Biosensores radiométricos que miden el estado redox mitocondrial y ATP en las células vivas de levadura

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Bioengineering

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Summary

Se describe el uso de dos, biosensores ratiometric codificados genéticamente, que se basan en la GFP, para vigilar los niveles de ATP estado redox mitocondrial y en la resolución subcelular en células de levadura vivas.

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Vevea, J. D., Alessi Wolken, D. M., Swayne, T. C., White, A. B., Pon, L. A. Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells. J. Vis. Exp. (77), e50633, doi:10.3791/50633 (2013).

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Abstract

Las mitocondrias tienen papeles en muchos procesos celulares, de metabolismo de la energía y la homeostasis del calcio para el control de la vida celular y la muerte celular programada. Estos procesos afectan y se ven afectados por el estado redox y de la producción de ATP por las mitocondrias. Aquí, se describe el uso de dos, biosensores codificados genéticamente radiométricos que pueden detectar los niveles de ATP estado redox mitocondrial y en la resolución subcelular en células de levadura viva. Estado redox mitocondrial se mide usando sensible a redox Proteína Fluorescente Verde (roGFP) que está dirigido a la matriz mitocondrial. Mito-roGFP contiene cisteínas en las posiciones 147 y 204 de la GFP, que se someten a la oxidación y reducción reversible y dependiente del entorno, que a su vez altera el espectro de excitación de la proteína. MitGO-ATeam es una transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) sonda en la que la subunidad ε del F o F 1-ATP sintasa se ​​intercala entre donante y aceptor de FRET fluoproteínas rescent. La unión de ATP a los resultados de la subunidad ε en cambios de conformación en la proteína que traen el donante de FRET y aceptor en estrecha proximidad y permiten la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia del donante al aceptor.

Introduction

Las mitocondrias son organelas esenciales para la producción de ATP, la biosíntesis de aminoácidos, ácidos grasos, hemo, clusters hierro-azufre y pirimidinas. Las mitocondrias también juegan un papel fundamental en la homeostasis del calcio, y en la regulación de la apoptosis. 1 El aumento de enlaces evidencia mitocondrias a envejecimiento y relacionada con la edad las enfermedades incluyendo la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica, y enfermedad de Huntington. 2 Si bien las personas viven toda su vida con las mutaciones en las proteínas mitocondriales que están asociados con enfermedades neurodegenerativas, los síntomas de la enfermedad se producen sólo más tarde en la vida. Esto indica que los cambios se producen en las mitocondrias con la edad que permiten patología de la enfermedad a emerger. En efecto, fitness mitocondrial se correlaciona con la salud en general y la longevidad celular en levaduras y células de mamífero. 3.4 Aquí se describe cómo utilizar biosensores fluorescentes genéticamente codificados, radiométricos para evaluar dos aspectos críticos de Mitochondria en células de levadura que viven: los niveles de ATP y el estado redox.

La función mitocondrial en la movilización de energía aeróbica está bien establecida. Estado redox mitocondrial es un producto de la reducción y las especies oxidantes en el orgánulo, incluyendo NAD + / NADH, FAD / FADH 2, NADP + / NADPH, glutatión / disulfuro de glutatión (GSH / GSSG) y especies reactivas de oxígeno (ROS). Desacoplar las mitocondrias o hipoxia afecta a la actividad respiratoria mitocondrial y altera la relación de NAD + a NADH en el orgánulo. ROS, que están producidos a partir de la transferencia de electrones ineficiente entre los complejos de la cadena de transporte de electrones en la membrana mitocondrial interna, así como de la desaminación de aminas a través de la monoamina oxidasa en la membrana mitocondrial externa 5, daños en lípidos, proteínas, y ácidos nucleicos y tienen ha relacionado con el envejecimiento y enfermedades neurodegenerativas asociadas a la edad 6,7,8. ROS también juegan un papel en la transducción de señal en mitochondria, a través de la oxidación de GSH. Por ejemplo, el NADH deshidrogenasa no sólo contribuye a la producción de ROS pero también está regulado a través de interacciones con la piscina glutatión 9,10. α-cetoglutarato deshidrogenasa y aconitasa, componentes del ciclo del TCA, muestran una actividad reducida en ambientes oxidantes 11,12.

En efecto, la regulación redox-dependiente de la actividad de la aconitasa se ​​conserva desde las bacterias hasta los mamíferos 13,14. Por lo tanto, el control de la los niveles de ATP de las mitocondrias y del estado redox es crucial para la comprensión de su función y el papel en la patología de la enfermedad.

Métodos bioquímicos se han utilizado para evaluar el estado redox o los niveles de ATP de las células enteras o mitocondrias aisladas. Ampliamente métodos utilizados para evaluar el estado redox de las células enteras o las mitocondrias aisladas se basan en la medición de los niveles del par redox GSH / GSSG 15. El sistema luciferina-luciferasa se utiliza comúnmente para medir mitocondrialLos niveles de ATP en cualquiera de las células enteras permeabilizadas o las mitocondrias aisladas. 16,17,18,19,20 En este ensayo, la luciferasa se ​​une a ATP y cataliza la oxidación y de quimioluminiscencia de luciferina. 21 La intensidad de la luz emitida es proporcional a la cantidad de ATP en la mezcla de reacción. 22

Estos métodos han revelado la información fundamental sobre la función mitocondrial, incluyendo el hallazgo de que los pacientes con enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer, tienen niveles anormalmente bajos de ATP. 23 Sin embargo, no se puede utilizar la imagen de vida, las células intactas. Por otra parte, los métodos basados ​​en el análisis de células enteras proporcionan un promedio de estado redox o los niveles de ATP en todos los compartimentos de la célula. Medidas en orgánulos aislados son potencialmente problemático porque los niveles de ATP estado o redox mitocondrial pueden cambiar durante el fraccionamiento subcelular. Por último, estudios recientes de nuestro laboratorio y otros indican que losmitocondrias dentro de las células individuales son heterogéneos en función, que a su vez afecta a la vida útil de las células madre y la hija. 3 Por lo tanto, hay una necesidad de medir los niveles de ATP mitocondrial y el estado redox en las células vivas con la resolución subcelular.

Los biosensores para la función mitocondrial aquí descritos están basados ​​en las buenas prácticas agrarias. GFP sensible a redox (roGFP) 24,25 es una variante de GFP en el que se añaden expuestos en la superficie cisteínas de la molécula. roGFP, como GFP de tipo salvaje, tiene dos picos de excitación (400 nm a ~ y ~ 480 nm) y un pico de emisión a ~ 510 nm. La oxidación de los residuos de cisteína en los resultados roGFP en un aumento de la excitación a ~ 400 nm. Reducción de las cisteínas favorece excitación a ~ 480 nm. Por lo tanto, la relación de 510 nm de emisión tras la excitación de roGFP a 480 nm y 400 nm revela la cantidad relativa de reducido y oxidado roGFP, que refleja el estado redox del medio ambiente del fluoróforo.

Dos versiones de roGFP son ampliamente utilizados: roGFP1 y roGFP2. Ambos contienen las mismas inserciones de cisteína. roGFP1 se basa en GFP de tipo salvaje y roGFP2 se basa en S65T de GFP, que tiene de excitación más eficiente a 480 nm de excitación y menos eficiente a 400 nm en comparación con wtGFP 24. roGFP1 es menos sensible al pH que roGFP2 y su rango dinámico se extiende aún más en la gama reducida. Por lo tanto, roGFP1 puede ser más útil para el seguimiento de los compartimentos más reductores tales como mitocondrias o el citosol, y compartimentos con pH variable, como los endosomas. roGFP2 ofrece la señal más brillante y, en algunos estudios, un mayor rango dinámico que roGFP1 24,26. Los estudios en Arabidopsis thaliana indican que el tiempo requerido para la respuesta a los cambios en el estado redox es similar para ambos sensores (t ½ para la oxidación, 65 y 95 segundos y t ½ para la reducción, 272 y 206 segundos, para roGFP1 y roGFP2, respectivamente). 26

MitGO-ATeam2 es mínimamente invasivo y confiablesensor que mide de ATP mitocondrial en la levadura de gemación Saccharomyces cerevisiae. GO-ATeam es una transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) sonda que consiste en la subunidad ε del F o F 1-ATP sintasa intercalada entre FRET donante y aceptor proteínas fluorescentes (GFP y la proteína fluorescente de color naranja (OFP), respectivamente). 27 La unión de ATP a los resultados de la subunidad ε en los cambios conformacionales en la proteína que traen el donante de FRET en estrecha proximidad con el aceptor y permiten la transferencia de energía del donante al aceptor. Hay dos variantes de GO-ATeam, GO-GO-ATeam1 y ATeam2. GO-ATeam2 tiene una mayor afinidad por MgATP de GO-ATeam1, por lo que es más adecuado para la medición de la típicamente inferior [ATP] en comparación con las mitocondrias al citosol. 27

Para sondear estado redox mitocondrial, se construyó una proteína de fusión (mito-roGFP1) que consiste en roGFP1 fusionado a la secuencia líder de una ATP9ND expresa a partir de un centrómero basado en (bajo número de copias) plásmido de expresión de levadura bajo el control del fuerte deshidrogenasa gliceraldehído-3-fosfato (GPD) promotor (p416GPD, Addgene). Se utilizó roGFP1 para sondear el estado redox de las mitocondrias en el contexto del envejecimiento del modelo hongo Saccharomyces cerevisiae. Encontramos que roGFP1 puede detectar cambios en el estado redox mitocondrial que se producen durante el envejecimiento y en respuesta a la disponibilidad de nutrientes, pero no tiene ningún efecto perjudicial evidente en células de levadura. También vemos que la variabilidad en el estado redox de las mitocondrias dentro de las células de levadura vivas individuales, un hallazgo que pone de relieve la importancia de un biosensor con subcelular resolución espacial.

MitGO-ATeam2 es una variante de GO-ATeam2, que tiene la secuencia señal mitocondrial del citocromo c oxidasa subunidad VIII bis se inserta en el extremo amino de GO-ATeam2. 27 Hemos modificado la sonda mitGO-ATeam2 (amablemente proporcionados por el laboratorio de H. Noji, Instituto of Investigación Científica e Industrial de la Universidad de Osaka, Japón) para su uso en la levadura subclonando que, a través de Xba1 y sitios HindIII, en el vector de expresión de levadura pAG415GPD-ccdB (Addgene, Cambridge, MA, EE.UU.), que es una copia de baja plásmido que contiene el promotor fuerte de GPD constitutivo. Expresamos mitGO-ATeam2 en ciernes levadura, y encontramos, por tinción de contraste con el ADN vinculante tinte DAPI, que se localiza exclusivamente en la mitocondria, donde sirve como una sonda eficaz para medir los cambios fisiológicos en los niveles de ATP mitocondrial.

roGFP y GO-ATeam son tanto codificados genéticamente. Como resultado de ello, pueden ser introducidos y mantenidos de forma estable en células intactas, y proporcionan información sobre el estado redox o los niveles de ATP en las células individuales, que viven. Por otra parte, ambos biosensores seguimiento de los cambios en el estado redox o los niveles de ATP que se producen en condiciones fisiológicas. 28 Ambas sondas también son radiométrica. Como resultado de ello, las mediciones realizadas con estas sondas no se ven afectados por changes en la concentración de biosensor o iluminación de la muestra o el espesor. Por último, ambos biosensores proporcionan subcelular resolución espacial. En efecto, roGFP se ha dirigido a las mitocondrias, ER, endosomas y peroxisomas 24, y puede detectar cambios en el estado redox de cada uno de estos orgánulos, en gran medida independientes del pH.

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Protocol

1. La transformación de células de levadura con los biosensores

  1. Transformación de la cepa de levadura deseada con cojinete plásmido mito-roGFP o mitGO-ATeam2 utilizando el método de acetato de litio 27.
  2. Para confirmar la transformación con el plásmido biosensor transmitidas y para prevenir la pérdida del plásmido, seleccionar y mantener los transformantes sobre el medio completo sintético selectivo apropiado (SC-ura para Mito-roGFP, o SC-Leu para mitGo-ATeam2). Si la sonda fluorescente se ha subclonado en un plásmido diferente de los descritos aquí, usar el medio selectivo apropiado. Visualizar transformantes por microscopía de fluorescencia para confirmar que expresan el biosensor fluorescente y exhibir la morfología mitocondrial normal.

2. Crecimiento de las Células y Preparación de la Imagen

Función de la célula y la respuesta al tratamiento con fármacos son altamente dependientes de la densidad celular y la actividad metabólica. Los mejores resultados se obtienen cuando las célulasestán en división activa (fase semi-log, ~ 0,5-1 x 10 7 células / ml). La forma más confiable para generar cultivos en fase logarítmica media de densidad constante es inocular a partir de una pre-cultivo en fase estacionaria.

  1. Preparar un pre-cultivo en fase estacionaria: recoger una única colonia de células transformadas a partir de una placa e inocular medios líquidos selectivos (5 ml en un tubo cónico de 50 ml de fondo). Crecen a 30 ° C con agitación a 225 rpm hasta que la densidad óptica del cultivo a 600 nm (OD 600) ha alcanzado una meseta (24-48 h).
  2. Preparar un cultivo en fase logarítmica media para la observación: utilizar el volumen apropiado de pre-cultivo para inocular 5 ml de medio selectivo en un tubo cónico de 50 ml de fondo. YPD los medios de comunicación es autofluorescente y no debe ser utilizado para estos estudios. Utilice glucosa base, deserción medios sintéticos completos, (SC-Ura). Se cultivan las células a 30 ° C, agitando a 225 rpm, durante 4-16 horas, hasta que alcanzan la fase logarítmica media (~ 0.5 - 1 x 10 7 células / ml). La densidad celular se puede determinarmediante la medición de OD 600; calibrar el espectrofotómetro para determinar la correcta lectura OD 600. En nuestro Beckman DU530 (Beckman Coulter, Indianapolis, IN), la fase logarítmica media corresponde a un OD 600 de 0,1 a 0,3.

Mito-roGFP1 sentidos fluctuaciones en el orgánulo en respuesta a los cambios metabólicos. Por ejemplo, en este ensayo mitocondriales cambios de estado redox cuando la levadura crecer en fuentes de carbono fermentables (por ejemplo, glucosa, como en los medios de comunicación SC) frente a las fuentes de carbono no fermentables (por ejemplo, glicerol, como en SGlyc medios de comunicación), e incluso en diferentes lotes de la misma los medios de comunicación. Por lo tanto, utilizar el mismo lote de medios de comunicación para todos los experimentos.

  1. Las células están listas para la concentración (véase el paso 2.4) y las imágenes si no se realiza ningún tratamiento. Si las células están siendo tratados, incubar las células con el tratamiento adecuado y continuar con el paso siguiente.
  2. Concentrado 1 ml de cultivo por centrifugación a 6000 xg durante 15 seg yla resuspensión del sedimento celular en 20 l de los medios de comunicación. Estas condiciones maximizar el número de células distinguibles en el campo de visión.
  3. Aplicar 2 l de las células resuspendidas a una diapositiva. Cubrir con un cubreobjetos (N º 1.5, preferiblemente de alto rendimiento 170 ± 5 m de espesor), y sellar los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas transparente o valap (véase Reactivos). Para sellar con valap, fundir una pequeña cantidad en una espátula de metal por sosteniéndola sobre llama de un mechero Bunsen, luego se extendió una pequeña cantidad a lo largo de los bordes del cubreobjetos.
  4. Mantener las células a 30 ° C durante la formación de imágenes. Un calentador de objetivo sobre la lente de inmersión en aceite de 100x utiliza para la imagen trabaja bien para esta aplicación. En estas condiciones, la morfología mitocondrial, estado redox y los niveles de ATP permanecen sin cambios durante la formación de imágenes durante 10-15 min.

3. Configuración de imagen

  1. Configuración para imágenes mito-roGFP1 en un microscopio de fluorescencia de campo amplio
    Los pasos que aquí se adaptan a la AxioObserver.Z1 microscopio equipado con una fuente de Colibri LED de excitación, un gran campo Orca ER cámara y software de adquisición de Axiovision. Photobleaching de ambos canales y fotoconversión de oxidados mito-roGFP1 se reduce significativamente el uso de la iluminación del LED en comparación con el arco de mercurio de la lámpara de iluminación (ver más abajo).
    Para maximizar la señal y la resolución, utilice la más alta apertura numérica posible en el objetivo, y el aumento más bajo que proporciona suficiente resolución espacial. Además, para Mito-roGFP formación de imágenes, compruebe que el objetivo transmite bien a 365 nm. El 100x/1.3NA CE PlanNeofluar objetivo (Zeiss) funciona bien para esta aplicación.
    Configure el software de adquisición de capturar las especies mito-roGFP1 oxidadas y reducidas. Utilizamos las siguientes condiciones.
    1. Configure el canal para oxidar mito-roGFP utilizar excitación a 365 nm (100% de potencia LED) y un filtro de emisión adecuados para las buenas prácticas agrarias, como el Juego de filtros 38 HE (Zeiss), con el excitatio incluidon filtro elimina de la cubo. La eliminación del filtro de excitación permite excitación a 365 nm y ambos 470 nm sin la necesidad de cambiar los filtros, aumentando así el tiempo de resolución alcanzable.
    2. Configure el canal para reducir el mito-roGFP utilizar excitación a 470 nm (100% de potencia LED) y, como se mencionó anteriormente, el mismo cubo filtro de emisión utilizado para la oxidación mito-roGFP. Coloque la cámara en 1x1 agrupación para optimizar la resolución espacial.
    3. Establecer programas para adquirir pila az consta de 11 cortes con espaciado de 0,5 m, la recogida de los dos canales en cada posición de z. Este modo de adquisición es más lenta que la adquisición de cada pila z, a su vez, pero impide que los artefactos derivados de movimiento mitocondrial entre la adquisición de los canales oxidada y reducida.
    4. Image varias células para determinar un tiempo de exposición apropiado, produciendo una señal de saturación fuerte pero no. Es importante mantener la relación de tiempos de exposición para oxidado y reducido mito-roGFP1 para todos experimentos. Por ejemplo, si los tiempos de exposición para oxidado y reducido mito-roGFP1 son 300 y 100 ms, respectivamente, entonces el tiempo de exposición para oxidado mito-roGFP1 debe ser 3 veces mayor que para la reducción de mito-roGFP para todos los experimentos.
  2. Configuración para imágenes mitGO-ATeam2 en un microscopio confocal espectral
    Para cuantificar los niveles de ATP utilizando mitGO-ATeam2, la fluorescencia de GFP (máximos de emisión 510 nm) debe distinguirse de la que a partir de OFP (máximo de emisión 560 nm). Hay juegos de filtros de fluorescencia que resuelven la fluorescencia emitida por estos fluoróforos. Sin embargo, nos encontramos con que un detector espectral, disponible en muchos microscopios confocal láser, que funciona mejor para esta aplicación. Un detector espectral separa la emisión de fluorescencia en muchos componentes (típicamente 32 o más) de acuerdo con la longitud de onda. Varias bandas de longitud de onda adyacentes se pueden combinar en un solo canal de la imagen. Las longitudes de onda a ser combinados se seleccionan empíricamente a fin de maximizar la señal de GFP y la OFP y evitar cruce de señal que confundir la medición de FRET. Utilice el más alto objetivo de apertura numérica disponible. Utilizamos un 100x/1.49 o 60x/1.49 lente Apo-TIRF. Usamos la Nikon A1R microscopio confocal con software Elementos NIS. Configure el software de adquisición de capturar la especie mitGO-ATeam2 ATP y con plazos ATP-independiente. Utilizamos las siguientes condiciones.
    1. Establecer pinhole de 1,0 unidades de Airy (UA), que en nuestro sistema corresponde a la resolución az de unos 0,42 m.
    2. Ajuste zoom de exploración para acercarse al límite de muestreo de Nyquist, que maximizará la información espacial en la imagen. En nuestro sistema, el tamaño del píxel es de 0,12 micras.
    3. Debido a las mitocondrias pueden moverse durante la exposición, puede ser útil para aumentar la velocidad de imagen recortando el campo a 512 x 256 píxeles. El tiempo total requerido para un cuadro de imagen en nuestro sistema es 1,0 seg, incluyendo un medio de exploración de 2 veces. Dependiendo de la resolución espacial deseada, el campo se puede recortar cada vez más ae resolución de tiempo.
    4. Excite a 488 nm, y recoger las emisiones 500-520 nm para GFP, y 550 a 580 nm para la OFP. Valores óptimos reales pueden variar con las características del sistema de formación de imágenes.
    5. La potencia del láser óptima para nuestro sistema es entre 6,0 y 6,4%. La potencia láser óptima variará para cada sistema de microscopio, pero, idealmente, ser tan bajo como sea posible y seguir produciendo una imagen interpretable. Utilice un medidor de potencia interna o externa para monitorear los cambios en la potencia del láser, que se producen normalmente con el tiempo en cualquier sistema óptico.
    6. Ajustar la ganancia del detector y la intensidad de luz de iluminación para maximizar el rango de valores de píxel detectado pero evitar la saturación de la señal, para tantas celdas como sea posible. No analizar las células que contienen más de 1% de píxeles saturados. Imagen todas las muestras utilizando el mismo objetivo, la potencia del láser, escaneo zoom, tamaño de píxel, la ganancia y offset.

4. Adquisición de imágenes

  1. Localice el pla focal ne de las células de interés utilizando luz transmitida para minimizar la decoloración sonda fluorescente.
  2. Después de localizar una o más células de interés, recoger una serie z-a través de toda la profundidad de una célula típica (aprox. 7 micras) utilizando un tamaño de paso de 0,5 micras.
  3. Imagen otras células de interés en la diapositiva, pero sin hacer una sola imagen de diapositiva durante más de 15 min. Después de 15 min en la diapositiva, las células pierden su viabilidad.

5. Análisis

Nivel de ATP mitocondrial se determinó mediante la medición de la relación de la emisión mitGO-ATeam2 a 560 nm que a 510 nm en 27 El estado redox del orgánulo se mide como el reducido a oxidado (R / S) relación de Mito-roGFP;. Es decir emisión a 510 nm tras excitación a 470 nm dividida por la emisión a 510 nm tras excitación a 365 nm. Antes de calcular la relación, restamos fondo y determinar un valor umbral para los píxeles pertenecientes a la mitocondria fluorescente.

tienda de campaña "> dominio público (por ejemplo, ImageJ 30) o disponible en el mercado (por ejemplo, Volocity, Perkin-Elmer) de software se puede utilizar para el análisis de Mito-roGFP1 o mitGO-ATeam2. Dependiendo del software utilizado para la adquisición de la imagen y para el análisis, las imágenes puede que necesite convertir a otro formato, como TIFF, antes de abrirlos en el software de análisis. Si las imágenes se convierten, es esencial para verificar que los valores de píxel no se cambian durante la conversión. Análisis de los datos de Mito-roGFP1, utilizando se describen los dos programas a continuación. menús de programa y opciones para elegir dentro de cada menú se resaltan en negrita y cursiva.

5.1 Análisis ImageJ

  1. Abrir imágenes y cambiar el tipo de 32 bits: imagen → Tipo → 32 bits.
  2. Dibuje una región de interés (ROI) en un área donde no hay células. Calcular la media de intensidad en este retorno de la inversión: Analizar → Medir.
  3. Reste el fondo media calculada a partir de la pila: Proceso → Matemáticas → Resta.
  4. Uso de la z-stack resta, encontrar el trozo central y el umbral de las mitocondrias: Imagen → Ajustar → Umbral y haga clic en Aplicar en la ventana Umbral. Aplicar a todas las rebanadas en la pila. Marque la casilla Establecer píxeles de fondo de NaN.
  5. Crear la relación z pila: Proceso → Calculadora Image Divida la pila reducida por la pila z oxidado para el análisis mito-roGFP1. Divide la imagen 560 nm (ATP determinada) por los 510 nm imagen (ATP unido) para el análisis mitGO-ATeam2.
  6. Dibuja un ROI alrededor del área de interés. Seleccione Analizar → Herramientas → ROI Manager, haga clic en Agregar para registrar el retorno de la inversión. Regiones múltiples pueden ser almacenados en el gestor. En ROI Manager, seleccionar todo ROI, a continuación, elija M→ mineral de medidas múltiples para medir todos los sectores de la pila. Exportar datos a una hoja de cálculo para su análisis.

5.2 Análisis Volocity

  1. Importación de imágenes en una biblioteca Volocity y crear una secuencia de imágenes de 2 canales.
  2. Dibuje una región de interés (ROI) en un área donde no hay células. Seleccione: Herramientas → Ratio.
  3. Utilice Volocity para calcular el fondo: obtener de retorno de la inversión.
  4. Ajuste del umbral para incluir estructuras mitocondriales.
  5. Marque la opción de aplicar una LUT arco iris para el canal de relación. El canal de intensidad modulada puede producir una imagen menos ruidoso para presentación, pero no debe ser utilizado para la cuantificación de la relación de la media.
  6. Seleccione la pestaña de Medición, seleccione el canal de relación y sacar un rendimiento de la inversión en la zona de interés. Mida el canal de relación, con exclusión de los valores cero. Regiones múltiples pueden ser seleccionados y medidosal mismo tiempo. Exportar datos a una hoja de cálculo para su análisis.

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Representative Results

Medición del estado redox mitocondrial con mito-roGFP

Aquí, mostramos que mito-roGFP1 tiene el rango dinámico para detectar cambios en el estado redox mitocondrial de totalmente oxidado a reducido en células de levadura viva, sin afectar el crecimiento de células de levadura o en la morfología mitocondrial. En primer lugar, nos encontramos con las células que expresan GFP mitocondrias-dirigida y roGFP1 crecen a tasas normales (Figura 1A). La máxima tasa de crecimiento, tal como se mide por la pendiente máxima de la curva de crecimiento durante el crecimiento en fase logarítmica y el tiempo para alcanzar la tasa de crecimiento máximo, es similar en células que expresan Mito-GFP y mito-roGFP1. Por otra parte, la mitocondria de la levadura que expresa mito-roGFP1 exposición morfología de tipo salvaje (Figura 1B). En concreto, son tubulares, se alinean a lo largo del eje de la madre del brote, y se acumulan en las puntas de las células madre y la hija. Dado que la disfunción mitocondrial a menudo induce la fragmentación, esta morfología normal, apoya la idea de que el mito-roGFP1 haceno perturban la función mitocondrial.

Para evaluar el rango dinámico de mito-roGFP1, hemos tratado de fase células de levadura de tipo salvaje mediados de registro con peróxido de hidrógeno (H 2 O 2) y ditiotreitol (DTT), respectivamente, y se midió la relación R / S mitocondrial media para evaluar mitocondrial estado redox (Figura 2). La titulación con H 2 O 2 o TDT de 0 a 10 mM resultados en un cambio dependiente de la dosis en relación media celular R / S con un rango medido desde 0,6 (en condiciones oxidantes) a 1,23 (en condiciones reductoras). Por lo tanto, mito-roGFP1 es un biosensor eficaz para el análisis de estado redox mitocondrial en células vivas.

Mito-roGFP1 también ofrece resolución subcelular de estado redox mitocondrial. Esta resolución subcelular revela que las mitocondrias dentro de las células individuales de levadura difieren en estado redox relativo. Si las mitocondrias dentro de una sola célula de levadura son funcionalmente distintos, es posible que ely son pasiva o activa segregada (Figura 3). Dicha separación puede contribuir a la edad de madre e hija asimetría y el rejuvenecimiento de las células hijas. Este hallazgo pone de relieve la necesidad de un biosensor con resolución subcelular de estado redox mitocondrial.

Durante mucho tiempo se ha conocido 31 que la luz puede inducir cambios en el cromóforo de GFP. Tras la exposición a la luz de alta intensidad de 400 nm, roGFP1 fotoconversión somete a una especie con un espectro de emisión diferente 26. Cuando se produce fotoconversión, hay una disminución en la emisión de verde de oxidada mito-roGFP1 y un aumento de la emisión verde después de la excitación de la reducción de mito-roGFP1, lo que altera la relación de I / O Mito-roGFP1 (Figura 4B). El uso de excitación (por ejemplo la iluminación en un 40% el uso de los LED de la fuente de luz Colibri 400 nm) de baja intensidad, no hay fotoconversión significativo durante el período analizado (Figura 4C). El p se refiere manera de reducir fotoconversión es para excitar la forma oxidada de roGFP a 365 nm (véase la discusión).

Medición de ATP mitocondrial con mitGO-ATeam2

MitGO-ATeam2 localiza en las mitocondrias cuando se expresa en células de mamífero. 27 Encontramos que mitGO-ATeam2 colocalizes con el ADN mitocondrial DAPI-manchado en la levadura, y se encuentra en estructuras tubulares típicas de tipo salvaje mitocondria de levadura (Figura 5). Por lo tanto, se verificó que la secuencia de direccionamiento mitocondrial de mamíferos de la citocromo c oxidasa subunidad VIIIA localiza la sonda a la mitocondria en la levadura sin interrumpir la morfología mitocondrial. Además, encontramos que la tasa de crecimiento de las células que expresan mitGO-ATeam2 es similar a la de las células que expresan GFP-mitocondria específica tanto en la glucosa y los medios de comunicación de glicerol (Figura 5B). Por lo tanto, la expresión de mitGO-ATeam2 no aparece perjudicial para la célula o las mitocondrias.

_content "> A continuación, probamos si la mitGO-ATeam2 FRET responde a los cambios en los niveles de ATP mitocondrial. Para ello, las células tratadas con antimicina A, un agente que se une al citocromo c reductasa, inhibe la oxidación del ubiquinol en la cadena de transporte de electrones , interrumpe el gradiente de protones, e inhibe la producción de ATP mitocondrial. 20 La mediana de FRET disminuye la relación en las células tratadas con antimicina A (Figura 6C).

Dada la evidencia que mitGO-ATeam2 es un biosensor eficaz para ATP mitocondrial, se utilizó esta sonda para monitorear los niveles de ATP mitocondrial en la levadura que se propagan usando una fuente fermentable o no fermentable de carbono (Figura 6A y 6B). La reducción de la superficie fluorescente total de la glucosa en las células cultivadas en confirmó que los resultados de la represión de glucosa en una disminución de la abundancia mitocondrial. Tomamos nota de la variación de célula a célula en el nivel de mitGO-ATeam2. Curiosamente, nuestros datos preliminares indican que hay ma y haber diferencias en los niveles de ATP en las mitocondrias diferente dentro de la misma célula (Figura 6D).

Figura 1
Figura 1. Mito-roGFP1 detecta estado redox mitocondrial sin afectar las tasas de crecimiento de las células o la morfología mitocondrial. (A) Crecimiento de la levadura que expresan las mitocondrias orientada GFP o ro-GFP1 se midió como el cambio en la densidad óptica a 600 nm como una función del tiempo de crecimiento en SC-Ura medio líquido a 30 ° C. (B) Paneles superiores: normal morfología mitocondrial y el canal de localización de imágenes en bruto. Paneles inferiores: imágenes muestran la relación canal reducido dividido por el canal oxidado (referencia de color a la derecha). Las imágenes muestran el efecto de la elección de umbral en los resultados. El umbral óptimo incluye estructuras mitocondriales y excluye fondo.jove.com/files/ftp_upload/50633/50633fig1hires.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver más grande la figura.

La figura 2

Figura 2. Mito-roGFP1 detecta cambios en el estado redox mitocondrial en respuesta al tratamiento con peróxido de hidrógeno o ditiotreitol. (AB) células de levadura fase semilogarítmica expresar mito-roGFP1 se incubaron en SC-ura medios de comunicación con ningún tratamiento (0) o con las concentraciones indicadas de H 2 O 2 o TDT durante 20 minutos a 30 ° C. (A) proyecciones de máxima intensidad de las imágenes mito-roGFP1 relación R / S se superponen a las imágenes de luz transmitida, que muestran contornos celulares. La referencia del color de mito-roGFP1 se muestra arriba a la derecha. Bar:. 5 mM (B) Haz clic aquí para ver más grande la figura.

Figura 3
Figura 3. Mito-roGFP1 ofrece una resolución subcelular de estado redox mitocondrial. Una proyección de máxima intensidad de la mito-roGFP1 canal de relación R / S se superpone a una imagen de luz transmitida. La referencia del color de mito-roGFP1 se muestra arriba a la derecha. Barras: 5 mM. Esta célula en particular tiene una relación media mito-roGFP1 R / O de 0,88. Sin embargo, las mitocondrias individuales dentro de esta celda muestran diferentes estados redox. Los números que se muestran en la mito-roGFP1 relación calculada de I / O para diferentes re mitocondrialregiones. Haz clic aquí para ver más grande la figura.

Figura 4
La Figura 4. Excitación de alta intensidad provoca fotoconversión y alteración de I / O Mito-roGFP1 ratios. Levadura fase semilogarítmica expresar mito-roGFP1 se ilumina con luz de 400 nm a 40% (A) o 100% (B) la energía de una fuente de luz LED , y la fluorescencia de reducido y oxidado mito-roGFP1 fue capturado cada 4 segundos. Las imágenes mostradas son proyecciones de máxima en la que los colores representan la relación R / S del mito-roGFP1 (véase la escala de color en la parte inferior derecha). Barras:. 5 mM (C) La relación de Mito-roGFP1 R / S se mantuvieron constantes durante el período de formación de imágenes tras la iluminación en el 40% de energía del LED. Sin embargo, tras la iluminación al 100% de potencia de LED,observar un cambio dependiente del tiempo en relación de Mito-roGFP1, que refleja photoswitching del fluoróforo R / S. Los cuadrados negros, el 40% de potencia LED;. Diamantes grises, 100% de potencia LED Haga clic aquí para ver más grande la figura.

La figura 5
Figura 5. MitGO-ATeam2 se localiza en las mitocondrias en la levadura y no afecta a las tasas de crecimiento de células de levadura. (A) Las células de levadura que expresan mitGO-ATeam2 se hicieron crecer hasta fase semilogarítmica, fijado utilizando paraformaldehido y se tiñeron con el colorante de unión a ADN DAPI, tal como se describe anteriormente 19. Las imágenes mostradas son proyecciones de máxima intensidad de deconvolved z-series. Por simplicidad, se obtuvieron las imágenes mitGO-ATeam2 utilizando un filtro de GFP convencional, por lo que sólo representan la población no unido a ATP. Móvil cabolíneas se muestran en blanco. N: ADN nuclear. ADNmt: ADN mitocondrial. Bar: 1 m (B) Curvas de crecimiento de las células de levadura de tipo salvaje que expresan GFP mitocondrias-objetivo o mitGO-ATeam2 de la glucosa a base (SC) y basado en glicerol (SGlyc) medio líquido a 30 ° C.. Estos datos son la media de quadruplicates para cada cepa en cada momento, y es representativo de dos experimentos independientes. Haz clic aquí para ver más grande la figura.

La figura 6
La Figura 6. Medidas MitGO-ATeam2 cambios en los niveles de ATP en la mitocondria de levadura con una resolución subcelular y suborganellar. (AB) Emisión de mitGO-ATeam2 de GFP (510 nm) y CCO (560 nm) y de cuantificación de la tasa de emisión de 560/510 nm de la levadura las células cultivadas durante la noche en glucose-basado (SC) (A) o basado en glicerol (SGlyc) (B) los medios de comunicación. El color de referencia para el canal 560/510 ratio se muestra abajo a la derecha. Barras: 1. Micras (C) Cuantificación de la relación 560/510 para las células propagadas en los medios de comunicación SGlyc con o sin antimicina A (2 g / ml) durante 1 hora a 30 ° C. La disminución en los niveles de ATP sobre antimicina A de tratamiento es estadísticamente significativa (prueba de significación de Kruskal-Wallis). (D) 560 nm/510 nm relación de mitGO-ATeam2 de una fase de células de tipo salvaje mediados de registro reproducidos en los medios de comunicación SC. El color de referencia para el canal 560/510 ratio se muestra abajo a la derecha. El contorno celular se muestra en blanco. La relación media de 560/510 nm para toda la célula es 0,43. Los números que aparecen son las 560/510 nm proporciones de regiones específicas dentro de las mitocondrias. Bar: 1 m. Haz clic aquí para ver más grande la figura.

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Discussion

A continuación, se describen los métodos para utilizar mito-roGFP1 y mitGO-ATeam2 como biosensores para evaluar los niveles de ATP estado redox mitocondrial y en células de levadura viva. Encontramos que la expresión del plásmido transmitidas por Mito-roGFP1 o mitGO-ATeam resultados en orientación cuantitativa a las mitocondrias, sin ningún efecto evidente sobre la morfología o distribución mitocondrial o en las tasas de crecimiento celulares. 3 Mito-roGFP1 puede detectar cambios en el estado redox mitocondrial de altamente oxidado a estados muy reducidos. Del mismo modo, mitGO-ATeam puede medir los cambios en los niveles de ATP mitocondriales que se producen en la levadura experimentando un crecimiento impulsado por la respiración y la levadura tratada con un inhibidor de la respiración. Por otra parte, ya que ambos biosensores ofrecen una resolución subcelular, que pueden detectar la heterogeneidad en el estado redox o los niveles de ATP de las mitocondrias dentro de las células individuales. Por último, ya que ambos biosensores son sondas radiométricos, que no se ven afectados por cambios en la concentración o la variabilidad en el espesor de la muestra o enfermoumination. Estas sondas proporcionan un enfoque mínimamente invasivo para el estudio de la función mitocondrial con resolución subcelular en las células vivas.

Para aplicar con éxito este método, las imágenes deben ser adquiridos con la relación máxima posible de señal-a-ruido. Un importante primer paso es examinar las células 10-20 colonias transformantes bajo el microscopio y seleccionar aquellos con fluorescencia robusta y morfología mitocondrial normal y las tasas de crecimiento. A continuación, las condiciones de formación de imágenes deben ser optimizados para producir alta, pero no saturar, intensidades sin causar daño solar a la proteína fluorescente o las células. Unas pocas células en una población (<1%) pueden tener inusualmente alta o baja fluorescencia en general debido a la variación en el número de copias del plásmido; éstos pueden descartarse en favor de la captura de imágenes interpretables de la mayoría de las células.

Si bien los beneficios de la mito-roGFP son claras, también es importante ser conscientes de los peligros potenciales. Detectamosdiferencias en el potencial redox mitocondrial no sólo con diferencias fuente de carbono inducidas en el metabolismo celular, sino también de la propagación de la levadura en diferentes lotes del mismo medio. Por lo tanto, se debe tener cuidado al elegir los medios de cultivo de células para mediciones redox mitocondrial. Por otra parte, aunque mito-roGFP ofrece resolución espacial sin precedentes de estado redox mitocondrial, la resolución temporal de roGFP no es suficiente para detectar ráfagas de ROS que están asociados con la transducción de señal de ROS 31. Por último, se debe tener cuidado al elegir la longitud de onda de excitación y la intensidad de la forma oxidada de roGFP. Iluminación a 400 nm excita óptimamente las especies oxidadas de roGFP. Sin embargo, también excita roGFP reducido en mayor medida en comparación con excitación a 365 nm. Esto conduce a la reducción de la sensibilidad en la medición de estado redox mitocondrial. Por otra parte, la exposición de Mito-roGFP1 a la iluminación de alta intensidad a 400 nm conduce a fotoconversión de la proteína a una especificaciónIES con propiedades espectrales alteradas. No hemos visto fotoconversión tras la iluminación de alta intensidad a 365 nm. Por lo tanto, se recomienda el uso de excitación 365 nm, si es posible.

MitGO-ATeam2 también tiene limitaciones. Por ejemplo, desde mitGO-ATeam2 es en sí misma una proteína que puede ser dañado por insultos celulares, incluyendo especies de oxígeno reactivas, que pueden afectar a su actividad biosensor. Además, GFP y longitudes de onda de emisión OFP (510 y 560 nm) deben ser resueltos para FRET análisis, que puede ser difícil en los microscopios de fluorescencia convencionales.

A diferencia de los ensayos enzimáticos in vitro, estos ensayos de células en vivo reportan cambios relativos en la ATP mitocondrial o el estado redox, y no miden la concentración absoluta de ATP o reducir la cisteína. Aunque una curva estándar teóricamente podría ser generada mediante la medición de la respuesta del sensor de proteínas en solución, esto no podría aplicarse a la diferente ambiente molecular dentro de la mitocondria. Ther ntes, estos ensayos proporcionan un medio de comparación de células en diferentes condiciones. Además, las condiciones de formación de imágenes varían, por lo que los valores exactos de relación adquiridos en una configuración de formación de imágenes no pueden ser replicados en otro.

Estas técnicas para relación de formación de imágenes se pueden adaptar para otros indicadores radiométricos, incluyendo otra roGFP o isoformas GO-ATEAM y otras sondas funcionales. La elección de la microscopía de campo amplio o confocal dependerá de la sonda y la resolución espacial requerida. El método de campo amplio se utiliza aquí para Mito-roGFP, ya que permite la excitación a 365 nm, lo que mejora la sensibilidad y la estabilidad del sensor. El método confocal con un detector espectral, tal como se utiliza aquí para mitGO-Ateam, proporciona una manera conveniente para eliminar cruce de emisión mediante el ajuste de las ventanas de detección espectrales. Sin embargo, es posible llevar a cabo experimentos similares en microscopia de campo amplio mediante el uso de filtros personalizados o la eliminación de cruce computacionalmente.

ntent "> La dificultad más común en este tipo de experimento de imágenes es la señal es insuficiente. hardware de imágenes (especialmente la lente del objetivo y el detector) es crítica para la recogida de señal suficiente para interpretar los datos.

Los pasos umbralización tienen una gran influencia en los resultados, como la inclusión de los píxeles de fondo puede frenar cualquier tendencia en las relaciones obtenidas. Métodos automáticos son preferibles, pero debido a una señal limitada, umbral manual es a menudo el mejor método disponible. Si se utilizan umbrales manuales, los criterios utilizados deben ser articulados, así como sea posible, y puede ser necesario el análisis a realizar a ciegas o por diferentes experimentadores para demostrar la reproducibilidad. Los experimentos de control con antimicina A (para mitGO-Ateam2) y H 2 O 2 o TDT (por mito-roGFP) pueden utilizarse para confirmar los cambios previstos en los coeficientes de fluorescencia.

Mito-roGFP y mitGO-ATeam2 son no invasivos, sondas radiométricos para la vigilancia mitogimnasio mitocondrial en células de levadura viva. Los sensores radiométricos usadas aquí fueron dirigidos a la mitocondria por la fusión de una secuencia de señales mitocondrias específicas. Otros compartimentos celulares podrían ser estudiados con la adición de secuencias de direccionamiento adecuadas para los sensores originales. Además, es posible combinar cualquiera de estos sensores con marcadores fluorescentes complementarias (por ejemplo, para orgánulos o factores de señalización) o sensores (por ejemplo, de calcio) para medir simultáneamente múltiples procesos en las células vivas.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por concesiones del HHMI 56006760 a JDV, los Institutos Nacionales de Salud (NIH) (2 TL1 RR 24158-6) para DMAW, y de la Fundación Médica Ellison (AG-SS-2465) y el NIH (GM45735, GM45735S1 y GM096445) a LP. GM45735S1 se emitió desde el NIH bajo la Ley de Reinversión de 2009 Recuperación y. Los microscopios utilizados para estos estudios fueron apoyados en parte por una subvención del NIH / NCI (5 P30 CA13696).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
  Reagents
Antimycin A Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) 1397-94-0 Dissolved in ethanol to a 2 mg/ml stock solution.
SGlyc (synthetic glycerol-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura
**omit for SGlyc-Leu
Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave.

Ingredients:
0.67% Yeast nitrogen base without amino acids
3% Glycerol
0.05% Glucose
2 mg/ml adenine
2 mg/ml uracil*
1 mg/ml L-arginine
1 mg/ml L-histidine
1 mg/ml L-leucine**
3 mg/ml L-lysine
2 mg/ml L-methionine
4 mg/ml L-phenylalanine
2 mg/ml L-tryptophan
3 mg/ml L-tyrosine
SC (synthetic complete, glucose-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura
**omit for SGlyc-Leu
Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients:
0.67% Yeast nitrogen base without amino acids
3% Glucose
2 mg/ml adenine
2 mg/ml uracil*
1 mg/ml L-arginine
1 mg/ml L-histidine
1 mg/ml L-leucine**
3 mg/ml L-lysine
2 mg/ml L-methionine
4 mg/ml L-phenylalanine
2 mg/ml L-tryptophan
3 mg/ml L-tyrosine
Valap Combine ingredients in a 1:1:1 (w:w:w) ratio. Melt by submerging in a 70 °C H2O bath. Aliquot into glass petri dishes. Store at room temperature. Ingredients:
Vaseline petroleum jelly, hard paraffin, lanolin
  Equipment and Software
Precleaned Gold Seal Rite-on Micro Slides Thomas Scientific (Swedesboro, NJ) 3050 Size: 25 x 75 mm; Thickness: 0.93 to 1.05 mm
High-performance coverslips, No. 1.5, 18x18 mm Zeiss (Thornwood, NY) 474030-9000-000 These are less variable in thickness (170±5 μm) than standard coverslips, reducing spherical aberration and improving 3D imaging performance
Fisherbrand Microscope Cover Glass, No. 1.5 Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) 12-545E Size: 22 x 22 mm, No. 1.5 thickness (170 μm)
A1 laser scanning confocal microscope with spectral detector and 100x/1.49 NA Apo-TIRF objective Nikon (Melville, NY)  
AxioObserver.Z1 microscope equipped with a 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar objective (Zeiss) and Orca ER cooled CCD camera (Hamamatsu) and controlled by Axiovision software Zeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Hamamatsu City, Japan)  
Volocity 3D Image Analysis software Perkin Elmer (Waltham, MA) Restoration module for deconvolution; Quantitation module for ratio calculation and measurement
ImageJ software National Institutes of Health (Bethesda, MD) http://rsb.info.nih.gov/ij/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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