Mikro Termoforosis tarafından Bağlama Affinity belirlenmesi Protein Saflaştırma-ücretsiz Yöntemi

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Mikro Termoforosis (MST) yaygın olarak hücre lizatlarından hedef proteinin arıtılmadan bağlanma afinitesinin belirlenmesinde kullanılabilir. Protokol, GFP-kaynaşık proteini, denatüre edici olmayan koşullar hücre parçalama ve ligand arasında değişen konsantrasyonlarda varlığında MST sinyalinin tespiti arasında aşırı içerir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Khavrutskii, L., Yeh, J., Timofeeva, O., Tarasov, S. G., Pritt, S., Stefanisko, K., Tarasova, N. Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis. J. Vis. Exp. (78), e50541, doi:10.3791/50541 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protein etkileşimleri kantitatif karakterizasyonu özellikle yaşam bilimleri, ilaç keşfi hemen her alanında gereklidir. K D tayin mevcut yöntemlerin çoğu zaman alıcı ve pahalı olabilir nesil olan ilgi protein, saflaştırılmış erişim gerektirir. Bu hücre lizatlarından hedef proteinin arıtılmadan mikro Termoforosis (MST) ile bağlanma afinitesinin belirlenmesine olanak sağlayan bir protokol geliştirmiştir. Yöntem, denatüre edici olmayan koşullar altında GFP kaynaşık protein ve hücre lisisinin aşırı içerir. STAT3-GFP yönteminin uygulanması geçici olarak ilk kez farklı dizileri ile oligonükleotidler için en iyi incelenmiş olan transkripsiyon faktörünün afinitesini belirlemek için izin HEK293 hücrelerinde ifade edilmiştir. Protokol basittir ve küçük moleküller, peptidler, DNA, RNA ile protein etkileşimleri çalışmak için uygulama çeşitli olabilir, ve proteins.

Introduction

Moleküller arası etkileşim yakınlık nicel karakterizasyonu biyomedikal araştırma birçok alanda önemlidir. Bağlama sabiti (Kd) ayrılma sadece ilaç keşfi değil, aynı zamanda gerekli olan herhangi bir biyolojik sistem herhangi bir ikili etkileşim karakterizasyonu önemli bir parametredir. Bu immunoprecipitation ve maya iki hibrit ekran gibi protein-protein etkileşimleri tespiti için kullanılan biyokimyasal yöntemler, yakınlık bu özel kompleks in vivo olarak verilen koşullar altında olup olmadığını tanımlar iken nasıl sıkı bu etkileşimler vardır bize haber yok. Ilaç keşfi işlemde, bağlanma tahlili geliştirilmesi gerekli ve sıklıkla en çok zaman tüketen aşamalar biridir. K D belirlenmesi En sık kullanılan yöntemler floresan polarizasyon, 1 yüzey plazmon rezonans (SPR) teknolojisi, 2 radyo-bağlama, 3 izotermal titrasyon kalorimetre, 4 equilibri dahilum diyaliz (ED), 5 ultrafiltrasyon (UF), 5 ve ultra-santrifüj (UC). 6 bunların tüm hedef saflaştırılmış proteinin önemli miktarlarda gerektirir. Mikro Termoforosis (MST) bir mikroskobik sıcaklık degrade moleküllerin yönelik hareketi algılayan hızla gelişen bir yöntemdir. Sıcaklık eğimi boyunca hareket göreli bir değişiklik biyomoleküllerin sonucu hidrasyon kabuk herhangi bir değişiklik. 7 MST bağlanma afiniteleri belirlemek için kullanılan ve bir hedef proteine ​​floresan ile etiketlenmiş proteinleri, ya da floresan ligandlarına ligand incelemek için uygulanmıştır. 8, 9 MST bir yüzeye immobilizasyon ihtiyacı (immobilizasyon-ücretsiz teknolojisi) doğrudan çözüm etkileşimleri ölçümü sağlar. Değişikliğin boyutunu önemli ölçüde sistemden sisteme farklı olmasına rağmen, pratik olarak herhangi bir bağlayıcı, MST sinyali bir değişiklik eşlik eder. MST tarafından molekülün hareket tespiti için, floresan gerekirnt. Yöntemin bu büyük sınırlama bir avantaj dönüştürülebilir. Bir protein herhangi bir sistem, bir GFP füzyon olarak ifade edilirse, bu tek flüoresan molekül olacak ve böylece hücre lizatı veya hücre içermeyen ekspresyon sisteminden izole edilmeden incelenebilir. Az eserler ile bağlama koşulları için izin hücre lizatları üretimi önemli bir sorundur. Burada birçok Çözünür ve zar proteinleri için kullanılabilir hücre lizatı hazırlanması ve MST deney bir protokol açıklamaktadır.

STAT proteinleri hücre dışı sinyallere yanıt olarak tirosin fosforilasyon ile aktif hale sitoplazmik transkripsiyon faktörleri gizli olan ve bağışıklık, hematopoiez, iltihaplanma, ve gelişme. Memelilerde 10 de dahil olmak üzere birçok biyolojik proseslerde yer alan, STAT etti STAT 1, 2, 3, 4 oluşmaktadır , 5A, 5B ve 6. Bütün aktif STAT aynı DNA sekansına bağlamak için bilinen, bu nedenle GAZ motifi olarak adlandırılan, IFN-gama sekansı aktifleştirildi. Bununla birlikte, transcriFarklı STAT bir ptional etkileri çok farklıdır. 11. birçok patolojik süreçler ve 17.000 yayınlar üzerinde verimli yoğun çalışmalar karışmakla rağmen, farklı DNA dizileri ile STAT etkileşimleri K D belirlenmemiştir. GAZ motifinin varyantlarına farklı durum arasında sadece göreli afinite karakterize edilmiştir. Protein ekspresyonu ve saflaştırılması, 11 güçlükler istatistik 'DNA bağlama seçicilik karakterizasyonu en önemli engeller vardır. Çalışmaların çoğunluğu Tyr-fosforile transkripsiyon faktörü için eş anlamlı hale geldi "aktif" STAT, transkripsiyon düzenlenmesi olmayan fosforile STAT (U-STAT) rolü rolü odaklanmış olmasına rağmen hızla ortaya çıkmaktadır. 12. Ancak, bu mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır, ve U-STAT aslında DNA bağlamak ya da diğer transkripsiyon faktörleri ile etkileşim yoluyla hareket kesin değildi vardır. Yakın zamanda U-STAT3 DNA istif bağlamak göstermiştirdaha yüksek afinite ile GAZ motifleri farklı ces. 13 bulgu bu önemli proteinin biyolojik fonksiyonları anlayışımızı için önemli etkileri vardır. Biz GAZ için STAT3 göreceli yakınlık belirlemek için mikro Termoforosis uygulanan ve AT-zengin oligonükleotid S +100 (Şekil 4) var. Hemen hemen aynı protokol farklı bir STAT3 ligandı bir lipopeptid inhibitör bağlanma için Kd tayini için kullanılmıştır. 14, negatif bir kontrol olarak kullanılmıştır ilgili bir transkripsiyon faktörü, GFP STAT1 bağlanma Resim böylece etkileşim seçiciliği teyit saptanabilir. 14

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Hücre lizatının hazırlanması

Bu protokol, bir GFP kaynaşık proteini ifade yapışık hücreler için tasarlanmıştır. Gerekli hücre sayısı protein ifade seviyesine bağlı olarak, gibi düşük bir çok 20 x 10 6 hücre 6 10 olarak değişebilir. Örneğin, HEK hücreleri eksprese GFP-STAT3 lizat 1 mL lizis tamponu ile% 70 yakın konfluent 10 T75 şişeleri içinde yetiştirilen hücreler muamele etmek suretiyle hazırlandı. Bununla birlikte, bu lizat MST deney için optimum seviyede floresan sağlamak üzere 150-kat sulandırılmış gerekiyordu. Hücre parçalama protokolü araştırılmaktadır özellikleri ve proteinin hücre içi lokalizasyonu kuvvetle bağlıdır. Deterjan kullanarak, çünkü protein istikrarsızlık istenmeyen ise, sonikasyon aşağıda açıklanan, en iyi seçenek olabilir. Farklı katkı maddeleri protein modifikasyonu reaksiyonları önlemek için lizis tamponu ilave edilebilir: EDTA fosforilasyon engeller, sodyum vanadat, böylece tirozin protein fosfatazlar inhibefenoksimetilpenisilin florür Ser / Thr fosfatazların bir inhibitörüdür.

  1. Lizis tamponu hazırlayın. Kolay elde sitoplazmik proteinler için aşağıdaki bileşime iyi çalışır: 25 mM Tris HCI, pH 8.0, ve proteaz inhibitörü kokteyl, 2 mM AEBSF, 0.3 uM aprotinin, 130 uM Bestatin, oluşan 100 kat (Sigma-Aldrich P2714, seyreltilmiş 1 mM EDTA, 14 uM E-64, 1 uM löpeptin). Alternatif olarak, daha az çözünür proteinler için, bir proteaz inhibitörleri kokteyli ve denatüre edici olmayan deterjan ile ticari RIPA tampon kullanabilir. Buz üzerinde tampon tutun.
  2. Buz gibi soğuk PBS T75 şişesi başına tampon 10 ml kullanarak kısa bir süre hücreleri yıkayın. 5 dakika buz üzerinde hücre tutmak kadar veya hücreler şişeden ayırma başlar. Gerekirse ayırmak için hücre kazıyıcı ile hücreleri kazıyın.
  3. 10 ml buz gibi soğuk PBS ile önceden soğutulmuş bir 14 ml'lik yuvarlak tabanlı bir santrifüj tüpüne transfer süspansiyon hücreleri.
  4. 4 de 400-600 x g'de santrifüj ile topak hücrelere ° C 5 dakika. Ben bu noktada birkaç matara hücreleri birleştirinf gerekli.
  5. Buz gibi soğuk lizis tamponu 200 ul PBS süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet kaldırmak, bir ön süspansiyon aktarılması 1.5 ml Eppendorf tüp soğutulmuş.
  6. Yerel aşırı ısınma en aza indirmek için buz üzerinde hücreleri tutun. Önceden soğutulmuş ucu 2-3 mm ile% 30 genlikte sonication 3x 10 sn bakliyat, hücreleri lyse. Yüzeyinin altında ucu frothing en aza indirmek için tutun. Bunun yerine 30 dakika boyunca buz üzerinde deterjan içeren tampon ve inkübe kullanılıyorsa bu adımı sayın.
  7. Fizyolojik tuz konsantrasyonu (100 mM NaCI) 5 M NaCI kullanılarak gerektiğinde içeren Lizat çözeltisi düzeltin.
  8. 10 dakika boyunca 4 ° C'de 26,000 x g'de santrifüj ile lizatları toplayın.
  9. Optimum seyreltme lizat (aşağıda Bölüm 3, açıklandığı gibi) ve bir titrasyon (önceden seyreltilmiş lizat tipik olarak yaklaşık 300 ul) için gerekli lizat miktarını belirler.
  10. Inceleme altındaki bir protein (-80 ° C, bir çok durumda) için uygun bir sıcaklıkta kısım lizat ve saklayın.
  11. </ Ol>

    2. MST Tampon seçimi ve hazırlanması

    1. Protein-ligand etkileşimleri tampon şartlarına bağlı olduğu için, MST, tampon bileşimi, belirli bir sistemin özelliklerine bağlı olarak seçilir. Bu, en az iki farklı tampon test etmek için genel olarak avantajlıdır.
    2. 2 5x MST tamponlar hazırlayın. Ve Tris HCI (250 mM Tris HCI, pH 7.4, 750 mM NaCI, 50 HEPES (, 25 mM MgCl2,, 500 mM NaCI,% 0.25 NP-40, 250 mM HEPES, pH 7.4): Bu iki bileşimler ile iyi deneyimleri mM MgCl2,% 0.05 Tween-20). BSA ilavesi (son bağlayıcı karışım 5%) plastik tüpler ve cam kılcal proteinlerin yapışmasını önlemeye yardımcı olabilir. NaN3 (0.5 mm) de mikroorganizmaların büyümesini engellemek için dahil edilebilir.

    3. Optimal Lizat Seyreltme Belirlenmesi

    1. Dalga boyu ile LED uyarma kaynağı seçin λ MST cihaz üzerinde = 470 nm.
    2. Ce ile kılcal Yük2 seyreltilmiş ve MST tamponu ile 10x ayıklamak edeceğiz.
    3. MST aletin Kontrol Yazılımı "Kılcal bul" işlemi gerçekleştirin. Sulandırılmış lizatında uygun floresan aralığı 400 ila 1500 floresans birimleri olup.

    4. Optimal Ligand Konsantrasyon aralığı belirlenmesi

    1. Ligandın en yüksek konsantrasyon beklenen ayrışma sabiti en az 20x daha yüksek olmalıdır.
    2. Düşük ligand konsantrasyonunun floresan protein molar konsantrasyonundan daha düşük olmalıdır.

    Ligand konsantrasyon aralığı tahmini için NanoTemper Teknolojileri Konsantrasyon Bulucu aracı bakın.

    5. Hücre lisatı ve ligand çözeltiler hazırlanması

    1. Buz üzerinde 0.5 ml LoBind santrifüj tüpleri gerekli bir dizi (genellikle 10-16) ile bir tüp raf yerleştirin. Her bir tüpün alt MST tampon pipetle 25 ul. Birinci küvet ligand stok solüsyonu 25 ul ekleE (# 1, ligandı en yüksek konsantrasyon) ve tüp dinlenme kullanarak ligandın iki kat seri seyreltme gerçekleştirin. Buz üzerinde ligand örnekleri ile raf tutun.
    2. Çözülme hücre buz üzerinde yavaşça lizat.
    3. Bağlama reaksiyonlarında floresan hedef proteinin optimum seviyesini sağlamak için MST tampon maddesi ile hücre lizatı seyreltin. Nihai protein konsantrasyonu tahmin Kd veya daha düşük yakın olmalıdır. Bu nihai çözüm floresan sayıları gerekli olan sayı elde etmek için ayarlanmalıdır. Lizat GFP-STAT3 konsantrasyonunun belirlenmesi için, alet floresein bir yardımı ile kalibre edildi. Lizattaki GFP molar konsantrasyonu sırasıyla floresein ve EGFP kuantum verimleri, 0.85 ve 0.61 oranı ile tespit edildi. 15

    6. Mikro Termoforosis Bağlama Çalışmaları

    1. MST cihaz üzerinde λ = 470 nm ile LED uyarma kaynağını seçin.
    2. T yerleştirin 0.5 ml LoBind tüplerligand seri seyreltme örnekleri ile tüpler karşısında ube raf. Dikkatle Her tüpün alt hücre lizatı 15 ul ekle. Örnek kaybını önlemek için tüp duvarları dokunmamaya gayret edin.
    3. Hücre lizatı ile ilgili tüp en yüksek konsantrasyonu (# 1) # 1 ile ligandın Örnek 15 ul ekle. İyice karıştırın ve bir pipet değiştirin. Ligand içermelidir sonuncusu hariç tüplerin geri kalanı ile bu adımı tekrar edin.
    4. Son tüp MST tampon 15 ul ekleyin ve iyice karıştırın.
    5. Tüp # 1 bağlayıcı karışımı ile yaklaşık 2/3 ilk kılcal doldurun, bu merkeze doğru çözüm taşımak için eğin, ve (tepsi açılış en yakın konumu) pozisyon # 1 kılcal tepsiye kılcal yerleştirin . Geri kalanı kılcal ile bu adımı yineleyin. Kılcal biter uzun deneyler için balmumu ile takılabilir.
    6. MST araç içindeki tepsi yerleştirin ve cihazın kapağını kapatın.
    7. "Kılcal Bul" gerçekleştirkomutu alet kılcal damarların tam pozisyon bulmak ve örneklerin floresan ölçmek izin.
    8. Floresan sinyal yoğunluğuna göre, 400-1,500 birimleri aralığı haline getirmek için LED güç (% 10-100 itibaren) ayarlayın.
    9. Termoforosis deney gerçekleştirmek için "Başlat" düğmesini tıklayın. Birden fazla kızılötesi lazer güç belirli bir sistem için optimal sıcaklık gradyanı bulmak için deney için seçilebilir. Ölçümlerin tekrarlanabilirliği sağlamak için kılcal damarların aynı seti 2-3 çalışır veri toplamak. Bu 16 kılcal damarların bir set çalıştırmak için 10-12 dakika sürer.

    7. Mikro Termoforosis Veri Analizi

    1. Analiz yazılımını açın.
    2. Proje klasörü yükleyin. Ortaya Bilgi Çalıştır Görüntüleyici seçtiğiniz belirli bir IR lazer güç thermophoretic eğrileri toplanan. Bu IR lazer gücü gibi çeşitli koşullar altında toplanan tüm thermophoretic izleri açma bir seçenek vardır, s LEDOver, sıcaklık, konsantrasyon, vb. az bir kez ve daha sonra onlara ve kapatarak analiz için herhangi bir eğrileri seçerek (deney adı tıklayın).
    3. Değerlendirme Puan grafik penceresinde, T-atlama ile Termoforosis veya Termoforosis seçin. Mavi ve kırmızı çizgiler doğru konumda olduğundan emin olun. Standart sapma ile ortalama puan alma, seçme "Ortalama Kullanım" veya ayrı çalışan için "ayırt çalışır".
    4. Bir ayrışma sabit uygun arsa, etiketli molekül konsantrasyonu değeri (bir uyum pencere menüsündeki "konsantrasyon" kare kontrol) girin ve düzeltmek, "Ortalama Kullanım" seçin ve eğri uygun. Standart sapma ile K D değeri ayrı bir bilgi pop-up penceresi görünür. Tepesi yöntemi kullanarak bir uyum çizmek için, Hill yöntemi "ortalama" seçin ve sonra eğri uygun. Standart sapma ile EC 50 benzerlik değeri, bu durumda gösterilmiştir. Zaman doygunluk K D veya Tepesi "sınır" özelliği de kullanılabilirBir bağlı durumda ulaşmış değildir.
    5. Bir metin dosyasına ortalama uyum verileri kaydetmek ve Excel'e aktarmak.
    6. Arsa F normu (normalleştirilmiş floresan), mesafe kadar taşınmış normuna (farklı deney karşılaştırılırsa normalleştirilmiş floresan fark), ya da bir kısmı, etiketsiz (titre) molekül konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak (bakınız, aşağıdaki formül) bağlanmıştır.

    Fraksiyon (karmaşık bir molekül fraksiyonu) = (Therm, (C)-serbest) / (ilişkili-bağlı olmayan), termal (C) konsantrasyonu C ölçülen Termoforosis olduğu, Bound bağlanmamış (moleküller olduğunda ilişkisiz bir durum için olan Termoforosis bir karmaşık) ve bağlı tamamen bağlı devlet için Termoforosis olduğunu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Oligonükleotidler için bağlayıcı olmayan fosforile STAT3 protein afinitesi ölçülmesi.

STAT3-GFP eksprese eden HEK293 hücreleri DNA bağlama deneyi için floresan etiketli STAT3 kaynağı olarak kullanılmıştır. Hücre lizatları RIPA tamponu (20x10 6 hücre / ml) kullanılarak hazırlandı. Bağlama çalışmaları için, lizatları bağlanma reaksiyonu (20 nM) 'de floresan protein en uygun düzeyde sağlamak için MST DNA bağlayıcı tampon maddesi ile 150x seyreltilmiştir. Sigara transfekte HEK293 hücreleri bile olmayan seyreltilmiş lizat olmayan tespit olduğu ortaya çıktı eşiğe, değerlendirmek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, arka plan flüoresan diğer ekspresyon sistemlerinde daha önemli olabilir ve bu nedenle takip edilmesi vardır. Bağ olmadan 11 bağlayıcı karışımları ve lizat örnek oluşan titrasyonu seri hazırlanmıştır. Her bir numune, seyreltilmiş hücre lizatı 15 ul ve konsantratı değişen oligonükleotid çözümleri içeren 15 uliyonları. 50 mM NaCI;, 2.5 mM MgCl2 ve% 0.025 NP-40 içinde son tampon karışım 25 mM HEPES, pH 7.2 içeriyordu. Ölçümler ortam sıcaklığında λ = 470 nm IR-lazer gücü ve LED uyarma kaynağı% 50 ile Monolith NT.115 cihaz üzerinde standart tedavi kılcal alınmıştır. Yüksek gerilimli bir oligonükleotid bağlayıcı bir sıcaklık gradyanı içinde STAT3 hareket önemli değişiklikler (Şekil 2) ile sonuçlanmıştır. Şekil 3'te, thermophoretic sinyal oligonükleotid konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak çizilmiştir. Her bir veri noktası üç ölçümün ortalamasını temsil eder. NanoTemper Analiz 1.2.20 yazılım verileri uyacak şekilde ve belirgin Kd değerlerini belirlemek için kullanıldı. Belirgin ayrışma sabitleri 37.9 idi ± 1.0 mcM ve 23.3 ± sırasıyla GAZ ve S +100, için 0.6 mcM (Şekil 4). A-ile-G ikame, S 100 Mut # 1 (bkz. Şekil 4) afinitesinde dramatik bir azalma ile sonuçlandı ise mutant S 100 mut 2. S +100 STAT3 tespit edilebilir bir bağlayıcı ve böylece teyit dizi-seçici bağlayıcı göstermiştir. Şaşırtıcı bir şekilde, S 100 dizileri Üç ölçü tekrarlarında GAZ biraz daha sıkı bağlanan gösterilir.

Şekil 1
Şekil 1. Deney genel şeması. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 2,
Şekil 2. AT açısından zengin bir oligonükleotid ile GFP STAT3 etkileşim için oluşturulan işlenmemiş veri Termoforosis. Seyreltilmiş hücre lizatı containi ng, 20 nM GFP STAT3 ligandın belirtilen konsantrasyonları elde edilmiştir çift sarmallı oligonükleotit, artan miktarlarda (5'-AAAACAAAACGAAACAAACAAACTA) ile karıştırıldı. Veriler% 50 lazer gücü toplanan ve% 100 LED edildi.

Şekil 3,
Şekil 3,. Bağlanma eğrisi NanoTemper 1.2.231 Analiz yazılımı tarafından oluşturulur. Floresan Normalize (sıcak başlangıç ​​/ floresan floresan) oligonükleotid konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak çizilmiştir. Protein ilişkisiz duruma göre bağlı olarak floresansında bir artış göstermektedir. Veriler NanoTemper Analysis yazılımı dahil Tepesi denklem metodu ile monte edilir.

0541fig4highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50541/50541fig4.jpg "/>
Şekil 4. GAZ için STAT3-GFP STAT3 farklı dizileri ile oligonükleotidler için bağlayıcı. Mikro Termoforosis bağlayıcı ölçümleri (K D = 37.9 ± 1.0 mcM), S +100 (K D = 23.3 ± 0.6 mcM), S +100 mutant 1 (K D = 740 ± 21 mcM), ve S +100 mutant 2 (bağlayıcı). STAT3-GFP konsantrasyonu yaklaşık 20 nM 'de sabit tutulur, ve oligonükleotid konsantrasyonu 666 0.650 uM arasında değişmiştir. Normalleştirilmiş floresan arasındaki fark [‰] oligonükleotid konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak çizilmiştir ve eğrilerin NanoTemper Analysis yazılımı kullanılarak Hill yöntemine donatılmıştır. Hata çubukları, 3 ölçümün standart hata temsil eder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protein ekspresyonu ve saflaştırılması, ancak, en güncel olarak kullanılan yöntem ile etkileşimleri "Kd belirlenmesi için gerekli olan bir zahmetli ve pahalı bir adımdır. MST uygulanması önemli ölçüde etkileşimlerinin kantitatif karakterizasyonu basitleştirilmesi ve hızlandırılması böylece protein saflaştırma kaçınarak sağlar. Bu tür bir zar proteinleri ve transkripsiyon faktörleri olarak zor olan açıklama ve saflaştırmak proteinler durumunda, özellikle önemli bir avantaj sunar.

MST en önemli sınırlama ve gereksinimi yeşil flüoresan protein ile bir füzyon olarak bir protein ifade yeteneğidir. Bununla birlikte, GFP ile birleştirilen insan ve fare proteinlerin çoğunluğu sentezlenmesi için yapıları ticari olarak mevcuttur. GFP-kaynaşık proteinler de yaygın olarak ticareti ve bozulması çalışmaları için kullanılır ve bu nedenle MST çalışmaları ile kombinasyon halinde "çift görev" hizmet edebilir.

Protein p gerek eksikliği ek olarakK D tespitler geleneksel yöntemlerle karşılaştırıldığında tüm reaktifler ve tampon kompozisyonlarda küçük farklılıklar için duyarsızlık urification, çok ekonomik kullanımı, MST diğer avantajlar sunmaktadır. Yüzey plazmon rezonans aksine, MST-tabanlı deneyler, en az 2 saat almak daha geniş K D tespitine imkan ve yüzey immobilizasyon eserler muzdarip yok. Biz STAT3 saflaştırılmış protein satın alma için fon önemli miktarda yatırım yaptık rağmen Örneğin, biz, SPR tarafından oligonükleotidler için STAT3 bağlama için K D belirleyemedi. Etkileşim K D sık transkripsiyon faktörleri için geçerli olan, çok yüksek oldu, ve SPR deney en konsantrasyon aralığı dışına düştü.

Titrasyon kalorimetre entalpi değişiklikler eşlik eder etkileşimleri için çalışır. Bu sınırlama, birçok durumda dışlar. Bu arada, thermophoretic hareketlilik değişiklikler, di için değerleri bir çok farklı her ne kadarfferent sistemleri, etkileşimlerin büyük çoğunluğu için oluşur. MST en büyük avantajlarından biri, bu şekilde çeşitli geçici bellekleri çalışır ve deterjan, miselleri, ve sistem içerisinde varlığı bicelles tolere olmasıdır. Bu özellik başka yollarla incelemek neredeyse imkansız olan membran proteinleri uygulayarak sağlar. Bununla birlikte, dikkatli bir bağ ile titrasyon sırasında deterjan ve misel içeriği ve bileşim içinde varyasyonları önlemek için kullanılmalıdır.

Çalışılan protein sıklıkla başka proteinler, nükleik asitler, kofaktörler ve bir kompleks doğal şeklinde, varolabileceği hücre ekstreleri kullanılarak zaman de göz önünde tutulmalıdır. Dolayısıyla, bağlanma afinitesi, karmaşık oluşumları karışmayan izole edilmiş bir protein için bu farklı olabilir. Aşırı sık bağlı olmayan durumda çalışılan protein moleküllerinin en bırakarak bir etkileşim ortakları titre sağlar. Bu achie çalıştığınız için bir başka nedendirhücrelerin transfeksiyonu üzerine GFP-kaynaşık proteininin çok yüksek seviyelerini ifade ettik. Diğer sert-to-kontrol parametresi de sisteme önemli heterojen ekleyebilirsiniz posttranslasyonel değişiklikler olduğunu. Ek bir kısıtlama proteinler ve geniş özellik ve lizat, mevcut çok protein ile etkileşim düşük afinite ile büyük miktarlarda veya moleküller hücre lizatları içinde mevcut olan küçük moleküllere bağlanma devam etmektedir. Wienken, CJ, et al. Kd E. MST belirlenir bulduk coli ekstresi antikorlar 9 ile interferon gamma etkileşim için bir tampon daha yüksek büyüklükte bir sipariş daha fazla oldu. Özü hiçbir proteaz inhibitörleri beri etkisi proteolizi kısmen bağlı olabilir. Serum albumin bağlanma küçük molekülü de MST 9 etkileşimler çalışmalarda Kd değiştirme için bulunmuştur.

Ekstraksiyon etkinliği de differe için farklı olabilirhücre içi lokalizasyonu ve fiziko-kimyasal özelliklerine göre nt proteinler. Bu nedenle, çeşitli hücre lizisi ve ekstraksiyon koşulları denemek için yararlıdır. Sitoplazmik proteinleri için, hiçbir deterjan kullanarak, hücre bozulması için sadece ultrason sık sık çok iyi verim ve veri üretir. Öte yandan, membran proteinleri değişik konsantrasyonlarda ve deterjan, lipit miseller veya bicelles doğası ile ekstre koşullarının daha kapsamlı bir eleme gerektirir. Deterjan içeriği bağlanma afinitesi etkileyen önlemek için minimumda tutulmalıdır.

Listelenen sınırlamaları rağmen, biz olmayan saflaştırılmış GFP-erimiş proteinlerin MST çalışmaları birçok protein ve ligand türleri için bağlayıcı yakınlık kantitatif için çok uygun olduğunu gördüm. Birçok laboratuvarda yöntemin daha geniş kullanımı daha da MST-bazlı protein bağlanma çalışmaları alanlarını genişletmek sağlayacak şüphe yoktur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim. Bu yayının içeriği mutlaka Sağlık ve İnsan Hizmetleri Departmanı görüş ve politikalarını yansıtmamaktadır, ne de ticari isimler, ticari ürünler, veya kuruluşların söz ABD Hükümeti tarafından onaylandığı anlamına gelmez.

Acknowledgments

Gelen ve federal fonların, NCI ve Calidris Tedavi arasındaki işbirliği araştırma Anlaşma,, OT için Amerikan Kanser Derneği hibe IRG 97-152-17 Bu çalışma kısmen NIH, Ulusal Kanser Enstitüsü, Kanser Araştırma Merkezi İntramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir sözleşme HHSN26120080001E altında Ulusal Kanser Enstitüsü, NIH,.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RIPA buffer Millipore 20-188 Other manufacturer's buffers work as well
Protease inhibitors cocktail Sigma-Aldrich P2714
Monolith NT.115 NanoTemper Technologies GmbH G008
Monolith NT.115 Capillary Tray NanoTemper Technologies GmbH T001
Monolith NT.115 Standard Treated Capillaries NanoTemper Technologies GmbH K002
NT Control software NanoTemper Technologies GmbH 2.0.2.29
NT Analysis software NanoTemper Technologies GmbH 1.4.27
Table-top refrigerated centrifuge Eppendorf 5417R Other microtube refrigerated centrifuges providing
Protein LoBind Tube 0.5 ml Eppendorf 22431064

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lea, W. A., Simeonov, A. Fluorescence polarization assays in small molecule screening. Expert. Opin. Drug Discov. 6, 17-32 (2011).
  2. Willander, M., Al-Hilli, S. Analysis of biomolecules using surface plasmons. Methods Mol. Biol. 544, 201-229 (2009).
  3. Hulme, E. C., Trevethick, M. A. Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation. Br. J. Pharmacol. 161, 1219-1237 (2010).
  4. Ghai, R., Falconer, R. J., Collins, B. M. Applications of isothermal titration calorimetry in pure and applied research--survey of the literature from 2010. J. Mol. Recognit. 25, 32-52 (2012).
  5. Vuignier, K., Schappler, J., Veuthey, J. L., Carrupt, P. A., Martel, S. Drug-protein binding: a critical review of analytical tools. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 398-3953 (2010).
  6. Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. Modern analytical ultracentrifugation in protein science: a tutorial review. Protein Sci. 11, 2067-2079 (2002).
  7. Duhr, S., Braun, D. Why molecules move along a temperature gradient. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 19678-19682 (2006).
  8. Zillner, K., Jerabek-Willemsen, M., et al. Microscale thermophoresis as a sensitive method to quantify protein: nucleic acid interactions in solution. Methods Mol. Biol. 815, 241-252 (2012).
  9. Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nat. Commun. 1, 100 (2010).
  10. Stark, G. R., Darnell, J. E. The JAK-STAT pathway at twenty. Immunity. 36, 503-514 (2012).
  11. Ehret, G. B., Reichenbach, P., et al. DNA binding specificity of different STAT proteins. Comparison of in vitro specificity with natural target sites. J. Biol. Chem. 276, 6675-6688 (2001).
  12. Yang, J., Stark, G. R. Roles of unphosphorylated STATs in signaling. Cell Res. 18, 443-451 (2008).
  13. Timofeeva, O. A., Chasovskikh, S., et al. Mechanisms of unphosphorylated STAT3 transcription factor binding to DNA. J. Biol. Chem. 287, 14192-14200 (2012).
  14. Timofeeva, O. A., Tarasova, N. I., et al. STAT3 suppresses transcription of proapoptotic genes in cancer cells with the involvement of its N-terminal domain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2013).
  15. Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. Fluorescent protein spectra. J. Cell Sci. 114, 837-838 (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics