Biophys. 25, 1 (1992).
  30. Rigaud, J. L., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods Enzymol. 372, 65 (2003).
  31. Walz, T., Grigorieff, N. Electron Crystallography of Two-Dimensional Crystals of Membrane Proteins. J. Struct. Biol. 121, (2), 142 (1998).
  32. Signorell, G. A., Kaufmann, T. C., Kukulski, W., Engel, A., Remigy, H. W. Controlled 2D crystallization of membrane proteins using methyl-beta-cyclodextrin. J. Struct. Biol. 157, 321 (2007).
  33. Vink, M., Derr, K., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins. J. Struct. Biol. 160, 295 (2007).
  34. Iacovache, I., et al. The 2DX robot: a membrane protein 2D crystallization Swiss Army knife. J. Struct. Biol. 169, 370 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics