מטבולית תיוג וממברנה היפוך חלוקה לניתוח השוואתי של proteomic

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

כאן אנו מתארים שיטה חזקה לחלוקה של ממברנות פלזמה צמח לקרומים מסיסים עמידים וחומרי ניקוי חומרי ניקוי המבוססת על תערובת של ללא תווית וin vivo באופן מלא 15 N תרביות תאי thaliana ארבידופסיס שכותרתו. ההליך מיושם ללימודי proteomic השוואתיים להבין תהליכי איתות.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Szymanski, W. G., Kierszniowska, S., Schulze, W. X. Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures. J. Vis. Exp. (79), e50535, doi:10.3791/50535 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

microdomains קרום פלזמה הם תכונות המבוססות על התכונות הפיסיקליות של סביבת השומנים וסטרולים ויש תפקידים מסוימים באיתות תהליכים. חילוץ microdomains קרום מועשר בסטרולים מתאי צמח לניתוח proteomic הוא משימה קשה בעיקר בשל צעדי הכנה מרובים ומקורות לזיהומים מתאים סלולריים אחרים. קרום הפלזמה מהווה רק כ 5-20% מכל הקרומים בתא צמח, ולכן הבידוד של חלק קרום פלזמה מטוהר מאוד מאתגר. שיטה משמשת לעתים קרובות כרוכה מחיצות מימיות שני שלבים בפוליאתילן גליקול וdextran, אשר מניבה שלפוחית ​​קרום פלזמה עם טוהר 95% 1. microdomains קרום סטרולים עשירים בתוך קרום הפלזמה הם מסיסים על טיפול עם חומרי ניקוי nonionic קרים ב-pH בסיסי. שבריר קרום אבקת עמידה זה יכול להיות מופרד מקרום הפלזמה כמויות גדולות על ידי ultracentrifugation כבשיפוע ucrose 2. בהמשך לכך, ניתן להפיק חלבונים מהלהקה הצפיפות הנמוכה של שיפוע סוכרוז על ידי משקעים מתנול / כלורופורם. חלבון המופק לאחר מכן ניתן יהיה טריפסין מתעכל, desalted ולבסוף נותח על ידי LC-MS/MS. פרוטוקול החילוץ שלנו לmicrodomains סטרולים עשירים מותאם במיוחד להכנה של שברים קרום נקיים חומרי ניקוי עמיד מתרביות תאי thaliana ארבידופסיס.

אנו משתמשים בתיוג טבולים מלא של תרביות תאי ההשעיה thaliana ארבידופסיס עם 15 K NO 3 כמקור חנקן היחיד ללימודי proteomic השוואתיים כמותית לאחר טיפול ביולוגי של עניין 3. על ידי ערבוב יחסים שווים של תרביות תאים שכותרתו וללא תווית להפקת חלבון משותפת ההשפעה של צעדי הכנה בתוצאה הכמותית סופית נשמר במינימום. גם אובדן של חומר במהלך החילוץ ישפיע גם שליטה ודגימות טיפול באותה הדרך,ד ולכן היחס של אור ופפטיד התרומה יישאר קבוע. בשיטה המוצעת או שכותרתו או תרבית תאים ללא תווית עוברת טיפול ביולוגי, ואילו השני משמש כשליטה 4.

Introduction

ב1972, ג'ונתן סינגר וגארת' ניקולסון הציעו מודל פסיפס נוזל מודל מבנה ממברנות תאים, החלפת מודל כריך חלבון שומנים החלבון שהיה מקובל ב 1960s מוקדם. זינגר וניקולסון הניחו כי הקרום הביולוגי יכול להיחשב כנוזל דו ממדים שבו כל מולקולות השומנים וחלבונים מפוזרות באופן חופשי ובקלות 5. מאז אותה תקופה, מודל מבנה של קרום הפלזמה והידע של הרכב הקרום הפך למורכב עוד יותר. במיוחד, בתוך קרום הפלזמה, ניתן לראות מבנים כגון קומפלקסי חלבונים וmicrodomains מבני מסודר המבוסס שומנים / סטרולים. בממברנות מודל מלאכותיות 6,7, סטרולים וsphingolipids יכולים רוחבי להפריד ממינים שומנים אחרים כדי ליצור אזורים עם מאפיינים פיזיים שונים. הפרדה זו בתוך קרום התא נגרמת בעיקר על ידי מאפייני שיוך העצמי בין סטרולים וsa מאודשרשרות פחמימנים turated של phopsho וsphingolipids 8. במיוחד, טבעות סטרולים הנוקשה להעדיף אינטראקציות עם נוקשה ומיני שומנים ישר רוויים ואינטראקציות אלה יאלצו את שרשרות הפחמימנים שכנים ליותר תצורות מורחבות, הגדלת עובי קרום ואת קשיות.

אחד המאפיינים שנצפה של microdomains קרום סטרולים מועשרים היה insolubility על טיפול בחומרי ניקוי שאינו יוניים כגון טריטון X-100 או 35 בריג'. שברים אלה נחשבים לזהים עם microdomains קרום ונקראו קרומי סבון עמידים (DRM) המבוססים על שיטת ההכנה ביוכימיים שלהם 2. השימוש בחומרי ניקוי nonionic במהלך חילוץ DRM קיבלו ביקורת כהכנת ה-DRM ביוכימיים לא יכולה ישירות מתאימות לכל תא קרום ספציפי בתוך התא החי 9. במיוחד, חומרי הניקוי ליחס חלבון נראה מכריעים בהכנות כאלה,חומרי ניקוי של שונים, כמו גם כמויות חומרי ניקוי שונות יכול להניב הרכב של שבריר קרום אבקת עמידה 10 שונה. עם זאת, יש ראיות לכך שמיני חלבון מסוימים באופן ספציפי לקשר עם תחומים אלה קרום סלולארי סטרולים עשירים, ושחלבונים אלו מועשרים גם בהכנות ביוכימיים של שברים קרום אבקת עמידה 11. הליבה של חלבונים, שנמצאו בחלק ה-DRM צמח, ואשר הנוכחות בDRMs הייתה סטרולים תלויה, היו בעיקר חלבונים מעוגנים-GPI, כגון חלבונים כמו fasciclin-arabinogalactan (flas) ובני משפחת חלבון מק. גם כמה חלבוני איתות, כגון קינאזות כמו קולטן או phospholipases נמצאו 11. תוצאות אלו עולות בקנה אחד עם מחקרים רבים proteomic על microdomains קרום היונקים 12,13. גם בצמחים יש להגדיל ראיות לתפקיד של microdomains קרום בהקשר של תגובה ללחץ 14 -16.

הפרוטוקול המתואר כאן מספק שיטה חזקה לחלוקה של microdomains קרום פלזמה ובמיוחד משתמש בחלבון לריכוז חומר ניקוי שמאפשר לנו לתאר שינויי מתח מושרה של תא קרום סטרולים עשירים 4,11,14.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

נוהל

ריאגנטים נפוצים ומאגרים בשימוש בפרוטוקול החילוץ:

  1. בינוני JPL לתרביות תאי ההשעיה thaliana ארבידופסיס
    • BO 3 מיקרומטר H 3 3
    • 3 מיקרומטר MnSO 4 x H 2 O
    • 1.1 מיקרומטר ZnSO 4 x 7 H 2 O
    • 0.15 KJ מיקרומטר
    • 0.03 מיקרומטר Na 2 Moo 4 x 2 H 2 O
    • 3 ננומטר CoCl 2 x 6 H 2 O
    • 3 ננומטר CuSO 4 X 5 H 2 O
    • 0.9 מ"מ CaCl 2 x 2 H 2 O
    • 0.5 מ"מ MgSO 4 x 7 H 2 O
    • 0.5 מיקרומטר FeSO H 4 x 7 2 O
    • 0.5 מיקרומטר Na 2 EDTA x 2 H 2 O
    • 0.12 מיקרומטר HCl תיאמין
    • 0.16 מיקרומטר חומצה ניקוטינית
    • HCl פירידוקסין 0.097 מיקרומטר
    • 0.107 NAA מיקרומטר
    • 0.375 מ"מ KH 2 PO 4
    • 0.061 מ"מ לאא2 PO 4 x 2 H 2 O
    • 0.039 מ"מ Na 2 HPO 4
    • גליצין 0.027 מ"מ
    • 0.56 מ"מ מיו-אינוסיטול
    • סוכרוז 1.5%
    • 10 מ"מ K 14 NO 3 או 10 מ"מ K 15 NO 3

הערה: ה-pH של מדיום JPL צריכה להיות מותאמת ל5.7 עם KOH. המדיום חייב להיות מעוקר על ידי סינון או מעוקר לפני השימוש.

  1. החיץ H
    • 100 HEPES מ"מ-KOH (pH 7.5)
    • 250 מ"מ סוכרוז
    • 10% גליצרול (w / v)
    • 5 מ"מ EDTA
    • חומצה אסקורבית 5 מ"מ
    • 0.6% (w / v) PVP K-25 או K-30
    • 5 מ"מ DTT (להוסיף טרי)
    • 1 מ"מ PMSF (להוסיף טרי)
    • מעכבי פרוטאז ו phosphatase (להוסיף טרי)
      • 50 מ"מ NAF
      • 1 מ"מ Na 3 VO 4
      • 1 מ"מ benzamidin
      • 0.3 מיקרומטר mikrocystin
      • 4 leupeptin מיקרומטר
      • מעכבי פרוטאז קוקטייל
  2. החיץ R
    • אשלגן זרחה 5 מ"מ
    • 0.33 M סוכרוז
    • 3 מ"מ KCl
    • 0.1 מ"מ EDTA
    • 1 מ"מ DTT (להוסיף טרי)
  3. החיץ TNE
    • 25 מ"מ טריס-HCl, pH 7.5
    • 150 מ"מ NaCl
    • 5 מ"מ EDTA
  4. מערכת דו שלביים (6 g-המערכת מתאימה לעד 15 גרם של דגימה במשקל טרי) שיטת הכנה
    ב15 מיליליטר מרכיבי תערובת צינור פלקון המפורטים להלן ומערבבים היטב:
    • 20% (w / w) T500 dextran - 2.6 גרם
    • פולי 40% (w / w) (אתילן גליקול) (PEG 3350) - 1.3 גרם
    • סוכרוז - 0.678 גרם
    • 0.2 פוספט M אשלגן, 7.8 pH - 0.15 מיליליטר
    • 2 M KCl - 0.014 מיליליטר
    • להוסיף מים עד שהמסה כוללת של מערכת שני שלבים היא 6 גרם.
  5. פתרונות סוכרוז במאגר TNE
    • 2.4 M, 1.6 M, 1.4 M, 0.15 M
  6. ריאגנטים לעיכול טריפסין
    • UTU: 6 M אוריאה, 2 M thiourea (pH 8.0 עם 10 מ"מ טריס-HCl) חיץ הפחתה (DTT 1 מיקרוגרם / μl במים; 6.5 מ"מ)
    • חיץ אלקילציה (5 מיקרוגרם / μl iodoacetamide במים; 27 מ"מ)
    • LysC Endopeptidase (0.5 מיקרוגרם / μl)
    • טריפסין, כיתה רצף שונה (0.4 מיקרוגרם / μl)
  7. ריאגנטים לdesalting פפטיד C מעל 18
    • פתרון resuspension: 2% חומצת trifluoroacetic (TFA), אצטוניטריל 5% במים
    • פתרון: 0.5% חומצה אצטית
    • פתרון ב ': אצטוניטריל 80%, 0.5% חומצה אצטית
  8. ריאגנטים להעשרת phosphopeptide
    • פתרון: 0.1% TFA, אצטוניטריל 5%
    • פתרון ב ': 0.1% TFA, אצטוניטריל 80%
    • Tio 2 10 מיקרומטר
    • אמוניה (פתרון 25% מניות)
    • Piperidine (מניית 100%)

פרוטוקולים

1. תיוג המטבולית של תרבויות תרחיף תא thaliana ארבידופסיס

  1. לגדול ארבידופסיס תא Col-0תרבויות השעיה נובעות מעלים 17 במדיום מלא 14 N-JPL (18; ראו "חומרים כימיים ומאגרים משותפים" סעיף) וקבוצה אחת של תרבויות ב15 בינוני N-JPL בבקבוק סטרילי בתנאי אור קבועים ב80-100 μmol / מ ' 2 שעה, 23 ° C, תחת קבוע רועד ב120 סל"ד.
  2. כדי לשמור על תרביות תאים, לחסן 400 מיליליטר של מדיום JPL הטרי עם 40 מיליליטר של תרבית תאים ישנה שבעת ימים בצלוחיות L 1.
  3. קצירה של תרביות תאים מתרחשת באמצעות יניקת ואקום דרך משפך זכוכית רחב עם רשת נירוסטה. תאים מצטברים על צלחת הרשת ובמשפך והוא יכול בקלות להיות שנאספו משם. תאים מומלץ להקפיא ב -80 מעלות צלזיוס או בחנקן נוזלי לפני הטחינה.

הערה: לקבלת 15 N תרביות תאים שכותרתו מטבולית להשתמש 15 K NO 3 כמקור היחיד של חנקן לפחות שני קטעים יותר משבועות 19. בexperiments לפרוטאומיקה השוואתית, השתמש 15 N תרבית תאים שכותרתו וגם לשמור על תרבות ללא תווית במדיום נורמלי. טיפול ביולוגי לאחר מכן ניתן יהיה להחיל את התרבות או שכותרתו או ללא תווית, ואילו השני משמש כביקורת (איור 1). להכנת חלבון, שתי התרבויות תשולב 20. כאשר מתכנן התקנה הניסיונית, אנו ממליצים לשקול התקנת גומלין תיוג 4 שבו את אותו הטיפול מוחל פעם אחת ל15 תאי N שכותרתו ופעם אחת לתאים ללא תווית וללא תווית המתאימה או 15 תאים N שכותרתו משמשים כקבוצת ביקורת. במקרה זה, הכמויות כפולות של תרביות תאים יש צורך.

2. פלזמה ממברנה טיהור

הערה: כל הצעדים נוספים מתבצעים בחדר הקר ו / או על קרח, אלא אם כן צוינו אחרת.

  1. Homogenize תאים מכ 1 ליטר של תרבויות השעיה תא בן 7 ימים בחנקן נוזלי.ניתן לאחסן את החומר ב-80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
  2. מערבבים את אותן הכמויות של תרביות תאים שכותרתו קפוא וללא תווית המבוססת על משקל טרי בכוס ולהוסיף 2 כרכים של החיץ H באופן מיידי. במקרה של הכנת microdomain קרום הוא הציע להשתמש בלפחות 7 גרם במשקל טרי של שני תאים שכותרתו וללא תווית.
  3. מניחים את הכוס על שייקר ולנער עד החומר הוא נמס והפתרון הוא נוזלי וללא גבישי קרח.
  4. סנן את homogenate דרך שכבה אחת של Miracloth ל50 צינורות צנטריפוגה מיליליטר.
  5. דגימות איזון עם H חיץ ו צנטריפוגות ב XG 10,000 במשך 8 דקות.
  6. טען את supernatant לתוך צינורות מקוררים מראש אולטרה צנטריפוגה (למשל עבור הרוטור בקמן קולטר SW31Ti), עם נפח של כ 32 מיליליטר
  7. דגימות איזון עם H חיץ וגלולת microsomes ידי צנטריפוגה ב100,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות באמצעות הרוטור בקמן SW32Ti.
  8. הסר את supernatant לאחר צנטריפוגה.

    הערה: את supernatant מכיל חלבונים מסיסים. כמות קטנה של חלק זה ניתן לשמור לממטרים נוספים חלבון וניתוח שלאחר מכן גם של חלבונים מסיסים.

    1. Resuspend את כדור הקרום של כל דגימה בכמות המתאימה של R חיץ ולטעון על גבי החלק העליון של מערכת שני שלבים U1 (איור 2). אם משתמשים במערכת שני השלבים 6 גרם, לטעון גרם בדיוק 2 של גלולה קרום מושעה.

    הערה: הנפח הסופי של R החיץ תלוי בגודל של מערכת שני שלב שהוא הולך להיות בשימוש (~ 1.6 מיליליטר של R החיץ נחוץ בעת שימוש במערכת גרם 6). מומלץ להשתמש בפחות חיץ לresuspension כך חיץ טהור ניתן להוסיף על גבי מערכת של שני שלבים כדי להשיג את המשקל דרש, ולא משתמש יותר מדי חיץ לsolubilization ולא תוכל לטעון את המדגם כולו על גבי המערכת של שני שלבים.

    1. טען את אותו הנפח של R חיץ הטהור כפי שהוא משמש עבור הresuspension מדגם דואר על U2.
    2. לאט לאט לערבב צינורות U1 ו-U2 ידי היפוכם 30x (כ 1 היפוך / sec).

    הערה: אין במרץ לנער את מערכת שני שלבים. זה יכול לגרום לחוסר ההפרדה בין השלבים בצעד ultracentrifugation.

    1. צנטריפוגה הדגימות ב1,500 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    2. הסר את supernatant לאחר צנטריפוגה.
    3. מעביר את השלב העליון מU1 על U2 וחזור צנטריפוגה ב1,500 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    4. הזז את השלב העליון מU2 לתוך צינורות ultracentrifuge SW41Ti ולדלל אותו עם חמישה כרכים של R חיץ ומערבבים היטב.

    הערה: השלב העליון הסופי עשוי להיות מחולק לצינורות ultracentrifuge נפרדים לפני שניתן יהיה המדולל חמש פעמים.

    1. צנטריפוגה הדגימות ב200,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת באמצעות הרוטור SW41Ti.
    2. גלולה קרום resuspend ב smalכמות ליטר של חיץ TNE (בדרך כלל 200 μl של חיץ משמשת) לבידודה של ממברנות עמידות חומרי ניקוי.

    הערה: כמות קטנה של חלק זה ניתן לשמור לניתוח של קרום הפלזמה unfractionated.

    הערה: חלק קרום הפלזמה יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה לפני חלוקה לממברנות עמידות חומרי ניקוי ושברים מסיסים חומרי ניקוי.

    3. דטרגנט עמיד ממברנה הכנה

    1. בדוק את הריכוז של שבריר קרום הפלזמה על ידי assay ברדפורד.
    2. הוספת טריטון X-100 לשבריר קרום הפלזמה. הריכוז הסופי של חומר ניקוי צריך להישאר בין 0.5-1%. חומר הניקוי למשקל חלבון יחס משקל צריך להישאר בין 13-15.
    3. דגימות Shake בסביבות 100 סל"ד ב-C ° 4 ל30 דקות.
    4. הוסף שלושה כרכים של 2.4 M סוכרוז לכרך אחד של קרום הפלזמה טופל להשיג 1.8 M ריכוז סופי של סוכרוז. </ Li>
    5. הכן את שיפוע סוכרוז בצינורות ultracentrifuge SW41Ti ידי טעינת פתרונות סוכרוז המתאימים בחלקו העליון של שבריר 1.8 M כפי שמודגם באיור 3.
    6. צנטריפוגה הדגימות ב250,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך שעות 18 באמצעות הרוטור בקמן SW41Ti.
    7. מוציא בזהירות את צינורות ultracentrifuge מהרוטור כדי למנוע שיבוש של הלהקה בצפיפות נמוכה שיכול להיות גלוי כמו טבעת חלבית על הממשק של 0.15 M/1.4 סוכרוז M. לפעמים שום דבר לא יכול היה לראות, אבל החלק עדיין מכיל את החלק יחסי חלבון עמיד לחומרי הניקוי.
    8. הסרת חלק קטן של 0.75 מיליליטר נפח מהחלק העליון של השיפוע. שברים 2 ו -3 אשר מכסים נפח של כ 1.5 מיליליטר מעל טבעת ביניים ו0.5 מיליליטר להלן מייצגים את החלק יחסי קרום עמיד חומרי הניקוי. איסוף השברים הללו ל15 צינורות מיליליטר פלקון. שברים 9 ו10 מכילים את חלק קרום מסיס בחומרי הניקוי ויכולים גם להיות שנאספו לצורך ההשוואה. לניתוח נוסף, Fract בריכהיונים 2 ו -3, כמו גם שברים 9 ו10.

    4. מיצוי של חלבונים מהחלק עמיד דטרגנט ידי מתנול / כלורופורם

    הערה: כל השלבים מתבצעים בטמפרטורת החדר.

    1. הוסף 4 כרכים של מתנול לשברים ומערבולת שנאספו ביסודיות.
    2. הוסף 1 נפח של כלורופורם, מערבולת ביסודיות.
    3. הוסף 3 כרכים של מים, מערבולת ביסודיות.
    4. צנטריפוגה הדגימות ב2,000 XG במשך 5 דקות באמצעות צנטריפוגות המעבדתיים (למשל Eppendorf 5417R).
    5. הסר את השלב המימית מעל שכבת החלבון בשלבי ביניים.
    6. הוסף 3 כרכים של מתנול, מערבולת ביסודיות.
    7. צנטריפוגה הדגימות ב4,000 XG 10 דקות.
    8. הסר supernatant ולייבש את גלולה. גלולה מיובשת מוכנה לעיכול בפתרון.

    5. ב- פתרון טריפסין עיכול

    הערה: בהליך זה נעשים כל הצעדים בטמפרטורת חדר כדי לצמצם derivatization לא רצוי של צד שרשרות של חומצות אמינו על ידי denaturants.

    1. ממיסים דגימה בנפח קטן של 6 M אוריאה, thiurea 2 מ ', pH 8 (UTU). השתמש בנפח נמוך כמו תואם את המדגם (בדרך כלל כ 40 μl).
    2. דגימות ספין solubilized בUTU בXG 5,000 בצנטריפוגה המעבדתיים (למשל Eppendorf 5417R) עבור 10 דקות עד גלולה כל חומר בלתי מסיס.
    3. ה-pH של הפתרון הסופי צריכה להיות ליד 8.0 לעיכול טריפסין אופטימלי. בדוק עם רצועות ה-pH.
    4. הוסף 1 μl של חיץ הפחתה לכל 50 מיקרוגרם חלבון מדגם של דגירה 30 דקות בטמפרטורת חדר.

    הערה: רק הערכה גסה של תכולת חלבון היא הכרחית. כאשר כמות מדגם מוגבלת עדיף להקריב את הדיוק ולא מבזבז את המדגם על assay חלבון.

    1. הוסף 1 μl של חיץ אלקילציה עבור כל חלבון מדגם 50 מיקרוגרם דגירה 20 דקות בטמפרטורת חדר בחושך.
    2. הוסף 0.5 μl של LysC ל50 חלבון מדגם מיקרוגרם דגירה במשך שלוש שעות בטמפרטורת חדר עם קבוע רועד ב700 סל"ד. במידת צורך, יכול גם להתבצע לעכל לילה. עם זאת, זמן יתארך בטמפרטורות חמות אינו מומלץ כפי שהוא יכול להגדיל את הפסד פפטיד בשל ספיחה לחומר צינור פלסטיק מתחת pH 8 תנאים מימיים.
    3. לדלל מדגם עם ארבעה כרכים 10 מ"מ טריס-HCl, pH 8.

    הערה: שלב זה הוא הכרחי כדי לדלל את ריכוז האוריאה כטריפסין הוא מאוד רגיש למלח גבוה.

    1. הוסף 1 μl של טריפסין ל50 חלבון מדגם מיקרוגרם ו דגירה הלילה בטמפרטורת חדר עם קבוע רועד ב700 סל"ד.
    2. להפוך לחומצת הדגימות ל0.2% ריכוז סופי TFA להגיע pH 2 (להוסיף כ 1/10 נפח של 2% חומצת trifluoracetic).

    הערה: דוגמאות ניתן לאחסן ב - 20 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף, אבל זה יותר טוב לאחסוןשלהם על StageTips על 4 מעלות צלזיוס אם זה לזמן קצר (שבוע) או לאחסן אותם לאחר desalting StageTips.

    6. ייצור של C-18 StageTips

    1. הנח Empore דיסק C18 על משטח שטוח ונקי כמו צלחת פטרי פלסטיק חד פעמית.
    2. אגרוף החוצה דיסק קטן באמצעות מחט מזרק קהה שקצהו בקוטר של 1.5 מ"מ. דיסק מקלות במחט וניתן להעביר אל קצה פיפטה.
    3. לדחוף את הדיסק החוצה של המחט ולתקן אותה בהיצרות פיפטה קצה על ידי חתיכה של סיליקה או צינורות מתאימים בחלק הפנימי של המחט התמזגו.

    הערה: ניתן לאחסן StageTips יבש בטמפרטורת חדר 21.

    7. שימוש בC 18 StageTips לפפטיד desalting וריכוז

    1. להתנות C 18 StageTip ידי הצבת 50 μl של הפתרון B על StageTip מוכן. ספין הקצה בצנטריפוגות ב 2,000 סל"ד במשך 2 דקות בג המעבדתייםentrifuge (למשל Eppendorf 5417R).

    הערה: מתאמי שימוש לטוות StageTips בצנטריפוגה Eppendorf, נוזל ייאסף בצינור תגובה 2 מיליליטר. להכנות בקנה מידה גדולה, יכולים גם להיות ממוקמים טיפים במה לארון תקשורת קצה עם 96 של הטיפים μl 200 ונוזל יכול להיות שנאספו בצלחת microtiter.

    הערה: לעולם אל תשתמש במהירויות גבוהות יותר מ -3,000 XG בצנטריפוגה המעבדתיים (למשל Eppendorf 5417R) בשל הסיכון של ספינינג את 18 הדיסק C מהקצה.

    1. לאזן StageTip באמצעות א פתרון 100 μl ספין הקצה בצנטריפוגות ב XG 5,000 בצנטריפוגה המעבדתיים (למשל Eppendorf 5417R).
    2. חזור על שלב 2.
    3. מדגם עומס על גבי דיסק על ידי pipetting בזהירות את המדגם לקצה פיפטה עם הדיסק בפנים.

    הערה: דיסק אחד יכול להיקשר כ. של חלבון 100 מיקרוגרם.

    1. ספין הטיפים בלסה"נntrifuge עד שכל הנפח של מדגם לעבור 18 הדיסק C.
    2. שטוף את StageTips שתי פעמים עם א פתרון 100 μl ספין הטיפים בצנטריפוגה.

    הערה: ניתן לאחסן StageTips שטף והעמיס על 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע.

    1. Elute מדגם עם 40 μl של B. פתרון איסוף eluate בצינור תגובה טרי 1.5 מיליליטר.
    2. לרכז את המדגם בVAC המהירות. בתנאים אידיאליים, לעצור את תהליך ההתייבשות כמו שיש רק על 1 או 2 נוזל μl עזב.

    ניתן לאחסן דגימות מיובשות ב-80 מעלות צלזיוס במשך שנים: הערה.

    1. הוספת נפח סופי של μl 9 של פתרון resuspension למדגם ולהעביר אותו לmicrotiterplate לניתוח מפרט המוני.

    הערה: הנפח הסופי של חיץ resuspension משמש תלוי בצרכים של הנסיין ואת הרגישות של ספקטרומטר המסהבשימוש.

    8. פרוטוקול חלופי לPhosphopeptide העשרה

    הערה: להעשרת phosphopeptide, מיצוי חלבון בשלב 2 חייב להיעשות בנוכחות מעכבי phosphatase.

    הערה: ריכוז חלבון מדויק אינו צריך להיקבע לשלבים הבאים. זה מספיק כדי לקבל הערכה גסה של תכולת חלבון כדי למנוע אובדן מיותר מדגם

    1. הכן את C-8 StageTips (בצע את אותו הפרוטוקול להכנת C 18 StageTips בשלב 6).
    2. העברה 1 מ"ג של Tio 2-חרוזים לראש C מוכנה 8-StageTips (מ"ג TIO שימוש 1 2 לחלבון 100 מיקרוגרם).
    3. לאזן Tio 2-טיפים עם של C פתרון, ספין 100 μl ב2,000 XG במשך 5 דקות בצנטריפוגה המעבדתיים (למשל Eppendorf 5417R).
    4. מערבבים 100 מיקרוגרם של פפטידים מתעכלים וdesalted מצעד 7.7 (זה צריך להיות בפתרון 100 μlB) עם של א 'פתרון 100 μl
    5. טען מעורב מדגם על Tio 2 עמודות equilibrated; ספין ב1,000 XG, 5 דקות.
    6. לאסוף את הזרימה דרך לטעון אותו על אותו הקצה שוב (לשמור על זרימה דרך אחרי מסירה שנייה).
    7. שטוף קצה עם פתרון 100 μl; ספין ב2,000 XG, 5 דקות בצנטריפוגה המעבדתיים (למשל Eppendorf 5417R).
    8. Elute מדגם עם 50 μl של אמוניה 5%.
    9. Elute מדגם עם 50 μl של piperidine 5% (ניתן לשלב שני eluates).
    10. מייד להפוך לחומצת המדגם באמצעות 50 μl של 20% חומצה זרחתית. pH צריך להיות סביב 2 ב.

    הערה: שמור את Tio 2 טיפים ולאחזר את האבקה. זה יכול להישטף עם הפתרון B ולהשתמש בו שוב לסיבוב או שתיים נוסף.

    1. שוב desalt דגימות acidified מעל C 18 טיפים (ראה שלב 8).

    9. ניתוח LC-MS/MS של פפטיד תערובות

    1. Resuspend phosph desaltedopeptides במאגר resuspension.
    2. טען resuspended מדגם על גבי מערכת של LC-MS/MS של בחירה ורכישת ספקטרום במצב תלוי נתונים ברזולוציה הציעה של 60,000 רוחבי מלא במחצית המרבית.

    הערה: לפיצול אופטימלי, או סריקה ניטראלי הפסד צריכה להיות מיושמת 22, או אם קיימת הפעלה הרבה שלבי 23. אם ETD נגיש זה יאפשר פיצול עמוד השדרה פפטיד ללא הפסד של חומצה זרחתית 24.

    הערה: רשימות שיא מהנתונים גולמיים צריכים להיות מופקים ומוגשים לזיהוי בסיס הנתונים, כמו גם לכימות. כאן, אנו מתארים את הגדרות לשימוש בקמע וMSQuant, אשר עובדת עבור קבצי נתונים גולמיים מLTQ, LTQ-Orbitrap ומכשירי LTQ-FT (Thermo Scientific).

    1. לחלץ רשימת שיא באמצעות DTAsupercharge בתוך התפריט "עוזר" בMSQuant. להשתמש בהגדרות ברירת מחדל.
    2. שלח כתוצאה קובץ רשימת שיא למנועי חיפוש קמע. Crהגדרות itical: מבשר יון המוני סובלנות 10 עמודים לדקה, סובלנות ההמונית MS / MS 0.5 דא. שינויים קבועים: carbamidomethylation של cysteines, שינויים משתנים: חמצון של מתיונין, זרחון של סרין, תראונין, טירוזין. שיטת quantitation: 15 N תיוג מטבולית.
    3. שמירת תוצאת קמע כקובץ דף האינטרנט.
    4. לטעון את קובץ תוצאת הקמע וקובץ גולמי לMSQuant. בחר את כל החלבונים של עניין ולהפעיל "quantitation האוטומטי". התכנית תקרא את ספקטרום סריקה מלא מקובץ הגלם ולעשות אינטגרציה שיא לשותפים שכותרתו וללא תווית של כל פפטיד.
    5. תוצאות quantitation יצוא לתכנית גיליון אלקטרוני או לקובץ טקסט מופרד באמצעות טאבים. אז יכולים להיות שהגישו את הנתונים לניתוח סטטיסטי נוסף ב-Excel או באמצעות חבילות תוכנה נוספות כגון Statquant 25 או קרקר 26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

עם הפרוטוקול שהוצג באמצעות תרביות תאי ארבידופסיס שכותרת מטבולית זה אפשרי לבודד ממברנות פלזמה מרקמות צמח (step2, איורים 2 ו 4), ומעשיר לשברי קרום אבקת עמידה בתוך קרום הפלזמה (שלב 3, איורים 3 ו -5). בהמשך לכך, הפרוטוקול מאפשר מיצוי של חלבונים משברי קרום אבקת עמידה אלה (שלב 4) ועיכול של החלבון לניתוח השוואתי proteomic (שלב 5). לבסוף, ההעשרה אופציונלית של phosphopeptides (שלב 8) היא מעניינת במיוחד בחקר תהליכי איתות תאיים. השלב האחרון ואז הוא ניתוח נתונים כמותיים (שלב 9, איור 6) של יחסי שפע חלבון בקרום שברים מתרבית תאים שכותרתו וללא תווית.

תוצאות אופייניות לאחר הערבוב של מערכת 2-השלב (שלב 2) ולאחר מכן הם צנטריפוגה ושלב עליון בצבע בהירירוק בצבע שלב נמוך יותר (איור 2). שלפוחית ​​קרום פלזמה מעדיף לשייך את שלב PEG העליון, בעוד שלפוחית ​​קרום מכלורופלסטים ירוקים וקרומים פנים אחרים ישולבו בשלב dextran נמוך יותר. אם לא ניתן להבחין בהפרדת הצבעים, שלב 2 לא בוצע בצורה נכונה וקרומים פלזמה יהיו מזוהמים עם כמויות משמעותיות של קרומים פנימיים. העשרה של חלבוני קרום פלזמה יכולה להיות מוצגת על ידי ניתוח proteomic של aliquots הקטנים של שברים פלזמה הממברנה וחלבונים בשלב נמוך יותר של המערכת בשני השלבים. השלב התחתון מכיל הקרום הפנימי של התא. לדוגמא, חלבונים במיוחד טיפוסיים ידועים פלזמה ממברנה, כגון חלבוני קינאז רצפטור הראו שפע גבוה בשבריר קרום פלזמה (PM) ושפע נמוך בחלק התחתון השלב (איור 4 א) המכיל את הקרומים הפנימיים (IM). בתורו חלבונים ידועים, של מופע reticulum endoplasmatic הגבוהשפע בשבריר הקרום הפנימי ולא נצפה בשבריר קרום פלזמה (איור 4).

ההעשרה הבאה של שברים חומר ניקוי עמידים קרום (שלב 3) תהיה במקרים אידיאליים לגרום להיווצרות טבעת חלבית של שלפוחית ​​קרום בצפיפות נמוכה בכ 1/5 th של גובה הצינור (איור 3). אם ההתאמה של טריטון X-100 ריכוזים או חומר הניקוי ליחס חלבון (שלב 3.2) היא אופטימלית להפרדה לשברים מסיסים אבקת עמידה וחומרי ניקוי, ניתן לראות טבעות נוספות בחלקים התחתונים של השיפוע ותהיינה גם גושי קרום בלהקה בצפיפות הנמוכה. במקרים אלה, חומרי ניקוי ליחס חלבון או בסך הכל כמות חומר ניקוי הוא שונה מריכוז micelle הקריטי ההכרחי להפרדה לשחזור של שני השברים תחום הממברנה. שימוש בריכוז חומר הניקוי הסופי וחומרי ניקוי ליחס חלבון שתואר כאן, Enrichment של חלבוני microdomain טיפוסיים, כגון remorin (AT3G61260) 27 יכולים להיות מאושר על ידי ניתוח השוואתי ספקטרומטריה של שבריר DRM, חלק אבקת מסיס (שלב 3.8), כמו גם קרום הפלזמה unfractionated וקרומים פנימיים. השפע הגבוה ביותר חלבון remorin של נמצא שבברי ה-DRM כצפוי (איור 6 א). חלבונים לא נמצאים בmicrodomains הקרום, כגון AT1G59870 ABC-טרנספורטר (איור 6), לא מראים שפע מוגבר בחלק ה-DRM. מזהמים גם טיפוסיים, כגון חלבון המיטוכונדריה (AT2G07707) ממתחם ATPase F0 (איור 6 ג) וחלבון ריבוזומלי (At1G001100) מהריבוזום 60S (איור 6 ד) לא מראים שפע מועשר בשבריר DRM, אם כי בכמויות מצומצמות יכולה עדיין להיות מזוהה.

לאחר יחסי שכיחות ניתוח ספקטרומטריה, חלבון מעמד זירחון החלבון בפלזמהברי קרום של תרביות תאים שכותרתו וללא תווית ניתן להבחין כמותית (איור 6). תוצאות אופייניות מMSQuant (msquant.alwaysdata.net חלון quantitation) צריכים להראות יחס עוצמת יון של אחד לאחד במשך רוב הפפטידים שזוהו (איור 6 א). פפטידים אלו עם יחס עוצמת יון לסטות באופן משמעותי מ1:01 נחשבים כהפרש מוסדר בין תרבית התאים שכותרתו וללא תווית, והם מועמדים להתאמה לחלבונים מושפעים מהטיפול המוחל (איור 6 ג). בקרת איכות טובה של תיוג חילוף חומרים מוצלח היא שיתוף elution של שניהם שכותרתו וגרסאות ללא תווית הפפטיד כשיא יחיד בהפרדת ננו HPLC (שלב 9) כפי שמוצגת ב6B דמויות ו-D.

איור 1 איור 1. אסטרטגיה ניסיונית תיוג מטבולית. ייצוג סכמטי של שתי גרסאות של עיצוב ניסיוני בעת שימוש בתרביות תאי thaliana א 'ללא תווית באופן מלא שכותרתו וחילוף חומרים. הנסיין יכול להחליט להשתמש 14 N תאים (ללא תווית) כביקורת ו15 N תאים (שכותרתו מטבולית) שעוברת טיפול ביולוגי או להיפך. בתכנון ניסוי גומלין שני הגרסאות מתבצעות במקביל.

איור 2
איור 2. זרימת עבודה להפרדה של שלפוחית ​​קרום צמח במערכת דו שלב מימית המבוססת על פוליאתילן גליקול (PEG) וdextran. שלפוחית ​​קרום פלזמה מופרדת לשלב PEG העליון תוך הכלורופלסט וקרומים פנימיים אחרים הקשורים לבוטשלב dextran אום לאחר צנטריפוגה. עם שטיפה נוספת של שלב העליון ניתן להשיג טיהור טובה יותר, אבל הפסד גם חומר הוא גדל.

איור 3
איור 3. העשרה של שברים קרום בצפיפות נמוכה. ייצוג שיפוע סוכרוז להעשרת שברים קרום אבקת עמידה בצפיפות נמוכה. המיקום הצפוי לאחר צנטריפוגה הלילה של להקת השלפוחית ​​הנמוכה צפיפות קרום מצויינים.

איור 4
איור 4. העשרה של חלבוני קרום פלזמה לאחר טיהור במערכת שני שלבים. מנורמלתעוצמות יון חלבון לחלבונים נמדדו בקרום פלזמה (PM) וקרום פנימי שבריר (IM). () מרכיבים ידועים אופייניים של קרום פלזמה מראים שפע הרבה יותר גבוה בשבריר PM מאשר בשבריר IM. מרכיבים ידועים (ב ') הטבעי של קרומים פנימיים מציג את ההתנהגות ההפוכה. לנורמליזציה, סכומי עוצמת יון עבור כל חלבון באו לידי ביטוי כחלק מעוצמת יון סך הכל לדגימה ולאחר מכן בממוצע בין משכפל. חלק בסך הכל בעוצמות יון אז בא לידי ביטוי כביחס לממוצע בין שני הטיפולים. ברים שגיאה מייצגים את סטיית התקן של שלוש הכנות מתרביות תאים גדלו באופן עצמאי. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

איור 5 איור 5. . שפע של סמני חלבון סטנדרטיים בתוך שברים נמדדו מגרשים מייצגים את חלוקת עוצמות יון חלבון מנורמלות של סמנים שנבחרו חלבון לתאי subcellular מסוימים (DRM - microdomains סטרולים עשירים, אחר הצהריים - קרום פלזמה, מסרים מיידיים - קרום פנימי, SP - חלבונים מסיסים). דפוסי שפע () remorin כסמן לmicrodomains קרום סטרולים עשירים, (ב) חלבון משפחת טרנספורטר ABC מסוג כנציג של חלבון לא סטרולים תלויים, (ג) למקטע של קומפלקס F0 המיטוכונדריה, (ד ') 60S מקטע של הריבוזומים כמו זיהום שיתוף טיהור טיפוסי. לנורמליזציה, סכומי עוצמת יון עבור כל חלבון באו לידי ביטוי כחלק מעוצמת יון סך הכל לדגימה ולאחר מכן בממוצע בין משכפל. חלק בסך הכל בעוצמות יון אז באו לידי ביטוי כביחס לממוצע בין שני הגידtments. ברים שגיאה מייצגים את סטיית התקן של שלוש הכנות מתרביות תאים גדלו באופן עצמאי. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

איור 6
איור 6. תוצאות צפויות של חלבון הכמותי ספקטרומטריית מסה. צילום מסך מMSQuant מראה את היחס של 1:1 עוצמת יון הצפוי של הפפטיד מתערובת 1:1 של תמציות חלבון מן הספקטרום שכותרת ותאי ארבידופסיס ללא תווית. () מלא סריקה של DNNLLGK פפטיד באופן ברור הפרדה שכותרתו (שיא מימין) וגרסה ללא תווית (שיא שמאלי) של פפטידים על הציר מ '/ z. מסת monoisotopic והאיזוטופ הראשון מסומנות על ידי סימנים כחולים. (ב ') שכותרתו (כחול)גרסאות ד ללא תווית (אדום) של הפפטיד שיתוף elute כשיא יחיד בכרומטוגרפיה ננו HPLC. ספקטרום סריקה מלא של הפפטיד עם יחס עוצמת יון של 01:05 כמועמד לחלבון באופן דיפרנציאלי מוסדר (C). (ד ' ) כמו כן חלבונים עם יחס שונה מ01:01 שיתוף elute בכרומטוגרפיה התהפך שלב. לחצו כאן כדי להציג דמות גדולה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול שהוצג במאמר זה מכיל שלבים רבים וכל אחד מהם הם חיוניים כדי להשיג חלוקה טהורה ונציג של קרום הפלזמה הצמח לממברנות עמידות חומרי ניקוי ושברים מסיסים חומרי ניקוי. לכן, חשוב לעקוב אחר כל צעד בהתאם להנחיות.

טיפול בשבריר קרום הפלזמה עם חומר ניקוי שאינו יוניים (שלב 3.2) יש ההשפעה החזקה ביותר על איכות חלוקה microdomain הממברנה. כדי להשיג תוצאות לשחזור בין תכשירים שונים, וכדי להיות מסוגל להשוות דגימות שונות מאותו הניסוי, זה מאוד חשוב להעריך במדויק את ריכוזם של חלבונים בקרום פלזמה וליישם את חומר הניקוי תמיד באותו היחס ביחס לתכולת חלבון ותמיד לאותו ריכוז סופי. מבחינה מעשית, זה אומר שלפעמים יש צורך לדלל דגימות עם ריכוז חלבון גבוה או להשתמש במניות ריכוז שונותשל טריטון X-100.

במחקרים ביוכימיים, לאחרונה חלה נטייה בקרב חוקרים להשתמש בשיטה ללא חומר ניקוי לבידודה של microdomains הקרום 28-30. שיטות אלה מבוססות על הפרעה מכאנית של קרום הפלזמה של גז באמצעות מחט קטנה מאוד בהשוואה לעיתונות תא לחץ הצרפתית. נהלים אלה מיושמים בהצלחה בתרביות תאים של יונקים עשירים בmicrodomains קרום, אבל יישום לקיר תא המכיל אורגניזמים (שמרים, תאי צמח) לא דווח. שימוש פרוטאומיקה כמותית יחד עם סוכני שיבוש בסטרולים, כגון מתיל-beta-ציקלודקסטרין, זה היה הראה כי שברי ה-DRM שהוכנו מקרום הפלזמה צמח אל מכילים חלבונים שהם סמנים לmicrodomains קרום 11.

לגבי התוצאות הסופיות של quantitation ספקטרומטריה, התוצאות טיפוסיות שמוצגת באיור 6 מייצגות את המצב האידיאלי בשעוצמת יון עבור רוב פפטידים שכותרת וללא תווית קרובות זהה. עם זאת, במקרים מסוימים ניתן להבחין במידה מסוימת של שונות ביולוגיות בין הסטים של תרביות תאים שכותרתו וללא תווית. לכן, לפני טיפול ביולוגי או שכותרתו או תרבית תאים ללא תווית מתבצעת, ניתוח של תערובת של תאים שכותרתו שליטה וללא תווית, שניהם ללא כל טיפול, מאפשר זיהוי של פפטידים עם יחסים מסתעף מאידאל 00:59 מצבים. חלבונים אלה עם יחס מסתעף אינדיקציות לשינוי ביולוגי. כדי להתגבר על האתגר של השפעות טיפול הייחודיות מוריאציה ביולוגית, ולכן אנו מציעים להשתמש תיוג הגומלין בניסויים לזווג 20. בהגדרת הניסוי ההדדית, שני הגרסאות של הניסוי מבוצעות כפי שהוצעו באיור 1 והצעדים של הפרוטוקול הם אחריו כפי שתוארו. ואז, בהשוואת יחסי עצמת יון של proteins משני הניסויים ההדדיים, ניתן להבחין אם ההבדלים בין יחסי עצמת יון הם עקב וריאציה ביולוגית או כהשפעה של הטיפול מיושם.

שיטה נוספת לטיפול בבעית ההבחנה בין השפעות טיפול ווריאציה ביולוגית היא השימוש סטנדרטי שכותרתו פנימית כנקודת התייחסות לכל הטיפולים ביום 31. בגישה זו, שליטה ללא תווית וללא תווית תאים שעוברים טיפול ביולוגי מעורבבים עם אותה הכמות של תאי שליטה שכותרתו כבדים, המגיעים מאותה אצווה. היא מאפשרת ומבטלת את ההשפעה של שונות ביולוגיות על יחס פפטיד, כי חלבונים נחשבים כמשמעותי, אם יחסי עצמת יון של 14 N-שליטה / 15 N-בקרה ו14 N-טיפול / 15 N-שליטה שונים באופן משמעותי. זה אפשרי, כמו התקן שכותרתו הוא בדיוק אותו בכל המקרים.

אחד drawbacks של הליך העשרת DRM שתואר כאן הם חלבוני שיתוף הטיהור שיכולה להיות מזוהה בשבריר הקרום עמיד חומרי הניקוי. ברשימה של חלבונים שזוהו משבריר קרום אבקת עמידה בצפיפות נמוכה, אנו יכולים לצפות באופן קבוע במספר רב של חלבוני ריבוזומלי. בשל הצפיפות הנמוכה יחסית של חלבוני ריבוזומלי, הם נודדים באותו שבריר כמו חלבוני קרום תלויים בסטרולים בשיפוע סוכרוז. היא הוצגה ללא כל ספקות כי חלבוני ריבוזומלי הם בבירור לא מרכיבים של microdomains קרום 11. כדי לא לכלול אלה וחלבונים שיתוף טיהור אחרים לא ממש קשורים עם השברים קרום בצפיפות נמוכה אבקת עמידה, אנו מציעים לנתח גם את הרכב proteomic של הקרומים תאיים (IM) אשר ניתן להפיק מהשלב dextran נמוך יותר משני מערכת השלב ולהשוות את יחסי השפע של חומרים מזהמים המשוערת בין הקרום הפנימי וה-DRMחלק קטן (ראה דוגמאות באיור 5). חלבוני ה-DRM שותף לטיהור צריכים שכיחות דומה בשני השברים (IM וDRM).

חלוקה של תמציות תא וmicrodomains הקרום היא אסטרטגיה משותפת להפחית את המורכבות במדגם לניתוח proteomic 32. לכן, הפרוטוקול המתואר כאן הוא שימושי לכל המחקרים של איתות תהליכים בקרום הפלזמה של תאי צמח. יישומים ביולוגיים נמצאים בלומדים את תגובות לחץ, כמו גם זיהומי פתוגן שכל במידה רבה לגרום לשינויים בהרכב קרום פלזמה ושינוי של חלבוני קרום 14,15. חוץ מזה לומד את תגובות לחץ, לכמת את שכיחותם של חלבונים בקרום שברים שונים יכול מאוד לסייע לביאור של חלבונים עדיין לא ידועים 33 34,35.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

המחבר, ויטולד שימנסקי, הנו עובד של מכון מקס פלנק למולקולרי Plant Physiology. המחבר, היים שולץ הוא עובד באוניברסיטת הוהנהיים, גרמניה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Chemicals were ordered from Sigma-Aldrich unless noted otherwise
Ammonia (stock 25 % solution) WAKO 010-03166
TiO2 10 μm GL-Science 5020-75010
Empore Disk C18 Varian 12145004
Polyethylene glycol(PEG 3350) Sigma 88276
Dextran T500 Roth 9219.2
Trypsin Promega V5113
Protease inhibitor cocktail (PIC) Sigma P9599
K15NO3 Cambridge Isotope Laboratories NLM-765-PK
EQUIPMENT
Optima L-80 XP Ultracentrifuge Beckman
Plate reader BioTek
EASY-nLC II nano-Liquid Chromatograph Thermo Scientific
LTQ-Orbitrap mass spectrometer Thermo Scientific
Centrifuge 5810R Eppendorf
Centrifuge 5417R Eppendorf
Thermomixer Eppendorf
Speed Vac RVC 2-25 Christ
Shaker Unimax 2010 Heidolph

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alexandersson, E., Saalbach, G., Larsson, C., Kjellbom, P. Arabidopsis plasma membrane proteomics identifies components of transport, signal transduction and membrane trafficking. Plant Cell Physiol. 45, 1543-1556 (2004).
  2. Brown, D. A., Rose, J. K. Sorting of GPI-anchored proteins to glycolipid-enriched membrane subdomains during transport to the apical cell surface. Cell. 68, 533-544 (1992).
  3. Lanquar, V., et al. 15N-metabolic labeling for comparative plasma membrane proteomics in Arabidopsis cells. Proteomics. 7, 750-754 (2007).
  4. Kierszniowska, S., Walther, D., Schulze, W. X. Ratio-dependent significance thresholds in reciprocal 15N-labeling experiments as a robust tool in detection candidate proteins responding to biological treatment. Proteomics. 9, 1916-1924 (2009).
  5. Singer, S. J., Nicolson, G. L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 175, 720-731 (1972).
  6. Simons, K., Ikonen, E. Functional rafts in cell membranes. Nature. 387, 569-5672 (1997).
  7. Baumgart, T., et al. Large-scale fluid/fluid phase separation of proteins and lipids in giant plasma membrane vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 3165-3170 (2007).
  8. Silvius, J. R. Partitioning of membrane molecules between raft-and non raft-domains: insights from model membrane studies. Biochim. Biophys. Acta. 1746, 193-202 (2005).
  9. Tanner, W., Malinsky, J., Opekarova, M. In plant and animal cells, detergent-resistant membranes do not define functional membrane rafts. Plant Cell. (2011).
  10. Lauwers, E., Andre, B. Association of yeast transporters with detergent-resistant membranes correlates with their cell-surface location. Traffic. 7, 1-15 (2006).
  11. Kierszniowska, S., Seiwert, B., Schulze, W. X. Definition of Arabidopsis sterol-rich membrane microdomains by differential treatment with methyl-ß-cyclodextrin and quantitative proteomics. Mol. Cell. Proteomics. 8, 612-623 (2009).
  12. Simons, K., Toomre, D. Lipid rafts and signal transduction. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 31-39 (2000).
  13. Maeda, Y., Kinoshita, T. Structural remodeling, trafficking and functions of glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins. Prog. Lipid Res. 50, (2011).
  14. Keinath, N. F., et al. PAMP-induced changes in plasma membrane compartmentalization reveal novel components of plant immunity. J. Biol. Chem. 285, 39140-39149 (2010).
  15. Stanislas, T., et al. Quantitative proteomics reveals a dynamic association of proteins to detergent resistant membranes upon elicitor signaling in tobacco. Mol. Cell. Proteomics. 8, 2186-2198 (2009).
  16. Minami, A., et al. Alterations in detergent-resistant plasma membrane microdomains in Arabidopsis thaliana during cold acclimation. Plant Cell Physiol. 50, 341-359 (2008).
  17. Pauly, M., Eberhard, S., Albersheim, P., Darvill, A., York, W. S. Effects of the mur1 mutation on xyloglucans produced by suspension-cultured Arabidopsis thaliana cells. Planta. 214, 67-74 (2001).
  18. Jouanneau, J. P., Peaud-Lenoel, C. Growth and synthesis of proteins in cell suspensions of a kinetin dependent tobacco. Physiol. Plant. 20, 834-850 (1967).
  19. Engelsberger, W. R., Erban, A., Kopka, J., Schulze, W. X. Metabolic labeling of plant cell cultures with K15NO3 as a tool for quantitative analysis of proteins and metabolites. Plant Methods. 2, 1-11 (2006).
  20. Arsova, B., Kierszniowska, S., Schulze, W. X. The use of heavy nitrogen in quantitative proteomics experiments in plants. Trends Plant Sci. 17, 102-112 (2012).
  21. Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop And Go Extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Anal. Chem. 75, 663-670 (2003).
  22. Olsen, J. V., Macek, B. High accuracy mass spectrometry in large-scale analysis of protein phosphorylation. Methods Mol. Biol. 492, 131-142 (2009).
  23. Schroeder, M. J., Shabanowitz, J., Schwartz, J. C., Hunt, D. F., Coon, J. J. A neutral loss activation method for improved phosphopeptide sequence analysis by quadrupole ion trap mass spectrometry. Anal. Chem. 76, 3590-3598 (2004).
  24. Frese, C. K., et al. Improved peptide identification by targeted fragmentation using CID, HCD and ETD on an LTQ-Orbitrap Velos. Journal of Protrome Research. 10, 2377-2388 (2011).
  25. van Breukelen, B., vanden Toorn, H. W., Drugan, M. M., Heck, A. J. StatQuant: a post-quantification analysis toolbox for improving quantitative mass spectrometry. Bioinformatics. 25, 1472-1473 (2009).
  26. Zauber, H., Schulze, W. X. Proteomics wants cRacker: Automated standardized data analysis of LC/MS derived proteomic data. J. Proteome Res. 11, 5548-5555 (2012).
  27. Raffaele, S., Mongrand, S., Gamas, P., Niebel, A., Ott, T. Genome-wide annotation of remorins, a plant-specific protein family: Evolutionary and functional perspectives. Plant Physiol. 145, 593-600 (2007).
  28. Shah, M. B., Sehgal, P. B. Nondetergent isolation of rafts. Methods Mol. Biol. 398, 21-28 (2007).
  29. Persaud-Sawin, D. -A., Lightcap, S., Harry, G. J. Isolation of rafts from mouse brain tissue by a detergent-free method. Journal of Lipid Research. 50, 759-767 (2009).
  30. Macdonald, L. J., Pike, L. J. A simplified method for the preparation of detergent-free lipid rafts. Journal of Lipid Research. 46, 1061-1067 (2005).
  31. Mühlhaus, T., Weiss, J., Hemme, D., Sommer, F., Schroda, M. Quantitative shotgun proteomics using a uniform 15N-labeled standard to monitor proteome dynamics in time course experiments reveals new insights into the heat stress response of Chlamydomonas reinhardtii. Mol. Cell. Proteomics. 10, M110.004739 (2011).
  32. Schulze, W., Usadel, B. Quantitation in mass-spectrometry-based proteomics. Annu. Rev. Plant Biol. 61, 491-516 (2010).
  33. Foster, L. J., de Hoog, C., Mann, M. Unbiased quantiative proteomics of lipid rafts reveales high specificity for signaling factors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 5813-5818 (2003).
  34. Lilley, K. S., Dupree, P. Plant organelle proteomics. Curr. Opin. Plant Biol. 10, 594-599 (2007).
  35. Sadowski, P. G., Groen, A. J., Dupree, P., Lilley, K. S. Sub-cellular localization of membrane proteins. Proteomics. 8, 3991-4011 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics