Metabolic Etichettatura e con membrana frazionamento per proteomica comparativa Analisi del

Biology

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Summary

Qui si descrive un metodo efficace per il frazionamento di membrane plasmatiche vegetali solubili nelle membrane resistenti e detergenti detergenti a base di miscela di non marcato e in vivo completamente 15 N etichettati colture cellulari Arabidopsis thaliana. La procedura viene applicata per studi di proteomica comparativi per capire i processi di segnalazione.

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Szymanski, W. G., Kierszniowska, S., Schulze, W. X. Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures. J. Vis. Exp. (79), e50535, doi:10.3791/50535 (2013).

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Abstract

Plasma microdomini di membrana sono caratteristiche basate sulle proprietà fisiche dell'ambiente lipidi e steroli e particolari ruoli nei processi di segnalazione. Estrazione microdomini di membrana arricchiti di steroli dalle cellule vegetali per l'analisi proteomica è un compito difficile, soprattutto a causa molteplici fasi di preparazione e le fonti di contaminazioni provenienti da altri compartimenti cellulari. La membrana plasmatica costituisce solo circa il 5-20% di tutte le membrane in una cellula vegetale, e quindi l'isolamento della frazione di membrana plasmatica altamente purificato è impegnativo. Un metodo utilizzato frequentemente comporta acquosa partizionamento bifase in polietilene glicole e destrano, che produce vescicole della membrana plasmatica con una purezza del 95% 1. Ricchi di steroli microdomini di membrana all'interno della membrana plasmatica sono insolubili in seguito al trattamento con detergenti non ionici fredde a pH alcalino. Questa frazione di membrana resistente ai detergenti può essere separato dalla membrana plasmatica bulk mediante ultracentrifugazione in quantogradiente ucrose 2. Successivamente, le proteine ​​possono essere estratti dalla banda bassa densità del gradiente di saccarosio da metanolo / cloroformio precipitazione. Proteina estratta sarà poi tripsina digerito, dissalato e, infine, analizzato da LC-MS/MS. Il nostro protocollo di estrazione per microdomini ricchi di steroli è ottimizzato per la preparazione di detergenti puliti resistente membrana frazioni da colture cellulari Arabidopsis thaliana.

Usiamo piena marcatura metabolica di Arabidopsis thaliana colture cellulari sospensione con K 15 NO 3 come unica fonte di azoto per studi di proteomica comparativi quantitativi in seguito al trattamento biologico di interesse 3. Mescolando uguali indici di colture cellulari etichettati e non etichettati per l'estrazione delle proteine ​​congiunta l'influenza della procedura di preparazione sul risultato quantitativo finale è mantenuta ad un minimo. Anche la perdita di materiale durante l'estrazione interesserà sia il controllo e campioni di trattamento nello stesso modo, und quindi il rapporto di luce e sollevamento peptide rimarrà costante. Nel metodo proposto sia etichettato o coltura cellulare non marcato subisce un trattamento biologico, mentre l'altro serve come controllo 4.

Introduction

Nel 1972, Jonathan Singer e Garth Nicolson proposto il modello a mosaico fluido un modello struttura delle membrane cellulari, sostituendo il modello panino proteina-lipide-proteina che è stata generalmente accettata nei primi anni 1960. Singer e Nicolson postulato che la membrana biologica può essere considerato come un liquido bidimensionale in cui tutte le molecole lipidiche e proteiche diffondersi liberamente e facilmente 5. Da allora, struttura tipo della membrana plasmatica e la conoscenza della composizione membrana è diventata ancora più complessa. In particolare, all'interno della membrana plasmatica, strutture come complessi proteici basati lipidi / steroli microdomini strutturalmente disordinate possono essere osservati. In membrane modello artificiali 6,7, steroli e sfingolipidi possono separare lateralmente da altre specie di lipidi per formare regioni con caratteristiche fisiche alterate. Questa segregazione all'interno della membrana cellulare è causato principalmente dalle proprietà di auto-associazione tra steroli e altamente sacatene di idrocarburi insaturi di phopsho-e sfingolipidi 8. In particolare, gli anelli rigidi steroli favoriscono le interazioni con più rigido e specie lipidiche dritto saturi e queste interazioni costringono vicine catene idrocarburiche in più conformazioni estese, aumentando lo spessore della membrana e durezza.

Una delle caratteristiche comuni delle steroli arricchito microdomini di membrana è stata loro insolubilità in seguito al trattamento con detergenti non ionici come un Triton X-100 o Brij 35. Queste frazioni sono stati pensati per essere identico a microdomini di membrana e sono stati chiamati membrane resistenti ai detergenti (DRM) basato sul loro metodo di preparazione biochimica 2. L'uso di detergenti non ionici durante l'estrazione DRM ricevuto qualche critica come la preparazione DRM biochimico potrebbe non corrispondere direttamente a qualsiasi compartimento di membrana specifico all'interno della cellula vivente 9. In particolare, il detersivo rapporto proteina sembra cruciale in tali preparati, uns diversi detergenti, e anche diverse quantità di detersivo può produrre diversa composizione del resistente detersivo frazione di membrana 10. Tuttavia, vi sono prove che particolari specie proteiche specificamente associare a questi domini di membrana ricchi di steroli cellulari, e che queste proteine ​​sono ben arricchiti in preparazioni biochimiche di detersivo resistente membrana frazioni 11. Il nucleo di proteine ​​che sono stati trovati in frazione DRM impianti, e per i quali la presenza di DRM era steroli dipendente, erano in particolare le proteine ​​GPI-ancorate, come le proteine ​​fasciclin-come Arabinogalattano (FLA) e membri della famiglia di proteine ​​SKU. Anche alcune proteine ​​di segnalazione, come chinasi o fosfolipasi recettore-like sono stati trovati 11. Questi risultati sono coerenti con numerosi studi di proteomica su microdomini di membrana mammiferi 12,13. Anche nelle piante è sempre più evidente per il ruolo di microdomini di membrana nel contesto della risposta allo stress 14 -16.

Il protocollo qui descritto fornisce un metodo robusto per frazionamento di microdomini di membrana del plasma e in particolare utilizza una proteina di concentrazione di detersivo che ci permette di rappresentare lo stress indotto alterazioni della ricca di steroli vano membrana 4,11,14.

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Protocol

PROCEDURA

Reagenti e tamponi comunemente utilizzate nel protocollo di estrazione:

  1. JPL mezzo per Arabidopsis thaliana colture cellulari di sospensione
    • 3 mM H 3 BO 3
    • 3 micron MnSO 4 x H 2 O
    • 1.1 micron ZnSO 4 x 7 H 2 O
    • 0.15 micron KJ
    • 0,03 mM Na 2 MoO 4 x 2 H 2 O
    • 3 nM CoCl 2 x 6 H 2 O
    • 3 nM CuSO 4 x 5 H 2 O
    • 0.9 mM CaCl 2 x 2 H 2 O
    • 0.5 MgSO mm 4 x 7 H 2 O
    • 0,5 micron FeSO 4 x 7 H 2 O
    • 0,5 mM Na 2 EDTA x 2 H 2 O
    • 0.12 micron tiamina HCl
    • 0.16 micron acido nicotinico
    • 0,097 micron piridossina HCl
    • 0.107 micron NAA
    • 0.375 mM KH 2 PO 4
    • 0.061 NaH mM2 PO 4 x 2 H 2 O
    • 0,039 mM Na 2 HPO 4
    • Glicina 0,027 mM
    • 0.56 mM mio-inositolo
    • 1,5% di saccarosio
    • 10 mM K 14 NO 3 o 10 mm K 15 NO 3

NOTA: pH del mezzo JPL deve essere regolato a 5,7 con KOH. Il terreno deve essere sterilizzata mediante filtrazione o autoclave prima dell'uso.

  1. Buffer H
    • 100 mM HEPES-KOH (pH 7.5)
    • 250 mM saccarosio
    • 10% (w / v) di glicerolo
    • 5 mM EDTA
    • Acido ascorbico 5 mM
    • 0,6% (w / v) PVP K-25 o K-30
    • 5 mM DTT (aggiungere fresco)
    • 1 PMSF mm (aggiungere fresco)
    • inibitori della proteasi e fosfatasi (aggiungere fresco)
      • 50 mM NaF
      • 1 mM Na 3 VO 4
      • 1 mM benzamidin
      • 0,3 micron mikrocystin
      • 4 micron leupeptina
      • inibitore della proteasi cocktail
  2. Buffer R
    • Fosfato di potassio 5 mM
    • 0.33 M saccarosio
    • 3 mM KCl
    • 0,1 mM EDTA
    • 1 mM DTT (aggiungere fresco)
  3. Buffer TNE
    • 25 mM Tris-HCl, pH 7.5
    • 150 mM NaCl
    • 5 mM EDTA
  4. Sistema bifasico (6 g-sistema è adatto per un massimo di 15 g di peso fresco campione) Metodo di preparazione
    In 15 ml Falcon ingredienti della miscela tubo di seguito elencati e mescolare accuratamente:
    • 20% (w / w) destrano T500 - 2.6 g
    • 40% (w / w) poli (etilene glicole) (PEG 3350) - 1.3 g
    • saccarosio - 0,678 g
    • 0,2 M fosfato di potassio, pH 7,8-0,15 ml
    • 2 M KCl - 0.014 ml
    • aggiungere acqua fino massa totale del sistema bifasico è 6 g.
  5. Soluzioni di saccarosio in tampone TNE
    • 2.4 M, 1,6 m, 1,4 m, 0,15 M
  6. Reagenti per la digestione tripsina
    • UTU: 6 M urea, 2 M tiourea (pH 8,0 con 10 mM Tris-HCl) Riduzione del buffer (1 mg / mL DTT in acqua, 6,5 mm)
    • Tampone Alchilazione (5 mg / ml iodoacetamide in acqua, 27 mm)
    • LysC endopeptidasi (0,5 mg / mL)
    • Tripsina, grado sequenza modificata (0,4 mg / mL)
  7. Reagenti per peptide dissalazione oltre C 18
    • soluzione di risospensione: acido 2% trifluoroacetico (TFA), 5% acetonitrile in acqua
    • soluzione A: 0,5% di acido acetico
    • Soluzione B: 80% acetonitrile, 0,5% di acido acetico
  8. Reagenti per fosfopeptide arricchimento
    • Soluzione A: 0,1% TFA, 5% acetonitrile
    • Soluzione B: 0,1% TFA, 80% acetonitrile
    • TiO 2 10 micron
    • Ammoniaca (soluzione 25%)
    • Piperidina (magazzino 100%)

PROTOCOLLI

1. Etichettatura metabolica di Arabidopsis thaliana Culture sospensione cellulare

  1. Grow Arabidopsis Col-0 cellcolture in sospensione derivate da foglie 17 in totale 14 N-JPL medio (18, vedere la sezione "reagenti comuni e tamponi") e una serie di culture in 15 N-JPL medio nel pallone sterile in condizioni di luce costante a 80-100 mmol / m 2 s, 23 ° C, sotto costante agitazione a 120 rpm.
  2. Per mantenere le colture cellulari, inoculare 400 ml di mezzo fresco JPL con 40 ml di sette giorni vecchia cultura di cellule in 1 L fiaschi.
  3. La raccolta delle colture cellulari avviene attraverso aspirazione di vuoto attraverso un ampio imbuto di vetro con una maglia in acciaio inox. Cellule si accumulano sulla piastra e maglia nell'imbuto e possono essere facilmente raccolti da lì. Le cellule sono raccomandati per essere congelati a -80 ° C o in azoto liquido prima della macinazione.

NOTA: Per 15 N colture di cellule marcate metabolicamente usa il K 15 NO 3 come unica fonte di azoto per almeno due passaggi in due settimane 19. In esperiments per proteomica comparativa, usa una coltura di cellule etichettate 15 N ed anche mantenere una cultura senza etichetta in mezzo normale. Trattamento biologico sarà poi applicata alla cultura sia marcato o non marcato, mentre l'altro serve come controllo (Figura 1). Per la preparazione di proteine, entrambe le culture saranno combinati 20. Quando si pianifica la configurazione sperimentale, si suggerisce di considerare una configurazione etichettatura reciproca 4, in cui lo stesso trattamento viene applicato una volta al 15 celle N-etichettati e una volta alle cellule non marcate e la rispettiva senza etichetta o 15 celle N-etichettati servono come controlli. In questo caso, sono necessari i doppi quantità di colture cellulari.

2. Plasma membrana Purificazione

NOTA: Tutte le fasi successive sono effettuate in camera fredda e / o su ghiaccio meno che non sia indicato diversamente.

  1. Omogeneizzare cellule da circa 1 L di 7 giorni di età colture in sospensione di cellule in azoto liquido.Il materiale può essere conservato a -80 ° C fino all'utilizzo.
  2. Mescolare le stesse quantità di colture cellulari congelati etichettati e non etichettati in base al peso fresco in un becher e aggiungere 2 volumi di tampone H immediatamente. In caso di membrana preparazione microdominio si consiglia di utilizzare almeno 7 g peso fresco di entrambe le cellule etichettati e senza etichetta.
  3. Porre il becher su un agitatore e agitare fino a quando il materiale viene fuso e la soluzione è liquido e senza cristalli di ghiaccio.
  4. Filtrare l'omogeneizzato attraverso uno strato di miracloth in 50 ml provette da centrifuga.
  5. Campioni di equilibrio con tampone H e centrifugare a 10.000 xg per 8 min.
  6. Caricare il surnatante in tubi ultra-centrifuga pre-raffreddato (ad esempio per il rotore Beckman Coulter SW31Ti), con un volume di circa 32 ml
  7. Campioni equilibrio con tampone H e pellet microsomi per centrifugazione a 100.000 xg a 4 ° C per 30 minuti con rotore Beckman SW32Ti.
  8. Rimuovere il surnatante dopo centrifugazione.

    NOTA: Il surnatante contiene proteine ​​solubili. Una piccola quantità di questa frazione può essere salvato per ulteriore precipitazione della proteina e successiva analisi anche di proteine ​​solubili.

    1. Risospendere il pellet membrana di ciascun campione in quantità corrispondente di tampone R e caricare sulla sommità del U1 sistema bifasico (Figura 2). Se viene utilizzato il 6 g sistema bifasico, caricare esattamente 2 g di pellet risospeso membrana.

    NOTA: Il volume finale di tampone R dipende dalle dimensioni del sistema a due fasi che sta per essere usato (~ 1,6 ml di tampone R è necessaria quando si utilizza il sistema 6 g). Si raccomanda di utilizzare meno buffer per risospensione in modo tampone puro può essere aggiunto su sistema bifasico per ottenere il peso richiesto, piuttosto che usando troppo buffer per solubilizzazione e non essere in grado di caricare l'intero campione sul sistema a due fasi.

    1. Caricare lo stesso volume di tampone puro R come usato per the campione risospensione su U2.
    2. Lentamente mescolare tubi U1 e U2 invertendo loro 30x (circa 1 inversione / sec).

    NOTA: Non scuotere vigorosamente il sistema a due fasi. Può causare una mancanza di separazione delle fasi nel passo ultracentrifugazione.

    1. Centrifugare i campioni a 1500 xga 4 ° C per 10 min.
    2. Rimuovere il surnatante dopo centrifugazione.
    3. Trasferire la fase superiore da U1 su U2 e ripetere centrifugazione a 1500 xga 4 ° C per 10 min.
    4. Spostare la fase superiore degli U2 nei tubi ultracentrifuga SW41Ti e diluirlo con cinque volumi di tampone R e mescolare accuratamente.

    NOTA: La fase superiore finale può essere diviso in tubi ultracentrifuga separati prima che possa essere diluito cinque volte.

    1. Centrifugare i campioni a 200.000 xg a 4 ° C per un'ora utilizzando il rotore SW41Ti.
    2. Risospendere membrana pellet in smalquantità l di tampone TNE (tipicamente 200 microlitri di buffer è usata) per l'isolamento di membrane resistenti detergenti.

    NOTA: Una piccola quantità di questa frazione può essere salvato per l'analisi di membrana plasmatica non frazionata.

    NOTA: La frazione di membrana plasmatica può essere conservato a 4 ° C per una notte prima di frazionamento nelle membrane resistenti detergenti e frazioni solubili detergenti.

    3. Detergente Resistente membrana Preparazione

    1. Controllare la concentrazione della frazione di membrana plasmatica mediante saggio Bradford.
    2. Aggiungere Triton X-100 alla frazione di membrana plasmatica. La concentrazione finale di detersivo dovrebbe rimanere tra il 0,5-1%. Il detersivo di peso proteine ​​in rapporto al peso dovrebbe rimanere tra i 13-15.
    3. Campioni Agitare a circa 100 rpm a 4 ° C per 30 min.
    4. Aggiungere tre volumi di 2.4 M saccarosio a un volume della membrana plasmatica trattato per ottenere 1,8 M concentrazione finale di saccarosio. </ Li>
    5. Preparare il gradiente di saccarosio in tubi ultracentrifuga SW41Ti caricando le rispettive soluzioni di saccarosio in cima della frazione 1,8 M come illustrato nella Figura 3.
    6. Centrifugare i campioni a 250.000 xg a 4 ° C per 18 ore utilizzando il rotore Beckman SW41Ti.
    7. Rimuovere con attenzione i tubi ultracentrifuga dal rotore Per evitare di perturbare della banda a bassa densità che può essere visibile come un anello lattiginoso all'interfaccia di 0,15 M/1.4 M saccarosio. A volte non si vede niente ma la frazione contiene ancora la frazione proteica resistente detersivo.
    8. Rimuovere frazione di volume di 0,75 ml dalla parte superiore del gradiente. Frazioni 2 e 3 che coprono volume di circa 1,5 ml di sopra dell'anello interfase e 0,5 ml di sotto rappresentano la frazione di membrana resistente ai detergenti. Raccogliere queste frazioni in provette da 15 ml Falcon. Frazioni 9 e 10 contengono la frazione di membrana solubile detersivo e possono essere rilevati anche per il confronto. Per un'analisi più approfondita, piscina fractioni 2 e 3, nonché frazioni 9 e 10.

    4. Estrazione delle proteine ​​dalla Frazione Resistente detergente da metanolo / cloroformio

    NOTA: Tutte le fasi vengono eseguite nella temperatura ambiente.

    1. Aggiungere 4 volumi di metanolo per le frazioni raccolte e vortex accuratamente.
    2. Aggiungere 1 volume di cloroformio, vortice accuratamente.
    3. Aggiungere 3 volumi di acqua, vortice accuratamente.
    4. Centrifugare i campioni a 2.000 xg per 5 minuti usando una centrifuga da banco (es Eppendorf 5417R).
    5. Rimuovere la fase acquosa di sopra dello strato proteina nell'interfase.
    6. Aggiungere 3 volumi di metanolo, vortex accuratamente.
    7. Centrifugare i campioni a 4.000 xg per 10 min.
    8. Rimuovere il surnatante e asciugare il pellet. Il pellet essiccato è pronto per la digestione in soluzione.

    5. In soluzione tripsina Digestione

    NOTA: In questa procedura tutti i passi sono fatte atemperatura ambiente per ridurre derivatizzazione indesiderata di aminoacidi catene laterali dai denaturanti.

    1. Sciogliere campione in piccolo volume di 6 M urea, 2 M thiurea, pH 8 (UTU). Utilizzare partire volume è compatibile con il campione (di solito circa 40 microlitri).
    2. Spin campioni solubilizzati in UTU a 5.000 xg in una centrifuga da banco (es Eppendorf 5417R) per 10 min a pellet qualsiasi materiale insolubile.
    3. Il pH della soluzione finale dovrebbe essere vicino a 8,0 per un'ottimale digestione tripsina. Verificare con le strisce di pH.
    4. Aggiungere 1 ml di tampone di riduzione per ogni 50 ug di proteina campione e incubare per 30 min a temperatura ambiente.

    NOTA: solo una stima approssimativa del tenore di proteine ​​è necessaria. Quando quantità di campione è limitato, è meglio sacrificare la precisione piuttosto che sprecare esempio in un saggio delle proteine.

    1. Aggiungere 1 ml di tampone di alchilazione per ogni proteina campione 50 mg e incubare 20 minuti a temperatura ambiente al buio.
    2. Aggiungere 0,5 ml di lysC a 50 ug di proteine ​​del campione e incubare per tre ore a temperatura ambiente con agitazione costante a 700 rpm. Se necessario, il digest può essere eseguita anche durante la notte. Tuttavia, il tempo prolungato a temperature calde non è raccomandato in quanto può aumentare la perdita di peptide a causa di adsorbimento a materiale tubo di plastica sotto acquosi pH 8 condizioni.
    3. Diluire il campione con quattro volumi 10 mM Tris-HCl, pH 8.

    NOTA: Questo passaggio è assolutamente necessario diluire la concentrazione di urea come tripsina è molto sensibile a alto sale.

    1. Aggiungere 1 ml di tripsina per 50 proteine ​​del campione mg e incubare una notte a temperatura ambiente con costante agitazione a 700 rpm.
    2. Acidificare i campioni al 0,2% TFA concentrazione finale di raggiungere pH 2 (aggiungere circa 1/10 del volume di 2% di acido trifluoroacetico).

    NOTA: I campioni possono essere conservati a - 20 ° C fino riutilizzato, ma è meglio conservareloro su StageTips a 4 ° C, se è per un breve periodo di tempo (una settimana) o memorizzarli dopo StageTips dissalazione.

    6. Produzione di C 18-StageTips

    1. Inserire un Empore Disk C18 su una superficie piana e pulita, come un piatto di plastica Petri usa e getta.
    2. Punch out un piccolo disco utilizzando un ago ipodermico a punta smussata con diametro di 1,5 mm. Il disco infila l'ago e può essere trasferito in un puntale.
    3. Spingere il disco esce l'ago e fissarlo nella rastrematura di una punta di pipetta da un pezzo di silice o montaggio nell'interno dell'ago tubo fuso.

    NOTA: StageTips possono essere conservati asciutto a temperatura ambiente 21.

    7. L'uso di C 18-StageTips per Peptide Desalting e concentrazione

    1. Condizionare una C 18-StageTip ponendo 50 ml di soluzione B sul StageTip preparato. Gira la punta nella centrifuga a 2000 rpm per 2 minuti in un banco centrifuge (es Eppendorf 5417R).

    NOTA: utilizzare adattatori a girare StageTips in una centrifuga Eppendorf, verrà raccolto il liquido in un tubo da 2 ml. Per i preparati su più vasta scala, consigli stadio può anche essere posizionato in un rack punta con 96 delle punte di 200 microlitri e liquidi possono essere raccolti in una micropiastra.

    NOTA: Non utilizzare velocità superiori di 3.000 xg in una centrifuga da banco (ad esempio Eppendorf 5417R) a causa del rischio di girare il disco C 18 dalla punta.

    1. Equilibrare il StageTip utilizzando una soluzione di 100 ml A. Spin la punta nella centrifuga a 5000 xg in una centrifuga da banco (ad esempio Eppendorf 5417R).
    2. Ripetere il passo 2.
    3. Campione del carico sul disco pipettando attentamente il campione nella punta della pipetta con il disco interno.

    NOTA: Un disco può legare ca. 100 mg di proteina.

    1. Far girare le punte del centrifuge finché l'intero volume di campione passa attraverso il disco C 18.
    2. Lavare le StageTips due volte con 100 ml di soluzione di A. girare le punte nella centrifuga.

    NOTA: Le StageTips lavate e caricate possono essere conservati a 4 ° C per un massimo di una settimana.

    1. Eluire campione con 40 ml di soluzione B. Raccogliere l'eluato in un nuovo 1,5 ml tubo di reazione.
    2. Concentrare il campione nella speed vac. In condizioni ideali, interrompere il processo di disidratazione in quanto vi è solo 1 o 2 ml di liquido partita.

    NOTA: secca campioni possono essere conservati a -80 ° C per anni.

    1. Aggiungere un volume finale di 9 ml di soluzione di risospensione al campione e trasferirlo alla piastra di microtitolazione per l'analisi spettrometro di massa.

    NOTA: Il volume finale del buffer risospensione usato dipende dalle esigenze di sperimentatore e la sensibilità dello spettrometro di massautilizzato.

    8. Protocollo per fosfopeptide arricchimento Alternative

    NOTA: Per fosfopeptide arricchimento, l'estrazione delle proteine ​​nel passaggio 2 deve essere realizzata in presenza di inibitori di fosfatasi.

    NOTA: la concentrazione di proteine ​​esatta non deve essere determinato per le seguenti fasi. E 'sufficiente avere una stima approssimativa del tenore proteico per evitare la perdita del campione inutili

    1. Preparare la C 8-StageTips (seguire lo stesso protocollo per la preparazione di C 18-StageTips al punto 6).
    2. Trasferire 1 mg di TiO 2-beads all'inizio preparato C 8-StageTips (uso 1 mg TiO 2 per 100 mg di proteina).
    3. Equilibrare le TiO 2 punte con 100 ml di soluzione C, centrifuga a 2.000 xg per 5 minuti in una centrifuga da banco (ad esempio Eppendorf 5417R).
    4. Miscelare 100 mg di peptidi digeriti e dissalate dal passo 7.7 (dovrebbe essere in 100 ml di soluzioneB) con 100 ml di soluzione A.
    5. Caricare campione misto sulle equilibrate TiO 2 colonne; centrifuga a 1000 xg, 5 min.
    6. Raccogliere il flow-through e caricarlo sulla stessa punta di nuovo (mantenere il flusso attraverso dopo il secondo passaggio).
    7. Lavare punta con 100 ml di soluzione A, centrifuga a 2000 xg, 5 min in una centrifuga da banco (ad esempio Eppendorf 5417R).
    8. Eluire campione con 50 ml di 5% di ammoniaca.
    9. Eluire campione con 50 ml di 5% piperidina (entrambi eluati possono essere combinati).
    10. Subito acidificare il campione con 50 ml di 20% di acido fosforico. pH dovrebbe essere di circa 2.

    NOTA: Salvare le TiO 2 punte e recuperare la polvere. Può essere lavato con soluzione B e riutilizzato per uno o due giri più.

    1. Ancora una volta desalt campioni acidificati su C 18 consigli (vedi punto 8).

    9. LC-MS/MS Analisi del Peptide miscele

    1. Risospendere fosf dissalatoopeptides in tampone risospensione.
    2. Carico risospeso campione sul sistema LC-MS/MS di scelta e acquisire spettri in modo dipendente dati a suggerito risoluzione di 60.000 larghezza a metà altezza.

    NOTA: Per la frammentazione ottimale, sia la scansione neutro perdita deve essere applicato il 22, o, se disponibile l'attivazione multistadio 23. Se ETD è disponibile ciò consentirà scheletro peptidico frammentazione senza perdita di acido fosforico 24.

    NOTA: elenchi picco da dati grezzi devono essere estratti e presentata Identificazione database nonché per la quantificazione. Qui, descriviamo le impostazioni per utilizzare Mascot e MSQuant, che lavora per i file di dati grezzi da LTQ, LTQ-Orbitrap e strumenti LTQ-FT (Thermo Scientific).

    1. Estrarre elenco di picco utilizzando DTAsupercharge all'interno del menu "Helper" in MSQuant. Utilizzare le impostazioni predefinite.
    2. Inviare file risultante elenco di picco motore di ricerca Mascot. CrImpostazioni itical: precursori di ioni di massa tolleranza di 10 ppm, MS / MS tolleranza di massa 0.5 bis. Fisso modifiche: carbamidometilazione di cisteine, modifiche variabili: ossidazione della metionina, fosforilazione di serina, treonina, tirosina. Metodo di quantificazione: 15 N marcatura metabolica.
    3. Salva risultato Mascot come file della pagina web.
    4. Caricare file dei risultati della mascotte e il file raw in MSQuant. Selezionare tutte le proteine ​​di interesse ed eseguire "quantificazione automatica". Il programma leggerà spettri a scansione totale del file raw e fare integrazione di picco per i partner etichettati e senza etichetta di ciascun peptide.
    5. Risultati Export quantificazione ad un programma di foglio di calcolo o un file di testo delimitato da tabulazioni. I dati possono poi essere sottoposti ad ulteriori analisi statistica in Excel o utilizzando altri pacchetti software come Statquant 25 o CRACKER 26.

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Representative Results

Con il protocollo presentato utilizzando colture cellulari Arabidopsis marcate metabolicamente è possibile isolare le membrane plasmatiche da tessuto vegetale (step2, figure 2 e 4), e per arricchire resistente detergenti frazioni di membrana all'interno della membrana plasmatica (passaggio 3, figure 3 e 5). Successivamente, il protocollo consente l'estrazione di proteine ​​da questi detergenti resistente frazioni di membrana (step 4) e digestione della proteina per analisi proteomica comparativa (fase 5). Infine, l'arricchimento opzionale di fosfopeptidi (passo 8) è particolarmente interessante studiare processi di segnalazione cellulare. L'ultimo passo è poi l'analisi quantitativa dei dati (passo 9, Figura 6) di rapporti proteina abbondanza in frazioni di membrana di coltura cellulare marcato e non marcato.

I risultati tipici dopo la miscelazione del sistema 2-fase (fase 2) e successiva centrifugazione sono una chiara fase superiore colorato e unverde colorato fase inferiore (Figura 2). Plasma vescicole di membrana preferenzialmente associano con la fase PEG superiore, mentre vescicole di membrana da cloroplasti verdi e altre membrane interne sono incorporati nella fase destrano inferiore. Se la separazione dei colori non può essere osservato, passaggio 2 non è stata eseguita correttamente e membrane plasmatiche saranno contaminati con quantità significative di membrane interne. Arricchimento delle proteine ​​di membrana di plasma può essere visualizzata mediante analisi proteomica di piccole aliquote di frazioni di membrana di plasma e proteine ​​nella fase inferiore del sistema bifasico. La fase inferiore contiene le membrane interne della cellula. Ad esempio, note proteine ​​di membrana plasmatiche particolarmente tipici, come le proteine ​​chinasi recettore mostravano alta abbondanza nella frazione di membrana plasmatica (PM) e bassa abbondanza nella frazione fase inferiore (Figura 4A) contenente le membrane interne (IM). A loro volta, proteine ​​note del reticolo endoplasmatico spettacolo di altaabbondanza nella frazione membrana interna e non sono stati osservati nella frazione di membrana plasmatica (Figura 4B).

Il successivo arricchimento di frazioni di membrana resistente ai detergenti (passo 3) sarà in casi ideali provocare la formazione di un anello lattiginoso di bassa densità vescicole di membrana a circa 1/5 dell'altezza tubo (Figura 3). Se la regolazione di Triton X-100 concentrazioni o il detergente rapporto proteina (passo 3.2) è ottimale per la separazione in frazioni solubili resistente detersivi e detergenti, anelli supplementari possono essere osservati nelle parti inferiori del gradiente e ci saranno anche ciuffi di membrana nella fascia bassa densità. In questi casi, detersivo rapporto proteina o importo totale del detergente è diversa dalla concentrazione micellare critica necessaria per la separazione riproducibile delle due frazioni di dominio di membrana. Utilizzando la concentrazione finale di detersivo e detergente rapporto proteina descritto qui, Enrichment di proteine ​​tipiche microdomini, come remorin (AT3G61260) 27 potrebbe essere confermato da una analisi comparativa spettrometria di massa della frazione DRM, frazione solubile detersivo (passo 3.8) nonché membrana plasmatica frazionata ed membrane interne. Massima abbondanza di proteine ​​remorin stato trovato in frazioni DRM come previsto (Figura 6A). Le proteine ​​non presenti nei microdomini di membrana, come il AT1G59870 ABC-trasportatore (Figura 6B), non mostrano una maggiore abbondanza nella frazione DRM. Contaminanti tipici Inoltre, come una proteina mitocondriale (AT2G07707) dal complesso ATPasi F0 (figura 6C) e proteina ribosomale (At1G001100) dal ribosoma 60S (Figura 6D) non mostrano un'abbondanza arricchito nella frazione DRM, anche se minime quantità può ancora essere identificati.

Dopo abbondanze spettrometria di massa, proteine ​​rapporti di status di fosforilazione proteica nel plasmafrazioni di membrana di colture cellulari etichettati e non etichettati possono distinguere quantitativamente (Figura 6). Risultati tipici della MSQuant ( msquant.alwaysdata.net finestra quantificazione) dovrebbero mostrare un rapporto di intensità di ioni di uno a uno per la maggior parte dei peptidi identificati (Figura 6A). Tali peptidi con rapporto di intensità ione deviando significativamente da 1:1 sono considerati differenziale regolato tra la coltura cellulare marcato e non marcato, e sono candidati per corrispondenti alle proteine ​​colpite dal trattamento applicato (figura 6C). Un buon controllo di qualità di marcatura metabolica successo è il co-eluizione di entrambi etichettati e versioni peptide non etichettati come un singolo picco nella separazione nano-HPLC (fase 9) come mostrato nelle figure 6B e D.

Figura 1 Figura 1. Marcatura metabolica strategia sperimentale. Rappresentazione schematica di due varianti di disegno sperimentale quando si utilizzano colture cellulari senza etichetta A. thaliana completamente metabolica etichettate. Lo sperimentatore può decidere di utilizzare 14 N celle (senza etichetta) come controllo e 15 N cellule metabolicamente (etichettati), che subiscono un trattamento biologico o viceversa. In un disegno sperimentale reciproco entrambe le varianti sono eseguite in parallelo.

Figura 2
Figura 2. Flusso di lavoro per la separazione di vescicole di membrana pianta su un sistema bifasico acquosa a base di polietilenglicole (PEG) e destrano. Plasma vescicole di membrana separati in fase PEG superiore mentre cloroplasto e altre membrane interne associati alla bottom fase di destrano dopo la centrifugazione. Con ulteriore lavaggio della fase superiore meglio purificazione può essere realizzata, ma anche la perdita di materiale è aumentata.

Figura 3
Figura 3. Arricchimento delle frazioni di membrana a bassa densità. Rappresentazione del gradiente di saccarosio per l'arricchimento di bassa densità resistente ai detergenti frazioni di membrana. Il percorso previsto dopo la centrifugazione notte della band vescicola membrana a bassa densità è indicata.

Figura 4
Figura 4. Arricchimento delle proteine ​​di membrana plasmatica dopo purificazione in sistema bifasico. Normalizzatointensità di ioni proteine ​​per proteine ​​misurati in membrana plasmatica (PM) e membrane interne (IM). frazione (A) costituenti tipici noti di membrana plasmatica mostrano molto maggiore abbondanza in PM frazione rispetto frazione IM. componenti noti (B) naturali delle membrane interne mostra il comportamento opposto. Per la normalizzazione, le somme intensità di ioni per ogni proteina sono stati espressi come frazione di intensità ione totale per campione e quindi la media tra le repliche. Frazione di intensità ionica totale sono stati quindi espressa in relazione alla media tra i due trattamenti. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard dei tre preparati da colture di cellule cresciute in maniera indipendente. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 5 Figura 5. . Abbondanza di marcatori proteici standard tra frazioni misurate Personaggi rappresentano la distribuzione della normalizzati intensità di ioni di proteine ​​di marcatori proteici scelti a particolari compartimenti subcellulari (DRM - microdomini ricchi di steroli, PM - membrana plasmatica, IM - membrane interne, SP - proteine ​​solubili). Modelli abbondanza di (A) remorin come indicatore per microdomini di membrana ricchi di steroli, (B) ABC-tipo di proteina familiare trasportatore come rappresentante di una proteina non steroli-dipendente, (C) subunità del complesso F0 mitocondriale, (D) 60S subunità dei ribosomi come un tipico contaminante co-purificazione. Per la normalizzazione, le somme intensità di ioni per ogni proteina sono stati espressi come frazione di intensità ione totale per campione e quindi la media tra le repliche. Frazione di intensità ionica totale sono stati quindi espressa in relazione alla media tra i due Treatments. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard dei tre preparati da colture di cellule cresciute in maniera indipendente. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 6
Figura 6. I risultati attesi di proteine ​​quantitativa spettrometria di massa. Schermata dal MSQuant che mostra il rapporto 1:1 intensità ioni atteso di un peptide da una miscela 1:1 di estratti proteici da etichettata e le cellule di Arabidopsis senza etichetta. (A) spettro scansione completa del peptide DNNLLGK chiaramente separando etichettati (picco a destra) e la versione senza etichetta (picco a sinistra) dei peptidi sull'asse m / z. La massa monoisotopico e il primo isotopo sono indicate da segni blu. (B) etichetta (blu) und senza etichetta (rosso) versioni del peptide co-eluire come picco singolo durante cromatografia nano-HPLC. (C) spettro scansione completa di un peptide con rapporto di intensità di ioni di 1:5 come candidato per una proteina differenzialmente regolamentato. (D ) Anche le proteine ​​con rapporti diversi da 1:1 co-eluire in fase inversa. Clicca qui per ingrandire la figura .

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Discussion

Il protocollo qui presentato contiene molti passaggi e tutti sono cruciali per ottenere frazionamento puro e rappresentativo della membrana plasmatica pianta nelle membrane resistenti detersivo e frazioni solubili detergenti. Pertanto, è importante seguire ogni passo le istruzioni.

Trattamento della frazione di membrana plasmatica con detergente non ionico (passo 3.2) ha la più forte influenza sulla qualità della membrana microdomini frazionamento. Per ottenere risultati riproducibili tra diverse preparazioni, ed essere in grado di confrontare diversi campioni dello stesso esperimento, è molto importante valutare con precisione la concentrazione di proteine ​​nella membrana plasmatica e di applicare il detergente sempre nello stesso rapporto rispetto al contenuto proteico e sempre alla stessa concentrazione finale. In pratica, ciò significa che a volte è necessario diluire i campioni con alta concentrazione di proteine ​​o di utilizzare materiale di concentrazione diversidi Triton X-100.

Negli studi biochimici, recentemente c'è stata una tendenza tra i ricercatori ad utilizzare un metodo privo di detersivo per l'isolamento dei microdomini di membrana 28-30. Questi metodi sono basati su una rottura meccanica della membrana plasmatica per tranciatura attraverso un ago molto piccolo in analogia alla stampa cella di pressione francese. Queste procedure sono state applicate con successo a colture di cellule di mammiferi ricchi di microdomini di membrana, ma l'applicazione a parete cellulare contenente organismi (lieviti, cellule vegetali), non è stato riportato. Utilizzando la proteomica quantitativa insieme con agenti steroli interrompendo, come metil-beta-ciclodestrina, è stato dimostrato che le frazioni DRM preparati membrana plasmatica pianta contengono proteine ​​che sono marcatori per microdomini di membrana 11.

Per quanto riguarda i risultati finali di massa spettrometria di quantificazione, i risultati tipici illustrati nella Figura 6 rappresentano la situazione ideale inche l'intensità di ioni per la maggior parte dei peptidi marcati e non marcato sono vicini identici. Tuttavia, in alcuni casi si può osservare un certo grado di variabilità biologica fra i gruppi di colture cellulari etichettati e non etichettati. Così, prima del trattamento biologico sia etichettato o di coltura cellulare senza etichetta viene effettuata, analisi di una miscela di cellule di controllo marcate e non marcate, sia senza alcun trattamento, permette l'identificazione di peptidi con un rapporti divergenti da quello ideale per una situazioni. Queste proteine ​​con rapporti divergenti siano indicazioni di variabilità biologica. Per superare la sfida degli effetti del trattamento distintivi di variabilità biologica, si propone dunque di utilizzare l'etichettatura reciproca negli esperimenti accoppiati 20. Nella configurazione sperimentale reciproca, entrambe le varianti dell'esperimento vengono eseguite come proposto nella figura 1 e le fasi del protocollo sono seguite come descritto. Poi, confrontando i rapporti di intensità ione di proteins da entrambi gli esperimenti reciproche, si può distinguere se le differenze tra i rapporti di intensità di ioni è causata variazione biologica o per effetto del trattamento applicato.

Un altro metodo per affrontare il problema differenziare gli effetti del trattamento e variazione biologica è l'uso di uno standard interno marcato come riferimento per tutti i trattamenti 31. In questo approccio, il controllo non marcato e cellule non marcati che sono sottoposti a trattamento biologico sono mescolati con la stessa quantità di cellule di controllo pesanti etichettati, proveniente dallo stesso lotto. Esso permette di eliminare l'influenza della variabilità biologica in rapporto peptide, perché le proteine ​​sono considerati come significativi, se i rapporti di intensità ioni di 14 N-control / 15 N-controllo e 14 N-trattamento / 15 N-controllo sono significativamente differenti. Ciò è possibile, come il campione marcato è esattamente lo stesso in tutti i casi.

Uno dei drawbacks della procedura DRM arricchimento qui descritto sono le proteine ​​co-purificazione che possono essere identificate nella frazione di membrana resistente ai detergenti. Nell'elenco di proteine ​​identificate dalla frazione di membrana a bassa densità resistente ai detergenti, possiamo osservare regolarmente un gran numero di proteine ​​ribosomali. A causa della relativamente bassa densità delle proteine ​​ribosomali, migrano nella stessa frazione come steroli proteine ​​di membrana dipendenti nel gradiente di saccarosio. E 'stato dimostrato senza alcun dubbio che le proteine ​​ribosomali non sono chiaramente costituenti dei microdomini di membrana 11. Per escludere queste e altre proteine ​​co-purificazione non effettivamente associati alle resistente detergente a bassa densità frazioni di membrana, proponiamo di analizzare anche la composizione proteomica delle membrane intracellulari (IM) che possono essere estratti dalla fase destrano inferiore dal due Sistema di fase e di confrontare i rapporti di abbondanza di contaminanti putativi tra la membrana interna e il DRMfrazione (vedi esempi della Figura 5). Proteine ​​DRM-co-purificazione dell'aria devono avere abbondanze simili in entrambe le frazioni (IM e DRM).

Frazionamento di estratti cellulari e dei microdomini di membrana è una strategia comune per ridurre la complessità in un campione per l'analisi proteomica 32. Pertanto, il protocollo qui descritto è utile per tutti gli studi di segnalazione processi a membrana plasmatica delle cellule vegetali. Applicazioni biologiche sono in studio risposte allo stress così come le infezioni patogeni che tutti in larga misura indurre alterazioni nella composizione della membrana plasmatica e modificazione di proteine ​​di membrana 14,15. Oltre a studiare le risposte allo stress, la quantificazione delle abbondanze di proteine ​​nelle diverse frazioni di membrana può aiutare notevolmente annotazione ancora proteine ​​sconosciute 33 34,35.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

L'autore, Witold Szymanski, è un dipendente dell'Istituto Max Planck di fisiologia molecolare delle piante. L'autore, Waltraud Schulze è un dipendente presso l'Università di Hohenheim, in Germania.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Chemicals were ordered from Sigma-Aldrich unless noted otherwise
Ammonia (stock 25 % solution) WAKO 010-03166
TiO2 10 μm GL-Science 5020-75010
Empore Disk C18 Varian 12145004
Polyethylene glycol(PEG 3350) Sigma 88276
Dextran T500 Roth 9219.2
Trypsin Promega V5113
Protease inhibitor cocktail (PIC) Sigma P9599
K15NO3 Cambridge Isotope Laboratories NLM-765-PK
EQUIPMENT
Optima L-80 XP Ultracentrifuge Beckman
Plate reader BioTek
EASY-nLC II nano-Liquid Chromatograph Thermo Scientific
LTQ-Orbitrap mass spectrometer Thermo Scientific
Centrifuge 5810R Eppendorf
Centrifuge 5417R Eppendorf
Thermomixer Eppendorf
Speed Vac RVC 2-25 Christ
Shaker Unimax 2010 Heidolph

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