Eiwitzuivering-vrij bindwijze affiniteit Bepaling door Microschaal thermophoresis

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Microschaal thermophoresis (MST) op grote schaal kunnen worden gebruikt voor de bepaling van de bindingsaffiniteit zonder zuivering van het doelwit eiwit uit cellysaten. Het protocol omvat overexpressie van GFP-gefuseerde eiwit, cellyse in niet-denaturerende omstandigheden en detectie van MST signaal in de aanwezigheid van variërende concentraties van het ligand.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Khavrutskii, L., Yeh, J., Timofeeva, O., Tarasov, S. G., Pritt, S., Stefanisko, K., Tarasova, N. Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis. J. Vis. Exp. (78), e50541, doi:10.3791/50541 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kwantitatieve karakterisering van eiwit interacties is essentieel in vrijwel elk gebied van life sciences, met name drug discovery. De meeste momenteel beschikbare methoden Kd bepaling is toegang tot gezuiverde eiwit van belang, generatie die kan tijdrovend en duur. We hebben een protocol dat het mogelijk maakt voor de bepaling van de bindingsaffiniteit door microschaal thermophoresis (MST) zonder zuivering van het doelwit eiwit uit cellysaten ontwikkeld. De werkwijze omvat overexpressie van GFP gefuseerde eiwit en cellysis in niet-denaturerende omstandigheden. Toepassing van de methode STAT3-GFP transiënt tot expressie in HEK293 cellen zelf te bepalen voor de eerste maal de affiniteit van de goed onderzochte transcriptiefactor aan oligonucleotiden met verschillende sequenties. Het protocol is eenvoudig en kan een verscheidenheid aan applicatie voor het bestuderen van interacties van eiwitten met kleine moleculen, peptiden, DNA, RNA, en proteins.

Introduction

Kwantitatieve karakterisering van affiniteit van intermoleculaire interacties is belangrijk in veel gebieden van het biomedisch onderzoek. Binding dissociatieconstante (KD) is niet alleen noodzakelijk drug discovery, maar is ook een belangrijke parameter in de karakterisering van een binaire interactie in een biologisch systeem. Biochemische methoden voor detectie van eiwit-eiwit interacties, zoals immunoprecipitatie en gist twee-hybride-screening, niet aan ons van hoe strak zijn die interacties, terwijl affiniteit bepaald of dit complex bestaat onder bepaalde omstandigheden in vivo. In drug discovery proces, bindingassay ontwikkeling is een van de noodzakelijke en vaak het meest tijdrovende stappen. Meest gebruikte methoden van Kd bepaling omvatten fluorescentiepolarisatie, 1 surface plasmon resonance (SPR) technologie, 2 radioligand binding, 3 isothermische titratie calorimetrie 4 Equilibrium dialyse (ED), 5 ultrafiltratie (UF), 5 en ultracentrifuge (UC). 6 Allemaal vereisen aanzienlijke hoeveelheden gezuiverd doelwit eiwit. Microschaal thermophoresis (MST) is een zich snel ontwikkelende methode die gerichte beweging van moleculen in een microscopische temperatuurgradiënt detecteert. Eventuele wijzigingen van de hydratatie schil van biomoleculen resultaat in een relatieve verandering van beweging langs de temperatuurgradiënt. 7 MST wordt gebruikt om bindende affiniteiten te bepalen en is aangevraagd voor het bestuderen van ligand binding aan fluorescent gelabelde eiwitten of fluorescerende liganden aan een doelwit eiwit. 8, 9 MST maakt meting van interacties direct in oplossing zonder immobilisatie op een oppervlak (immobilisatie-vrije technologie). Praktisch wordt bindende gepaard met een verandering in het signaal MST, hoewel de grootte van de verandering verschilt van systeem tot systeem sterk. Voor de detectie molecuul verzoek van MST, zij moet fluorescerennt. Deze belangrijke beperking van de methode kan worden omgezet in een voordeel. Wanneer een eiwit tot expressie als een GFP-fusie in een systeem, zal de enige fluorescent molecuul zijn en dus kunnen worden bestudeerd zonder isolatie van het cellysaat of celvrij expressiesysteem. Generatie van cellysaten die het mogelijk maken voor bindende voorwaarden met minimale artefacten is de grote uitdaging. Hier een protocol cellysaat preparaat en MST experiment dat kan worden gebruikt voor vele oplosbare en membraaneiwitten beschrijven we.

STAT eiwitten latente cytoplasmische transcriptiefactor geactiveerd door tyrosine fosforylering in respons op extracellulaire signalen en zijn betrokken bij vele biologische processen zoals immuniteit, hematopoiese, ontsteking en ontwikkeling. 10 In zoogdieren, de STAT STAT familie bestaat uit 1, 2, 3, 4 , 5A, 5B en 6. Alle geactiveerde STAT's zijn bekend te binden aan dezelfde DNA-sequentie, zogenaamde GAS motief, IFN-gamma geactiveerd sequentie. De transcriptioneel effecten van verschillende STAT's zijn zeer verschillend. 11 Ondanks betrokkenheid bij vele pathologische processen en uitgebreide studies waarbij meer dan 17.000 publicaties hebben de KD van STAT interacties met andere DNA-sequenties niet vastgesteld. Slechts relatieve affiniteit van verschillende statistieken tot varianten van GAS motief werd gekenmerkt. 11 Moeilijkheden in eiwit expressie en zuivering zijn de belangrijkste belemmeringen in de karakterisering van STAT 'DNA-binding selectiviteit. Hoewel de meeste studies zijn gericht op de rol van "geactiveerde" STAT, die synoniem geworden aan Tyr-gefosforyleerde transcriptiefactor, de rol van niet-gefosforyleerde STAT (U-STAT) in regulatie van transcriptie snel opkomende. 12 echter deze mechanismen worden slecht begrepen, en het was niet duidelijk of U-STAT daadwerkelijk binden aan DNA of optreden via interacties met andere transcriptiefactoren. We hebben onlangs aangetoond dat de U-STAT3 kan binden aan DNA sequences verschillend van GAS motieven met een nog hogere affiniteit. 13 De bevinding heeft belangrijke implicaties voor ons begrip van de biologische functies van deze belangrijke proteïne. We hebben microschaal thermophoresis relatieve affiniteiten van STAT3 bepalen GAS toegepast en AT-rijke oligonucleotide S 100 (figuur 4). Bijna identieke protocol is gebruikt KD bepaling voor binding van een ander ligand STAT3, een lipopeptide inhibitor. Nr. 14 binding aan een verbonden transcriptiefactor GFP-STAT1 die werd gebruikt als een negatieve controle worden gedetecteerd hetgeen bevestigt selectiviteit van interactie. 14

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bereiding van cellysaat

Dit protocol is bedoeld voor hechtende cellen die geen GFP-gefuseerd eiwit. Benodigd aantal cellen kan variëren van zo laag als 10 6 tot wel 20 x 10 6 cellen, afhankelijk van het niveau van eiwitexpressie. Bijvoorbeeld lysaat van HEK overexpressie GFP-STAT3 werd bereid door cellen gekweekt in T75 kolven 10 tot bijna 70% confluentie met 1 ml lysis buffer. Echter lysaat moest worden verdund 150-voudig tot optimaal niveau van fluorescentie voorzien MST experiment. Cell lysis protocol sterk afhankelijk van de eigenschappen en intracellulaire lokalisatie van het eiwit onderzocht. Bij gebruik van reinigingsmiddelen is ongewenst vanwege eiwit instabiliteit, sonicatie hieronder beschreven, zou de beste keuze zijn. Verschillende additieven kunnen worden toegevoegd aan de lysis buffer eiwitmodificatie reacties te voorkomen EDTA voorkomt fosforylering natriumvanadaat remt tyrosine proteïne fosfatasen, zodatdium fluoride is een remmer van Ser / Thr fosfatasen.

  1. Bereid lysebuffer. Om gemakkelijk te extraheren cytoplasmatische eiwitten de volgende samenstelling werkt goed: 25 mM Tris HCl, pH 8,0, en proteaseremmercocktail 100 maal verdund (Sigma-Aldrich P2714, bestaande uit 2 mM AEBSF, 0,3 uM aprotinine, 130 uM bestatine, 1 mM EDTA, 14 uM E-64, 1 uM leupeptine). Als alternatief voor minder oplosbare eiwitten, een commercieel kunnen RIPA buffer gebruiken proteaseremmers cocktail en niet-denaturerende detergenten. Houd de buffer op ijs.
  2. Was de cellen kort met ijskoude PBS met behulp van 10 ml buffer per T75 fles. Blijf cellen op ijs gedurende 5 minuten of totdat cellenbegin los van de fles. Schraap cellen met celschraper te halen als dat nodig is.
  3. Resuspendeer cellen in 10 ml ijskoude PBS en overbrengen in een voorgekoeld 14 ml ronde bodem centrifugebuis.
  4. Pellet cellen door centrifugeren bij 400-600 xg bij 4 ° C gedurende 5 minuten. Combineer cellen van meerdere kolven op dit punt if nodig.
  5. Verwijder PBS supernatant en resuspendeer pellet in 200 pl ijskoude lysis buffer, suspensie overbrengen naar een vooraf gekoelde 1,5 ml Eppendorf buisje.
  6. Houd cellen op ijs plaatselijke oververhitting te minimaliseren. Lyse cellen met 3x 10 sec pulsen van ultrasoonapparaat op 30% amplitude, met een 2-3 mm pre-gekoelde tip. Houd de punt onder de oppervlakte te minimaliseren schuimen. Sla deze stap over wanneer u een afwasmiddel-bevattende buffer en incubeer op ijs gedurende 30 minuten plaats.
  7. Corrigeer de lysaatoplossing aan fysiologische zoutconcentratie (100 mM NaCl), indien nodig met behulp van 5 M NaCl bevatten.
  8. Verzamel lysaten door centrifugatie bij 26.000 xg bij 4 ° C gedurende 10 minuten.
  9. Bepaal de optimale lysaat verdunning (zoals beschreven in paragraaf 3 hieronder) en de hoeveelheid lysaat nodig is voor een titratie (meestal rond de 300 pi van pre-verdund lysaat).
  10. Aliquot het lysaat en bewaar bij geschikte temperatuur voor het onderzochte eiwit (-80 ° C, in de meeste gevallen).
  11. </ Ol>

    2. MST Buffer en voorbereiding

    1. Aangezien het eiwit-ligand interacties zijn afhankelijk buffer omstandigheden wordt MST buffersamenstelling gekozen op basis van de eigenschappen van een bepaald systeem. Het is in het algemeen voordelig om ten minste twee verschillende buffers testen.
    2. Bereid 2 5x MST buffers. We hadden goede ervaringen met deze twee samenstellingen: HEPES (250 mM HEPES, pH 7,4, 25 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 0,25% NP-40) en Tris HCl (250 mM Tris HCl, pH 7,4, 750 mM NaCl, 50 mM MgCl2, 0,05% Tween-20). Toevoeging van BSA (5% in het uiteindelijke mengsel binding) kan helpen adhesie van eiwitten op kunststof buizen en glazen capillairen te voorkomen. NaN3 (0,5 mM) zijn mogelijk om de groei van micro-organismen te voorkomen.

    3. Bepaling van de optimale verdunning lysaat

    1. Selecteer de LED excitatie lichtbron met de golflengte λ = 470 nm van de MST instrument.
    2. Laad capillairen met de cell extract verdund 2 en 10x met MST buffer.
    3. Presteren "Zoek Haarvaten" operatie op Control Software van MST instrument. De optimale fluorescentie assortiment in verdunde lysaat is van 400 tot 1500 fluorescentie-eenheden.

    4. Het bepalen van de optimale Ligand Concentratiebereik

    1. De hoogste concentratie van het ligand moet minstens 20x hoger dan de verwachte dissociatieconstante.
    2. De laagste concentratie ligand moet lager zijn dan de molaire concentratie van het fluorescerende eiwit.

    Raadpleeg de NanoTemper Technologies Concentratie Finder tool voor het ligand concentratiegebied schatting.

    5. Bereiding van cellysaat en Ligand Verdunningen

    1. Plaats een buis rek met een benodigde aantal (meestal 10-16) van 0,5 ml LoBind centrifuge buizen op ijs. Pipetteer 25 ul MST buffer naar de bodem van elke buis. Voeg 25 ul van de ligand stockoplossing aan de eerste kuipe (# 1, ligand hoogste concentratie) en voer seriële tweevoudige verdunning van de ligand met de overige buizen. Houd het rek met ligand monsters op ijs.
    2. Dooi cellysaat langzaam op ijs.
    3. Verdun cellysaat met MST buffer om het optimale niveau van het fluorescente doeleiwit in de bindingsreacties verschaffen. Uiteindelijke eiwitconcentratie te dicht bij verwachte K D of lager. Het moet worden aangepast om benodigde aantal fluorescentie tellingen vinden in de uiteindelijke oplossing. Voor de bepaling van GFP-concentratie STAT3 in het lysaat werd het instrument gekalibreerd met behulp van fluoresceïne. De molaire concentratie van GFP in het lysaat werd bepaald met de verhouding van fluoresceïne en EGFP kwantumopbrengsten, 0,85 en 0,61 respectievelijk. 15

    6. Microschaal thermophoresis Binding Studies

    1. Selecteer de LED excitatiebron met λ = 470 nm van de MST instrument.
    2. Plaats 0,5 ml LoBind buizen in de tube rack tegenover buizen met ligand seriële verdunning monsters. Voeg voorzichtig 15 ul cellysaat van de aan de bodem van elke buis. Probeer niet te pijpwanden raken om te proeven verlies te voorkomen.
    3. Voeg 15 ul van de ligand monster met de hoogste concentratie (nr. 1) op de overeenkomstige buis # 1 met het cellysaat. Meng goed en wijzigen van een pipet tip. Herhaal deze stap voor de overige buizen behalve de laatste, waarbij geen ligand bevatten.
    4. Voeg 15 ul van buffer MST de laatste buis en meng.
    5. Vul ongeveer 2/3 van de eerste capillair met bindende mengsel van buis # 1, kantelen om de oplossing te verplaatsen naar het midden, en plaats het capillair op de capillaire lade om de positie # 1 (de dichtst mogelijke positie van de opening tray) . Herhaal deze stap met de rest haarvaten. Capillair uiteinden kunnen worden aangesloten met wax voor langere experimenten.
    6. Plaats de lade in de MST-instrument en de deur van het instrument te sluiten.
    7. Presteren "Zoek Haarvaten"commando te laten het instrument te vinden exacte posities van de haarvaten en meet de fluorescentie van de monsters.
    8. Op basis van de fluorescentie-intensiteit van het signaal, passen de LED-vermogen (10-100%) om het in 400-1,500 eenheden interval brengen.
    9. Klik op de knop "Start" om de thermophoresis experiment uit te voeren. Meer dan een IR-laservermogen kan het experiment worden gekozen om de optimale temperatuurgradiënt voor het specifieke systeem. Gegevensverzameling 2-3 runs voor dezelfde set van capillairen om de reproduceerbaarheid van metingen te garanderen. Het duurt 10-12 minuten om een ​​set van 16 capillairen lopen.

    7. Microschaal thermophoresis Data Analysis

    1. Open de Analysis software.
    2. Laad de projectmap. In het verschenen Information Run Viewer selecteren verzameld op een bepaald IR laservermogen thermophoretic bochten. Er is een optie van het openen van alle thermophoretic sporen onder verschillende omstandigheden, zoals IR-laser macht verzameld, LED-power, temperatuur, concentratie, etc. in een keer en dan te kiezen voor alle curves voor analyse door het inschakelen hen aan en uit (klik op de naam van het experiment).
    3. In de Evaluatie Points grafiek venster selecteert u de thermophoresis of thermophoresis met T-sprong. Zorgen dat blauwe en rode lijnen juist gepositioneerd zijn. Om de gemiddelde punten met standaarddeviaties te verkrijgen, selecteert u "Gemiddeld" of "Onderscheiden loopt" voor afzonderlijke runs.
    4. Om een ​​dissociatie constante pasvorm plot, selecteer "Gebruik Gemiddeld", voer en bevestig de gelabelde molecuul concentratie waarde (controleer de "concentratie" plein in een vlaag venster menu), en past de curve. De K D-waarde met zijn standaardafwijking verschijnt in een apart informatie pop-up venster. Om een ​​fit met Hill-methode plot, selecteer "Gemiddeld", Hill-methode, en dan past de curve. De EC 50 waarde affiniteit met standaardafwijking wordt in dit geval. Het kenmerk van KD of Hill "border" kan ook worden gebruikt bij verzadigingin een gebonden toestand niet wordt bereikt.
    5. Sla de gemiddelde fit data in een tekstbestand en overbrengen naar Excel.
    6. Plot F norm (genormaliseerde fluorescentie), AF norm (verschil in genormaliseerde fluorescentie als verschillende experimenten worden vergeleken) of gebonden fractie (zie onderstaande formule) als functie van de gemerkte (getitreerd) molecuul concentratie.

    Fraction Bound (fractie van moleculen in een complex) = (Therm (C)-gebonden) / (bound-gebonden), waarbij Therm (C) is thermophoresis gemeten voor de concentratie C, ongebonden is thermophoresis de ongebonden toestand (wanneer moleculen niet in een complex), en gebonden is thermophoresis voor het volledig gebonden toestand.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het meten van de affiniteit van de niet-gefosforyleerde STAT3 eiwit binding aan oligonucleotiden.

HEK293 cellen die STAT3-GFP werden gebruikt als een bron van fluorescent gelabelde STAT3 voor DNA-bindingstest. Cellysaten werden bereid met RIPA buffer (20x10 6 cellen / ml). Bij bindingsstudies werden de lysaten verdund 150x MST DNA-binding buffer om het optimale niveau van het fluorescente eiwit in de bindingsreactie (ongeveer 20 nM) verschaffen. Niet-getransfecteerde HEK293-cellen zijn gebruikt om achtergrond fluorescentie, die bleek niet detecteerbaar te zijn, zelfs in niet-verdunde lysaat evalueren. Echter, achtergrond fluorescentie groter in andere expressiesystemen zijn en moet derhalve worden gecontroleerd. Titratiereeks bestaande uit 11 binding mengsels en lysaat monster zonder het ligand zijn voorbereid. Elk monster bevatte 15 gl verdunde cellysaat en 15 gl oplossing van oligonucleotiden variërende CONCENTRATionen. Final buffersamenstelling inbegrepen 25 mM HEPES, pH 7,2, 50 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, en 0,025% NP-40. De metingen werden uitgevoerd in standaard behandeld haarvaten op Monoliet NT.115 instrument met 50% IR-laservermogen en LED excitatiebron met λ = 470 nm bij kamertemperatuur. Binding van sterk geladen oligonucleotiden in significante veranderingen in STAT3 mobiliteit temperatuurgradiënt (figuur 2). In figuur 3 wordt thermophoretic signaal uitgezet als functie van de concentratie oligonucleotide. Elk gegevenspunt vertegenwoordigt het gemiddelde van drie metingen. NanoTemper Analysis 1.2.20 software werd gebruikt om de gegevens te passen en de schijnbare Kd-waarden te bepalen. De schijnbare dissociatieconstanten waren 37,9 ± 1,0 uM en 23,3 ± 0,6 uM voor GAS en S 100, respectievelijk (figuur 4). Substitutie van A naar G geresulteerd in dramatische afname in affiniteit van S 100 mut # 1 (figuur 4), terwijl mutant S 100 mut # 2 toonde geen detecteerbare binding dus een bevestiging opeenvolging-selectieve binding van STAT3 naar S 100. Verrassend, S 100 sequenties weergegeven iets strakker binden dan GAS in drie metingen herhalingen.

Figuur 1
Figuur 1. Algemene opzet van het experiment. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 2
Figuur 2. Onverwerkte thermophoresis gegevens gegenereerd voor de interactie van GFP-STAT3 met AT-rijke oligonucleotide. Verwaterde cellysaat containi ng 20 nM GFP-STAT3 werd gemengd met toenemende hoeveelheden dubbelstrengs oligonucleotide (5'-AAAACAAAACGAAACAAACAAACTA) waardoor de gespecificeerde concentratie van het ligand. De gegevens werden verzameld bij 50% laservermogen en 100% LED.

Figuur 3
Figuur 3. Binding kromme gegenereerd door de NanoTemper 1.2.231 Analysis software. Genormaliseerde fluorescentie (warm fluorescentie / initiële fluorescentie) uitgezet als functie van de concentratie oligonucleotide. Het eiwit vertoont een toename in fluorescentie van de gebonden ten opzichte van de ongebonden toestand. De gegevens worden gemonteerd met behulp van de Heuvel vergelijking methode opgenomen in de NanoTemper Analysis software.

0541fig4highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50541/50541fig4.jpg "/>
Figuur 4. STAT3 binding aan oligonucleotiden met verschillende sequenties. Microschaal thermophoresis binding metingen van STAT3-GFP aan GAS (K D = 37,9 ± 1,0 uM), S 100 (K D = 23,3 ± 0,6 uM), S 100 mutant 1 (K D = 740 ± 21 uM), en S 100 mutant 2 (niet bindend). De STAT3-GFP-concentratie werd constant gehouden op ongeveer 20 nM en de concentratie van de oligonucleotiden varieerden 666-0,650 uM. Het verschil in genormaliseerde fluorescentie [‰] is uitgezet als een functie van de concentratie oligonucleotide en curven worden bevestigd met de werkwijze van de Hill NanoTemper Analysis software. Fout balken geven standaardfout van 3 metingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Eiwit expressie en zuivering is een omslachtige en dure stap, die echter noodzakelijk voor het bepalen van interactie "K D op meest gebruikelijke methode. Toepassing van MST maakt het vermijden eiwitreiniging dus aanzienlijk vereenvoudigen en te versnellen kwantitatieve karakterisering van interacties. Het presenteert bijzonder belangrijk voordeel bij moeilijk te drukken en te zuiveren eiwitten zoals membraaneiwitten en transcriptiefactoren.

De belangrijkste beperking en eisen van MST is de mogelijkheid om een ​​eiwit tot expressie als een fusie met groen fluorescent eiwit. De constructen voor de expressie van GFP-deel van humaan en muis gefuseerd eiwitten zijn in de handel verkrijgbaar. GFP-gefuseerde eiwitten worden ook veel gebruikt voor mensenhandel en degradatie studies, en dus kan dienen "dubbele plichten" in combinatie met MST studies.

Naast het ontbreken van de behoefte aan eiwit purification, zeer zuinig gebruik van alle reagentia en ongevoeligheid voor kleine variaties in buffersamenstellingen, MST biedt ook andere voordelen ten opzichte van traditionele methoden van K D vaststellingen. In tegenstelling tot oppervlakteplasmonresonantie, MST-gebaseerde experimenten in minder dan 2 uur, zodat voor de bepaling van K D in breder bereik en hebben geen last van het oppervlak immobilisatie artefacten. Zo konden we niet bepalen K D voor STAT3 binding aan oligonucleotiden door SPR, hoewel we behoorlijk bedrag hebben geïnvesteerd voor de aankoop van gezuiverde STAT3 eiwit. K D van de interactie te hoog was, hetgeen vaak het geval is voor transcriptiefactoren, en viel uit concentratiegebied SPR experiment.

Titratiecalorimetrie werkt alleen voor interacties die gepaard gaan met veranderingen in de enthalpie. Deze beperking sluit veel gevallen. Ondertussen, veranderingen in thermophoretic mobiliteit, hoewel niet veel verschillen in waarden voor different systemen komen voor meeste interacties. Een van de grootste voordelen van MST is dat het werkt in verschillende buffers en tolereert de aanwezigheid van detergentia, micellen en bicelles in het systeem. Deze eigenschap maakt het mogelijk toe te passen op membraaneiwitten die praktisch onmogelijk om te studeren op een andere manier zijn. Wel moet de voorzichtigheid gebruikt worden om de verschillen in wasmiddel en micellen inhoud en samenstelling voor het titreren van de ligand te voorkomen.

Ook moet in gedachten worden gehouden bij het gebruik van cel extracten die het bestuderen eiwit kan bestaan ​​in zijn natieve vorm, die vaak een complex met andere eiwitten, nucleïnezuren, en cofactoren. Zo kan bindingsaffiniteit verschillen van die voor een geïsoleerd eiwit niet betrokken bij complexe formaties. Overexpressie kan vaak titreren de interactiepartners terwijl de meeste moleculen van het te bestuderen eiwit in niet-gebonden toestand. Dit is een andere reden voor het proberen om achieve zeer hoge expressieniveaus van het GFP-eiwit gefuseerde cellen na transfectie. De andere parameter moeilijk control is posttranslationele modificaties dat ook aanzienlijke heterogeniteit aan het systeem toevoegen. Aanvullende beperking bestudeert binding aan eiwitten en kleine moleculen die in cellysaten in grote hoeveelheden of moleculen met brede specificiteit en lage affiniteit die kunnen interageren met meerdere proteïnen in het lysaat worden. Wienken, CJ, et al.. hebben aangetoond dat K D bepaald door MST in E. coli extract is meer dan een orde van grootte hoger dan in een buffer voor de interactie van interferon gamma met antilichamen 9. Het effect kan deels te wijten aan de proteolyse zijn geweest sinds het extract had geen proteaseremmers. Kleine molecule binding aan serum albumine bleek eveneens K D in interactie studies wijzigen MST 9.

De werkzaamheid van de winning kunnen ook verschillen voor different eiwitten afhankelijk intracellulaire lokalisatie en fysisch-chemische eigenschappen. Aldus is het nuttig om verschillende cellyse en eiwit extractieomstandigheden proberen. Voor cytoplasmatische eiwitten, gebruiken, wordt geen detergenten, enkel echografie voor celdisruptie produceert vaak zeer goede opbrengsten en data. Ondertussen membraaneiwitten behoefte aan uitgebreidere screening van extractieomstandigheden met verschillende concentraties en de aard van wasmiddelen, lipide micellen, of bicelles. Detergent inhoud moet minimum moet worden beperkt om te voorkomen dat het beïnvloeden bindingsaffiniteit.

Ondanks de genoemde beperkingen hebben wij gevonden MST studies van niet-gezuiverde GFP gefuseerde eiwitten zeer geschikt voor kwantificering van bindingsaffiniteiten voor veel eiwitten en types ligand. Er is geen twijfel dat een ruimer gebruik van de methode in veel laboratoria zal verdere verbreding van de toepassingen van MST-based eiwitbindingstudies.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen. De inhoud van deze publicatie geeft niet noodzakelijk de mening of het beleid van het ministerie van Volksgezondheid en Human Services, noch vermelding van handelsnamen, commerciële producten, of organisaties enkele wijze de goedkeuring door de Amerikaanse regering.

Acknowledgments

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Intramurale Research Program van de NIH, National Cancer Institute, Center for Cancer Research; Collaborative Research Overeenkomst tussen NCI en Calidris Therapeutics; American Cancer Society subsidie ​​IRG 97-152-17 om OT, en federale fondsen van de National Cancer Institute, NIH, onder contract HHSN26120080001E.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RIPA buffer Millipore 20-188 Other manufacturer's buffers work as well
Protease inhibitors cocktail Sigma-Aldrich P2714
Monolith NT.115 NanoTemper Technologies GmbH G008
Monolith NT.115 Capillary Tray NanoTemper Technologies GmbH T001
Monolith NT.115 Standard Treated Capillaries NanoTemper Technologies GmbH K002
NT Control software NanoTemper Technologies GmbH 2.0.2.29
NT Analysis software NanoTemper Technologies GmbH 1.4.27
Table-top refrigerated centrifuge Eppendorf 5417R Other microtube refrigerated centrifuges providing
Protein LoBind Tube 0.5 ml Eppendorf 22431064

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lea, W. A., Simeonov, A. Fluorescence polarization assays in small molecule screening. Expert. Opin. Drug Discov. 6, 17-32 (2011).
  2. Willander, M., Al-Hilli, S. Analysis of biomolecules using surface plasmons. Methods Mol. Biol. 544, 201-229 (2009).
  3. Hulme, E. C., Trevethick, M. A. Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation. Br. J. Pharmacol. 161, 1219-1237 (2010).
  4. Ghai, R., Falconer, R. J., Collins, B. M. Applications of isothermal titration calorimetry in pure and applied research--survey of the literature from 2010. J. Mol. Recognit. 25, 32-52 (2012).
  5. Vuignier, K., Schappler, J., Veuthey, J. L., Carrupt, P. A., Martel, S. Drug-protein binding: a critical review of analytical tools. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 398-3953 (2010).
  6. Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. Modern analytical ultracentrifugation in protein science: a tutorial review. Protein Sci. 11, 2067-2079 (2002).
  7. Duhr, S., Braun, D. Why molecules move along a temperature gradient. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 19678-19682 (2006).
  8. Zillner, K., Jerabek-Willemsen, M., et al. Microscale thermophoresis as a sensitive method to quantify protein: nucleic acid interactions in solution. Methods Mol. Biol. 815, 241-252 (2012).
  9. Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nat. Commun. 1, 100 (2010).
  10. Stark, G. R., Darnell, J. E. The JAK-STAT pathway at twenty. Immunity. 36, 503-514 (2012).
  11. Ehret, G. B., Reichenbach, P., et al. DNA binding specificity of different STAT proteins. Comparison of in vitro specificity with natural target sites. J. Biol. Chem. 276, 6675-6688 (2001).
  12. Yang, J., Stark, G. R. Roles of unphosphorylated STATs in signaling. Cell Res. 18, 443-451 (2008).
  13. Timofeeva, O. A., Chasovskikh, S., et al. Mechanisms of unphosphorylated STAT3 transcription factor binding to DNA. J. Biol. Chem. 287, 14192-14200 (2012).
  14. Timofeeva, O. A., Tarasova, N. I., et al. STAT3 suppresses transcription of proapoptotic genes in cancer cells with the involvement of its N-terminal domain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2013).
  15. Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. Fluorescent protein spectra. J. Cell Sci. 114, 837-838 (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics