البروتين طريقة خالية من تنقية تجليد تحديد الانجذاب من قبل Thermophoresis الميكروسكيل

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

thermophoresis الميكروسكيل (MST) يمكن استخدامها على نطاق واسع لتحديد تقارب ملزمة دون تنقية البروتين المستهدف من الخلية لست. البروتوكول ينطوي overexpression من البروتين GFP تنصهر، تحلل الخلية في غير تغيير طبيعة الظروف، والكشف عن إشارة MST في وجود تركيزات من يجند متفاوتة.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Khavrutskii, L., Yeh, J., Timofeeva, O., Tarasov, S. G., Pritt, S., Stefanisko, K., Tarasova, N. Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis. J. Vis. Exp. (78), e50541, doi:10.3791/50541 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

توصيف الكمي للتفاعلات البروتين ضروري عمليا في أي مجال من مجالات علوم الحياة، وخاصة اكتشاف المخدرات. معظم الطرق المتاحة حاليا من K D تقرير تتطلب الوصول إلى تنقية البروتين من الفائدة، الجيل الذي يمكن أن يكون مضيعة للوقت ومكلفة. لقد قمنا بتطوير البروتوكول الذي يسمح لتحديد تقارب ملزمة من قبل thermophoresis الميكروسكيل (MST) من دون تنقية البروتين المستهدف من الخلية لست. ينطوي على طريقة overexpression من البروتين GFP تنصهر وتحلل الخلية في غير تغيير طبيعة الظروف. تطبيق طريقة لSTAT3-GFP أعرب عابر في HEK293 الخلايا يسمح لتحديد لأول مرة تقارب من عامل النسخ مدروسة لأليغنوكليوتيد] مع سلاسل مختلفة. بروتوكول واضح وصريح ويمكن أن يكون لها مجموعة متنوعة من التطبيقات لدراسة التفاعلات بين البروتينات مع جزيئات صغيرة، الببتيدات، DNA، RNA، وProteins.

Introduction

توصيف الكمي للتقارب من التفاعلات بين الجزيئات مهم في العديد من مجالات البحوث الطبية الحيوية. ملزمة التفكك المستمر (K D) أمر ضروري ليس فقط في اكتشاف المخدرات وإنما هو أيضا معلمة هامة في توصيف أي تفاعل ثنائي في أي نظام بيولوجي. أساليب الكيمياء الحيوية المستخدمة للكشف عن البروتين البروتين التفاعلات، مثل مناعي والخميرة شاشات هجين اثنين، لم يكن لاعلامنا على كيفية ضيق هي تلك التفاعلات، في حين يحدد ما إذا كان هذا التقارب مجمع خاص موجود تحت ظروف معينة في الجسم الحي. في عملية اكتشاف المخدرات، والتنمية مقايسة ملزمة هي واحدة من اللازم وغالبا من أشد الخطوات تستغرق وقتا طويلا. الأساليب الأكثر استخداما من K D عزم تشمل الاستقطاب مضان، 1 سطح مأكل صدى (SPR) والتكنولوجيا، 2 اللاجن ملزم، 3 متساوي الكالوري المعايرة، 4 equilibriأم غسيل الكلى (ED)، 5 الترشيح الفائق (UF) و 5 و تنبيذ فائق (UC). 6 فجميعها تتطلب كميات كبيرة من البروتين النقي الهدف. thermophoresis الميكروسكيل (MST) هي طريقة سريعة النمو الذي يكشف حركة موجهة من الجزيئات في التدرج في درجة الحرارة المجهرية. أي تغييرات من قذيفة الماء من الجزيئات الحيوية نتيجة في التغير النسبي للحركة على طول التدرج في درجة الحرارة. يستخدم 7 MST لتحديد الانتماءات الملزمة وأنها طبقت لدراسة يجند ملزم للبروتينات fluorescently المسمى أو بروابط الفلورسنت لبروتين الهدف. 8، 9 MST يسمح قياس التفاعلات مباشرة في حل من دون الحاجة إلى تجميد على سطح (خالية من الشلل التكنولوجيا). عمليا، ويرافق أي ملزم عن تغيير في إشارة MST، على الرغم من أن حجم التغيير يختلف من نظام إلى نظام بشكل كبير. للكشف عن حركة جزيء بواسطة MST، فإنها يجب أن تكون يتألقNT. ويمكن تشغيل هذا القيد الرئيسي للطريقة إلى ميزة. إذا يتم التعبير عن بروتين كما التحام GFP في أي نظام، وسوف يكون جزيء نيون فقط، وبالتالي يمكن دراستها دون بمعزل عن المحللة الخلية أو نظام خالية من الخلايا التعبير. توليد لست] الخلية التي تسمح للظروف ملزمة مع الحد الأدنى من القطع الأثرية هو التحدي الرئيسي. نحن هنا وصف بروتوكول من إعداد المحللة الخلية والتجربة MST التي يمكن استخدامها للعديد من البروتينات القابلة للذوبان والغشاء.

هي كامنة البروتينات STAT عوامل النسخ حشوية تفعيلها من خلال الفسفرة التيروزين في استجابة لإشارات خارج الخلية وتشارك في العديد من العمليات البيولوجية بما في ذلك الحصانة، تكون الدم، والالتهابات، والتنمية 10 في الثدييات، وتتكون الأسرة من STAT STAT 1، 2، 3، 4 ، 5A، 5B، و 6. ومن المعروف أن جميع الإحصائيات تفعيلها لربط تسلسل الحمض النووي نفسه، ما يسمى عزر GAS، الإنترفيرون جاما تنشيط تسلسل. ومع ذلك، فإن transcriآثار ptional من الإحصائيات المختلفة هي مختلفة جدا. 11 وعلى الرغم من تورط في العديد من العمليات المرضية ودراسات مستفيضة مما أسفر عن أكثر من 17،000 المنشورات، لم يتم تحديد K D من التفاعلات STAT مع تسلسل الحمض النووي مختلفة. وقد اتسمت فقط تقارب النسبي للإحصائيات مختلفة لأنواع من عزر الغاز. صعوبات في التعبير 11 البروتين وتنقية هي العوائق الرئيسية في توصيف الحمض النووي الانتقائية الإحصائيات 'ملزمة. على الرغم من أن الغالبية العظمى من الدراسات ركزت على دور الإحصائيات "المنشط"، الذي أصبح مرادفا للعامل النسخ صور-فسفرته، ودور الإحصائيات غير فسفرته (U-الإحصائيات) في تنظيم النسخ تبرز بسرعة 12 ومع ذلك، هذه الآليات غير مفهومة جيدا، ولكن لم يتضح ما إذا كانت U-الإحصائيات ربط الواقع على الحمض النووي أو التصرف من خلال التفاعلات مع عوامل النسخ الأخرى. لقد أظهرنا مؤخرا أن U-STAT3 يمكن ربط الحمض النووي sequenCES مختلفة من الزخارف الغاز مع أعلى حتى تقارب 13 هذه النتيجة لها انعكاسات كبيرة على فهمنا للالوظائف البيولوجية من هذا البروتين مهم. لقد طبقنا thermophoresis الميكروسكيل لتحديد الانتماءات النسبية للSTAT3 إلى الغاز وAT-S الغنية قليل النوكليوتيد +100 (الشكل 4). وقد استخدم بروتوكول متطابقة تقريبا لK D تقرير للربط ليجند STAT3 مختلفة، مثبط lipopeptide 14 لا ملزم للعامل النسخ ذات الصلة، GFP-STAT1 الذي تم استخدامه كعنصر تحكم سلبي يمكن أن يتم الكشف عن مما يؤكد الانتقائية من التفاعل. 14

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الخلايا المحللة

ويهدف هذا البروتوكول لخلايا ملتصقة تعرب عن أي بروتين GFP تنصهر. مطلوب عدد الخلايا يمكن أن تختلف من منخفضة تصل إلى 10 6 إلى ما يصل إلى 20 × 10 6 خلايا، اعتمادا على مستوى التعبير البروتين. على سبيل المثال، تم إعداد المحللة من كلوة الجنين البشري خلايا overexpressing GFP-STAT3 عن طريق علاج الخلايا المزروعة في 10 T75 القوارير إلى قرب 70٪ confluency مع 1 مل العازلة تحلل. ومع ذلك، كان هذا المحللة إلى أن تضعف 150 أضعاف لتوفير المستوى الأمثل من مضان لتجربة MST. بروتوكول تحلل الخلية يعتمد بقوة على خصائص وتوطين الخلايا من البروتين قيد التحقيق. في حالة استخدام منظفات غير مرغوب فيه بسبب عدم الاستقرار البروتين، وصفت صوتنة أدناه، يمكن أن يكون أفضل خيار. إضافات مختلفة يمكن أن تضاف إلى تحلل العازلة لمنع ردود الفعل التعديل البروتين: EDTA يمنع الفسفرة، فانادات الصوديوم يمنع البروتين phosphatases التيروزين، لذلكفلوريد المتوسط ​​أبعد هو المانع من السير / الثريونين phosphatases.

  1. إعداد العازلة تحلل. للاستخراج البروتينات سهلة حشوية على التشكيل التالي يعمل بشكل جيد: 25 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، والبروتيني كوكتيل المانع المخفف 100 أضعاف (سيغما الدريخ P2714، تتكون من 2 ملي AEBSF، 0.3 ميكرومتر أبروتينين، 130 bestatin ميكرومتر، 1 ملم EDTA، 14 ميكرومتر E-64، 1 leupeptin ميكرومتر). بدلا من ذلك، للبروتينات أقل القابلة للذوبان، يمكن للمرء استخدام العازلة RIPA التجارية مع مثبطات الأنزيم البروتيني كوكتيل والمنظفات غير تغيير طبيعة. إبقاء العازلة على الجليد.
  2. غسل الخلايا لفترة وجيزة مع PBS الجليد الباردة باستخدام 10 مل من العازلة في قارورة T75. تبقي الخلايا على الجليد لمدة 5 دقائق، أو حتى تبدأ الخلايا فصل من القارورة. تتخلص الخلايا مع مكشطة الخلية لفصل إذا لزم الأمر.
  3. Resuspend الخلايا في 10 مل الجليد الباردة PBS ونقل إلى prechilled 14 مل جولة أسفل أنبوب الطرد المركزي.
  4. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في XG 400-600 في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. الجمع بين الخلايا من عدة قوارير في هذه النقطة أناحاجة F.
  5. إزالة برنامج تلفزيوني وطاف بيليه resuspend في 200 ميكرولتر من العازلة تحلل الجليد الباردة، ونقل التعليق إلى ما قبل برود 1.5 مل أنبوب إيبندورف.
  6. تبقي الخلايا على الجليد للحد من ارتفاع درجة الحرارة المحلية. ليز الخلايا مع 3X 10 ثانية نبضات من صوتنة في السعة 30٪، وذلك باستخدام 2-3 ملم غيض قبل المبردة. الحفاظ على معلومات سرية تحت سطح الأرض لتقليل مزبد. حذفت هذه الخطوة عند استخدام المنظفات التي تحتوي على العازلة واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة بدلا من ذلك.
  7. تصحيح الحل المحللة لاحتواء تركيز الملح الفسيولوجية (100 ملي مول كلوريد الصوديوم) إذا لزم الأمر استخدام 5 M كلوريد الصوديوم.
  8. جمع لست] بواسطة الطرد المركزي في حوالي 26،000 XG في 4 درجات مئوية لمدة 10 دقيقة.
  9. تحديد تخفيف المحللة الأمثل (كما هو موضح في القسم 3 أدناه) وكمية من المحللة اللازمة للمعايرة واحدة (عادة حوالي 300 ميكرولتر من المحللة ما قبل المخففة).
  10. قسامة المحللة وتخزينها في درجة حرارة مناسبة للبروتين تحت التحقيق (-80 ° C، في معظم الحالات).
  11. </ OL>

    2. MST اختيار العازلة وإعداد

    1. منذ تفاعلات البروتين يجند تعتمد على الظروف العازلة، يتم اختيار MST تكوين العازلة على أساس خصائص نظام معين. ومن المسلم به عموما من المفيد لاختبار اثنين على الاقل من مخازن مختلفة.
    2. إعداد 2 5X مخازن MST. كان لدينا تجارب جيدة مع هذه التراكيب اثنين: HEPES (250 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.4 و 25 ملي MgCl 500 مم كلوريد الصوديوم؛ 0.25٪ NP-40) وتريس حمض الهيدروكلوريك (250 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4؛ 750 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 50 ملي MgCl 0.05٪ توين-20). بالإضافة إلى ذلك من BSA (5٪ في خليط نهائي ملزم) يمكن أن تساعد في منع التصاق البروتينات لأنابيب البلاستيك والزجاج الشعيرات الدموية. نان 3 (0.5 ملم) ويمكن أيضا أن يدرج لمنع نمو الكائنات الدقيقة.

    3. تحديد الأمثل التخفيف المحللة

    1. حدد مصدر الإثارة LED مع الطول الموجي λ = 470 نانومتر على صك MST.
    2. تحميل الشعيرات الدموية مع CEليرة لبنانية استخراج المخفف 2 و 10x مع MST العازلة.
    3. أداء "البحث الشعيرات الدموية" العملية على برنامج حاسوبي لمراقبة وثيقة MST. مضان المدى الأمثل في المحللة المخفف هو من 400 إلى 1،500 وحدة مضان.

    4. تحديد الأمثل يجند مدى تركيز

    1. أعلى تركيز من يجند ينبغي أن يكون 20x وعلى الأقل أعلى من ثابت التفكك المتوقعة.
    2. يجب أن يكون أقل تركيز يجند أقل من تركيز المولي للبروتين فلوري.

    الرجوع إلى التكنولوجيات أداة الباحث عن تركيز NanoTemper لنطاق تركيز يجند تقدير.

    5. إعداد الخلايا المحللة والتخفيفات يجند

    1. وضع رف أنبوب مع العدد المطلوب (عادة 10-16) من 0.5 مل أنابيب الطرد المركزي LoBind على الجليد. ماصة 25 ميكرولتر من العازلة MST إلى الجزء السفلي من كل أنبوب. إضافة 25 ميكرولتر من محلول المخزون يجند إلى الحوض الأوله (# 1، يجند أعلى تركيز) وتنفيذ المسلسل التخفيف شقين ليجند باستخدام بقية الأنابيب. الحفاظ على الرف مع عينات يجند على الجليد.
    2. الخلية ذوبان الجليد المحللة ببطء على الجليد.
    3. تمييع الخلايا المحللة مع MST عازلة لتوفير المستوى الأمثل من البروتين الهدف الفلورسنت في ردود الفعل ملزم. وينبغي أن يكون تركيز البروتين النهائي على مقربة من المتوقع K D أو أقل. ينبغي تعديل ذلك للحصول على العدد اللازم من التهم مضان في الحل النهائي. لتحديد GFP-STAT3 التركيز في المحللة، ومعايرة أجهزة القياس مع مساعدة من فلوريسئين. تم تحديد تركيز المولي من GFP في المحللة باستخدام نسبة من فلوريسئين وEGFP الغلة الكم، 0.85 و 0.61 على التوالي. 15

    6. Thermophoresis الدراسات التجليد الميكروسكيل

    1. حدد مصدر الإثارة LED مع λ = 470 نانومتر على صك MST.
    2. مكان 0.5 مل أنابيب LoBind في تييوب رف على الجانب الآخر من الأنابيب مع يجند مسلسل عينات التخفيف. بعناية إضافة 15 ميكرولتر من المحللة الخلية إلى أسفل كل أنبوب. حاول أن لا تلمس الجدران أنبوب لتجنب فقدان العينة.
    3. إضافة 15 ميكرولتر من العينة يجند مع أعلى تركيز (رقم 1) إلى أنبوب المقابلة # 1 مع المحللة الخلية. تخلط جيدا وتغيير تلميح ماصة. كرر هذه الخطوة مع بقية الأنابيب باستثناء آخر واحد، والتي ينبغي أن لا تحتوي على يجند.
    4. إضافة 15 ميكرولتر من العازلة MST إلى أنبوب آخر وتخلط جيدا.
    5. ملء ما يقرب من 2/3 من أول الشعرية مع الخليط ملزم من أنبوب # 1، والميل الى التحرك نحو الحل الوسط، ووضع شعري على علبة الشعرية إلى الموضع رقم 1 (أقرب موقف لافتتاح صينية) . كرر هذه الخطوة مع بقية الشعيرات الدموية. إنتهاء الشعرية يمكن توصيله مع الشمع للتجارب أطول.
    6. وضع صينية داخل الصك MST وإغلاق الباب الصك.
    7. أداء "البحث الشعيرات الدموية"الأمر للسماح للأداة العثور على وظائف بالضبط من الشعيرات الدموية وقياس مضان من العينات.
    8. استنادا إلى شدة إشارة مضان، ضبط قوة الصمام (10-100٪) لجعله 400-1،500 وحدات الفاصل.
    9. انقر فوق زر "ابدأ" لتنفيذ التجربة thermophoresis. ويمكن اختيار أكثر من واحد قوة الأشعة تحت الحمراء ليزر للتجربة في أجل العثور على التدرج في درجة الحرارة المثلى لنظام معين. جمع البيانات 2-3 أشواط لنفس مجموعة من الشعيرات الدموية لضمان استنساخ القياسات. فإنه يأخذ 10-12 دقيقة لتشغيل مجموعة واحدة من 16 الشعيرات الدموية.

    7. الميكروسكيل تحليل البيانات Thermophoresis

    1. فتح برنامج التحليل.
    2. تحميل مجلد المشروع. في معلومات ظهرت عارض تشغيل حدد جمعها في معين يزر الأشعة تحت الحمراء منحنيات thermophoretic السلطة. هناك خيار لفتح كل آثار thermophoretic جمعها في ظل ظروف مختلفة مثل الطاقة يزر الأشعة تحت الحمراء، الصمام POWER، ودرجة الحرارة، والتركيز، وغيرها. في وقت واحد ومن ثم اختيار أي منحنيات للتحليل عن طريق التحول لهم وإيقاف (انقر على اسم التجربة ل).
    3. في تقييم نقاط نافذة الرسم البياني، حدد thermophoresis أو thermophoresis مع T-القفزة. ضمان أن يتم وضع خطوط زرقاء وحمراء بشكل صحيح. للحصول على النقاط بلغ متوسط ​​مع الانحرافات المعيارية، حدد "استخدام متوسط" أو "تميز يدير" لأشواط منفصلة.
    4. لرسم نوبة التفكك المستمر، حدد "استخدام متوسط"، أدخل وإصلاح جزيء قيمة تركيز المسمى (التحقق من "تركيز" مربع في القائمة إطار مناسبا)، وتناسب المنحنى. تظهر القيمة D K مع انحرافها المعياري في المعلومات نافذة منبثقة منفصلة. لرسم نوبة باستخدام طريقة هيل، حدد "متوسط"، طريقة هيل، ومن ثم تتناسب مع منحنى. يظهر EC 50 قيمة تقارب مع انحرافها المعياري في هذه الحالة. ويمكن أيضا ميزة من K D أو هيل "الحدود" أن تستخدم عندما تشبعفي حالة محددة لم يتم التوصل.
    5. حفظ البيانات متوسط ​​مناسبا في ملف نصي ونقل إلى Excel.
    6. مؤامرة القاعدة F (مضان تطبيع)، ΔF القاعدة (الاختلاف في مضان تطبيع إذا تم مقارنة تجارب مختلفة)، أو جزء ملزمة (انظر الصيغة أدناه) بوصفها وظيفة من توضيحها (معاير) تركيز جزيء.

    جزء منضم (جزء من الجزيئات في مجمع) = (ثيرم (C)، غير منضم) / (محكومة غير منضم)، حيث ثيرم (C) هو thermophoresis قياس لتركيز C، غير منضم هو thermophoresis للدولة غير منضم (عندما الجزيئات ليس في مجمع)، والالتزام هو thermophoresis للدولة ملزمة تماما.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

قياس تقارب من البروتين STAT3 غير فسفرته ملزمة لأليغنوكليوتيد].

واستخدمت HEK293 الخلايا معربا عن GFP STAT3-كمصدر للfluorescently المسمى STAT3 لفحص الحمض النووي ملزم. أعدت لست] الخلية باستخدام RIPA العازلة (20X10 6 خلية / مل). للدراسات ملزم، وتضعف لست] 150X مع MST العازلة الحمض النووي الملزمة لتوفير المستوى الأمثل من البروتين الفلوري في رد فعل ملزم (حوالي 20 نانومتر). وقد استخدمت الخلايا HEK293 غير transfected لتقييم مضان الخلفية، والتي تحولت إلى أن تكون غير قابلة للكشف حتى في المحللة غير المخفف. ومع ذلك، يمكن مضان الخلفية تكون أكثر أهمية في أنظمة التعبير الأخرى، وبالتالي لابد من رصدها. تم إعداد سلسلة المعايرة التي تتكون من 11 مخاليط ملزمة وعينة المحللة دون يجند. يرد كل عينة 15 ميكرولتر من المحللة خلية المخفف و 15 ميكرولتر من الحلول أليغنوكليوتيد] متفاوتة ويركزالأيونات. وشملت النهائية تكوين العازلة HEPES 25 ملي، ودرجة الحموضة 7.2 و 50 ملي مول كلوريد الصوديوم؛ 2.5 ملي MgCl و0.025٪ NP-40. أخذ القياسات في مستوى الشعيرات الدموية تعامل على متراصة NT.115 صك باستخدام 50٪ من الطاقة IR-الليزر ومصدر الإثارة LED مع λ = 470 نانومتر عند درجة حرارة الغرفة. أدى ملزم من [أليغنوكليوتيد مشحونة في تغييرات كبيرة في STAT3 التنقل في التدرج في درجة الحرارة (الشكل 2). في الشكل (3)، يتم رسم إشارة thermophoretic بوصفها وظيفة من تركيز قليل النوكليوتيد. كل نقطة بيانات يمثل متوسط ​​ثلاثة قياسات. تم استخدام التحليل NanoTemper 1.2.20 برنامج لاحتواء البيانات وتحديد واضح للقيم K D. كانت ثوابت التفكك الظاهر 37.9 ± 1.0 ميكرومتر و 23.3 ± 0.6 ميكرومتر للغاز وS +100، على التوالي (الشكل 4). أدى استبدال A-إلى-G في الانخفاض الكبير في تقارب من S +100 موت # 1 (الشكل 4)، في حين مووأظهرت تانت S +100 موت رقم 2 لم يتم كشفها ملزمة مؤكدة بذلك ملزم تسلسل انتقائية من STAT3 إلى S +100. والمثير للدهشة، S +100 تسلسل عرض تشديد قليلا ملزم من الغاز في ثلاثة التكرار القياس.

الشكل 1
الشكل 1. الخطة الشاملة للتجربة. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الشكل 2
الشكل 2. البيانات thermophoresis غير المجهزة ولدت لتفاعل GFP-STAT3 مع قليل النوكليوتيد AT الغنية. الخلية المخففة المحللة containi نانوغرام 20 نانومتر GFP-STAT3 كانت مختلطة مع كميات متزايدة من قليل النوكليوتيد المزدوج تقطعت بهم السبل (5'-AAAACAAAACGAAACAAACAAACTA) تسفر عن تركيزات محددة من يجند. وقد تم جمع البيانات في 50٪ من الطاقة ليزر و 100٪ الصمام.

الشكل (3)
الشكل (3). منحنى ملزم التي تم إنشاؤها بواسطة NanoTemper تحليل 1.2.231 البرنامج. تطبيع مضان (الساخنة مضان / مضان الأولي) هو تآمر بوصفها وظيفة من تركيز قليل النوكليوتيد. يظهر بروتين زيادة في مضان في منضم بالمقارنة مع دولة غير منضمة. يتم تجهيز البيانات باستخدام طريقة المعادلة هيل دمجها في برامج التحليل NanoTemper.

0541fig4highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50541/50541fig4.jpg "/>
الشكل 4. STAT3 ملزمة لأليغنوكليوتيد] مع سلاسل مختلفة. الميكروسكيل القياسات thermophoresis ملزم من STAT3-GFP إلى الغاز (K D = 37.9 ± 1.0 ميكرومتر)، S +100 (K D = 23.3 ± 0.6 ميكرومتر)، S +100 متحولة 1 (K D = 740 ± 21 ميكرومتر)، وS +100 متحولة 2 (لا ملزم). ابقى تركيز STAT3-GFP ثابتة عند حوالي 20 نانومتر، وتركيز أليغنوكليوتيد] تباينت 666-،650 ميكرومتر. الفرق في مضان تطبيع [‰] يتم رسم بوصفها وظيفة من تركيز قليل النوكليوتيد، ويتم تركيبها منحنيات باستخدام طريقة هيل من البرنامج تحليل NanoTemper. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري لل3 القياسات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تعبير البروتين وتنقية هو خطوة شاقة ومكلفة، والتي، مع ذلك، من الضروري لتحديد التفاعلات 'K D بواسطة الأسلوب الأكثر المستخدمة حاليا. تطبيق يسمح MST تجنب تنقية البروتين وبالتالي تبسيط بشكل كبير وتسريع توصيف الكمي من التفاعلات. أنه يقدم مزايا كبيرة خاصة في حالة يصعب التعبير وتنقية البروتينات، مثل البروتينات الغشاء وعوامل النسخ.

فإن القيود الرئيسية ومتطلبات MST هو القدرة على التعبير عن بروتين باعتبارها الانصهار مع بروتين الفلورية الخضراء. ومع ذلك، فإن بنيات للتعبير عن غالبية GFP تنصهر البروتينات البشرية والماوس متاحة تجاريا. كما تستخدم البروتينات GFP تنصهر على نطاق واسع للاتجار ودراسات تدهور، وبالتالي يمكن أن تكون "الرسوم المزدوجة" في تركيبة مع دراسات MST.

بالإضافة إلى عدم وجود حاجة للبروتين Purification، واستخدام اقتصادية للغاية من كل الكواشف وعدم الاكتراث إلى اختلافات طفيفة في التراكيب العازلة، MST يقدم مزايا أخرى بالمقارنة مع الأساليب التقليدية للK D القرارات. على عكس سطح مأكل صدى، والتجارب المستندة إلى MST يستغرق أقل من 2 ساعة، والسماح لتحديد K D في نطاق أوسع ولا تعاني من الشلل سطح القطع الأثرية. على سبيل المثال، لم نتمكن من تحديد K D لSTAT3 ملزمة لأليغنوكليوتيد] بواسطة SPR، على الرغم من أننا قد استثمرت قدرا كبيرا من الأموال لشراء لتنقية STAT3 البروتين. K D من التفاعل كان عاليا جدا، مما هو الحال بالنسبة للعوامل النسخ في كثير من الأحيان، وسقطت خارج النطاق تركيز SPR التجربة ل.

الكالوري المعايرة يعمل فقط لالتفاعلات التي تصاحبها تغييرات في المحتوى الحراري. لا يشمل هذا القيد كثير من الحالات. في هذه الأثناء، والتغيرات في التنقل thermophoretic، على الرغم من أن لا تختلف كثيرا في القيم لدينظم fferent، تحدث عن الغالبية العظمى من التفاعلات. واحدة من أكبر مزايا MST هو أنه يعمل في مجموعة متنوعة من مخازن وتتسامح مع وجود المنظفات والمذيلات، وbicelles في النظام. هذه الخاصية تسمح تطبيقه على البروتينات الغشاء الذي من المستحيل عمليا للدراسة من قبل وسائل أخرى. ومع ذلك، يجب استخدام الحذر لتجنب الاختلافات في صناعة المنظفات والمحتوى المذيلات وتكوينها أثناء المعايرة مع يجند.

ينبغي أن يوضع في الاعتبار أيضا عند استخدام مقتطفات الخلية أن البروتين قيد الدراسة قد تكون موجودة في شكله الأصلي، الذي هو في كثير من الأحيان معقدة مع البروتينات الأخرى، والأحماض النووية، والعوامل المساعدة. وبالتالي، قد يكون تقارب ملزمة مختلفة عن تلك التي لبروتين معزولة لا تشارك في أي تشكيلات معقدة. من overexpression كثيرا ما يسمح المعايرة من الشركاء التفاعل وترك معظم جزيئات من البروتين قيد الدراسة في دولة غير منضمة. هذا هو سبب آخر لمحاولة achieهاء مستويات التعبير عالية جدا من البروتين GFP تنصهر على الخلايا ترنسفكأيشن. المعلمة التي يصعب التحكم الأخرى هو تعديلات ما بعد النقل التي يمكن أن تضيف أيضا عدم تجانس كبير للنظام. قيود إضافية تدرس ملزم للبروتينات والجزيئات الصغيرة التي تكون موجودة في الخلية لست بكميات كبيرة أو الجزيئات مع خصوصية واسعة وتقارب المنخفضة التي يمكن أن تتفاعل مع بروتينات متعددة موجودة في المحللة. Wienken، CJ، وآخرون. وقد وجدت أن K D يحدده MST في E. وكان استخراج القولونية أكثر من أمر من حجم أعلى مما كانت عليه في مخزن مؤقت للتفاعل مضاد للفيروسات غاما مع الأجسام المضادة 9. تأثير قد يكون جزئيا بسبب التحلل البروتيني منذ أن كان استخراج أي مثبطات الأنزيم البروتيني. تم العثور على جزيء صغير ملزمة لالزلال في الدم أيضا إلى تغيير K D في دراسات تفاعلات بواسطة MST 9.

يمكن للفعالية استخراج أيضا تختلف عن احالبروتينات NT اعتمادا على توطين الخلايا والخصائص الفيزيائية والكيميائية. وبالتالي، فإنه من المفيد أن حاول عدة تحلل الخلايا وشروط استخراج البروتين. للبروتينات حشوية، وذلك باستخدام أي منظفات، الموجات فوق الصوتية فقط لتمزيق الخلايا تنتج في كثير من الأحيان غلة جيدة جدا والبيانات. وفي الوقت نفسه، بروتينات غشاء تتطلب فحص أكثر شمولا من ظروف استخراج مع تركيزات مختلفة وطبيعة المنظفات والمذيلات الدهون، أو bicelles. محتوى المنظفات لابد من الاحتفاظ بالحد الأدنى لتجنب التأثير على تقارب ملزم.

وعلى الرغم من القيود المدرجة، لقد وجدت الدراسات MST من غير المنقى البروتينات GFP تنصهر لتكون مريحة للغاية لتحديد الكميات من الانتماءات الملزمة للعديد من البروتينات وأنواع يجند. ليس هناك شك في أن التوسع في استخدام الأسلوب في العديد من المختبرات وسوف تسمح بالمزيد من توسيع تطبيقات من الدراسات ملزم البروتين على أساس MST.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة. محتوى هذا المنشور لا تعكس بالضرورة وجهات نظر أو سياسات وزارة الصحة والخدمات البشرية، ولا ذكر الأسماء التجارية، المنتجات التجارية، أو المنظمات لا تعني مصادقة من قبل الحكومة الأمريكية.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل جزئيا من قبل برنامج بحوث جماعية من المعاهد الوطنية للصحة، والمعهد الوطني للسرطان، مركز لأبحاث السرطان؛ اتفاقية الأبحاث التعاونية بين لجنة التحقيق الوطنية وCalidris التداوي؛ جمعية السرطان الأمريكية منحة IRG 97-152-17 إلى OT؛ والأموال الاتحادية من المعهد الوطني للسرطان، المعاهد الوطنية للصحة، تحت HHSN26120080001E العقد.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RIPA buffer Millipore 20-188 Other manufacturer's buffers work as well
Protease inhibitors cocktail Sigma-Aldrich P2714
Monolith NT.115 NanoTemper Technologies GmbH G008
Monolith NT.115 Capillary Tray NanoTemper Technologies GmbH T001
Monolith NT.115 Standard Treated Capillaries NanoTemper Technologies GmbH K002
NT Control software NanoTemper Technologies GmbH 2.0.2.29
NT Analysis software NanoTemper Technologies GmbH 1.4.27
Table-top refrigerated centrifuge Eppendorf 5417R Other microtube refrigerated centrifuges providing
Protein LoBind Tube 0.5 ml Eppendorf 22431064

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lea, W. A., Simeonov, A. Fluorescence polarization assays in small molecule screening. Expert. Opin. Drug Discov. 6, 17-32 (2011).
  2. Willander, M., Al-Hilli, S. Analysis of biomolecules using surface plasmons. Methods Mol. Biol. 544, 201-229 (2009).
  3. Hulme, E. C., Trevethick, M. A. Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation. Br. J. Pharmacol. 161, 1219-1237 (2010).
  4. Ghai, R., Falconer, R. J., Collins, B. M. Applications of isothermal titration calorimetry in pure and applied research--survey of the literature from 2010. J. Mol. Recognit. 25, 32-52 (2012).
  5. Vuignier, K., Schappler, J., Veuthey, J. L., Carrupt, P. A., Martel, S. Drug-protein binding: a critical review of analytical tools. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 398-3953 (2010).
  6. Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. Modern analytical ultracentrifugation in protein science: a tutorial review. Protein Sci. 11, 2067-2079 (2002).
  7. Duhr, S., Braun, D. Why molecules move along a temperature gradient. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 19678-19682 (2006).
  8. Zillner, K., Jerabek-Willemsen, M., et al. Microscale thermophoresis as a sensitive method to quantify protein: nucleic acid interactions in solution. Methods Mol. Biol. 815, 241-252 (2012).
  9. Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nat. Commun. 1, 100 (2010).
  10. Stark, G. R., Darnell, J. E. The JAK-STAT pathway at twenty. Immunity. 36, 503-514 (2012).
  11. Ehret, G. B., Reichenbach, P., et al. DNA binding specificity of different STAT proteins. Comparison of in vitro specificity with natural target sites. J. Biol. Chem. 276, 6675-6688 (2001).
  12. Yang, J., Stark, G. R. Roles of unphosphorylated STATs in signaling. Cell Res. 18, 443-451 (2008).
  13. Timofeeva, O. A., Chasovskikh, S., et al. Mechanisms of unphosphorylated STAT3 transcription factor binding to DNA. J. Biol. Chem. 287, 14192-14200 (2012).
  14. Timofeeva, O. A., Tarasova, N. I., et al. STAT3 suppresses transcription of proapoptotic genes in cancer cells with the involvement of its N-terminal domain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2013).
  15. Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. Fluorescent protein spectra. J. Cell Sci. 114, 837-838 (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics