लिविंग खमीर कोशिकाओं में Mitochondrial रिडॉक्स राज्य और एटीपी उपाय है कि ratiometric Biosensors

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Bioengineering

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Summary

हम रह खमीर कोशिकाओं में subcellular संकल्प पर मितोचोन्द्रिअल redox राज्य और एटीपी के स्तर पर नजर रखने के लिए, GFP के आधार पर कर रहे हैं जो दो ratiometric, आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग, biosensors के उपयोग का वर्णन.

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Vevea, J. D., Alessi Wolken, D. M., Swayne, T. C., White, A. B., Pon, L. A. Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells. J. Vis. Exp. (77), e50633, doi:10.3791/50633 (2013).

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Abstract

Mitochondria ऊर्जा चयापचय और सेलुलर उम्र और क्रमादेशित कोशिका मृत्यु का नियंत्रण करने के लिए कैल्शियम homeostasis से, कई सेलुलर प्रक्रियाओं में भूमिका है. इन प्रक्रियाओं को प्रभावित और के redox स्थिति और माइटोकांड्रिया द्वारा एटीपी उत्पादन से प्रभावित हैं. यहाँ, हम खमीर जीवित कोशिकाओं में subcellular संकल्प पर मितोचोन्द्रिअल redox राज्य और एटीपी के स्तर का पता लगा सकते हैं कि दो ratiometric, आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग biosensors के उपयोग का वर्णन. Mitochondrial रेडोक्स राज्य मितोचोन्द्रिअल मैट्रिक्स करने का लक्ष्य है कि redox के प्रति संवेदनशील हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (roGFP) का उपयोग कर मापा जाता है. मिटो-roGFP बदले में प्रोटीन की उत्तेजना स्पेक्ट्रम बदल जो प्रतिवर्ती और पर्यावरण पर निर्भर ऑक्सीकरण और कमी, गुजरना जो पदों 147 और GFP की 204, पर cysteines होता है. MitGO-ATeam एफ की ε सबयूनिट एफ 1-एटीपी synthase के बीच sandwiched है जिसमें एक Forster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) जांच है दाता और स्वीकर्ता fluo झल्लाहटrescent प्रोटीन. लाने कि प्रोटीन में रचना परिवर्तन में ε सबयूनिट परिणाम को एटीपी के बंधन करीब निकटता में दाता और स्वीकर्ता झल्लाहट और दाता से स्वीकर्ता प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण के लिए अनुमति देते हैं.

Introduction

माइटोकॉन्ड्रिया अमीनो एसिड, फैटी एसिड, हीम, लोहे सल्फर समूहों और pyrimidines की एटीपी उत्पादन, जैव संश्लेषण के लिए आवश्यक organelles के हैं. माइटोकॉन्ड्रिया भी कैल्शियम homeostasis में निर्णायक भूमिका निभाते हैं, और apoptosis के नियमन में. पार्किंसंस रोग, अल्जाइमर रोग, amyotrophic पार्श्व काठिन्य, और Huntington रोग सहित उम्र बढ़ने और उम्र से संबंधित बीमारियों के लिए माइटोकांड्रिया 1 बढ़ाने सबूत लिंक. 2 व्यक्तियों के साथ अपनी पूरी जिंदगी रहते हैं neurodegenerative रोगों के साथ जुड़े रहे हैं कि mitochondrial प्रोटीन में उत्परिवर्तन, रोग के लक्षण केवल बाद के जीवन में होते हैं. यह परिवर्तन है कि उभरने की विकृति रोग की अनुमति है कि उम्र के साथ माइटोकॉन्ड्रिया में होने का संकेत है. दरअसल, मितोचोन्द्रिअल फिटनेस समग्र सेल स्वास्थ्य और उम्र खमीर में और स्तनधारी कोशिकाओं के साथ जोड़ा जाता है. यहाँ 3,4, हम mitoc के दो महत्वपूर्ण सुविधाओं का आकलन करने के लिए आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग, ratiometric फ्लोरोसेंट biosensors के उपयोग करने के लिए कैसे का वर्णनखमीर कोशिकाओं में रहने वाले hondria: redox राज्य और एटीपी के स्तर.

एरोबिक ऊर्जा जुटाने में mitochondrial समारोह अच्छी तरह से स्थापित है. Mitochondrial रेडोक्स राज्य NAD + / NADH, धुनी / FADH 2, NADP + / NADPH, ग्लूटाथैऑन / ग्लूटाथैऑन डाइसल्फ़ाइड (GSH / GSSG) और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) सहित, organelle में प्रजातियों को कम करने और ऑक्सीकरण का एक उत्पाद है. माइटोकांड्रिया या हाइपोक्सिया uncoupling mitochondrial श्वसन गतिविधि को प्रभावित करता है और NAD के अनुपात + organelle में NADH को परिवर्तित कर देता है. भीतरी mitochondrial झिल्ली में इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला के परिसरों, साथ ही amines के deamination से बाहरी mitochondrial झिल्ली में monoamine oxidase के माध्यम से 5, नुकसान लिपिड, प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड के बीच अक्षम इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण से उत्पादित कर रहे हैं और जो आरओएस, 6,7,8 उम्र बढ़ने और उम्र जुड़े neurodegenerative रोगों से जोड़ा गया. आरओएस भी मीटर में संकेत पारगमन में एक भूमिका निभाitochondria, GSH के ऑक्सीकरण के माध्यम से. उदाहरण के लिए, NADH डिहाइड्रोजनेज आरओएस उत्पादन के लिए योगदान नहीं बल्कि ग्लूटाथैऑन पूल 9,10 के साथ बातचीत के माध्यम से नियंत्रित किया जाता है. α-ketoglutarate डिहाइड्रोजनेज और aconitase, TCA चक्र के घटकों, वातावरण 11,12 ऑक्सीकरण में कम गतिविधि दिखा रहे हैं.

दरअसल, aconitase गतिविधि के redox पर निर्भर विनियमन बैक्टीरिया से स्तनधारियों 13,14 के लिए संरक्षित है. इस प्रकार, redox राज्य और mitochondria की एटीपी स्तर की निगरानी रोग विकृति विज्ञान में उनके कार्य और भूमिका को समझने के लिए महत्वपूर्ण है.

बायोकेमिकल तरीकों रेडोक्स राज्य या पूरे कोशिकाओं के एटीपी के स्तर का आकलन किया या माइटोकांड्रिया पृथक किया गया है. पूरे कोशिकाओं या के redox स्थिति का आकलन करने के लिए व्यापक रूप से इस्तेमाल के तरीकों माइटोकांड्रिया पृथक रेडोक्स जोड़ी GSH / GSSG 15 के स्तर को मापने पर आधारित हैं. luciferin-luciferase प्रणाली सामान्यतः मितोचोन्द्रिअल को मापने के लिए प्रयोग किया जाता हैमाइटोकॉन्ड्रिया permeabilized पूरे कोशिकाओं या अलग से किसी में एटीपी के स्तर. 16,17,18,19,20 इस परख में, luciferase राशि के लिए आनुपातिक है एटीपी को बांधता है और के ऑक्सीकरण और luciferin से chemiluminescence catalyzes. 21 उत्सर्जित प्रकाश की तीव्रता प्रतिक्रिया मिश्रण में एटीपी. 22 की

इन तरीकों में अल्जाइमर रोग जैसे neurodegenerative रोगों के साथ रोगियों असामान्य रूप से कम एटीपी स्तर है कि खोजने सहित mitochondrial समारोह, के बारे में बुनियादी जानकारी से पता चला है. 23 हालांकि, वे छवि रहते हैं, कोशिकाओं बरकरार करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता. इसके अलावा, पूरे सेल विश्लेषण पर आधारित विधियों रेडोक्स राज्य या सेल के सभी डिब्बों में एटीपी के स्तर के एक औसत प्रदान करते हैं. मितोचोन्द्रिअल रेडोक्स राज्य या एटीपी के स्तर subcellular fractionation के दौरान बदल सकते हैं क्योंकि अलग organelles में माप संभावित समस्याग्रस्त हैं. अंत में, हमारी प्रयोगशाला और दूसरों से हाल के अध्ययनों से संकेत मिलता है किव्यक्ति की कोशिकाओं के भीतर माइटोकांड्रिया बदले में मां और बेटी की कोशिकाओं के जीवन को प्रभावित करता है, जो समारोह में विषम हैं. 3 प्रकार, subcellular संकल्प के साथ जीवित कोशिकाओं में mitochondrial एटीपी स्तर और रेडोक्स राज्य उपाय करने की जरूरत है.

दोनों GFP के आधार पर कर रहे हैं mitochondrial समारोह के लिए biosensors यहाँ वर्णित है. Redox के प्रति संवेदनशील GFP (roGFP) 24,25 सतह उजागर cysteines अणु को जोड़ रहे हैं, जिसमें एक GFP संस्करण है. roGFP, जंगली प्रकार GFP की तरह, दो उत्तेजना चोटियों (~ 400 एनएम और ~ 480 एनएम) और ~ 510 एनएम पर एक उत्सर्जन चोटी है. ~ 400 एनएम पर उत्तेजना में वृद्धि में roGFP परिणामों में सिस्टीन अवशेषों के ऑक्सीकरण. उन cysteines की कमी ~ 480 एनएम उत्तेजना पक्ष में है. इस प्रकार, 480 एनएम और 400 एनएम पर roGFP की उत्तेजना पर 510 एनएम उत्सर्जन का अनुपात फ्लोरोफोरे के वातावरण के redox स्थिति को दर्शाता है जो कम और ऑक्सीकरण roGFP, के रिश्तेदार राशि का पता चलता है.

दो versroGFP के आयनों व्यापक रूप से इस्तेमाल कर रहे हैं: roGFP1 और roGFP2. दोनों ही सिस्टीन सम्मिलन होते हैं. roGFP1 जंगली प्रकार GFP पर आधारित है और roGFP2 wtGFP 24 की तुलना में 400 एनएम पर 480 एनएम और कम कुशल उत्तेजना में अधिक कुशल उत्तेजना है जो S65T GFP, पर आधारित है. roGFP1 roGFP2 और इसके गतिशील रेंज कम रेंज में आगे फैली से संवेदनशील कम पीएच है. इस प्रकार, roGFP1 अधिक कम करने में इस तरह के माइटोकॉन्ड्रिया के डिब्बों या साइटोसॉल, और इस तरह के endosomes के रूप में चर पीएच, के साथ डिब्बों की निगरानी के लिए और अधिक उपयोगी हो सकता है. roGFP2 उज्जवल संकेत और, कुछ अध्ययनों में, roGFP1 24,26 से अधिक गतिशील रेंज प्रदान करता है. Arabidopsis thaliana में अध्ययन redox राज्य में परिवर्तन करने के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए आवश्यक समय दोनों सेंसर (टी साढ़े ऑक्सीकरण के लिए, 65 और 95 सेकंड और टी साढ़े क्रमशः roGFP1 और roGFP2 के लिए कमी, 272 और 206 सेकंड,, के लिए) के लिए इसी तरह की है कि संकेत मिलता है. 26

MitGO-ATeam2 एक न्यूनतम इनवेसिव, विश्वसनीय हैनवोदित खमीर में mitochondrial एटीपी उपायों कि सेंसर. जाओ ATeam दाता और स्वीकर्ता फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP और नारंगी (OFP) प्रोटीन फ्लोरोसेंट, क्रमशः) झल्लाहट एफ के बीच sandwiched एफ 1-एटीपी synthase ε सबयूनिट के होते हैं कि एक Forster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) जांच है. 27 लाने कि प्रोटीन में गठनात्मक परिवर्तन में ε सबयूनिट परिणाम को एटीपी के बंधन स्वीकर्ता के पास दाता झल्लाहट और दाता से स्वीकर्ता करने के लिए ऊर्जा के स्थानांतरण के लिए अनुमति देते हैं. जाओ ATeam, जाओ ATeam1 और जाओ ATeam2 के दो वेरिएंट हैं. जाओ ATeam2 आम तौर पर कम माइटोकांड्रिया में cytosol की तुलना [एटीपी]. 27 को मापने के लिए यह अधिक उपयुक्त बनाने, जाओ ATeam1 से MgATP के लिए एक उच्च संबंध है

मितोचोन्द्रिअल रेडोक्स राज्य की जांच के लिए हमने एक ATP9 नेता अनुक्रम के लिए जुड़े हुए roGFP1 से मिलकर एक संलयन प्रोटीन (मिटो-roGFP1) का निर्माणएन डी मजबूत glyceraldehyde-3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज (GPD) प्रमोटर (p416GPD, Addgene) के नियंत्रण में प्लाज्मिड एक गुणसूत्रबिंदु आधारित (कम प्रतिलिपि संख्या) खमीर अभिव्यक्ति से व्यक्त की. हम मॉडल कवक Saccharomyces cerevisiae की उम्र बढ़ने के संदर्भ में माइटोकॉन्ड्रिया के redox स्थिति की जांच के लिए roGFP1 इस्तेमाल किया. हम roGFP1 उम्र बढ़ने के दौरान और पोषक तत्वों की उपलब्धता के जवाब में होते हैं लेकिन खमीर की कोशिकाओं पर कोई स्पष्ट हानिकारक प्रभाव पड़ता है कि mitochondrial redox राज्य में परिवर्तन का पता लगा सकते हैं कि लगता है. हम भी व्यक्ति जीवित खमीर कोशिकाओं के भीतर माइटोकांड्रिया के redox राज्य में परिवर्तनशीलता, subcellular स्थानिक संकल्प के साथ एक biosensor के महत्व को रेखांकित करता है कि एक खोज देखें.

MitGO-ATeam2 जाओ ATeam2 के अमीनो टर्मिनस पर डाला साइटोक्रोम ग oxidase सबयूनिट VIIIA की मितोचोन्द्रिअल संकेत अनुक्रम है जो जाओ ATeam2, का एक संस्करण है. 27 हम mitGO-ATeam2 जांच (कृपया एच. की प्रयोगशाला द्वारा प्रदान की संशोधित Noji, संस्थान ओच वैज्ञानिक और एक कम नकल प्लाज्मिड है जो खमीर अभिव्यक्ति वेक्टर pAG415GPD-ccdB (Addgene, कैम्ब्रिज, एमए, यूएसए), में Xba1 और HindIII साइटों के माध्यम से यह subcloning द्वारा खमीर में उपयोग के लिए औद्योगिक अनुसंधान, ओसाका विश्वविद्यालय, जापान),, मजबूत विधान GPD प्रमोटर युक्त. हम नवोदित खमीर में mitGO-ATeam2 व्यक्त की, और यह मितोचोन्द्रिअल एटीपी के स्तर में शारीरिक परिवर्तन को मापने के लिए एक प्रभावी जांच के रूप में कार्य करता है जहां यह माइटोकांड्रिया के लिए विशेष रूप से localizes कि डीएनए बाध्यकारी डाई DAPI, साथ counterstaining द्वारा, पाते हैं.

roGFP और जाओ ATeam आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग रहे हैं दोनों. नतीजतन, वे शुरू की है और स्थिरतापूर्वक बनाए रखा बरकरार कोशिकाओं में, और redox राज्य या व्यक्ति, जीवित कोशिकाओं में एटीपी के स्तर के बारे में जानकारी प्रदान की जा सकती है. इसके अलावा, दोनों biosensors के शारीरिक शर्तों के तहत रेडोक्स राज्य या होती है कि एटीपी के स्तर में परिवर्तन की निगरानी. 28 दोनों जांच भी ratiometric हैं. नतीजतन, इन जांच के साथ किए गए माप चा से प्रभावित नहीं हैंbiosensor एकाग्रता या नमूना रोशनी या मोटाई में nges. अंत में, दोनों biosensors के subcellular स्थानिक संकल्प प्रदान करते हैं. दरअसल, roGFP माइटोकांड्रिया, ईआर के लिए लक्षित किया गया है, endosomes और 24 पेरोक्सिज़ोम, और पीएच की काफी हद तक स्वतंत्र इन organelles के प्रत्येक के redox राज्य में परिवर्तन का पता लगा सकते हैं.

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Protocol

1. Biosensors साथ खमीर कोशिकाओं के परिवर्तन

  1. लिथियम एसीटेट विधि 27 का उपयोग कर प्लाज्मिड असर मिटो-roGFP या mitGO-ATeam2 साथ वांछित खमीर तनाव रूपांतरण.
  2. प्लाज्मिड जनित biosensor के साथ परिवर्तन की पुष्टि करने के लिए और प्लाज्मिड के नुकसान को रोकने के लिए, चयन और उपयुक्त चयनात्मक सिंथेटिक पूरा मध्यम (मिटो-roGFP के लिए SC-Ura, या mitGo-ATeam2 के लिए SC-लियू) पर transformants बनाए रखें. फ्लोरोसेंट जांच यहाँ वर्णित उन लोगों की तुलना में एक अलग प्लाज्मिड में subcloned किया गया है, तो उपयुक्त चयनात्मक माध्यम का उपयोग. वे फ्लोरोसेंट biosensor व्यक्त कि की पुष्टि करें और सामान्य मितोचोन्द्रिअल आकारिकी प्रदर्शन करने के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा transformants कल्पना.

2. इमेजिंग के लिए कोशिकाओं और तैयारी की ग्रोथ

सेल समारोह और नशीली दवाओं के उपचार के जवाब सेल घनत्व और चयापचय गतिविधि पर अत्यधिक निर्भर हैं. सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त कर रहे हैं जब कोशिकाओंसक्रिय (- 1 x 10 7 कोशिकाओं / एमएल मध्य लॉग चरण, ~ 0.5) बांट रहे हैं. लगातार घनत्व के मध्य लॉग चरण संस्कृतियों उत्पन्न करने के लिए सबसे विश्वसनीय तरीका एक स्थिर चरण पूर्व संस्कृति से टीका लगाना है.

  1. एक स्थिर चरण पूर्व संस्कृति तैयार: एक थाली से बदल कोशिकाओं का एक ही कॉलोनी लेने और चयनात्मक तरल मीडिया (एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार नीचे ट्यूब में 5 मिलीलीटर) टीका लगाना. 600 एनएम (600 आयुध डिपो) में संस्कृति के ऑप्टिकल घनत्व एक पठार (24-48 घंटे) तक पहुँच गया है जब तक 225 rpm पर झटकों के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर आगे बढ़ें.
  2. अवलोकन के लिए एक मध्य लॉग चरण संस्कृति की तैयारी: एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार नीचे ट्यूब में चयनात्मक मीडिया के 5 मिलीलीटर टीका लगाना पूर्व संस्कृति की उचित मात्रा का उपयोग करें. YPD मीडिया autofluorescent है और इन अध्ययनों के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए. सिंथेटिक पूरा, ग्लूकोज आधारित है, छोड़ने वालों (अनुसूचित जाति Ura) मीडिया का प्रयोग करें. वे मध्य लॉग चरण (- 1 x 10 7 कोशिकाओं / एमएल ~ 0.5) तक पहुँचने तक, 4-16 घंटे के लिए, 225 rpm पर मिलाते हुए, 30 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को विकसित. सेल घनत्व निर्धारित किया जा सकता है600 आयुध डिपो को मापने के द्वारा, सही आयुध डिपो के 600 पढ़ने निर्धारित करने के लिए स्पेक्ट्रोफोटोमीटर जांचना. हमारे बैकमैन DU530 (में Beckman कल्टर, इंडियानापोलिस,) पर, मध्य लॉग चरण 0.1-0.3 की एक आयुध डिपो के 600 से मेल खाती है.

मिटो-roGFP1 चयापचय परिवर्तनों के जवाब में organelle में होश उतार चढ़ाव. उदाहरण के लिए, इस परख मितोचोन्द्रिअल redox राज्य में परिवर्तन में खमीर किण्वनीय कार्बन स्रोतों (जैसे ग्लूकोज, अनुसूचित जाति मीडिया के रूप में) बनाम गैर उफानने कार्बन स्रोतों (जैसे ग्लिसरॉल, के रूप में SGlyc मीडिया में) पर होते हैं, और यहां तक कि एक ही के विभिन्न बैचों में मीडिया. इसलिए, सभी प्रयोगों के लिए मीडिया के एक ही बैच का उपयोग करें.

  1. कोई इलाज किया जा रहा है अगर कोशिकाओं एकाग्रता के लिए तैयार (2.4 कदम देखें) और इमेजिंग हैं. कोशिकाओं का इलाज किया जा रहा है, उचित उपचार के साथ कोशिकाओं को सेते हैं और अगले कदम के लिए जारी है.
  2. 15 सेकंड के लिए 6000 XG पर centrifugation द्वारा संस्कृति के 1 मिलीलीटर ध्यान लगाओ औरमीडिया के 20 μl में सेल गोली का मेजबान. इन स्थितियों के मद्देनजर क्षेत्र में अलग पहचाना कोशिकाओं की संख्या को अधिकतम.
  3. किसी स्लाइड में resuspended कोशिकाओं के 2 μl लागू करें. एक coverslip (संख्या 1.5, अधिमानतः उच्च प्रदर्शन 170 ± 5 माइक्रोन मोटाई) के साथ कवर, और स्पष्ट नेल पॉलिश या valap (अभिकर्मकों देखें) के साथ coverslip के किनारों को सील. Valap साथ सील करने के लिए, coverslip के किनारों के साथ एक छोटी राशि का प्रसार तो, एक लेम्प बर्नर लौ पर इसे पकड़ कर एक धातु रंग पर एक छोटी राशि पिघला.
  4. इमेजिंग के दौरान 30 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को बनाए रखें. इमेजिंग के लिए इस्तेमाल 100x तेल विसर्जन लेंस पर एक उद्देश्य हीटर इस आवेदन के लिए अच्छी तरह से काम करता है. इन शर्तों के तहत, mitochondrial आकारिकी, redox राज्य और एटीपी के स्तर 10-15 मिनट के लिए इमेजिंग के दौरान अपरिवर्तित ही रहेंगे.

3. इमेजिंग सेटअप

  1. एक व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति खुर्दबीन पर इमेजिंग मिटो-roGFP1 के लिए सेटअप
    यहाँ कदम AxioObse के अनुरूप हैंrver.Z1 खुर्दबीन एक Colibri एलईडी उत्तेजना स्रोत, एक व्यापक क्षेत्र ओर्का ईआर कैमरा और AxioVision अधिग्रहण सॉफ्टवेयर से लैस. मिटो-roGFP1 ऑक्सीकरण के दोनों चैनलों और photoconversion की photobleaching पारा आर्क दीपक रोशनी (देखें नीचे) की तुलना में एलईडी रोशनी का उपयोग काफी कम हो जाता है.
    संकेत और संकल्प को अधिकतम करने के लिए, उद्देश्य में संभव उच्चतम संख्यात्मक एपर्चर, और पर्याप्त स्थानिक संकल्प प्रदान करता है कि सबसे कम बढ़ाई उपयोग करें. इसके अलावा, मिटो-roGFP इमेजिंग के लिए, उद्देश्य 365 एनएम पर अच्छी तरह से स्थानांतरित करता है, इसकी पुष्टि. 100x/1.3NA चुनाव आयोग PlanNeofluar उद्देश्य (Zeiss) के इस आवेदन के लिए अच्छी तरह से काम करता है.
    ऑक्सीकरण और कम मिटो-roGFP1 प्रजातियों पर कब्जा करने के लिए अधिग्रहण सॉफ्टवेयर विन्यास करें. हम निम्न शर्तों का उपयोग करें.
    1. शामिल excitatio साथ, मिटो-roGFP ऐसे महामहिम (जीस) सेट फिल्टर के रूप में 38 365 एनएम (100% एलईडी शक्ति) और GFP के लिए उपयुक्त एक उत्सर्जन फिल्टर, पर उत्तेजना का उपयोग करने के ऑक्सीकरण के लिए चैनल विन्यस्त करेंएन फिल्टर क्यूब से हटा दिया. उत्तेजना फिल्टर को हटाने के इस प्रकार प्राप्त समय संकल्प में वृद्धि, फिल्टर स्विच करने के लिए आवश्यकता के बिना 365 एनएम और 470 एनएम दोनों में उत्तेजना की अनुमति देता है.
    2. उपरोक्त के रूप में, 470 एनएम (100% एलईडी बिजली) में उत्तेजना का उपयोग करने के लिए और कम मिटो-roGFP के लिए चैनल विन्यस्त करें, एक ही उत्सर्जन फिल्टर घन ऑक्सीकरण मिटो-roGFP के लिए इस्तेमाल किया. स्थानिक संकल्प अनुकूलन करने के लिए 1x1 binning के लिए कैमरा सेट.
    3. प्रत्येक Z स्थिति में दोनों चैनलों का संग्रह, 0.5 माइक्रोन रिक्ति के साथ 11 स्लाइस से मिलकर AZ ढेर प्राप्त करने के लिए सॉफ्टवेयर सेट करें. अधिग्रहण की इस विधा में हर मोड़ जेड ढेर प्राप्त करने की तुलना में धीमी है, लेकिन यह ऑक्सीकरण और कम चैनलों के अधिग्रहण के बीच मितोचोन्द्रिअल गति से उत्पन्न होने वाली कलाकृतियों से बचाता है.
    4. छवि कई कोशिकाओं को एक मजबूत नहीं बल्कि संतृप्त संकेत उत्पादन, एक उचित जोखिम समय निर्धारित करने के लिए. यह सभी प्रयोग के लिए ऑक्सीकरण और मिटो-roGFP1 कम के लिए जोखिम बार के अनुपात को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण हैएस. उदाहरण के लिए, के लिए जोखिम बार ऑक्सीकरण और मिटो-roGFP1 मिटो-roGFP1 ऑक्सीकरण के लिए जोखिम समय फिर, क्रमश: 300 और 100 मिसे हैं कम तो 3 गुना होना चाहिए कि सभी प्रयोगों के लिए मिटो-roGFP कम के लिए.
  2. एक वर्णक्रमीय confocal खुर्दबीन पर इमेजिंग mitGO-ATeam2 के लिए सेटअप
    MitGO-ATeam2, GFP (उत्सर्जन अधिकतम 510 एनएम) से रोशनी का उपयोग कर एटीपी के स्तर यों OFP (उत्सर्जन अधिकतम 560 एनएम) से उस से प्रतिष्ठित किया जाना चाहिए. इन fluorophores से उत्सर्जित प्रतिदीप्ति हल कि प्रतिदीप्ति फिल्टर सेट कर रहे हैं. हालांकि, हम confocal सूक्ष्मदर्शी स्कैनिंग कई लेजर पर उपलब्ध एक वर्णक्रमीय डिटेक्टर, इस आवेदन के लिए सबसे अच्छा काम करता है. एक वर्णक्रमीय डिटेक्टर तरंगदैर्ध्य के अनुसार कई घटकों (आमतौर पर 32 या अधिक) में प्रतिदीप्ति उत्सर्जन अलग करती है. कई आसन्न तरंगदैर्ध्य बैंड एक छवि चैनल में जोड़ा जा सकता है. संयुक्त होने की तरंग दैर्ध्य के अनुभव से तो जी से संकेत अधिकतम करने के रूप में चुने गए हैंउलझाना चाहते हैं कि संकेत के विदेशी परहेज एफपी और OFP माप झल्लाहट. उपलब्ध उच्चतम संख्यात्मक एपर्चर लेंस का प्रयोग करें. हम एक 100x/1.49 या 60x/1.49 ए पी ओ-TIRF लेंस का उपयोग करें. हम एनआईएस तत्वों सॉफ्टवेयर चल निकॉन A1R confocal खुर्दबीन का उपयोग करें. एटीपी वाली और एटीपी अपार mitGO-ATeam2 प्रजातियों पर कब्जा करने के लिए अधिग्रहण सॉफ्टवेयर विन्यास करें. हम निम्न शर्तों का उपयोग करें.
    1. हमारे सिस्टम पर लगभग 0.42 माइक्रोन की अज़ संकल्प से मेल खाती है, जो 1.0 हवादार इकाइयों (एयू) के पिनहोल सेट करें.
    2. छवि में स्थानिक जानकारी को अधिकतम जाएगा जो Nyquist नमूना सीमा, दृष्टिकोण करने के लिए स्कैन ज़ूम सेट करें. हमारे सिस्टम पर पिक्सेल आकार 0.12 माइक्रोन है.
    3. माइटोकॉन्ड्रिया इमेजिंग के दौरान स्थानांतरित कर सकते हैं, क्योंकि यह 512 x 256 पिक्सल के लिए मैदान फसल से इमेजिंग गति को बढ़ाने के लिए सहायक हो सकता है. हमारी प्रणाली में छवि एक फ्रेम करने के लिए आवश्यक कुल समय एक 2 गुना स्कैन औसत सहित 1.0 सेकंड है. वांछित स्थानिक संकल्प पर निर्भर करता है, क्षेत्र में आगे बढ़ाने के लिए उत्पन्न किया जा सकता हैई समय संकल्प.
    4. 488 एनएम पर उत्तेजित, और 500 से उत्सर्जन इकट्ठा - GFP के लिए 520 एनएम, और 550 से - OFP के लिए 580 एनएम. वास्तविक इष्टतम मूल्यों इमेजिंग प्रणाली की विशेषताओं के साथ भिन्न हो सकते हैं.
    5. हमारी प्रणाली के लिए इष्टतम लेजर शक्ति 6.0 और 6.4% के बीच है. इष्टतम लेजर शक्ति प्रत्येक माइक्रोस्कोप प्रणाली के लिए अलग अलग होंगे, लेकिन अभी भी एक व्याख्या छवि का निर्माण किया है, जबकि आदर्श रूप में संभव के रूप में कम हो जाएगा. किसी भी ऑप्टिकल सिस्टम में समय के साथ सामान्य रूप से पाए जाते हैं, जो लेजर सत्ता में परिवर्तन पर नजर रखने के लिए एक आंतरिक या बाहरी बिजली मीटर का प्रयोग करें.
    6. पिक्सेल मूल्यों का पता लगाया सीमा को अधिकतम लेकिन संभव के रूप में कई के रूप में कोशिकाओं के लिए, saturating के संकेत से बचने के लिए डिटेक्टर लाभ और रोशनी प्रकाश की तीव्रता को समायोजित करें. 1% से अधिक संतृप्त पिक्सल जिन सेल का विश्लेषण न करें. एक ही उद्देश्य है, लेजर बिजली, स्कैन ज़ूम, पिक्सेल आकार, लाभ, और ऑफसेट का उपयोग कर छवि सभी नमूनों.

4. छवि अधिग्रहण

  1. फोकल पीएलए का पता लगाएँ फ्लोरोसेंट जांच विरंजन कम करने के लिए प्रेषित प्रकाश का उपयोग ब्याज की कोशिकाओं के पूर्वोत्तर.
  2. ब्याज की एक या अधिक कक्षों लगाने के बाद, 0.5 माइक्रोन से एक कदम आकार का उपयोग करते हुए एक ठेठ सेल (लगभग 7 माइक्रोन) की पूरी गहराई के माध्यम से एक z-श्रृंखला इकट्ठा.
  3. छवि अन्य स्लाइड पर ब्याज की कोशिकाओं, लेकिन छवि अब से 15 मिनट के लिए एक एकल स्लाइड नहीं करते. स्लाइड पर 15 मिनट के बाद, कोशिकाओं व्यवहार्यता खो देते हैं.

5. विश्लेषण

Mitochondrial एटीपी स्तर 510 एनएम कि करने के लिए 560 एनएम पर mitGO-ATeam2 उत्सर्जन का अनुपात को मापने के द्वारा निर्धारित किया जाता है 27 organelle के redox राज्य मिटो-roGFP के (आर / ओ) ऑक्सीकरण अनुपात को कम कर के रूप में मापा जाता है;. यानी 365 एनएम उत्तेजना पर 510 एनएम पर उत्सर्जन द्वारा विभाजित 470 एनएम उत्तेजना पर 510 एनएम पर उत्सर्जन. अनुपात की गणना से पहले, हम पृष्ठभूमि घटाना और फ्लोरोसेंट माइटोकांड्रिया से संबंधित पिक्सल के लिए एक मूल्य सीमा निर्धारित करते हैं.

तम्बू "> पब्लिक डोमेन (जैसे ImageJ 30) या सॉफ्टवेयर मिटो-roGFP1 या mitGO-ATeam2 का विश्लेषण. छवि अधिग्रहण के लिए इस्तेमाल किया सॉफ्टवेयर पर निर्भर करता है के लिए और विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (जैसे Volocity, Perkin-एल्मर) व्यावसायिक रूप से उपलब्ध, छवियों पहला विश्लेषण सॉफ्टवेयर में उन्हें खोलने से पहले, इस तरह झगड़ा के रूप में, किसी अन्य स्वरूप में परिवर्तित करने की आवश्यकता हो सकती है. छवियों को परिवर्तित कर रहे हैं, यह पिक्सेल मूल्यों रूपांतरण के दौरान बदल नहीं कर रहे हैं सत्यापित करने के लिए आवश्यक है. मिटो-roGFP1 डेटा के विश्लेषण का उपयोग कर दोनों कार्यक्रमों के नीचे वर्णित है. प्रत्येक मेनू के भीतर चयन करने के लिए कार्यक्रम मेनू और विकल्प बोल्ड इटैलिक में डाला जाता है.

5.1 ImageJ विश्लेषण

  1. ओपन छवियों और परिवर्तन प्रकार 32 बिट के लिए: छवि → प्रकार → 32 बिट.
  2. कोई कोशिकाओं रहे हैं जहां एक क्षेत्र में ब्याज (आरओआई) के एक क्षेत्र ड्रा. इस आरओआई में मतलब तीव्रता की गणना: → उपाय विश्लेषण.
  3. ढेर से गणना मतलब पृष्ठभूमि घटाना: प्रक्रिया → मठ → घटाना.
  4. घटाया z ढेर का उपयोग करना, माइटोकॉन्ड्रिया पर मध्य टुकड़ा और सीमा पाते: छवि → समायोजित → दहलीज और दहलीज खिड़की पर लागू करें क्लिक करें. ढेर में सभी स्लाइस को लागू करें. नेन के लिए पृष्ठभूमि पिक्सल सेट की जाँच करें.
  5. अनुपात बनाएँ जेड ढेर: प्रक्रिया → छवि कैलक्यूलेटर मिटो-roGFP1 विश्लेषण के लिए ऑक्सीकरण जेड ढेर से कम ढेर फूट डालो. MitGO-ATeam2 विश्लेषण के लिए (एटीपी अनबाउंड) छवि 510 एनएम से 560 एनएम (एटीपी बाध्य) छवि विभाजित करते हैं.
  6. हित के क्षेत्र के आसपास एक रॉय ड्रा. → उपकरण → रॉय प्रबंधक का विश्लेषण करें चुनें, और रॉय रिकॉर्ड करने के लिए जोड़ें पर क्लिक करें. कई क्षेत्रों प्रबंधक में संग्रहित किया जा सकता है. रॉय प्रबंधक, सभी ROIs के चयन, तो एम का चयनअयस्क → सब ढेर स्लाइस को मापने के लिए मल्टी उपाय. विश्लेषण के लिए एक स्प्रेडशीट के लिए डेटा निर्यात करें.

5.2 Volocity विश्लेषण

  1. एक Volocity पुस्तकालय में छवियों को आयात और 2 चैनल के साथ एक छवि अनुक्रम बनाने.
  2. कोई कोशिकाओं रहे हैं जहां एक क्षेत्र में ब्याज (आरओआई) के एक क्षेत्र ड्रा. चुनें: उपकरण → अनुपात.
  3. रॉय से प्राप्त करें: पृष्ठभूमि की गणना करने के Volocity का प्रयोग करें.
  4. मितोचोन्द्रिअल संरचनाओं शामिल करने के लिए सीमा को समायोजित करें.
  5. अनुपात चैनल के लिए एक इंद्रधनुष lut लागू करने के लिए विकल्प की जाँच करें. तीव्रता संग्राहक चैनल presenta tion के लिए एक कम शोर छवि उत्पादन हो सकता है, लेकिन यह औसत अनुपात के quantitation के लिए नहीं किया जाना चाहिए.
  6. मापन टैब का चयन करें, अनुपात चैनल चुनें और हित के क्षेत्र के आसपास एक रॉय आकर्षित. शून्य मानों को छोड़कर अनुपात चैनल, उपाय. कई क्षेत्रों का चयन किया है और मापा जा सकता हैएक ही समय में. विश्लेषण के लिए एक स्प्रेडशीट के लिए डेटा निर्यात करें.

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Representative Results

मिटो-roGFP साथ मितोचोन्द्रिअल रेडोक्स राज्य मापने

यहाँ, हम मिटो-roGFP1 खमीर सेल के विकास या mitochondrial आकारिकी प्रभावित किए बिना, खमीर जीवित कोशिकाओं में कम करने के लिए पूरी तरह से ऑक्सीकरण से मितोचोन्द्रिअल redox राज्य में परिवर्तन का पता लगाने के लिए गतिशील रेंज है कि दिखा. सबसे पहले, हम माइटोकांड्रिया लक्षित GFP और roGFP1 व्यक्त कोशिकाओं सामान्य दर (चित्रा 1 ए) से बढ़ने लगता है. के रूप में लॉग चरण के विकास के लिए और अधिक से अधिक विकास दर तक पहुंचने में समय के दौरान विकास की अवस्था का अधिकतम ढाल द्वारा मापा अधिकतम विकास दर, मिटो-GFP और मिटो-roGFP1 व्यक्त कोशिकाओं में इसी तरह की है. इसके अलावा, मिटो-roGFP1 प्रदर्शनी जंगली प्रकार आकारिकी (चित्रा 1 बी) व्यक्त खमीर में माइटोकॉन्ड्रिया. विशेष रूप से, वे ट्यूबलर हैं, माँ कली अक्ष के साथ संरेखित, और माँ और बेटी की कोशिकाओं के सुझावों पर जमा है. Mitochondrial रोग अक्सर विखंडन लाती है के बाद से, यह सामान्य आकारिकी मिटो-roGFP1 करता है कि इस विचार का समर्थन करता हैनहीं उपद्रव mitochondrial समारोह.

मिटो-roGFP1 के गतिशील रेंज का आकलन करने के लिए, हम क्रमशः, हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच 2 हे 2) और dithiothreitol (डीटीटी) के साथ मध्य लॉग चरण जंगली प्रकार खमीर कोशिकाओं का इलाज किया, और mitochondrial आकलन करने के लिए मतलब मितोचोन्द्रिअल आर / हे अनुपात मापा रेडोक्स राज्य (चित्रा 2). एच 2 के साथ अनुमापन 0 से 1.23 (शर्तों को कम से कम) के लिए 0.6 (शर्तों ऑक्सीकरण के नीचे) से एक मापा श्रृंखला के साथ मतलब सेलुलर आर / हे अनुपात में एक खुराक पर निर्भर परिवर्तन में 10 मिमी परिणाम के लिए 2 हे या डीटीटी. इस प्रकार, मिटो-roGFP1 जीवित कोशिकाओं में mitochondrial रेडोक्स राज्य के विश्लेषण के लिए एक प्रभावी biosensor है.

मिटो-roGFP1 भी मितोचोन्द्रिअल रेडोक्स राज्य के subcellular संकल्प प्रदान करता है. इस subcellular संकल्प व्यक्ति खमीर कोशिकाओं के भीतर माइटोकांड्रिया रिश्तेदार redox राज्य में अलग है कि पता चलता है. एक एकल खमीर कोशिका के भीतर माइटोकांड्रिया कार्यात्मक अलग कर रहे हैं, तो यह संभव है किवाई निष्क्रिय या सक्रिय रूप से अलग (चित्रा 3) हैं. इस तरह के अलगाव माँ बेटी उम्र विषमता और बेटी कोशिकाओं का कायाकल्प करने के लिए योगदान कर सकता है. यह निष्कर्ष मितोचोन्द्रिअल रेडोक्स राज्य के subcellular संकल्प के साथ एक biosensor के लिए की जरूरत को रेखांकित करता है.

यह प्रकाश GFP क्रोमोफोर में परिवर्तन पैदा कर सकते हैं कि 31 लंबे समय से ज्ञात किया गया है. उच्च तीव्रता 400 एनएम प्रकाश के संपर्क करने पर, roGFP1 एक अलग उत्सर्जन स्पेक्ट्रम 26 के साथ एक प्रजाति को photoconversion आए. Photoconversion होता है, मिटो-roGFP1 ऑक्सीकरण से हरी उत्सर्जन में कमी और आर / ओ मिटो-roGFP1 (चित्रा 4 बी) का अनुपात बदल जो कम मिटो-roGFP1, उत्तेजना पर हरी उत्सर्जन में वृद्धि हुई है. कम तीव्रता उत्तेजना (Colibri प्रकाश स्रोत में एलईडी 400 एनएम का उपयोग कर 40% पर जैसे रोशनी) का उपयोग करना, (चित्रा 4C) का विश्लेषण अवधि के दौरान कोई महत्वपूर्ण photoconversion है. पी photoconversion को कम करने के लिए भेजा रास्ता (चर्चा देखने के लिए) 365 एनएम पर roGFP का ऑक्सीकरण फार्म उत्तेजित करने के लिए है.

MitGO-ATeam2 साथ मापने मितोचोन्द्रिअल एटीपी

स्तनधारी कोशिकाओं में व्यक्त की है जब MitGO-ATeam2 mitochondria में localizes. 27 हम mitGO-ATeam2 खमीर में DAPI से सना हुआ mitochondrial डीएनए के साथ colocalizes कि मिल जाए, और माइटोकांड्रिया जंगली प्रकार खमीर (चित्रा 5A) के विशिष्ट ट्यूबलर संरचना में पाया जाता है. इस प्रकार, हम स्तनधारी साइटोक्रोम ग oxidase सबयूनिट VIIIA से मितोचोन्द्रिअल को लक्षित अनुक्रम मितोचोन्द्रिअल आकारिकी में खलल न डालें बिना खमीर में mitochondria में जांच localizes कि सत्यापित. इसके अतिरिक्त, हम mitGO-ATeam2 व्यक्त कोशिकाओं की वृद्धि दर ग्लूकोज और ग्लिसरॉल मीडिया दोनों में माइटोकॉन्ड्रिया लक्षित GFP (चित्रा 5 ब) व्यक्त कोशिकाओं के समान है कि लगता है. इस प्रकार, mitGO-ATeam2 की अभिव्यक्ति सेल या माइटोकांड्रिया के लिए हानिकारक नहीं होती है.

_content "> इसके बाद, हम mitGO-ATeam2 मितोचोन्द्रिअल एटीपी के स्तर में परिवर्तन. ऐसा करने के लिए जवाब है झल्लाहट परीक्षण किया कि क्या, हम, antimycin ए, साइटोक्रोम ग रिडक्टेस को बांधता है कि एक एजेंट के साथ कोशिकाओं का इलाज इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला में Ubiquinol के ऑक्सीकरण को रोकता , प्रोटॉन ढाल बाधित, और mitochondrial एटीपी उत्पादन को रोकता है. 20 मंझला Antimycin साथ इलाज किया कोशिकाओं में अनुपात घटने झल्लाहट ए (चित्रा 6C).

MitGO-ATeam2 मितोचोन्द्रिअल एटीपी के लिए एक प्रभावी biosensor है कि साक्ष्य को देखते हुए हम एक किण्वनीय या गैर उफानने कार्बन स्रोत (चित्रा 6A और 6B) का उपयोग कर प्रचारित किया गया कि खमीर में mitochondrial एटीपी स्तर पर नजर रखने के लिए इस जांच का इस्तेमाल किया. ग्लूकोज में विकसित कोशिकाओं में कुल फ्लोरोसेंट क्षेत्र में कमी मितोचोन्द्रिअल बहुतायत में कमी है कि ग्लूकोज दमन परिणामों की पुष्टि की. हम mitGO-ATeam2 के स्तर में सेल करने वाली सेल भिन्नता ध्यान दें. दिलचस्प है, हमारे प्रारंभिक डेटा इंगित करता है कि वहाँ मा वाई एक ही कक्ष के भीतर अलग माइटोकांड्रिया में एटीपी के स्तर में मतभेद (चित्रा 6D) हो.

चित्रा 1
चित्रा 1. मिटो-roGFP1 सेल विकास दर या mitochondrial आकारिकी प्रभावित किए बिना मितोचोन्द्रिअल redox के राज्य का पता लगाता है. व्यक्त माइटोकांड्रिया लक्षित GFP या ro के GFP1 में वृद्धि के समय के एक समारोह के रूप में 600 एनएम ऑप्टिकल घनत्व में परिवर्तन के रूप में मापा गया था कि खमीर की (ए) विकास 30 में अनुसूचित जाति Ura तरल माध्यम डिग्री सेल्सियस (बी) ऊपरी पैनल: सामान्य मितोचोन्द्रिअल आकारिकी और कच्चे छवियों में स्थानीयकरण चैनल. निचले पैनल: अनुपात छवियों ऑक्सीकरण चैनल (सही पर रंग संदर्भ) द्वारा विभाजित कम चैनल दिखाते हैं. छवियों परिणामों पर सीमा चुनाव का असर दिखा. इष्टतम सीमा मितोचोन्द्रिअल संरचनाओं और शामिल नहीं पृष्ठभूमि भी शामिल है.jove.com/files/ftp_upload/50633/50633fig1hires.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2

चित्रा 2. मिटो-roGFP1 मिटो-roGFP1 व्यक्त हाइड्रोजन पेरोक्साइड या dithiothreitol. (एबी) मध्य लॉग चरण खमीर कोशिकाओं के साथ उपचार के जवाब में mitochondrial redox राज्य में परिवर्तन का पता लगाता है कोई इलाज (0) के साथ या संकेत सांद्रता के साथ अनुसूचित जाति Ura मीडिया में incubated रहे थे 30 पर 20 मिनट डिग्री सेल्सियस (ए) आर / ओ मिटो-roGFP1 अनुपात छवियों की अधिकतम तीव्रता अनुमानों सेल रूपरेखा दिखा जो प्रेषित प्रकाश छवियों, पर आरोपित कर रहे हैं के लिए एच 2 2 हे या डीटीटी का. मिटो-roGFP1 के लिए रंग संदर्भ ऊपरी सही पर दिखाया गया है. बार:. 5 माइक्रोन (बी) बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3. मिटो-roGFP1 मितोचोन्द्रिअल रेडोक्स राज्य के subcellular संकल्प प्रदान करता है. आर / ओ मिटो-roGFP1 अनुपात चैनल की अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण एक प्रेषित प्रकाश छवि पर आरोपित है. मिटो-roGFP1 के लिए रंग संदर्भ ऊपरी सही पर दिखाया गया है. बार: 5 माइक्रोन. यह विशेष रूप से सेल 0.88 की एक मतलब आर / ओ मिटो-roGFP1 अनुपात है. हालांकि, इस सेल के भीतर माइटोकांड्रिया व्यक्ति अलग रेडोक्स राज्यों दिखा. दिखाया संख्या अलग मितोचोन्द्रिअल पुनः के लिए गणना आर / ओ मिटो-roGFP1 अनुपात हैंgions. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
4 चित्रा. उच्च तीव्रता उत्तेजना photoconversion की ओर जाता है और बदल आर / ओ मिटो-roGFP1 अनुपात. मिटो-roGFP1 व्यक्त मध्य लॉग चरण खमीर 40% (ए) या ​​100% एक एलईडी प्रकाश स्रोत से (बी) के सत्ता में 400 एनएम प्रकाश के साथ प्रकाशित किए गए थे , और कम और मिटो-roGFP1 ऑक्सीकरण से प्रतिदीप्ति हर 4 सेकंड कब्जा कर लिया था. दिखाया छवियाँ रंग मिटो-roGFP1 के आर / हे अनुपात (कम सही में रंग पैमाने देखें) का प्रतिनिधित्व करते हैं, जिसमें अधिकतम अनुमानों हैं. बार:. 5 माइक्रोन (सी) मिटो-roGFP1 के आर / हे अनुपात 40% एलईडी सत्ता पर रोशनी पर इमेजिंग अवधि में स्थिर बने रहे. हालांकि, 100% पर रोशनी पर हम शक्ति का नेतृत्व कियाकी fluorophore photoswitching को दर्शाता है जो मिटो-roGFP1, के आर / हे अनुपात में एक समय पर निर्भर परिवर्तन का पालन. काले वर्गों, 40% बिजली एलईडी;. ग्रे हीरे, 100% एलईडी बिजली बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
चित्रा 5. MitGO-ATeam2 खमीर में माइटोकॉन्ड्रिया के लिए localizes और खमीर सेल विकास दर को प्रभावित नहीं करता है. (ए) mitGO-ATeam2 व्यक्त खमीर कोशिकाओं के रूप में पहले वर्णित, डीएनए बाध्यकारी डाई DAPI साथ paraformaldehyde और दाग का उपयोग कर तय, मध्य लॉग चरण के लिए बड़े हो रहे थे दिखाया. 19 छवियाँ Z-श्रृंखला deconvolved की अधिकतम तीव्रता अनुमानों हैं. सादगी के लिए, mitGO-ATeam2 छवियों ताकि वे एटीपी लिए केवल जनसंख्या अबाध का प्रतिनिधित्व करते हैं, एक पारंपरिक GFP फिल्टर का उपयोग कर प्राप्त किया गया. सेल से बाहरलाइनों सफेद में दिखाए जाते हैं. उत्तर: परमाणु डीएनए. mtDNA: mitochondrial डीएनए. बार: 1 माइक्रोन (बी) जंगली प्रकार खमीर कोशिकाओं के विकास घटता 30 में माइटोकॉन्ड्रिया लक्षित GFP या mitGO-ATeam2 ग्लूकोज आधारित में (एससी) और ग्लिसरॉल आधारित (SGlyc) तरल मीडिया डिग्री सेल्सियस व्यक्त. इस डेटा हर समय बिंदु पर प्रत्येक तनाव के लिए quadruplicates का औसत है, और दो ​​स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 6
6 चित्रा. MitGO-ATeam2 उपायों subcellular और suborganellar प्रस्ताव पर माइटोकांड्रिया खमीर में एटीपी के स्तर में परिवर्तन. (एबी) GFP (510 एनएम) और OFP (560 एनएम) से mitGO-ATeam2 का उत्सर्जन, और खमीर से 560/510 एनएम उत्सर्जन अनुपात के quantitation ग्लूको में रातोंरात विकसित कोशिकाओंएसई आधारित (अनुसूचित जाति) (ए) या ​​ग्लिसरॉल आधारित (SGlyc) (बी) मीडिया. 560/510 अनुपात चैनल के लिए रंग संदर्भ निचले सही पर दिखाया गया है. बार:. 1 माइक्रोन (सी) कोशिकाओं के लिए 560/510 अनुपात के quantitation 30 पर 1 घंटे के लिए के साथ या antimycin ए (2 ग्राम / एमएल) के बिना SGlyc मीडिया में प्रचारित डिग्री सेल्सियस antimycin पर एटीपी स्तर को एक उपचार में कमी (Kruskal वालिस महत्व परीक्षण) सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण है. एक मध्य लॉग चरण जंगली प्रकार के सेल की mitGO-ATeam2 (डी) 560 nm/510 एनएम अनुपात अनुसूचित जाति मीडिया पर प्रचारित किया गया. 560/510 अनुपात चैनल के लिए रंग संदर्भ निचले सही पर दिखाया गया है. सेल रूपरेखा सफेद में दिखाया गया है. पूरे सेल के लिए मतलब 560/510 एनएम अनुपात 0.43 है. दिखाया संख्या माइटोकांड्रिया में निर्दिष्ट क्षेत्र के 560/510 एनएम अनुपात हैं. बार: 1 माइक्रोन. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

यहाँ, हम खमीर जीवित कोशिकाओं में mitochondrial redox राज्य और एटीपी के स्तर का आकलन करने के लिए biosensors के रूप में मिटो-roGFP1 और mitGO-ATeam2 उपयोग करने के तरीकों का वर्णन है. हम मात्रात्मक मितोचोन्द्रिअल आकारिकी या वितरण पर या सेलुलर विकास दर पर कोई स्पष्ट प्रभाव के बिना, mitochondria में लक्षित करने में प्लाज्मिड जनित मिटो-roGFP1 या mitGO-ATeam परिणाम की कि अभिव्यक्ति हैं. 3 Mito-roGFP1 अत्यधिक से मितोचोन्द्रिअल redox राज्य में परिवर्तन का पता लगा सकते हैं अत्यधिक कम राज्यों के ऑक्सीकरण. इसी तरह, mitGO-ATeam एक श्वसन अवरोध करनेवाला के साथ इलाज श्वसन संचालित विकास और खमीर के दौर से गुजर खमीर में होते हैं कि mitochondrial एटीपी के स्तर में परिवर्तन उपाय कर सकते हैं. दोनों biosensors के subcellular संकल्प की पेशकश के बाद से इसके अलावा, वे रेडोक्स राज्य या व्यक्ति की कोशिकाओं के भीतर mitochondria की एटीपी के स्तर में विविधता का पता लगा सकते हैं. दोनों biosensors के ratiometric जांच कर रहे हैं, क्योंकि अंत में, वे नमूना मोटाई या बीमार में एकाग्रता या परिवर्तनशीलता में परिवर्तन से प्रभावित नहीं हैंumination. ये जांच जीवित कोशिकाओं में subcellular संकल्प के साथ mitochondrial समारोह का अध्ययन करने के लिए एक न्यूनतम इनवेसिव दृष्टिकोण प्रदान करते हैं.

सफलतापूर्वक इस पद्धति लागू करने के लिए, छवियों को अधिकतम संभव संकेत करने वाली शोर अनुपात के साथ प्राप्त किया जाना चाहिए. एक महत्वपूर्ण पहला कदम खुर्दबीन के नीचे 10-20 transformant कालोनियों से कोशिकाओं की जांच और मजबूत प्रतिदीप्ति और सामान्य मितोचोन्द्रिअल आकारिकी और विकास दर के साथ उन लोगों का चयन करने के लिए है. अगला, इमेजिंग शर्तों फ्लोरोसेंट प्रोटीन या कोशिकाओं को photodamage कारण के बिना उच्च, लेकिन नहीं संतृप्त, तीव्रता का उत्पादन करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. एक जनसंख्या (<1%) में कुछ कोशिकाओं प्लाज्मिड नकल संख्या में भिन्नता के कारण असामान्य रूप से उच्च या कम समग्र प्रतिदीप्ति हो सकता है, इन कोशिकाओं के बहुमत की व्याख्या छवियों पर कब्जा करने के पक्ष में नहीं लिया जा सकता है.

मिटो-roGFP के लाभ स्पष्ट कर रहे हैं, यह संभावित नुकसान के बारे में पता होना भी जरूरी है. हम पता लगासेल चयापचय में कार्बन स्रोत प्रेरित मतभेदों के साथ, लेकिन यह भी एक ही माध्यम के विभिन्न बैचों में खमीर के प्रसार पर न सिर्फ मितोचोन्द्रिअल redox क्षमता में अंतर. मितोचोन्द्रिअल redox के मापन के लिए सेल के विकास मीडिया का चयन करते समय इस प्रकार, ध्यान रखा जाना चाहिए. मिटो-roGFP मितोचोन्द्रिअल रेडोक्स राज्य की अभूतपूर्व स्थानिक संकल्प प्रदान करता है हालांकि इसके अलावा, roGFP का अस्थायी समाधान आरओएस संकेत पारगमन 31 के साथ जुड़े रहे हैं आरओएस के फटने का पता लगाने के लिए पर्याप्त नहीं है. RoGFP का ऑक्सीकरण फार्म के लिए उत्तेजना तरंगदैर्ध्य और तीव्रता का चयन करते समय अंत में, ध्यान रखा जाना चाहिए. 400 एनएम पर रोशनी बेहतर roGFP का ऑक्सीकरण प्रजातियों उत्तेजित. हालांकि, यह भी 365 एनएम पर उत्तेजना की तुलना में एक बड़ी हद तक कम roGFP उत्तेजित. इस मितोचोन्द्रिअल रेडोक्स राज्य मापने में कम संवेदनशीलता की ओर जाता है. 400 एनएम पर उच्च तीव्रता रोशनी को मिटो-roGFP1 की इसके अलावा, जोखिम एक कल्पना करने के लिए प्रोटीन की photoconversion की ओर जाता हैबदल वर्णक्रमीय गुणों के साथ एँ. हम 365 एनएम पर उच्च तीव्रता रोशनी पर photoconversion नहीं देखा है. इसलिए, हम यदि संभव हो तो 365 एनएम का उपयोग कर उत्तेजना की सलाह देते हैं.

MitGO-ATeam2 भी सीमाएं हैं. MitGO-ATeam2 अपने आप में एक प्रोटीन है क्योंकि उदाहरण के लिए, यह अपने biosensor गतिविधि क्षीण हो सकता है जो प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों, सहित सेलुलर अपमान द्वारा क्षतिग्रस्त किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, GFP और OFP उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य (510 और 560 एनएम) पारंपरिक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी पर मुश्किल हो सकता है जो विश्लेषण, झल्लाहट के लिए हल किया जाना चाहिए.

इन विट्रो एंजाइम assays में विपरीत इन रहने कक्ष assays के मितोचोन्द्रिअल एटीपी या redox राज्य में रिश्तेदार परिवर्तन रिपोर्ट, और एटीपी की पूर्ण एकाग्रता या कम सिस्टीन उपाय नहीं है. एक मानक वक्र सैद्धांतिक रूप से समाधान में सेंसर प्रोटीन की प्रतिक्रिया को मापने के द्वारा उत्पन्न किया जा सकता है, इस माइटोकॉन्ड्रिया के भीतर अलग आणविक पर्यावरण के लिए लागू नहीं हो सकता है. वहाँ efore, इन assays अलग अलग परिस्थितियों में कोशिकाओं की तुलना करने का एक साधन प्रदान करते हैं. इसके अलावा, इमेजिंग की स्थिति भिन्न है, एक इमेजिंग सेटअप पर अधिग्रहीत सटीक अनुपात मूल्यों दूसरे पर नहीं दोहराया जा सकता है.

अनुपात इमेजिंग के लिए इन तकनीकों में अन्य roGFP या जाओ ATeam isoforms और अन्य कार्यात्मक जांच सहित अन्य ratiometric संकेतक, के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. व्यापक क्षेत्र या confocal माइक्रोस्कोपी का चुनाव जांच और आवश्यक स्थानिक संकल्प पर निर्भर करेगा. यह सेंसर की संवेदनशीलता और स्थिरता में सुधार, जो 365 एनएम, पर उत्तेजना की अनुमति देता है क्योंकि व्यापक क्षेत्र विधि मिटो-roGFP के लिए यहां इस्तेमाल किया गया था. के रूप में mitGO-Ateam के लिए यहां इस्तेमाल एक वर्णक्रमीय डिटेक्टर, साथ कोंफोकल विधि वर्णक्रमीय पता लगाने विंडोज़ का समायोजन करके उत्सर्जन विदेशी को खत्म करने के लिए एक सुविधाजनक तरीका प्रदान करता है. हालांकि, यह कस्टम फिल्टर का उपयोग या computationally विदेशी नष्ट करने से व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी में इसी तरह के प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए संभव है.

ntent "> इमेजिंग प्रयोग के इस प्रकार में सबसे आम कठिनाई अपर्याप्त संकेत है. इमेजिंग हार्डवेयर (विशेष रूप से उद्देश्य लेंस और डिटेक्टर) से पर्याप्त डेटा की व्याख्या करने के लिए संकेत इकट्ठा करने के लिए महत्वपूर्ण है.

पृष्ठभूमि पिक्सल का समावेश प्राप्त अनुपात में कोई रुझान गीला हो सकते हैं thresholding कदम, परिणाम पर काफी प्रभाव है. स्वचालित विधियों बेहतर कर रहे हैं, लेकिन सीमित संकेत के कारण, मैनुअल thresholding अक्सर उपलब्ध सर्वोत्तम विधि है. मैनुअल थ्रेसहोल्ड उपयोग किया जाता है, तो इस्तेमाल किया मापदंड के रूप में अच्छी तरह से संभव के रूप में व्यक्त किया जाना चाहिए, और विश्लेषण reproducibility में प्रदर्शित करने के लिए विभिन्न प्रयोगकर्ताओं द्वारा या अंधा प्रदर्शन करने की आवश्यकता हो सकती है. Antimycin ए (mitGO-Ateam2 के लिए) और एच 2 2 हे या डीटीटी (मिटो-roGFP के लिए) के साथ नियंत्रण प्रयोगों प्रतिदीप्ति अनुपात में भविष्यवाणी परिवर्तन की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

मिटो-roGFP और mitGO-ATeam2 निगरानी मिटो के लिए गैर इनवेसिव, ratiometric जांच कर रहे हैंखमीर कोशिकाओं में रहने वाले chondrial फिटनेस. यहां इस्तेमाल ratiometric सेंसर माइटोकांड्रिया विशिष्ट संकेत दृश्यों के विलय द्वारा माइटोकांड्रिया को निशाना बनाया गया. अन्य सेलुलर डिब्बों मूल सेंसर के लिए उपयुक्त लक्षित कर दृश्यों के अलावा के साथ अध्ययन किया जा सकता है. इसके अलावा, यह एक साथ जीवित कोशिकाओं में कई प्रक्रियाओं को मापने के लिए पूरक फ्लोरोसेंट मार्कर (organelles या संकेत कारकों के लिए जैसे) या सेंसर (जैसे कैल्शियम के लिए) के साथ इन सेंसरों के दोनों गठबंधन करने के लिए संभव है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इस काम HHMI 56006760 से (GM45735, JDV, DMAW को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) (2 TL1 आरआर 24158-6), के लिए और एलिसन मेडिकल फाउंडेशन (एजी-एसएस 2465) और एनआईएच से पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया GM45735S1 और GM096445) एल.पी. के लिए. GM45735S1 अमेरिकी रिकवरी और पुनर्निवेश अधिनियम 2009 के तहत एनआईएच से जारी किया गया था. इन अध्ययनों के लिए इस्तेमाल सूक्ष्मदर्शी एक NIH / NCI अनुदान (5 P30 CA13696) के माध्यम से हिस्से में समर्थित थे.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
  Reagents
Antimycin A Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) 1397-94-0 Dissolved in ethanol to a 2 mg/ml stock solution.
SGlyc (synthetic glycerol-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura
**omit for SGlyc-Leu
Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave.

Ingredients:
0.67% Yeast nitrogen base without amino acids
3% Glycerol
0.05% Glucose
2 mg/ml adenine
2 mg/ml uracil*
1 mg/ml L-arginine
1 mg/ml L-histidine
1 mg/ml L-leucine**
3 mg/ml L-lysine
2 mg/ml L-methionine
4 mg/ml L-phenylalanine
2 mg/ml L-tryptophan
3 mg/ml L-tyrosine
SC (synthetic complete, glucose-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura
**omit for SGlyc-Leu
Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients:
0.67% Yeast nitrogen base without amino acids
3% Glucose
2 mg/ml adenine
2 mg/ml uracil*
1 mg/ml L-arginine
1 mg/ml L-histidine
1 mg/ml L-leucine**
3 mg/ml L-lysine
2 mg/ml L-methionine
4 mg/ml L-phenylalanine
2 mg/ml L-tryptophan
3 mg/ml L-tyrosine
Valap Combine ingredients in a 1:1:1 (w:w:w) ratio. Melt by submerging in a 70 °C H2O bath. Aliquot into glass petri dishes. Store at room temperature. Ingredients:
Vaseline petroleum jelly, hard paraffin, lanolin
  Equipment and Software
Precleaned Gold Seal Rite-on Micro Slides Thomas Scientific (Swedesboro, NJ) 3050 Size: 25 x 75 mm; Thickness: 0.93 to 1.05 mm
High-performance coverslips, No. 1.5, 18x18 mm Zeiss (Thornwood, NY) 474030-9000-000 These are less variable in thickness (170±5 μm) than standard coverslips, reducing spherical aberration and improving 3D imaging performance
Fisherbrand Microscope Cover Glass, No. 1.5 Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) 12-545E Size: 22 x 22 mm, No. 1.5 thickness (170 μm)
A1 laser scanning confocal microscope with spectral detector and 100x/1.49 NA Apo-TIRF objective Nikon (Melville, NY)  
AxioObserver.Z1 microscope equipped with a 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar objective (Zeiss) and Orca ER cooled CCD camera (Hamamatsu) and controlled by Axiovision software Zeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Hamamatsu City, Japan)  
Volocity 3D Image Analysis software Perkin Elmer (Waltham, MA) Restoration module for deconvolution; Quantitation module for ratio calculation and measurement
ImageJ software National Institutes of Health (Bethesda, MD) http://rsb.info.nih.gov/ij/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rizzuto, R., De Stefani, D., Raffaello, A., Mammucari, C. Mitochondria as sensors and regulators of calcium signalling. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 13, (9), 566-578 (2012).
  2. Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148, (6), 1145-1159 (2012).
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