Metabolsk Merking og Membran Fraksjone for komparativ proteomikk analyser av

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Her beskriver vi en robust fremgangsmåte for fraksjonering av planteplasmamembraner i detergentresistente og detergentløselige membraner basert på en blanding av umerket og in vivo fullt 15 N merket Arabidopsis thaliana cellekulturer. Fremgangsmåten er brukt for sammenlignende proteomic studier for å forstå signaleringsprosesser.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Szymanski, W. G., Kierszniowska, S., Schulze, W. X. Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures. J. Vis. Exp. (79), e50535, doi:10.3791/50535 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Plasmamembran microdomains er funksjoner basert på de fysiske egenskaper av lipid og sterol miljø og har spesielle roller i signaleringsprosesser. Trekke sterol-beriket membran microdomains fra planteceller for proteomikk analyser er en vanskelig oppgave i hovedsak på grunn av flere forberedende trinn og kilder for forurensing fra andre cellene. Den plasmamembranen utgjør bare omtrent 5 til 20% av alle membranene i en plantecelle, og således isolasjonen av høyt renset plasmamembranfraksjonen er utfordrende. En ofte brukt metode involverer vandig to-fasepartisjone i polyetylenglykol og dekstran, som gir plasma membran-vesikler med en renhet på 95% 1. Sterol-rik membran microdomains i plasmamembranen er uoppløselig ved behandling med kaldt ikke-ioniske tensider ved alkalisk pH. Dette vaskemiddel-resistente membranfraksjon kan separeres fra hoveddelen plasma membran ved ultrasentrifugering i såucrose gradient to. Deretter kan proteiner ekstraheres fra den lave tetthet bandet av sukrose gradient av metanol / kloroform utfelling. Ekstrahert protein blir deretter trypsin-spaltet, avsaltet og endelig analysert ved LC-MS/MS. Vår ekstraksjon protokoll for sterol-rike microdomains er optimalisert for fremstilling av rene vaskemiddelresistent membranfraksjoner fra Arabidopsis thaliana cellekulturer.

Vi bruker hele metabolske merking av Arabidopsis thaliana suspensjon cellekulturer med K 15 NO 3 som eneste nitrogenkilden for kvantitative komparative proteomikk studier etter biologisk behandling av interesse tre. Ved å blande like forhold av merkede og umerkede cellekulturer for felles protein ekstraksjon påvirkning av forberedelse trinn for slutt kvantitative resultat holdes på et minimum. Også tap av materiale under utvinning vil påvirke både kontroll og prøver behandling på samme måte, end derfor forholdet mellom lys og heave peptid vil forbli konstant. I den foreslåtte fremgangsmåte, enten merket eller umerket cellekultur gjennomgår en biologisk behandling, mens den andre tjener som kontroll 4..

Introduction

I 1972, Jonathan Singer og Garth Nicolson foreslo væske mosaikk-modellen en struktur modell av cellemembraner, erstatte protein-lipid-protein sandwich-modellen som var allment akseptert i de tidlige 1960-tallet. Singer og Nicolson postulerte at den biologiske hinne kan betraktes som en to-dimensjonal væske der alle lipid-og proteinmolekyler diffundere fritt og lett 5. Siden den gang struktur modell av plasmamembranen og kunnskap om membransammensetning ble enda mer komplisert. Spesielt, i plasmamembranen, strukturer som proteinkomplekser og lipid / sterol basert strukturelt uordnede microdomains kan observeres. I kunstig modellmembraner 6,7, kan steroler og sphingolipids lateralt skille fra andre lipid arter å danne regioner med endrede fysiske egenskaper. Dette segregering innenfor cellemembranen er hovedsakelig forårsaket av de selv assosiere egenskaper mellom steroler og svært saumettede hydrokarbon kjeder av phopsho-og sphingolipids åtte. Spesielt de stive sterol ringer favorisere interaksjoner med stivere og rettere mettet lipid arter og disse interaksjonene tvinge nabohydrokarbonkjeder i flere utvidede konformasjoner, økende membrantykkelse og hardhet.

En av de vanligst observerte egenskaper av sterol anriket membran microdomains var deres uoppløselighet ved behandling med ikke-ioniske detergenter, for eksempel en Triton X-100 eller Brij 35.. Disse fraksjonene ble antatt å være identisk med membran microdomains og ble kalt vaskemiddelbestandige membraner (DRM) basert på deres biokjemiske forberedelse metode to. Bruken av ikke-ioniske vaskemidler i DRM ekstraksjon fikk noe kritikk som den biokjemiske DRM preparatet kan ikke direkte tilsvare en hvilken som helst spesifikk membrankammeret i den levende celle 9.. Spesielt synes vaskemiddel til protein ratio avgjørende i slike preparater, ens forskjellige vaskemidler, samt forskjellige detergentmengder kan gi forskjellig sammensetning av vaskemiddelbestandig membran fraksjon 10.. Men det er bevis for at spesielle protein arter spesielt forbinder med disse cellulære sterol-rik membran domener, og at disse proteinene er godt beriket i biokjemiske preparater av vaskemiddel-resistent membran fraksjoner 11. Kjernen av proteiner som ble funnet i anlegget DRM brøkdel, og hvor tilstedeværelse i DRMS ​​var sterol avhengig, var spesielt GPI-forankrede proteiner, slik som fasciclin lignende arabinogalaktan proteiner (FLAS) og medlemmer av SKU protein familien. Også noen signaleringsproteiner, slik som reseptor-lignende kinaser eller fosfolipaser ble funnet 11.. Disse resultatene er i samsvar med mange proteomikk studier på pattedyr membran microdomains 12,13. Også i planter er det økende bevis for rollen av membran microdomains i sammenheng med stressrespons 14 -16.

Protokollen er beskrevet her gir en robust metode for fraksjonering av plasma membran microdomains og særlig bruker et protein til vaskemiddel konsentrasjon som tillater oss å skildre stress-induserte forandringer av sterol rike membran rommet 4,11,14.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

PROSEDYRE

Vanlige reagenser og buffere som brukes i ekstraksjonen protokoll:

  1. JPL medium for Arabidopsis thaliana suspensjon cellekulturer
    • 3 mikrometer H 3 BO 3
    • 3 mikrometer MnSO 4 x H 2 O
    • 1,1 mikrometer ZnSO 4 x 7 H 2 O
    • 0,15 mikrometer KJ
    • 0,03 mikrometer Na 2 Moo 4 x 2 H 2 O
    • 3 nM CoCl 2 x 6 H 2 O
    • 3 nM CuSO 4 x 5 H 2 O
    • 0,9 mM CaCl 2 x 2 H 2 O
    • 0,5 mM MgSo4 x 7 H 2 O
    • 0,5 mikrometer FeSO 4 x 7 H 2 O
    • 0,5 mikrometer Na 2 EDTA x 2 H 2 O
    • 0,12 mikrometer tiamin HCl
    • 0,16 mikrometer nikotinsyre
    • 0,097 mikrometer pyridoksin HCl
    • 0.107 mikrometer NAA
    • 0.375 mM KH 2 PO 4
    • 0.061 mM NaH2 PO 4 x 2 H 2 O
    • 0.039 mM Na 2 HPO 4
    • 0.027 mM glysin
    • 0.56 mm myo-inositol
    • 1,5% sukrose
    • 10 mM K 14 NO 3 eller 10 mM K 15 NO 3

MERK: pH i JPL medium bør justeres til 5,7 med KOH. Mediet må steriliseres ved filtrering eller autoklavering før bruk.

  1. Buffer H
    • 100 mM HEPES-KOH (pH 7,5)
    • 250 mM sukrose
    • 10% (w / v) glycerol
    • 5 mM EDTA
    • 5 mM askorbinsyre
    • 0,6% (w / v) PVP K-25 eller K-30
    • 5 mM DTT (legg frisk)
    • 1 mM PMSF (legg frisk)
    • protease og fosfatase hemmere (legg frisk)
      • 50 mM NaF
      • 1 mM Na 3 VO 4
      • 1 mM benzamidin
      • 0,3 mikrometer mikrocystin
      • 4 mikrometer leupeptin
      • proteasehemmer cocktail
  2. Buffer R
    • 5 mM kaliumfosfat
    • 0,33 M sukrose
    • 3 mM KCl
    • 0,1 mM EDTA
    • 1 mM DTT (legg frisk)
  3. Buffer TNE
    • 25 mM Tris-HCl, pH 7.5
    • 150 mM NaCl
    • 5 mM EDTA
  4. To-fase-systemet (6 g-systemet er egnet i opp til 15 g av prøve ferskvekt) forberedelse metode
    I 15 ml Falcon rør mix ingredienser som er oppført nedenfor, og bland godt:
    • 20% (w / v) dekstran T500 - 2,6 g
    • 40% (w / w) poly (etylenglykol) (PEG 3350) - 1,3 g
    • sukrose - 0,678 g
    • 0,2 M kaliumfosfat, pH 7,8 til 0,15 ml
    • 2 M KCl - 0.014 ml
    • tilsett vann inntil totalvekt av to-fase-system er 6 g.
  5. Sukrose løsninger i TNE buffer
    • 2,4 M, 1,6 M, 1,4 M, 0,15 M
  6. Reagenser for trypsin fordøyelse
    • UTU: 6 M urea, 2 M tiourea (pH 8,0 med 10 mM Tris-HCI) Reduksjon buffer (1 pg / pl DTT i vann, 6,5 mM)
    • Alkylering buffer (5 mikrogram / mikroliter jodacetamid i vann, 27 mM)
    • LysC Endopeptidase (0,5 mikrogram / mL)
    • Trypsin, endret sekvense grade (0,4 mikrogram / mL)
  7. Reagenser for peptid avsalting enn C 18
    • resuspendering løsning: 2% trifluoreddiksyre (TFA), 5% acetonitril i vann
    • oppløsning A: 0,5% eddiksyre
    • oppløsning B: 80% acetonitril, 0,5% eddiksyre
  8. Reagenser for phosphopeptide berikelse
    • Løsning A: 0,1% TFA, 5% acetonitril
    • Løsning B: 0,1% TFA, 80% acetonitril
    • TiO 2 10 mikrometer
    • Ammoniakk (lager 25% løsning)
    • Piperidin (lager 100%)

PROTOCOLS

En. Metabolsk Merking av Arabidopsis thaliana Cell suspensjonskulturer

  1. Grow Arabidopsis Col-0 cellesuspensjonskulturer avledet fra bladene 17 i sin helhet 14 N-JPL medium (18, se "Vanlige reagenser og buffere"-delen), og ett sett av kulturer i 15 N-JPL medium i steril kolbe ved konstant lys tilstand ved 80 til 100 pmol / m 2 s, 23 ° C, under konstant risting ved 120 rpm.
  2. For å opprettholde cellekulturer, vaksinere 400 ml frisk JPL medium med 40 ml av syv dager gammel cellekultur i en L kolber.
  3. Høsting av cellekulturer skjer via vakuumsug gjennom et bredt glasstrakt med et rustfritt stålnett. Cellene oppsamles på nettingplaten og i trakten og kan lett hentes derfra. Celler ble anbefalt å bli frosset ved -80 ° C eller i flytende nitrogen før sliping.

MERK: For 15 N metabolsk merket cellekulturer bruke K 15 NO 3 som eneste kilde til nitrogen i minst to passeringer enn to uker 19. I erfaringriments for komparative proteomikk, bruker en 15 N merket cellekultur og også opprettholde en umerket kultur i normal medium. Biologisk rensing vil da bli brukt til enten merket eller umerket kultur, mens den andre tjener som kontroll (figur 1). For protein forberedelse, vil begge kulturer kombineres 20. Ved planlegging av eksperimentelle oppsettet, anbefaler vi vurderer en gjensidig merking setup 4 hvor det samme behandling er brukt en gang til de 15 N-merket celler og en gang til de umerkede celler og de ​​respektive umerkede eller 15 N-merket celler fungerer som kontroller. I dette tilfelle blir de doble mengder av cellekulturer er nødvendig.

2. Plasma Membran Rensing

NOTE: Alle ytterligere trinn utføres i kjølerommet, og / eller på is, med mindre det er bemerket på annen måte.

  1. Homogen celler fra omtrent 1 l 7 dager gamle cellesuspensjonskulturer i flytende nitrogen.Materialet kan lagres ved -80 ° C inntil videre bruk.
  2. Bland de samme mengder av merket og umerket frosne cellekulturer basert på fersk vekt i et begerglass og tilsett 2 volumdeler buffer H umiddelbart. I tilfelle av membran microdomain preparat er det foreslått å anvende minst 7 g ferskvekt av både merkede og umerkede celler.
  3. Plasser begerglass på en riste og rist til materialet er smeltet, og løsningen er flytende, og uten iskrystaller.
  4. Filtrer homogenatet gjennom ett lag av Miracloth i 50 ml sentrifugerør.
  5. Balanse prøver med buffer H og sentrifuger ved 10 000 x g i 8 min.
  6. Laste supernatanten inn pre-avkjølte ultra-sentrifugerør (f.eks for rotor Beckman Coulter SW31Ti), med volum på ca 32 ml
  7. Balanse prøver med buffer H og pellet mikrosomer ved sentrifugering ved 100.000 x g ved 4 ° C i 30 min ved bruk av Beckman SW32Ti rotor.
  8. Fjern supernatanten etter sentrifugering.

    MERK: Overstående inneholder løselige proteiner. En liten mengde av denne fraksjon, kan lagres for videre ventet protein og påfølgende analyse også av løselige proteiner.

    1. Resuspender membran pellet av hver prøve i respektive buffer R og laster inn på toppen av U1 to-fasesystem (figur 2). Dersom 6 g to-fase-systemet brukes, legger nøyaktig 2 g resuspendert membran pellet.

    NB: Det endelige volum av buffer A er avhengig av størrelsen av de to-fasesystem som skal benyttes (~ 1,6 ml av buffer A som er nødvendig ved bruk av 6 g-system). Det anbefales å bruke mindre buffer for resuspensjon så ren buffer kan legges bort på to-fase-system for å oppnå den forlangte vekt, istedenfor å bruke for mye buffer for solubilisering og ikke være i stand til å laste hele prøven inn i tofase-system.

    1. Legg i den samme volum av ren buffer R som brukes for the sample resuspensjon på U2.
    2. Sakte blande U1 og U2 rør ved å snu dem 30x (ca. en inversjon / sek).

    MERK: Ikke kraftig riste to-fase system. Det kan føre til en mangel på separasjon av faser i ultrasentrifugetrinnet.

    1. Sentrifuger prøvene ved 1500 x g ved 4 ° C i 10 min.
    2. Fjern supernatanten etter sentrifugering.
    3. Overfør den øvre fase fra U1 U2 til og gjenta sentrifugering ved 1500 x g ved 4 ° C i 10 min.
    4. Flytt den øvre fase fra U2 inn i SW41Ti ultrasentrifugerør rør og spe den med fem bind av buffer R og bland godt.

    MERK: Den endelige øvre fase kan ha for å bli delt inn i separate ultrasentrifugerør rør før det kan bli utvannet fem ganger.

    1. Sentrifuger prøvene ved 200 000 x g ved 4 ° C i en time ved hjelp av SW41Ti rotor.
    2. Suspender membran pellet i small mengden av TNE buffer (typisk 200 pl buffer brukes) for isolering av detergentresistente membraner.

    MERK: En liten mengde av denne fraksjon, kan lagres for analyse av ufraksjonert plasma membran.

    MERK: Den plasma membran brøkdel kan lagres ved 4 ° C over natten før fraksjone inn vaskemiddelbestandige membraner og vaskemiddel løselige fraksjoner.

    Tre. Vaskemiddel Resistant Membrane Forberedelse

    1. Kontroller konsentrasjonen av plasmamembranen fraksjon ved Bradford-analysen.
    2. Til Triton X-100 til plasmamembranen fraksjon. Den endelige konsentrasjonen av vaskemiddel bør holde seg mellom 0,5-1%. Vaskemiddelet til protein vektforholdet bør holde seg mellom 13-15.
    3. Rist prøver ved om lag 100 rpm ved 4 ° C i 30 min.
    4. Til tre volumer av 2,4 M sukrose til et volum av den behandlede plasma membran for å oppnå 1,8 M endelig konsentrasjon av sukrose. </ Li>
    5. Forbered sukrosegradient i SW41Ti ultrasentrifugerør rør ved å laste de respektive sukrose løsninger på toppen av 1,8 M brøkdel som illustrert i figur 3.
    6. Sentrifuger prøvene ved 250 000 x g ved 4 ° C i 18 timer ved bruk av Beckman SW41Ti rotor.
    7. Fjern forsiktig ultrasentrifugerør rør fra rotoren til å unngå å forstyrre av lav tetthet band som kan være synlig som en melkeaktig ring i grenselandet mellom 0,15 M/1.4 M sukrose. Noen ganger kan ikke noe kan sees, men fraksjonen fortsatt inneholder vaskemiddelresistent protein-fraksjon.
    8. Fjern fraksjon på 0,75 ml volumet fra toppen av gradienten. Fraksjoner 2 og 3, som dekker volum på rundt 1,5 ml ovenfor er mellomringen og 0,5 ml nedenfor representerer vaskemiddelresistent membranfraksjon. Samle disse fraksjonene i 15 ml Falcon rør. Fraksjonene 9 og 10 inneholde vaskemiddel oppløselig membranfraksjonen, og også kan bli samlet inn for sammenligning. For ytterligere analyse, basseng fractioner 2 og 3 samt fraksjoner ni og ti.

    4. Utvinning av Proteiner fra vaskemiddelbestandige Brøk av Metanol / Kloroform

    MERK: Alle trinn utføres i romtemperatur.

    1. Tilsett 4 volumer av metanol til de samlede fraksjoner og vortex grundig.
    2. Tilsett 1 volum kloroform, vortex grundig.
    3. Legg tre mengder vann, virvle grundig.
    4. Sentrifuger prøvene ved 2000 x g i 5 min ved hjelp av en bordsentrifuge (Eppendorf f.eks 5417R).
    5. Fjern det vandige fasen ovenfor proteinet laget i interfase.
    6. Tilsett 3 volumdeler metanol, vortex grundig.
    7. Sentrifuger prøvene ved 4000 xg i 10 min.
    8. Fjern supernatant og tørke pellet. Den tørkede pellet er klar for in-løsning fordøyelsen.

    5. In-løsning Trypsin Fordøyelse

    MERK: I denne prosedyren alle trinnene er gjort påromtemperatur, for å redusere uønsket derivatisering av amino-syresidekjeder av denatureringsmidler.

    1. Oppløs prøven i lite volum av 6 M urea, 2 M thiurea, pH 8 (UTU). Bruk så lavt volum som er kompatibelt med prøven (vanligvis omtrent 40 ul).
    2. Spin prøver oppløseliggjort i UTU på 5000 xg i en stasjonær sentrifuge (f.eks Eppendorf 5417R) for 10 min til pellets noe uløselig materiale.
    3. PH i den endelige løsningen bør være nær 8,0 for optimal trypsin fordøyelsen. Sjekk med pH-strips.
    4. Legg 1 mL av reduksjon buffer for hvert 50 mikrogram av prøveproteiner og inkuber i 30 min ved romtemperatur.

    MERK: Bare et grovt estimat av proteininnholdet er nødvendig. Når prøven mengde er begrenset er det bedre å ofre nøyaktigheten i stedet for å kaste bort prøven på et protein-assay.

    1. Legg 1 mL av alkylering buffer for hver 50 ug prøveprotein, og inkuber i 20 min ved romtemperatur i mørke.
    2. Tilsett 0,5 mL av LysC per 50 ug prøveprotein og inkuberes i tre timer ved romtemperatur med konstant risting ved 700 rpm. Om nødvendig, kan den digest også utføres over natten. Imidlertid er forlenget tid ved høye temperaturer anbefales ikke da det kan øke peptid-tap på grunn av adsorbsjon til plastrør materiale under vandige pH 8 forhold.
    3. Prøven fortynnes med fire volumer 10 mM Tris-HCl, pH 8..

    MERK: Dette trinnet er helt nødvendig for å fortynne ureakonsentrasjonen som trypsin er svært følsom for høy salt.

    1. Til en pl trypsin pr 50 ug prøveproteiner og inkuber over natten ved romtemperatur med konstant risting ved 700 rpm.
    2. Surgjøre prøvene til 0,2% TFA endelig konsentrasjon for å nå pH 2 (legg til omtrent 1/10 volum av 2% trifluoreddiksyre).

    MERK: Prøver kan oppbevares ved - 20 ° C til det brukes videre, men det er bedre å lagredem på StageTips ved 4 ° C hvis det er for en kort tid (en uke) eller lagre dem etter StageTips avsalting.

    6. Produksjon av C 18-StageTips

    1. Plasser en Empore Disk C18 på en flat, ren overflate som en engangs plast petriskål.
    2. Punch ut en liten disk med en butt spiss kanyle med diameter på 1,5 mm. Disken kjepper i nålen og kan bli overført til en pipette tips.
    3. Skyv disk ut av nålen og festes i avsmalning av en pipettespiss med et stykke av smeltet silisiumdioksyd eller slangen montering på innsiden av kanylen.

    MERK: StageTips kan lagres tørt i romtemperatur 21.

    7. Bruk av C 18-StageTips for Peptide avsalting og konsentrasjon

    1. Betinger en C 18-StageTip ved å plassere 50 mL av løsning B på det klargjorte StageTip. Spin spissen i sentrifuge ved 2000 rpm i 2 min i en stasjonær centrifuge (f.eks Eppendorf 5417R).

    MERK: Bruk adaptere for å snurre StageTips i en Eppendorf sentrifuge, vil væske bli samlet i en 2 ml reaksjonsrøret. For preparater større skala, kan scene tips også plasseres inn et tips rack med 96 av de 200 mL tips og væske kan samles i en mikrotiterplate.

    MERK: Bruk aldri høyere hastigheter enn 3000 xg i en stasjonær sentrifuge (f.eks Eppendorf 5417R) på grunn av risikoen for å spinne ut C 18 disk fra spissen.

    1. Stabilisere den StageTip med 100 mL løsning A. Spin spissen i sentrifuger ved 5000 xg i en stasjonær sentrifuge (f.eks Eppendorf 5417R).
    2. Gjenta trinn 2.
    3. Last prøve på disk ved forsiktig pipettering prøven i pipettespissen med platen inni.

    MERK: Én plate kan binde ca. 100 ug protein.

    1. Spinn tips i centrifuge til hele volumet av prøven passerer gjennom den C-18 disk.
    2. Vask StageTips to ganger med 100 mL av løsningen A. spinne tips i sentrifugen.

    MERK: De vaskede og lastet StageTips kan lagres ved 4 ° C i opp til en uke.

    1. Eluere prøven med 40 ul av oppløsning B. samles eluatet i en frisk 1,5 ml reaksjonsrøret.
    2. Konsentrer prøven i hastigheten vac. Under ideelle forhold, stoppe dehydrering prosessen så det er bare om ett eller to mL væske igjen.

    NOTE: Tørkede prøver kan lagres i -80 ° C i flere år.

    1. Til et sluttvolum på 9 mL av resuspensjon løsning til prøven, og overføre den til microtiterplate for masses analyse.

    NB: Det endelige volum av det brukte resuspendering buffer er avhengig av behovene til experimenter og følsomheten av massespektrometeranvendes.

    8. Alternativ Protokoll for Phosphopeptide Enrichment

    MERK: For phosphopeptide berikelse, protein utvinning i trinn 2 må gjøres i nærvær av fosfatase hemmere.

    MERK: Nøyaktig protein konsentrasjon trenger ikke å være bestemt for følgende trinn. Det er nok til å ha et grovt anslag av proteininnhold for å unngå unødvendig prøvetap

    1. Forbered C 8-StageTips (følg samme protokoll for utarbeidelse av C 18-StageTips på trinn 6).
    2. Overføring 1 mg av TiO 2-perler til toppen av klare C 8-StageTips (bruk 1 mg TiO 2 per 100 ug protein).
    3. Stabil TIO 2-tips med 100 mL av løsning C, spinn ved 2000 xg i 5 min i en stasjonær sentrifuge (f.eks Eppendorf 5417R).
    4. Bland 100 ug fordøyd og avsaltet peptider fra trinn 7,7 (det skal være i 100 pl av løsningenB) med 100 mL av løsningen A.
    5. Laste blandet prøven på de ekvilibrert TiO to kolonner, spinn ved 1000 xg, 5 min.
    6. Samle gjennomstrømning og legger det på den samme spissen igjen (holde flyten gjennom etter andre pass).
    7. Vask spissen med 100 mL av løsning A; spinn ved 2000 xg, 5 min i en stasjonær sentrifuge (f.eks Eppendorf 5417R).
    8. Eluere prøven med 50 ul av 5% ammoniakk.
    9. Eluere prøven med 50 ul av 5% piperidin (begge eluater kan kombineres).
    10. Umiddelbart surgjøre prøven ved bruk av 50 pl av 20% fosforsyre. pH bør være på omkring 2.

    MERK: Redd TiO 2 tips og hente pulveret. Det kan vaskes med løsning B og brukes på nytt for en eller to runder.

    1. Igjen avsalte sure prøve C 18 tips (se trinn 8).

    9. LC-MS/MS Analyse av Peptide blandinger

    1. Susp avsaltet fosfatopeptides i resuspensjon buffer.
    2. Load resuspendert prøven på LC-MS/MS system for valg og skaffe spektra i dataavhengig modus på foreslått oppløsning på 60 000 fulle bredde på halv maksimum.

    MERK: For optimal fragmentering, bør enten nøytral-tap skanning brukes 22, eller hvis tilgjengelig flertrinns aktivering 23. Hvis ETD er tilgjengelig vil det tillate peptid ryggrad fragmentering uten tap av fosforsyre 24.

    MERK: Peak lister fra rådata må trekkes ut og sendes til databasen identifisering samt for kvantifisering. Her beskriver vi innstillinger for bruk av Mascot og MSQuant, som arbeider for rådatafiler fra LTQ, LTQ-Orbitrap og LTQ-FT instrumenter (Thermo Scientific).

    1. Pakk topp liste ved hjelp DTAsupercharge innenfor "Helper" Meny i MSQuant. Bruk standardinnstillingene.
    2. Send resulterer topp liste fil til Mascot søkemotor. Critical innstillinger: forløper ion mass toleranse 10 ppm, MS / MS masse toleranse 0,5 Da. Faste modifikasjoner: carbamidomethylation av cysteiner, variable modifikasjoner: oksidasjon av metionin, fosforylering av serin, treonin, tyrosin. Kvantifisering metode: 15 N metabolsk merking.
    3. Lagre Mascot resultat som web side arkiv.
    4. Laste Mascot resultat fil og RAW-filen inn MSQuant. Velg alle proteiner av interesse og kjøre "Automatisk kvantifisering". Programmet vil lese full skanning spektra fra RAW-filen og gjøre peak integrasjon for merket og umerket partnere av hvert peptid.
    5. Eksporter kvantiteringsstandarder resultater til et regnearkprogram eller til en tabulatordelt tekstfil. Dataene kan deretter sendes inn til videre statistisk analyse i Excel eller bruke ytterligere programvarepakker som Statquant 25 eller Cracker 26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Med den fremlagte protokoll ved hjelp av metabolisk merkede Arabidopsis cellekulturer er det mulig å isolere plasmamembraner fra plantevev (trinn 2, 4 Figur 2 og), og berike for detergentresistent membranfraksjoner innenfor plasmamembranen (trinn 3, figur 3 og 5). Deretter lar protokollen utvinning av proteiner fra disse vaskemiddelresistent membranfraksjoner (trinn 4), og fordøyelse av proteinet for sammenlignende analyse proteomikk (trinn 5). Til slutt, er det valgfritt berikelse av phosphopeptides (trinn 8) spesielt interessant i å studere cellulære signalprosesser. Det siste trinnet er deretter den kvantitative analyse av data (trinn 9, figur 6) av protein overflod prosenter i membranfraksjoner fra merket og umerket cellekultur.

Typiske resultater etter blanding av de to-fase-systemet (trinn 2) og etterfølgende sentrifugering er en klart farget øvre fase og engrønt fargede nedre fasen (figur 2). Plasma-membranvesiklene fortrinnsvis forbinder med den øvre PEG fase, mens membranvesiklene fra grønne kloroplaster og andre innvendige membraner er innlemmet i den nedre dekstran fase. Hvis fargeseparasjon ikke kan observeres, ble trinn 2 ikke utføres riktig, og plasma membraner vil være forurenset med betydelige mengder interne membraner. Anrikning av plasmamembranproteiner, kan vises ved proteomikk analyse av små porsjoner av plasmamembranfraksjoner og proteiner i den nedre fase av to-fase-system. Den nedre fase inneholder de indre membraner i cellen. For eksempel, spesielt typiske kjente plasmamembranproteiner, slik som reseptor-kinase proteiner viste høy overflod i plasmamembranen fraksjon (PM) og lav overflod i den nedre fase fraksjon (figur 4A) som inneholder de indre membraner (IM). I sin tur, kjente proteiner av endoplasmatisk retikulum viser høyoverflod i den indre membranfraksjonen, og ble ikke observert i plasmamembranfraksjonen (figur 4B).

Den etterfølgende anrikning av vaskemiddelresistente membranfraksjoner (trinn 3) vil i ideelle tilfeller resultere i dannelsen av en melkeaktig ring av lav tetthet membranvesikler på omtrent 1/5 av den rørlengde (figur 3). Ved justering av Triton X-100 konsentrasjoner eller vaskemiddel til proteinforhold (trinn 3.2) er optimal for separasjon i detergentbestandig-og detergentløselige fraksjoner, kan flere ringer være observert i nedre deler av gradienten, og det vil også være membran klumper i lav tetthet band. I disse tilfeller er vaskemiddel til proteinforhold eller totale vaskemiddel beløp enn den kritiske micelle-konsentrasjon som er nødvendig for reproduserbar separering av de to membrandomene fraksjoner. Bruke den endelige vaskemiddel konsentrasjon og vaskemiddel til protein ratio beskrevet her, Enrichment av typiske microdomain proteiner, slik som remorin (AT3G61260) 27 kan bli bekreftet ved en sammenlignende massespektrometrisk analyse av DRM-fraksjon, vaskemiddel løselig fraksjon (trinn 3.8), så vel som ufraksjonert plasma membran og indre membraner. Høyeste overflod av remorin protein ble funnet i DRM-fraksjoner som forventet (fig. 6A). Proteiner som ikke er tilstede i membranen microdomains, slik som ABC-transportør AT1G59870 (figur 6B), ikke viser en økt mengde i DRM-fraksjonen. Også typiske forurensninger, for eksempel en mitokondrie protein (AT2G07707) fra ATPase F0-komplekset (figur 6C) og ribosomal protein (At1G001100) fra 60S ribosom (Figur 6D) ikke viser en beriket overflod i DRM brøkdel, selv om minimale mengder kan fremdeles bli identifisert.

Etter massespektrometrisk analyse, protein Forekomsten prosenter av protein fosforylering status i plasmamembranfraksjoner av merkede og umerkede cellekulturer kan bli kvantitativt skilles (figur 6). Typiske resultater fra MSQuant ( msquant.alwaysdata.net ) kvantifisering vinduet skal vise et ion intensitetsforhold på 12:59 for de fleste av de identifiserte peptider (figur 6A). Disse peptider med ion intensitetsforholdet signifikant avviker fra 1:1 betraktes som differensial regulert mellom merket og umerket cellekultur, og som er kandidater for samsvarende til proteiner som er berørt av behandlingen anvendt (figur 6C). En god kvalitetskontroll av vellykket metabolsk merking er co-eluering av både merkede og umerkede peptider versjoner som en enkel topp i nano-HPLC separasjon (trinn 9), som vist i figurene 6B og D.

Figur 1 Figur 1. Metabolsk merking eksperimentell strategi. Skjematisk fremstilling av to varianter av eksperimentell design ved bruk av fullt metabolsk merket og umerket A. thaliana cellekulturer. Den experimenter kan enten velge å bruke 14 N celler (umerket) som en kontroll, og 15 N-celler (metabolisk merkede) som gjennomgår biologisk behandling eller vice versa. I en tilsvarende eksperimentell design begge varianter blir utført i parallell.

Fig. 2
Figur 2. Arbeidsflyt for separasjon av plante membranvesikler på en vandig to-fasesystem basert på polyetylenglykol (PEG) og dextran. Plasma-membranvesiklene skilles i øvre PEG fase mens kloroplast og andre innvendige membraner forbundet med bottOM-dekstran fase etter sentrifugering. Med ytterligere vasking av øvre fase bedre rensing kan oppnås, men også materiale tap økes.

Figur 3
Figur 3. Anrikning av low-density membran fraksjoner. Representasjon av sukrosegradient for anriking av low-density vaskemiddel resistent membran fraksjoner. Den forventede plassering etter over natten sentrifugering av lav tetthet membran vesikkel båndet er indikert.

Figur 4
Figur 4. Anrikning av plasmamembranproteiner etter rensing i to-fase-system. Normalisertprotein ion intensiteter for proteiner målt i plasmamembran (PM) og interne membraner (IM) fraksjon. (A) Typiske kjente bestanddeler av plasma membran viser mye høyere overflod i PM brøkdel enn i IM brøkdel. (B) Natural kjente komponenter av interne membraner viser det motsatte atferd. For normalisering ble ion intensitet summer for hver protein uttrykt som en brøkdel av total ion intensitet per prøve, og deretter gjennomsnitt mellom replikater. Fraksjon av totale ione intensiteter ble så uttrykt som relative til gjennomsnittet mellom de to behandlinger. Feil søylene representerer standardavviket tre preparater fra uavhengig dyrket cellekulturer. Klikk her for å se større figur .

Figur 5 Figur 5. . Overflod av standard protein markører innenfor målt fraksjoner Tomter representerer fordelingen av normaliserte protein ion intensiteter av utvalgte protein markører til bestemte subcellulære avdelinger (DRM - sterol rike microdomains, PM - plasma membran, IM - interne membraner, SP - løselige proteiner). Overflod mønstre av (A) remorin som en markør for sterol rike membran microdomains, (B) ABC-type transporter familie proteiner som en representant for en ikke sterol-avhengig protein, (c) underenheten av mitokondriell F0 kompleks, (D) 60S subenheten til ribosomer som en typisk ko-rensende kontaminant. For normalisering ble ion intensitet summer for hver protein uttrykt som en brøkdel av total ion intensitet per prøve, og deretter gjennomsnitt mellom replikater. Fraksjon av totale ione intensiteter ble så uttrykt som relative til gjennomsnittet mellom de to treatments. Feil søylene representerer standardavviket tre preparater fra uavhengig dyrket cellekulturer. Klikk her for å se større figur .

Figur 6
Figur 6. Forventede resultater fra kvantitativ protein massespektrometri. Skjermbilde fra MSQuant viser det forventede intensitetsforholdet 01:01 ion av et peptid fra en 1:1 blanding av proteinekstrakter fra merket og umerket Arabidopsis celler. (A) Fullstendig skanning spektrum av peptid DNNLLGK klart separering av den merkede (høyre topp) og umerket (venstre peak) versjon av peptidene på m / z-aksen. Den monoisotopic massen og den første isotop er indikert med blå merker. (B) Merket (blå) etd umerkede (røde) versjoner av peptid co eluere som en enkelt topp i nano-HPLC-kromatografi. (C) Fullstendig skanning-spektrum av et peptid med ion intensitetsforhold på 1:5 som en kandidat for et differensielt regulert protein (D. ) Også proteiner med forholdstall forskjellig fra 01:01 coelueres i reversert fase kromatografi. Klikk her for å se større figur .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen som presenteres i denne artikkelen inneholder mange trinn og alle av dem er helt avgjørende for å oppnå ren og representative fraksjonering av planteplasma membran inn vaskemiddelresistente membraner og detergentløselige fraksjoner. Derfor er det viktig å følge hvert trinn som instruert.

Behandling av plasmamembranfraksjonen med ikke-ionisk detergent (trinn 3.2) har størst innvirkning på kvaliteten av membranen microdomain fraksjonering. For å oppnå reproduserbare resultater mellom forskjellige preparater, og for å kunne sammenligne forskjellige prøver fra den samme eksperimentet, er det svært viktig å nøyaktig evaluere konsentrasjonen av proteiner i plasma-membranen og å anvende vaskemiddel alltid i samme forhold med hensyn til proteininnhold og alltid til den samme endelige konsentrasjon. I praksis betyr dette at noen ganger er det nødvendig å fortynne prøvene med høy proteinkonsentrasjon, eller å bruke forskjellige konsentrasjons stocksTriton X-100.

I biokjemiske studier, nylig har det vært en tendens blant forskere å bruke et vaskemiddel-fri metode for isolering av membran microdomains 28-30. Disse metoder er basert på en mekanisk forstyrrelse av plasmamembranen ved skjæring gjennom en meget liten nål i analogi til den franske trykkcellepresse. Disse prosedyrene ble vellykket resultat for pattedyrcellekulturer rik på membran microdomains, men søknaden til celleveggen inneholder organismer (gjær, planteceller) har ikke blitt rapportert. Ved hjelp av kvantitative proteomforskning sammen med sterol forstyrrende midler, slik som metyl-beta-cyklodekstrin, ble det vist at DRM-fraksjoner fremstilt fra planteplasma membran inneholder proteiner som er markører for membran microdomains 11.

Angående de endelige resultatene av massespektrometrisk kvantifisering, den typiske resultater som er vist i figur 6 representerer den ideelle situasjonsom ion intensiteten for de fleste av merkede og umerkede peptider er nær identiske. Men i noen tilfeller en viss grad av biologisk variasjon mellom settene av merkede og umerkede cellekulturer kan observeres. Således, før biologisk behandling av enten merket eller umerket cellekultur utføres, analyse av en blanding av merkede og umerkede kontrollceller, begge uten noen behandling, tillater identifikasjon av peptider med et forholdstall avvikende fra den ideelle 1-1 situasjoner. Disse proteinene med avvikende forholdstall er indikasjoner for biologisk variasjon. For å overvinne utfordringen med å skille behandlingseffekter fra biologisk variasjon, vi foreslår derfor å bruke den gjensidige merking i sammenkoblede eksperimenter 20. I den gjensidige eksperimentelle oppsettet er begge varianter av eksperimentet utført som foreslått i figur 1, og trinnene i protokollen blir fulgt som beskrevet. Deretter sammenligne ion intensitetsforhold av proteins fra begge de gjensidige eksperimenter kan man skille mellom hvis forskjellene mellom ion intensitetsforhold er på grunn av biologisk variasjon, eller som en effekt av den anvendte behandling.

En annen metode for adressering problemet å skille mellom behandlingseffekter og biologisk variasjon er bruk av en intern standard merket som en referanse for alle behandlingene 31. I den fremgangsmåten, blir umerket kontroll og umerkede celler som gjennomgår biologisk behandling blandet med den samme mengden av tunge merkede kontrollceller, som kommer fra den samme batch. Det gjør det mulig å eliminere innflytelsen av biologisk variasjon på peptid-forhold, fordi proteinene betraktes som signifikant hvis ion intensitetsforhold av 14 N-kontroll / 15 N-kontroll-og 14 N-behandling / 15 N-kontroll er vesentlig forskjellige. Dette er mulig, da den merkede standard er den samme i alle tilfeller.

En av drawbacks av DRM berikelse prosedyren som er beskrevet her er co-rensende proteiner som kan identifiseres i vaskemiddelbestandige membranen brøkdel. I listen av proteiner identifisert fra den lav tetthet vaskemiddelbestandig membran-fraksjon, kan vi ofte observere et stort antall ribosomale proteiner. På grunn av den relativt lave tetthet av de ribosomale proteiner, de vandrer i den samme fraksjon som sterol avhengige membranproteiner i sukrosegradient. Det ble vist uten tvil at de ribosomal proteiner er helt klart ikke bestanddeler av membran microdomains 11. For å utelukke disse og andre co-rensende proteiner faktisk ikke forbundet med vaskemiddel motstandsdyktig low-density membran fraksjoner, foreslår vi å analysere også proteomikk sammensetningen av de intracellulære membraner (IM) som kan hentes ut fra den nedre dekstran fasen fra de to- fasesystem, og å sammenligne de overflod prosenter av antatte forurensninger mellom den indre membran og DRMfraksjon (se eksempler i figur 5). DRM-co-rensende proteiner bør ha tilsvarende i hopetall i begge fraksjoner (IM og DRM).

Fraksjonering av celle ekstrakter og membran microdomains er en felles strategi for å redusere kompleksiteten i en prøve for proteomikk analyser 32. Derfor er den protokoll som er beskrevet her er nyttig for alle studier av signaleringsprosesser på plasmamembranen av planteceller. Biologiske anvendelser er i å studere stressresponser samt patogen infeksjoner som alle i stor grad induserer endringer i plasma membran sammensetning og endring av membran proteiner 14,15. Foruten å studere stressresponser, kan kvantifisering av protein hopetall i ulike membranfraksjoner stor hjelp annotering av ennå ukjente proteiner 33 34,35.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.

Forfatteren, Witold Szymanski, er ansatt i Max Planck Institute of Molecular plantefysiologi. Forfatteren, er Waltraud Schulze en ansatt ved Universitetet i Hohenheim, Tyskland.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Chemicals were ordered from Sigma-Aldrich unless noted otherwise
Ammonia (stock 25 % solution) WAKO 010-03166
TiO2 10 μm GL-Science 5020-75010
Empore Disk C18 Varian 12145004
Polyethylene glycol(PEG 3350) Sigma 88276
Dextran T500 Roth 9219.2
Trypsin Promega V5113
Protease inhibitor cocktail (PIC) Sigma P9599
K15NO3 Cambridge Isotope Laboratories NLM-765-PK
EQUIPMENT
Optima L-80 XP Ultracentrifuge Beckman
Plate reader BioTek
EASY-nLC II nano-Liquid Chromatograph Thermo Scientific
LTQ-Orbitrap mass spectrometer Thermo Scientific
Centrifuge 5810R Eppendorf
Centrifuge 5417R Eppendorf
Thermomixer Eppendorf
Speed Vac RVC 2-25 Christ
Shaker Unimax 2010 Heidolph

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alexandersson, E., Saalbach, G., Larsson, C., Kjellbom, P. Arabidopsis plasma membrane proteomics identifies components of transport, signal transduction and membrane trafficking. Plant Cell Physiol. 45, 1543-1556 (2004).
  2. Brown, D. A., Rose, J. K. Sorting of GPI-anchored proteins to glycolipid-enriched membrane subdomains during transport to the apical cell surface. Cell. 68, 533-544 (1992).
  3. Lanquar, V., et al. 15N-metabolic labeling for comparative plasma membrane proteomics in Arabidopsis cells. Proteomics. 7, 750-754 (2007).
  4. Kierszniowska, S., Walther, D., Schulze, W. X. Ratio-dependent significance thresholds in reciprocal 15N-labeling experiments as a robust tool in detection candidate proteins responding to biological treatment. Proteomics. 9, 1916-1924 (2009).
  5. Singer, S. J., Nicolson, G. L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 175, 720-731 (1972).
  6. Simons, K., Ikonen, E. Functional rafts in cell membranes. Nature. 387, 569-5672 (1997).
  7. Baumgart, T., et al. Large-scale fluid/fluid phase separation of proteins and lipids in giant plasma membrane vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 3165-3170 (2007).
  8. Silvius, J. R. Partitioning of membrane molecules between raft-and non raft-domains: insights from model membrane studies. Biochim. Biophys. Acta. 1746, 193-202 (2005).
  9. Tanner, W., Malinsky, J., Opekarova, M. In plant and animal cells, detergent-resistant membranes do not define functional membrane rafts. Plant Cell. (2011).
  10. Lauwers, E., Andre, B. Association of yeast transporters with detergent-resistant membranes correlates with their cell-surface location. Traffic. 7, 1-15 (2006).
  11. Kierszniowska, S., Seiwert, B., Schulze, W. X. Definition of Arabidopsis sterol-rich membrane microdomains by differential treatment with methyl-ß-cyclodextrin and quantitative proteomics. Mol. Cell. Proteomics. 8, 612-623 (2009).
  12. Simons, K., Toomre, D. Lipid rafts and signal transduction. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 31-39 (2000).
  13. Maeda, Y., Kinoshita, T. Structural remodeling, trafficking and functions of glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins. Prog. Lipid Res. 50, (2011).
  14. Keinath, N. F., et al. PAMP-induced changes in plasma membrane compartmentalization reveal novel components of plant immunity. J. Biol. Chem. 285, 39140-39149 (2010).
  15. Stanislas, T., et al. Quantitative proteomics reveals a dynamic association of proteins to detergent resistant membranes upon elicitor signaling in tobacco. Mol. Cell. Proteomics. 8, 2186-2198 (2009).
  16. Minami, A., et al. Alterations in detergent-resistant plasma membrane microdomains in Arabidopsis thaliana during cold acclimation. Plant Cell Physiol. 50, 341-359 (2008).
  17. Pauly, M., Eberhard, S., Albersheim, P., Darvill, A., York, W. S. Effects of the mur1 mutation on xyloglucans produced by suspension-cultured Arabidopsis thaliana cells. Planta. 214, 67-74 (2001).
  18. Jouanneau, J. P., Peaud-Lenoel, C. Growth and synthesis of proteins in cell suspensions of a kinetin dependent tobacco. Physiol. Plant. 20, 834-850 (1967).
  19. Engelsberger, W. R., Erban, A., Kopka, J., Schulze, W. X. Metabolic labeling of plant cell cultures with K15NO3 as a tool for quantitative analysis of proteins and metabolites. Plant Methods. 2, 1-11 (2006).
  20. Arsova, B., Kierszniowska, S., Schulze, W. X. The use of heavy nitrogen in quantitative proteomics experiments in plants. Trends Plant Sci. 17, 102-112 (2012).
  21. Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop And Go Extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Anal. Chem. 75, 663-670 (2003).
  22. Olsen, J. V., Macek, B. High accuracy mass spectrometry in large-scale analysis of protein phosphorylation. Methods Mol. Biol. 492, 131-142 (2009).
  23. Schroeder, M. J., Shabanowitz, J., Schwartz, J. C., Hunt, D. F., Coon, J. J. A neutral loss activation method for improved phosphopeptide sequence analysis by quadrupole ion trap mass spectrometry. Anal. Chem. 76, 3590-3598 (2004).
  24. Frese, C. K., et al. Improved peptide identification by targeted fragmentation using CID, HCD and ETD on an LTQ-Orbitrap Velos. Journal of Protrome Research. 10, 2377-2388 (2011).
  25. van Breukelen, B., vanden Toorn, H. W., Drugan, M. M., Heck, A. J. StatQuant: a post-quantification analysis toolbox for improving quantitative mass spectrometry. Bioinformatics. 25, 1472-1473 (2009).
  26. Zauber, H., Schulze, W. X. Proteomics wants cRacker: Automated standardized data analysis of LC/MS derived proteomic data. J. Proteome Res. 11, 5548-5555 (2012).
  27. Raffaele, S., Mongrand, S., Gamas, P., Niebel, A., Ott, T. Genome-wide annotation of remorins, a plant-specific protein family: Evolutionary and functional perspectives. Plant Physiol. 145, 593-600 (2007).
  28. Shah, M. B., Sehgal, P. B. Nondetergent isolation of rafts. Methods Mol. Biol. 398, 21-28 (2007).
  29. Persaud-Sawin, D. -A., Lightcap, S., Harry, G. J. Isolation of rafts from mouse brain tissue by a detergent-free method. Journal of Lipid Research. 50, 759-767 (2009).
  30. Macdonald, L. J., Pike, L. J. A simplified method for the preparation of detergent-free lipid rafts. Journal of Lipid Research. 46, 1061-1067 (2005).
  31. Mühlhaus, T., Weiss, J., Hemme, D., Sommer, F., Schroda, M. Quantitative shotgun proteomics using a uniform 15N-labeled standard to monitor proteome dynamics in time course experiments reveals new insights into the heat stress response of Chlamydomonas reinhardtii. Mol. Cell. Proteomics. 10, M110.004739 (2011).
  32. Schulze, W., Usadel, B. Quantitation in mass-spectrometry-based proteomics. Annu. Rev. Plant Biol. 61, 491-516 (2010).
  33. Foster, L. J., de Hoog, C., Mann, M. Unbiased quantiative proteomics of lipid rafts reveales high specificity for signaling factors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 5813-5818 (2003).
  34. Lilley, K. S., Dupree, P. Plant organelle proteomics. Curr. Opin. Plant Biol. 10, 594-599 (2007).
  35. Sadowski, P. G., Groen, A. J., Dupree, P., Lilley, K. S. Sub-cellular localization of membrane proteins. Proteomics. 8, 3991-4011 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics