Yaşam Maya Hücreleri Mitokondriyal Redoks Devlet ve ATP ölçün oranlı metrik Biyosensörler

* These authors contributed equally
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Biz canlı maya hücrelerinde hücre içi çözünürlükte mitokondriyal redoks devlet ve ATP düzeylerini izlemek için, GFP temel alan iki rasyometrik, genetik olarak kodlanmış biyosensör, kullanımı açıklanmaktadır.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Vevea, J. D., Alessi Wolken, D. M., Swayne, T. C., White, A. B., Pon, L. A. Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells. J. Vis. Exp. (77), e50633, doi:10.3791/50633 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Mitokondri enerji metabolizması ve hücre ömrü ve programlanmış hücre ölümü kontrol etmek için kalsiyum homeostazı, birçok hücresel süreçlerde rol oynarlar. Bu süreçler etkiler ve redoks durumu ve mitokondri tarafından ATP üretimi etkilenir. Burada, maya hücreleri canlı hücre içi çözünürlükte mitokondriyal redoks devlet ve ATP düzeyini algılar iki rasyometrik, genetik olarak kodlanmış biyosensör kullanımını tarif. Mitokondriyal redoks devlet mitokondrial matriks hedeflenmektedir redoks duyarlı Yeşil floresan proteini (roGFP) kullanılarak ölçülür. Mito-roGFP da protein uyarma spektrumu değiştirebilir geri ve çevre-bağımlı oksidasyon ve redüksiyon, tabi pozisyonlar 147 ve GFP 204, de sistein içerir. MitGO-ATeam F o ε altbirim F 1-ATP sentetaz arasına sıkıştırılmış olduğu bir Förster rezonans enerji transferi (FRET) probu, donör ve alıcı Fluo FRETrescent proteinler. Getirmek protein konformasyonunun olarak ε altbirim sonuçlarına ATP bağlama yakın verici ve alıcı ve verici FRET gelen alıcı için floresans rezonans enerji transferi için izin verir.

Introduction

Mitokondri amino asitler, yağlı asitler, heme, demir sülfür, kümeleri ve pirimidinlerin ATP üretimi, biyosentezi için gerekli organellerdir. Mitokondri de kalsiyum dengesinin önemli rol oynarlar ve apoptoz düzenlenmesinde. Parkinson hastalığı, Alzheimer hastalığı, Amyotrofik lateral skleroz ve Huntington hastalığı gibi yaşlanma ve yaşa bağlı hastalıklara mitokondri Artan 1 kanıt bağlantılar. 2 kişi ile bütün hayatlarını yaşarken nörodejeneratif hastalıklar ile ilişkili protein, mitokondriyal mutasyonlar, hastalık semptomları ileri yaşlarda ortaya çıkar. Bu değişiklikler ortaya hastalık patolojisi izin yaşla birlikte mitokondri meydana gösterir. Gerçekten de, mitokondriyal spor genel hücre sağlığı ve ömrü maya ve memeli hücreleri ile ilişkilidir. Burada 3,4, biz mitoc iki kritik özellikleri değerlendirmek için genetik olarak kodlanmış, rasyometrik floresan biyosensörler nasıl kullanılacağı açıklanmaktadırmaya hücreleri canlı hondria: redoks devlet ve ATP seviyeleri.

Aerobik enerji seferberlik içinde mitokondriyal fonksiyonu iyi bilinmektedir. Mitokondriyal redoks devlet NAD + / NADH, FAD / FADH 2, NADP + / NADPH, glutatyon / glutatyon disülfit (GSH / GSSG) ve reaktif oksijen türlerinin (ROS) dahil olmak üzere, organel türlerin azaltılması ve oksitleyici bir ürünüdür. Mitokondri veya hipoksi ayrılması mitokondriyal solunum faaliyeti etkiler ve NAD oranı + organelde NADH için değiştirir. Iç mitokondriyal zarın bir elektron nakil zincirinin kompleksleri, hem de aminlerin deaminasyon gelen dış mitokondriyal membranın monoamin oksidaz ile 5, hasar lipidler, proteinler ve nükleik asitler arasındaki yetersiz elektron transferinden imal edilmiştir ve ROS 6,7,8 yaşlanma ve yaşla ilişkili nörodejeneratif hastalıklar ile bağlantılı olmuştur. ROS, aynı zamanda m sinyal transdüksiyonu bir rol oynayabiliritochondria, GSH oksidasyonu ile. Örneğin, NADH dehidrogenaz ROS üretimine katkıda değil, aynı zamanda glutatyon havuzu 9,10 ile etkileşim yoluyla düzenlenir. α-Ketoglutarat dehidrogenaz ve asonitaz, TCA döngüsü bileşenleri, ortamlar 11,12 oksitleyici azalmış aktivite gösterirler.

Gerçekten de, asonitaz faaliyet redoks bağımlı düzenleme bakterilerden memelilere 13,14 için korunur. Böylece, redoks devlet ve mitokondri ATP seviyeleri izleme hastalığı patoloji kendi işlevini ve rolünü anlamak için çok önemlidir.

Biyokimyasal yöntemler redoks devlet veya tüm hücrelerin ATP düzeylerini değerlendirmek için kullanılan ya da mitokondri izole edilmiştir. Bütün hücrelerde ya da redoks durumunu değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan yöntemler mitokondri izole redoks çifti GSH / GSSG 15 seviyelerinin ölçülmesi dayanmaktadır. Lusiferin-lusiferaz sistemi yaygın mitokondriyal ölçmek için kullanılırMitokondri permeabilize bütün hücreler veya izole edilmiş ya da ATP seviyeleri. 16,17,18,19,20 Bu deneyde, lusiferaz orantılıdır ATP ye bağlanan ve oksitlenmesi ve luciferase ikinci kemilüminesans katalize eder. 21 yayılan ışık şiddeti Reaksiyon karışımı, ATP. 22

Bu yöntemler, örneğin Alzheimer hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıklar, anormal derecede düşük olan hastalarda ATP seviyeleri bulgu da dahil olmak üzere, mitokondriyal fonksiyonu, ilgili temel bilgiler ortaya konmuştur. 23 Bununla birlikte, görüntü canlı, sağlam hücreler için kullanılamaz. Ayrıca, tüm-hücre analizine dayalı yöntemler redoks durumu ya da hücrenin tüm bölümlerinde ATP seviyelerinin bir ortalaması sağlar. Mitokondriyal redoks devlet veya ATP seviyeleri hücre içi fraksiyon sırasında değişebilir çünkü izole organeller ölçümler potansiyel sorunlu. Son olarak, laboratuar ve diğerlerinden son çalışmalar gösteriyor kitek tek hücreler içinde mitokondri da anne ve yavru hücrelerin ömrünü etkiler, fonksiyon heterojendir. 3 Bu nedenle, hücre içi çözünürlüğe sahip canlı hücrelerde mitokondriyal ATP seviyeleri ve redoks ölçmek için bir ihtiyaç vardır.

Her iki GFP dayalı mitokondriyal fonksiyon için biyosensör Burada anlatılan. Redoks-duyarlı GFP (roGFP) 24,25 yüzeye maruz kalan sisteinler molekülüne ilave edildiği bir GFP çeşididir. roGFP, yabani tip GFP gibi, iki uyarma tepeler (~ 400 nm ve 480 nm 'de ~) ve ~ 510 nm'de emisyon tepe vardır. ~ 400 nm'de eksitasyon artışa roGFP sonuçlarında sistein kalıntıları oksidasyonu. Bu sistein azaltılması ~ 480 nm uyarma yanadır. Böylece, 480 nm ve 400 nm dalga boyunda roGFP uyarma üzerine 510 nm emisyon oranı fluorofor en ortamının redoks durumunu yansıtan azalır ve okside roGFP, göreli miktarını ortaya koymaktadır.

İki versroGFP iyonları yaygın olarak kullanılır: roGFP1 ve roGFP2. Her ikisi de aynı sistein eklemeleri içerir. roGFP1 yabani tip GFP esas alınmaktadır ve roGFP2 wtGFP 24 göre 400 nm ile 480 nm ve daha az etkili bir uyarma daha verimli bir uyarım var S65T GFP esas alınmaktadır. roGFP1 roGFP2 ve dinamik aralığı düşük bir kapsama alanı içine daha fazla genişletir daha duyarlı daha az pH olduğunu. Böylece, roGFP1 daha azaltılması gibi mitokondri gibi bölmeleri veya sitoplazmada ve bu endozomlar gibi değişken pH, ile bölmeleri izlenmesi için daha yararlı olabilir. roGFP2 parlak sinyal ve, bazı çalışmalarda, roGFP1 24,26 daha büyük bir dinamik aralık sunuyor. Arabidopsis thaliana çalışmalar redoks değişikliklere yanıt için gereken zaman her iki sensörden (t ½ oksidasyonu için, 65 ve 95 sn ve t ½, sırasıyla roGFP1 ve roGFP2 için azaltılması, 272 ve 206 saniye,) için benzer olduğunu gösterir. 26

MitGO-ATeam2 minimal invaziv, güvenilirtomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiae mitokondriyal ATP ölçer sensör. GO-ATeam donör ve alıcı floresan proteinleri (GFP ve turuncu (OFP) protein floresan, sırasıyla) FRET F o arasında sıkışmış F 1-ATP sentaz ε alt birimi oluşan bir Förster rezonans enerji transferi (FRET) prob. 27 getirmek proteinin konformasyonel değişiklikler ε altbirim sonuçlarına ATP bağlama alıcı yakın FRET donör ve alıcı vericiden enerji transferini sağlar. GO-ATeam, GO-ATeam1 ve GO-ATeam2 iki türevleri vardır. GO-ATeam2 genellikle daha düşük mitokondride sitoplazmada karşılaştırılmıştır [ATP]. 27 ölçüm için daha uygun hale GO-ATeam1 daha MgATP için daha yüksek bir afiniteye sahiptir

Mitokondriyal redoks araştırmak için, bir lider dizisi ATP9 kaynaşmış roGFP1 oluşan bir füzyon proteini (mito-roGFP1) inşand güçlü gliseraldehit-3-fosfat dehidrojenaz (gpd) promoteri (p416GPD, Addgene) kontrolü altında, bir sentromer plazmid bazlı (düşük kopya sayısı) maya ekspresyon eksprese. Bu model mantar, Saccharomyces cerevisiae yaşlanma bağlamında mitokondri redoks statüsü araştırmak için kullanılan roGFP1. Biz roGFP1 yaşlanma sırasında ve besin durumu tepki olarak ortaya ama maya hücreleri üzerinde belirgin bir olumsuz etki yapar mitokondriyal redoks devlet değişiklikleri algılamak bulabilirsiniz. Biz de tek tek canlı maya hücrelerinin içinde mitokondri redoks durumu değişkenlik, hücre içi mekansal çözünürlükte bir biyosensör önemini vurguluyor bir bulgu bakın.

MitGO-ATeam2 GO-ATeam2 en amino ucunda takılı sitokrom c oksidaz alt ünite VIIIA en mitokondriyal sinyal dizisi vardır GO-ATeam2, bir çeşididir. 27 Biz mitGO-ATeam2 prob (lütfen H. laboratuvar tarafından sağlanan modifiye Noji, Enstitüsü of Bilimsel ve düşük kopya plazmid olan maya ifade vektörü pAG415GPD-ccdb (Addgene, Cambridge, MA, USA) içine Xba1 ve HindIII bölgeleri yoluyla alt klonlama ile Mayada kullanım için endüstriyel araştırma, Osaka Üniversitesi, Japonya), güçlü kurucu GPD organizatörü içeren. Biz tomurcuklanan maya mitGO-ATeam2 ifade ve mitokondriyal ATP düzeylerinde fizyolojik değişiklikleri ölçmek için etkili bir prob olarak hizmet vermektedir bu mitokondri için sadece lokalize DNA bağlayıcı boya DAPI,, ile counterstaining tarafından, bulabilirsiniz.

roGFP ve GO-ATeam genetik olarak kodlanmış her ikisi de. Sonuç olarak, ortaya ve sabit bir şekilde tutulmuş sağlam hücreler ve redoks durumu ya da tek tek, canlı hücrelerdeki ATP seviyeleri hakkında bilgi alınabilir. Ayrıca, her iki biyosensör fizyolojik koşullar altında redoks devlet veya meydana ATP seviyelerinde değişiklikleri izlemek. 28 Her iki prob da rasyometrik bulunmaktadır. Bunun sonucu olarak, bu sonda ile yapılan ölçümler Cha etkilenmezbiyosensör konsantrasyon veya numune aydınlatma veya kalınlığında nges. Son olarak, her iki biyosensör hücre içi uzaysal çözünürlüğü sağlar. Gerçekten de, roGFP mitokondri, ER için hedeflenmiştir, endozomlar ve 24 peroksizomlar, ve pH büyük ölçüde bağımsız Bu parçaların her birinin redoks durumu değişiklikleri, algılayabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Biyosensörler ile Maya Hücreleri Dönüşüm

  1. Lityum asetat yöntemi 27 kullanarak plazmid taşıyan mito-roGFP veya mitGO-ATeam2 ile istenilen maya suşu Transform.
  2. Plazmid kaynaklı biyosensör ile dönüşüm onaylamak ve plazmid kaybını önlemek için, seçin ve uygun seçici sentetik tam orta (mito-roGFP için SC-Ura, veya mitGo-ATeam2 için SC-Leu) üzerinde transformantlar korumak. Floresan prob burada tarif edilenden farklı bir plazmide alt klonlanmıştır ise, uygun seçici orta kullanın. Onlar floresan biyosensör ifade onaylamak ve normal mitokondriyal morfoloji sergilemek floresan mikroskobu ile transformantlar gözünüzde canlandırın.

2. Görüntüleme için Hücreler ve Hazırlık Büyüme

Hücre fonksiyonu ve ilaç tedavisine yanıt hücre yoğunluğu ve metabolik aktivite son derece bağlıdır. En iyi sonuçlar elde edilir; hücreaktif (- 1 x 10 7 hücre / ml orta-log fazı, ~ 0.5) bölünmesi vardır. Tutarlı yoğunluğu orta log fazı kültür oluşturmak için en güvenilir yolu sabit bir faz öncesi kültürden aşılamak için.

  1. Bir sabit faz ön-kültür hazırlanması: bir tabaktan dönüştürülmüş hücrelerin tek bir koloni almak ve seçici sıvı ortam (50 ml konik bir tüp içinde alt-5 mi) inoküle. 600 nm (OD 600) de kültürün optik yoğunluk bir plato (24-48 saat) ulaşıncaya kadar 225 rpm'de sallayarak ile 30 ° C de büyür.
  2. Gözlem için bir orta log fazı kültürü hazırlanması: 50 ml konik bir tüp içinde alt-seçici ortam 5 ml inoküle etmek üzere ön-kültür, uygun hacmi kullanın. YPD ortamı autofluorescent ve bu çalışmalar için kullanılmamalıdır. Sentetik tam, glukoz tabanlı, bırakma (SC-Ura) ortamları kullanın. Onlar orta-log fazı (- 1 x 10 7 hücre / ml ~ 0.5) ulaşana kadar, 4-16 saat, 225 rpm sallayarak, 30 ° C'de hücreleri büyütün. Hücre yoğunluğu belirlenebilirOD 600 ölçerek, doğru OD 600 okuma belirlemek için spektrofotometre kalibre. Bizim Beckman DU530 (IN Beckman Coulter, Indianapolis,) On, orta-log fazı 0.1-0.3 bir OD 600 karşılık gelir.

Mito-roGFP1 metabolik değişimler nedeniyle organelde duyuları dalgalanmalar. Örneğin, bu deneyde, mitokondriyal redoks durumu değişiklikleri maya fermente edilebilir karbon kaynağı (örneğin glükoz, SC medya gibi) karşı olmayan fermente edilebilir karbon kaynağı (örneğin, gliserol gibi SGlyc medya) büyümeye ne zaman ve hatta aynı farklı kısımlarındaki medya. Bu nedenle, tüm deneyler için aynı ortam toplu kullanın.

  1. Hiçbir tedavi yapılıyorsa Hücreler konsantrasyon hazır (adım 2.4) ve görüntüleme vardır. Hücreleri tedavi ediliyor, uygun tedavi ile hücreleri inkübe ve bir sonraki adıma geçin.
  2. 15 saniye boyunca 6000 x g'de santrifüj ile kültüre 1 ml konsantre veOrtam 20 ul hücre pelet yeniden süspanse. Bu koşullar, görüş alanında ayırt hücrelerin sayısını en üst düzeye çıkarmak.
  3. Bir slayt için yeniden süspanse hücre 2 ul uygulayın. Bir lamel (No 1.5, tercihen yüksek performanslı 170 ± 5 mikron kalınlığında) ile kaplayın, ve net oje veya valap (Reaktifler bakınız) ile lamel kenarları mühür. Valap ile mühür, lamel kenarları boyunca küçük bir miktar yayılır sonra, bir Bunsen beki alev üzerinde tutarak bir metal spatula üzerinde küçük bir miktar eritebilir.
  4. Görüntüleme sırasında 30 ° C'de hücreleri koruyun. Görüntüleme için kullanılan 100x immersiyon yağı lens hakkında objektif bir ısıtıcı bu uygulama için iyi çalışır. Bu koşullar altında, mitokondriyal morfolojisi, redoks durumu ve ATP seviyeleri 10-15 dakika boyunca görüntüleme sırasında değişmeden kalır.

3. Görüntüleme Kurulum

  1. Bir geniş alan floresan mikroskop görüntüleme mito-roGFP1 için Kurulum
    Burada adımlar AxioObse uyarlanmışrver.Z1 mikroskop bir Colibri LED uyarma kaynağı, bir geniş alan Orca ER kamera ve Axiovision toplama yazılımı ile donatılmıştır. Mito-roGFP1 okside her iki kanal ve Fotoçevrim photobleaching cıva ark lambası aydınlatma (bkz. aşağıda) ile karşılaştırıldığında LED aydınlatma kullanılarak önemli ölçüde azalır.
    Sinyal ve çözünürlük en üst düzeye çıkarmak için, amacı mümkün olan en yüksek sayısal diyafram ve yeterli uzaysal çözünürlük sağlayan en düşük büyütme kullanın. Buna ek olarak, mito-roGFP görüntüleme için, objektif 365 nm de iletir doğrulayın. 100x/1.3NA EC PlanNeofluar objektif (Zeiss) bu uygulama için iyi çalışır.
    Yükseltgenmiş ve indirgenmiş mito-roGFP1 tür yakalamak için toplama yazılımı yapılandırın. Biz şu şartları kullanılabilir.
    1. Dahil excitatio ile, mito-roGFP gibi HE (Zeiss) set filtre 38 olarak 365 nm (% 100 LED güç) ve GFP için uygun bir emisyon filtresi, de uyarma kullanmak okside için kanal yapılandırman filtre küp kaldırıldı. Eksitasyon filtresi çıkarılması böylece ulaşılabilir zaman çözünürlüğü artan, filtreleri geçmek için gerek kalmadan 365 nm ve 470 nm hem de uyarma sağlar.
    2. Yukarıda da belirtildiği gibi, 470 nm (% 100 LED güç) de uyarma kullanımı ve düşük mito-roGFP için kanal yapılandırma, aynı emisyon filtresi küp okside mito-roGFP için kullanılır. Uzaysal çözünürlüğü optimize etmek için 1x1 binning için kamera ayarlayın.
    3. Her z pozisyonda kanalları hem toplama, 0.5 mikron aralığı ile 11 dilim oluşan az yığını elde etmek için yazılım ayarlayın. Satın alma Bu mod da her z yığını elde daha yavaş, ama yükseltgenmiş ve indirgenmiş kanal satın arasındaki mitokondriyal hareket kaynaklanan eserler önler.
    4. Görüntü birkaç hücreleri güçlü değil doyurarak sinyal üreten, uygun bir pozlama süresi belirlemek için. Tüm deney için okside ve mito-roGFP1 azaltılmış için pozlama süreleri oranı korumak için önemlidirs. Örneğin, için pozlama süreleri okside ve mito-roGFP1 mito-roGFP1 okside için maruz kalma süresi, daha sonra sırasıyla, 300 ve 100 milisaniye olan azaltılmış ise 3 kez olması gerektiğini tüm deneyler için mito-roGFP azaltılmış için.
  2. Bir spektral konfokal mikroskop görüntüleme mitGO-ATeam2 için Kurulum
    MitGO-ATeam2, GFP (emisyon maksimum 510 nm) floresan kullanarak ATP düzeylerini ölçmek için OFP (emisyon maksimum 560 nm) gelen bu ayırt edilmelidir. Bu fluorophores yayılan floresan çözmek floresan filtre setleri vardır. Ancak, konfokal mikroskoplar tarama birçok lazer geçerli bir spektral dedektör,, bu uygulama için en uygun bulmak. Bir spektral dedektör dalga boyuna göre çok bileşen (genellikle 32 veya daha fazla) içine floresan emisyon ayırır. Birkaç komşu dalga boyu bantları bir resim kanal birleştirilebilir. Birleştirilmek üzere dalga boylarında çok deneysel G sinyali en yüksek olarak seçilirKarıştırabileceklerinden sinyalinin çapraz kaçınarak FP ve OFP ölçüm FRET. Mevcut en yüksek sayısal açıklık objektif kullanın. Bir 100x/1.49 veya 60x/1.49 Apo-TIRF objektif kullanın. Biz NIS Elements yazılımı çalıştıran Nikon A1R konfokal mikroskop kullanın. ATP bağlı ve ATP-ilişkisiz mitGO-ATeam2 tür yakalamak için toplama yazılımı yapılandırın. Biz şu şartları kullanılabilir.
    1. Sistemimizde yaklaşık 0.42 mikron az çözünürlüğe karşılık 1.0 Airy birimleri (AU), için iğne deliği ayarlayın.
    2. Görüntüdeki mekansal bilgi en üst düzeye çıkaracak Nyquist örnekleme sınırı, yaklaşım tarama zoom ayarlayın. Sistemimizde piksel boyutu 0.12 mm.
    3. Mitokondri görüntüleme sırasında hareket edebilir, çünkü 512 x 256 piksel alanı kırpma tarafından görüntüleme hızını artırmak için yararlı olabilir. Sistemimizde görüntü bir kare için gereken toplam süre 2 kat tarama ortalama dahil olmak üzere, 1.0 sn. İstenen uzaysal çözünürlüğü bağlı olarak, alanında daha da increas kırpılmış olabilire zaman çözünürlüğü.
    4. 488 nm'de Excite ve 500 emisyon toplamak - GFP için 520 nm ve 550 - OFP için 580 nm. Gerçek en iyi değerleri görüntüleme sistemi özellikleri ile değişebilir.
    5. Sistemimiz için en uygun lazer gücü 6.0 ve% 6.4 arasındadır. En uygun lazer gücü her mikroskop sistemi için değişir, ama yine de bir yorumlanabilir görüntü üretirken ideal mümkün olduğunca düşük olacaktır. Herhangi bir optik sistem zaman içinde normal meydana lazer güç değişiklikleri, izlemek için bir dahili veya harici güç ölçer kullanın.
    6. Piksel değerlerinin tespit aralığı en üst düzeye çıkarmak ancak mümkün olduğu kadar çok hücreler olarak için, doyurarak sinyal önlemek için dedektör kazanç ve aydınlatma ışık yoğunluğunu ayarlayın. % 1'den fazla doymuş piksel içeren herhangi bir hücre analiz yok. Aynı amaç, lazer gücü, tarama zoom, piksel boyutu, kazanç ve ofset kullanarak görüntü tüm örnekler.

4. Resim Alma

  1. Odak pla bulun floresan prob beyazlatma en aza indirmek için iletilen ışık kullanarak ilgi hücrelerinin ne.
  2. Ilgi çekici bir veya daha fazla hücre bulduktan sonra, 0.5 mikron arasında bir adım boyutu ile tipik bir cep (yaklaşık 7 um), bütün derinliği boyunca z-dizi toplamak.
  3. Resim diğer slayt faiz hücreleri, ancak görüntü 15 dakikadan fazla tek bir slayt yok. Slayt üzerinde 15 dakika sonra, hücre canlılığını kaybeder.

5. Analiz

Mitokondrial ATP seviyesinde 510 nm 'de olduğu için 560 nm'de mitGO-ATeam2 emisyon oranını ölçerek belirlenir 27 organel redoks durumu Mito-roGFP bölgesinin (T / O) okside oranı düşürülür olarak ölçülür;. Yani 365 nm uyarma üzerine 510 nm emisyon bölünmesiyle 470 nm uyarma üzerine 510 nm emisyon. Oranı hesaplamadan önce, biz arka plan çıkarma ve floresan mitokondri ait piksel için bir eşik değerini belirlemek.

çadır "> Kamu malı (örneğin ImageJ 30) veya yazılım mito-roGFP1 veya mitGO-ATeam2 analizi. görüntü elde etmek için kullanılan yazılıma bağlı olarak ve analiz için kullanılabilir (örneğin Volocity, Perkin-Elmer) ticari, görüntüleri İlk analiz yazılımı onları açmadan önce, TIFF gibi, başka bir biçime dönüştürülmesi gerekebilir. görüntüler dönüştürülür, bu piksel değerleri dönüşüm sırasında değiştirilmez doğrulamak için gereklidir. mito-roGFP1 veri analizi kullanarak her iki program aşağıda açıklanmıştır. her menü içinde seçmek için Program menüleri ve seçenekleri koyu ve italik olarak vurgulanır.

5.1 ImageJ analizi

  1. Açık görüntüleri ve değişim tipi 32 bit için: Görüntü → tipi → 32 bit.
  2. Hiçbir hücre vardır bir alanda ilgi (ROI) bir bölge çizin. Bu yatırım getirisi ortalama yoğunluğu hesaplayın: → Tedbir analiz edin.
  3. Yığından hesaplanan ortalama arka plan çıkarma: Süreç → Matematik → Çıkart.
  4. Çıkarılır z-yığını kullanarak, mitokondri üzerinde orta dilim ve eşik bulmak: Resim → Ayarla → Eşik ve Eşik penceresinde Uygula'yı tıklatın. Yığın tüm dilimleri için geçerlidir. NaN arka plan pikseller ayarlayın kontrol edin.
  5. Oranı oluşturma z yığını: Süreç → Görüntü Hesaplama mito-roGFP1 analizi için okside z yığını tarafından azaltılmış yığını bölün. MitGO-ATeam2 analizi için (ATP ilişkisiz) görüntü 510 nm ile 560 nm (ATP bağlı) görüntü bölün.
  6. Ilgi alanı etrafında bir ROI çizin. → Araçlar → ROI Müdürü analiz seçin ve ROI kaydetmek için Ekle'yi tıklatın. Birden fazla bölge yöneticisi saklanabilir. ROI Yöneticisi, tüm ROI seçin, sonra M seçincevher → Tüm yığın dilimleri ölçmek için Birleştirilmiş. Analiz için bir elektronik tabloya veri verir.

5.2 Volocity analizi

  1. Bir Volocity kütüphaneye görüntüleri aktarmak ve 2 kanallı bir görüntü dizisi oluşturun.
  2. Hiçbir hücre vardır bir alanda ilgi (ROI) bir bölge çizin. Seçin: Araçlar → Oranı.
  3. ROI itibaren alın: arka hesaplamak için Volocity kullanın.
  4. Mitokondriyal yapıları içerecek şekilde eşik ayarlayın.
  5. Oranı kanala bir gökkuşağı LUT uygulamak için seçeneğini işaretleyin. Yoğunluk ayarlı kanal sunum için daha az gürültülü görüntüleri oluşmasına neden olabilir, ama ortalama oranı kantitatif için kullanılmamalıdır.
  6. Ölçüm sekmesini seçin bu oran kanalı seçin ve ilgi alanı etrafında bir ROI çizin. Sıfır değerleri hariç oranı kanal ölçün. Çoğul bölgeler ve ölçülebiliraynı zamanda. Analiz için bir elektronik tabloya veri verir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mito-roGFP ile mitokondriyal redoks devlet Ölçme

Burada, mito-roGFP1 maya hücre büyümesi veya mitokondriyal morfolojisi etkilemeden, maya hücreleri canlı azalmış tamamen okside gelen mitokondriyal redoks devlet değişiklikleri algılamak için dinamik menzile sahip olduğunu göstermektedir. İlk olarak, mitokondri hedefli GFP ve roGFP1 ifade hücreleri normal tarifeler (Şekil 1A) büyümesi bulabilirsiniz. Olarak log-faz büyüme ve maksimum büyüme oranı ulaşmak için zaman içinde büyüme eğrisinin maksimum eğim ile ölçülen maksimum büyüme oranı, mito-GFP ve mito-roGFP1 ifade hücrelerinde benzer. Ayrıca, mito-roGFP1 sergi yabani tip morfolojisi (Şekil 1B) ifade maya mitokondri. Özellikle, boru olan, anne-tomurcuk ekseni boyunca uyum ve anne ve kızı hücrelerinin ucunda birikir. Mitokondriyal disfonksiyon genellikle parçalanma neden olduğundan, bu normal morfoloji mito-roGFP1 yaptığı fikrini desteklerdeğil kafasını karıştırmak mitokondriyal fonksiyonu.

Mito-roGFP1 en dinamik aralık değerlendirmek için, sırasıyla, hidrojen peroksit (H 2 O 2) ve ditiyotreitol (DTT) ile orta-log fazı yabani tip maya hücreleri tedavi ve mitokondriyal değerlendirmek için ortalama mitokondriyal R / O oranı ölçülen redoks devlet (Şekil 2). H 2 titrasyonu ile 0 ila 1.23 (indirgeyici koşullar altında), yaklaşık 0,6 (oksitleyici koşullar altında) ölçülü bir aralık ile ortalama hücre Ar / O oranı olarak doza bağımlı bir değişiklik, 10 mM sonuçlar için O 2 ya da DTT. Böylece, mito-roGFP1 canlı hücrelerde mitokondriyal redoks devlet analizi için etkili bir biyosensör olduğunu.

Mito-roGFP1 da mitokondriyal redoks devlet hücre içi çözünürlük sunuyor. Bu hücre içi çözünürlük bireysel maya hücreleri içinde mitokondri göre redoks devlet farklılık ortaya koymaktadır. Tek bir maya hücre içinde mitokondri işlevsel farklı ise, bunun mümkün olduğunuy pasif ya da aktif ayrılmış (Şekil 3). Bu ayrımı anne-kız yaş asimetri ve kızı hücrelerin gençleşme katkıda bulunabilir. Bu bulgu, mitokondriyal redoks devlet hücre içi çözünürlüğe sahip bir biyosensör ihtiyacını vurgular.

Bu ışık GFP kromofor değişiklikleri neden olabilir 31 uzun süredir bilinmektedir. Yüksek yoğunluklu 400 nm ışığına maruz kalma üzerine, roGFP1 farklı bir emisyon spektrumu 26, bir tür için Fotoçevrim uğrar. Fotoçevrim oluştuğunda, mito-roGFP1 okside gelen yeşil emisyon azalma ve R / O mito-roGFP1 (Şekil 4B) oranı değiştirir düşük mito-roGFP1, uyarma üzerine yeşil emisyon bir artış var. Düşük yoğunluklu uyarma (Colibri ışık kaynağı LED 400 nm kullanarak% 40 gibi aydınlatma) kullanarak, (Şekil 4C) analiz döneminde önemli bir Fotoçevrim yoktur. P Fotoçevrim azaltmak için sevk yolu (Tartışma) 365 nm roGFP en okside formu heyecanlandırmak için.

MitGO-ATeam2 ile ölçüm mitokondriyal ATP

Memeli hücrelerinde ifade zaman MitGO-ATeam2 mitokondri için lokalize. 27 Biz mitGO-ATeam2 maya DAPI-lekeli mitokondriyal DNA ile colocalizes bulmak ve mitokondri yabani tip maya (Şekil 5A) tipik tübüler yapılar bulunur. Böylece, memeli sitokrom c oksidaz alt ünite VIIIA gelen mitokondriyal hedef dizisini mitokondriyal morfolojisi bozmadan maya mitokondri için prob lokalize olduğu belirlenmiş. Buna ek olarak, mitGO-ATeam2 ifade eden hücrelerin büyüme oranı glikoz ve gliserol medya hem de mitokondri hedefli GFP (Şekil 5B) ifade eden hücreler ile benzer olduğunu bulmak. Bu nedenle, mitGO-ATeam2 ekspresyonu, hücre veya mitokondri için zararlı görünmüyor.

_content "> Sonra, mitGO-ATeam2 mitokondriyal ATP düzeylerinde değişiklikler. Bunu yapmak için yanıt FRET olmadığını test, biz, antimycin A, sitokrom c redüktaz bağlanan bir ajan ile hücrelerin tedavi elektron taşıma zincirinde ubikinol oksidasyonu inhibe , proton degrade bozar ve mitokondriyal ATP üretimini engeller. 20 medyan Antimycin ile tedavi edilen hücrelerde oranı azalır FRET A (Şekil 6C).

MitGO-ATeam2 mitokondriyal ATP için etkili bir biyosensör olduğunu kanıtlar göz önüne alındığında, bir fermente olmayan fermente karbon kaynağı (Şekil 6A ve 6B) kullanılarak yayılır edildi maya mitokondriyal ATP düzeylerini izlemek için bu prob kullanılır. Glikoz yetişen toplam hücre floresan alanındaki azalma mitokondriyal miktarındaki azalma bu glukoz baskı sonuçları doğruladı. Biz mitGO-ATeam2 düzeyinde hücre-hücre morfolojisinde not edin. İlginç bir şekilde, bizim ön veriler gösterir ki orada ma y aynı hücre içinde farklı mitokondride ATP seviyeleri açısından farklılıklar (Şekil 6D) olmak.

Şekil 1
Şekil 1. Mito-roGFP1 hücre büyüme oranları veya mitokondriyal morfolojisi etkilemeden mitokondriyal redoks durumu tespit eder. Ekspres mitokondri hedefli bir GFP veya Ro-GFP1 büyüme zamanın bir fonksiyonu olarak 600 nm'de optik yoğunluktaki değişiklik olarak ölçülür ki maya (a) büyüme 30 SC-Ura sıvı orta ° C (B) Üst panel: Normal mitokondriyal morfolojisi ve ham görüntüler yerelleştirme kanal. Alt panel: Oranı görüntüleri okside kanal (sağda renk referans) bölünmesiyle düşük kanal göstermektedir. Görüntüler sonuçlarına eşiği tercih etkisini göstermektedir. En uygun eşik mitokondriyal yapı ve dışlar arka plan içerir.jove.com/files/ftp_upload/50633/50633fig1hires.jpg "target =" _blank "> büyük rakam görmek için buraya tıklayın.

Şekil 2,

Şekil 2. Mito-roGFP1 Mito-roGFP1 ifade hidrojen peroksit ya da ditiotreitol. (AB) orta log fazı maya hücreleri ile yapılan tedaviye yanıt olarak mitokondriyal redoks durumu değişiklikleri tespit herhangi bir tedavi (0) ya da belirtilen konsantrasyonları ile SC-Ura ortam içinde inkübe edildi 30 20 dakika ° C (A) R / O mito-roGFP1 oranı görüntülerin maksimum yoğunluğu projeksiyonları hücre hatları göstermek iletilen ışık görüntü, üzerinde üst üste için H 2 O 2 veya DTT. Mito-roGFP1 için renk referans sağ üst kısmında gösterilir. Bar:. 5 mcM (B) büyük rakam görmek için buraya tıklayın.

Şekil 3,
Şekil 3,. Mito-roGFP1 mitokondriyal redoks devlet hücre içi çözünürlük sunuyor. R / O mito-roGFP1 oranı kanal en fazla yoğunluk projeksiyonu iletilen ışık görüntü üzerinde bindirilir. Mito-roGFP1 için renk referans sağ üst kısmında gösterilir. Bar: 5 mcM. Bu, belirli bir hücre 0.88 ortalama bir R / O Mito-roGFP1 oranına sahiptir. Ancak, bu hücre içinde mitokondri tek tek farklı redoks durumları göstermektedir. Gösterilen numaraları farklı mitokondriyal yeniden için hesaplanan R / O mito-roGFP1 oranı olangions. büyük rakam görmek için buraya tıklayın.

Şekil 4,
Şekil 4. Yüksek yoğunluklu uyarma Fotoçevrim yol açar ve değişmiş R / O mito-roGFP1 oranları. Mito-roGFP1 ifade Orta-log fazı maya% 40 (A) veya% 100 bir LED ışık kaynağından (B) güçte 400 nm ışık ile aydınlatılmış edildi ve azalır ve mito-roGFP1 okside gelen floresan her 4 sn yakalandı. Gösterilen görüntüler renklerin mito-roGFP1 en R / O oranı (sağ alt renk skalası bakınız) temsil eden maksimum projeksiyonlar bulunmaktadır. Bar:. 5 mcM (C) mito-roGFP1 bir R / O oranı% 40 LED güçte aydınlatma üzerine görüntüleme dönemi boyunca sabit kalmıştır. Ancak,% 100 aydınlatma üzerine biz, güçlü LEDfluorofor photoswitching yansıtan mito-roGFP1, R / O oranında bir zamana bağlı değişim görüyoruz. Siyah kareler,% 40 güç LED;. Gri elmas,% 100 LED güç büyük rakam görmek için buraya tıklayın.

Şekil 5,
Şekil 5,. MitGO-ATeam2 maya mitokondriyasına lokalize ve maya hücresi büyüme oranları etkilemez. (A) mitGO-ATeam2 ifade eden maya hücreleri daha önce anlatıldığı gibi, söz konusu DNA bağlayıcı boya DAPI ile boyanmış ve paraformaldehit ile sabitlenmiştir, orta log fazına yetiştirilmiştir gösterilir. 19 Resim z serisi deconvolved maksimum yoğunluklu projeksiyonlar bulunmaktadır. Kolaylık olması açısından, mitGO-ATeam2 resimlerini, ATP'ye nüfusun sadece ilişkisiz temsil eder, geleneksel bir GFP filtresi kullanılarak elde edildi. Hücre dışarıbeyaz çizgilerle gösterilmiştir. N: nükleer DNA. mtDNA: mitokondriyal DNA. Bar: 1 mikron (B) yabani tip maya hücrelerinin büyüme eğrileri 30 mitokondri hedefli GFP veya mitGO-ATeam2 glukoz-temelli (SC) ve gliserol-tabanlı (SGlyc) sıvı ortamda ° C ifade. Bu veriler her noktada her bir suş için quadruplicates olan ortalama ve iki bağımsız deneyler için temsili niteliktedir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın.

Şekil 6,
6 Şekil. MitGO-ATeam2 önlemler hücre içi ve suborganellar çözünürlükte mitokondri maya ATP düzeylerinde değişiklikler. (AB) GFP (510 nm) ve OFP (560 nm) mitGO-ATeam2 Emisyon ve maya 560/510 nm emisyon oranı kantitatif gluko gece boyunca yetiştirilen hücrelerSE-bazlı (SC) (A) ya da gliserol bazlı (SGlyc) (B) ortam. 560/510 oranı kanal için renk referans sağ alt kısmında gösterilir. Bar. 1 mikron (C) hücreler için 560/510 oranı kantitasyonu 30, 1 saat boyunca veya antimycin A (2 ug / ml) olmadan SGlyc ortam içinde çoğaltıldı ° C Antimycin üzerine ATP seviyeleri bir tedavi azalma (Kruskal-Wallis önemlilik testi) istatistiksel olarak anlamlıdır. Orta-log fazı yabani tip hücrenin mitGO-ATeam2 (D) 560 nm/510 nm oranı SC ortama yayılır. 560/510 oranı kanal için renk referans sağ alt kısmında gösterilir. Hücre hatları beyaz gösterilmiştir. Tüm hücre için ortalama 560/510 nm oranı 0.43 olduğunu. Gösterilen sayılar mitokondri içinde spesifik bölgelerinin 560/510 nm oranlarıdır. Bar: 1 mikron. büyük rakam görmek için buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada, maya hücreleri canlı mitokondriyal redoks devlet ve ATP düzeylerini değerlendirmek için biyosensör olarak mito-roGFP1 ve mitGO-ATeam2 kullanımı yöntemleri açıklanmaktadır. Biz nicel mitokondriyal morfolojisi veya dağıtım veya hücresel büyüme oranları üzerinde herhangi bir belirgin etki olmadan, mitokondri için hedef olarak plazmid kaynaklı mito-roGFP1 veya mitGO-ATeam sonuçlarının bu ifade bulabilirsiniz. 3 Mito-roGFP1 yüksek gelen mitokondriyal redoks devlet değişiklikleri algılayabilir son derece düşük devletlere okside. Benzer şekilde, mitGO-ATeam bir solunum inhibitörü ile tedavi solunum odaklı büyüme ve maya geçiren maya meydana mitokondriyal ATP düzeylerinde değişikliğe ölçebilirsiniz. Her iki biyosensörler hücre içi çözünürlük sunuyor Dahası, onlar redoks devlet veya tek tek hücrelerin içinde mitokondri ATP düzeylerinde heterojen algılayabilir. Her iki biyosensörler rasyometrik prob çünkü Son olarak, onlar örnek kalınlığı ya da kötü konsantrasyon veya değişkenlik değişikliklerden etkilenmezumination. Bu sondalar canlı hücrelerde hücre içi çözünürlükte mitokondriyal fonksiyonu eğitim için minimal invaziv bir yaklaşım sağlamak.

Başarıyla bu yöntemi uygulamak için, görsel mümkün olan en yüksek sinyal-gürültü oranı ile elde edilmelidir. Önemli bir ilk adım mikroskop altında 10-20 transformant koloniler hücreleri incelemek ve sağlam floresan ve normal mitokondriyal morfolojisi ve büyüme oranları olan seçmektir. Daha sonra, görüntüleme koşulları floresan protein veya hücre fotohasar neden olmadan yüksek, ama doyurarak, yoğunluğu üretmek için optimize edilmelidir. Bir popülasyon (<% 1) bir kaç hücre plazmid kopya sayısında varyasyon nedeniyle alışılmadık derecede yüksek veya düşük genel floresan sahip olabilir, bu hücrelerin çoğunluğunun yorumlanabilir görüntü yakalama lehine göz ardı edilebilir.

Mito-roGFP yararları açık olsa da, bu potansiyel tuzaklar farkında olmak da önemlidir. Biz tespithücre metabolizmasında karbon kaynağı indüklenen farklılıklar ile değil, aynı zamanda aynı ortamın farklı gruplar maya yayılması üzerine sadece mitokondriyal redoks potansiyeli farklılıkları. Mitokondriyal redoks ölçümleri için hücre büyüme ortamı seçerken Böylece, dikkat edilmelidir. Mito-roGFP mitokondriyal redoks devletin görülmemiş mekansal çözünürlüğe sahip olmasına rağmen Ayrıca, roGFP zamansal çözünürlüğe ROS sinyal iletimi 31 ile ilişkili ROS patlamaları tespit etmek için yeterli değildir. RoGFP ve okside formu için dalgaboyu ve yoğunluğu seçerken Son olarak, dikkat edilmelidir. 400 nm'de aydınlatma optimum roGFP en okside tür heyecanlandırıyor. Ancak, bu da 365 nm'de eksitasyon ile karşılaştırıldığında daha büyük ölçüde azaltılabilir roGFP heyecanlandırıyor. Bu mitokondriyal redoks durumunu ölçmenin azalmış duyarlılık yol açar. 400 nm yüksek yoğunluklu aydınlatma için mito-roGFP1 bir Ayrıca, maruz kalma bir spec protein Fotoçevrim yol açardeğişmiş spektral özelliklere sahip ler. Biz 365 nm yüksek yoğunluklu aydınlatma üzerine Fotoçevrim görmedim. Bu nedenle, mümkünse 365 nm kullanarak uyarma tavsiye ederiz.

MitGO-ATeam2 de sınırlamaları vardır. MitGO-ATeam2 kendisi bir protein olduğu için örneğin, onun biyosensör faaliyet bozabilir reaktif oksijen türleri, dahil olmak üzere hücresel hakaret hasar görebilir. Ayrıca, GFP ve OFP emisyon dalga boylarında (510 ve 560 nm) geleneksel floresan mikroskoplar üzerinde zor olabilir analizi, FRET için çözülmelidir.

In vitro enzim deneyleri farklı olarak, bu canlı hücre deneyleri mitokondriyal ATP veya redoks durumda göreceli değişiklikler rapor ve ATP mutlak konsantrasyon veya azaltılmış sistein tedbir yok. Bir standart eğri teorik çözüm sensör proteinlerin yanıt ölçülerek elde edilebilir olsa da, bu mitokondri içinde farklı moleküler ortam için geçerli olmayabilir. Orada efore, bu testlerin farklı koşullar altında hücrelerin karşılaştırma için bir yol sağlar. Buna ek olarak, görüntüleme koşulları değişir, bir görüntüleme kurulum alınan tam oranı değerleri birbirlerine çoğaltılması olmayabilir.

Oranı görüntüleme için bu teknikler diğer roGFP veya GO-ATeam izoformları ve diğer fonksiyonel problar dahil olmak üzere diğer rasyometrik göstergeler için adapte edilebilir. Geniş alan veya konfokal mikroskopi seçimi prob ve gerekli uzaysal çözünürlüğü bağlıdır. Bu sensör hassasiyeti ve kararlılığını geliştirir 365 nm, az uyarma izin verir, çünkü geniş alan yöntemi mito-roGFP için buraya kullanıldı. Olarak mitGO-Ateam için burada kullanılan bir spektral dedektörü, ile konfokal yöntem spektral algılama pencere ayarlayarak emisyon çapraz ortadan kaldırmak için uygun bir yol sağlar. Ancak, özel filtreler kullanarak veya hesaplama çapraz ortadan kaldırarak geniş alan mikroskobu benzer deneyler gerçekleştirmek mümkündür.

ntent "> görüntüleme deney bu tip en sık zorluk yetersiz sinyaldir. Görüntüleme donanım (özellikle objektif lens ve dedektör) yeterli verileri yorumlamak için sinyal toplamak için önemlidir.

Arka plan pikseller dahil elde edilen oranlarda herhangi bir eğilimleri kırmak gibi eşikleme adımlar, sonuçlar üzerinde büyük etkisi var. Otomatik yöntem tercih edilir, ancak sınırlı bir sinyal nedeniyle, manuel eşikleme genellikle mevcut en iyi yöntemdir. Manuel eşikleri kullanıldığında, kullanılan kriterler de mümkün olduğunca ifade edilmelidir, ve analiz tekrarlanabilirlik göstermek için farklı deneyci veya kör yapılması gerekebilir. Antimycin A (mitGO-Ateam2 için) ve H2O 2 ya da DTT (MITO'nun roGFP için) ile kontrol deneyleri floresans oranı tahmin edilen değişikliklere teyit etmek için kullanılabilir.

Mito-roGFP ve mitGO-ATeam2 izleme mito için non-invaziv, rasyometrik problarıdırmaya hücreleri canlı chondrial spor. Burada kullanılan rasyometrik sensörler mitokondri özel sinyal dizileri füzyonu ile mitokondri için hedef alındı. Diğer hücre bölmeleri orijinal sensörleri uygun hedefleme sekanslarının eklenmesi ile incelenebilir olabilir. Buna ek olarak, aynı zamanda canlı hücrelerde çok sayıda süreç ölçmek için tamamlayıcı flüoresan işaretler (organel ya da işaret etme faktörleri gibi) ya da sensör (örneğin, kalsiyum için), bu sensörler ya da birleştirmek mümkündür.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Bu çalışma HHMI 56006760 dan (GM45735, JDV, DMAW için Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH) (2 1 TL RR 24.158-6), ve Ellison Tıp Vakfı (AG-SS-2.465) ve NIH ödül tarafından desteklenen GM45735S1 ve GM096445) LP. GM45735S1 Amerikan Kurtarma ve yeniden yatırım Yasası 2009 altında NIH yayınlandı. Bu çalışmalar için kullanılan mikroskoplar bir NIH / NCI hibe (5 P30 CA13696) ile kısmen desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
  Reagents
Antimycin A Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) 1397-94-0 Dissolved in ethanol to a 2 mg/ml stock solution.
SGlyc (synthetic glycerol-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura
**omit for SGlyc-Leu
Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave.

Ingredients:
0.67% Yeast nitrogen base without amino acids
3% Glycerol
0.05% Glucose
2 mg/ml adenine
2 mg/ml uracil*
1 mg/ml L-arginine
1 mg/ml L-histidine
1 mg/ml L-leucine**
3 mg/ml L-lysine
2 mg/ml L-methionine
4 mg/ml L-phenylalanine
2 mg/ml L-tryptophan
3 mg/ml L-tyrosine
SC (synthetic complete, glucose-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura
**omit for SGlyc-Leu
Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients:
0.67% Yeast nitrogen base without amino acids
3% Glucose
2 mg/ml adenine
2 mg/ml uracil*
1 mg/ml L-arginine
1 mg/ml L-histidine
1 mg/ml L-leucine**
3 mg/ml L-lysine
2 mg/ml L-methionine
4 mg/ml L-phenylalanine
2 mg/ml L-tryptophan
3 mg/ml L-tyrosine
Valap Combine ingredients in a 1:1:1 (w:w:w) ratio. Melt by submerging in a 70 °C H2O bath. Aliquot into glass petri dishes. Store at room temperature. Ingredients:
Vaseline petroleum jelly, hard paraffin, lanolin
  Equipment and Software
Precleaned Gold Seal Rite-on Micro Slides Thomas Scientific (Swedesboro, NJ) 3050 Size: 25 x 75 mm; Thickness: 0.93 to 1.05 mm
High-performance coverslips, No. 1.5, 18x18 mm Zeiss (Thornwood, NY) 474030-9000-000 These are less variable in thickness (170±5 μm) than standard coverslips, reducing spherical aberration and improving 3D imaging performance
Fisherbrand Microscope Cover Glass, No. 1.5 Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) 12-545E Size: 22 x 22 mm, No. 1.5 thickness (170 μm)
A1 laser scanning confocal microscope with spectral detector and 100x/1.49 NA Apo-TIRF objective Nikon (Melville, NY)  
AxioObserver.Z1 microscope equipped with a 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar objective (Zeiss) and Orca ER cooled CCD camera (Hamamatsu) and controlled by Axiovision software Zeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Hamamatsu City, Japan)  
Volocity 3D Image Analysis software Perkin Elmer (Waltham, MA) Restoration module for deconvolution; Quantitation module for ratio calculation and measurement
ImageJ software National Institutes of Health (Bethesda, MD) http://rsb.info.nih.gov/ij/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rizzuto, R., De Stefani, D., Raffaello, A., Mammucari, C. Mitochondria as sensors and regulators of calcium signalling. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 13, (9), 566-578 (2012).
  2. Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148, (6), 1145-1159 (2012).
  3. McFaline-Figueroa, J. R., Vevea, J., et al. Mitochondrial quality control during inheritance is associated with lifespan and mother-daughter age asymmetry in budding yeast. Aging Cell. 10, (5), 885-895 (2011).
  4. Hamilton, M. L., Van Remmen, H., et al. Does oxidative damage to DNA increase with age. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 10469-10474 (2001).
  5. Cadenas, E., Davies, K. J. Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging. Free Radical Biology & Medicine. 29, (3-4), 222 (2000).
  6. Mammucari, C., Rizzuto, R. Signaling pathways in mitochondrial dysfunction and aging. Mechanisms of Ageing and Development. 131, (7-8), 536-543 (2010).
  7. Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443, (7113), 787-795 (2006).
  8. Schon, E. A., Przedborski, S. Mitochondria: the next (neurode)generation. Neuron. 70, (6), 1033-1053 (2011).
  9. Taylor, E. R., Hurrell, F., Shannon, R. J., Lin, T. -K., Hirst, J., Murphy, M. P. Reversible glutathionylation of complex I increases mitochondrial superoxide formation. The Journal of Biological Chemistry. 278, (22), 19603-19610 (2003).
  10. Beer, S. M., Taylor, E. R., et al. Glutaredoxin 2 catalyzes the reversible oxidation and glutathionylation of mitochondrial membrane thiol proteins: implications for mitochondrial redox regulation and antioxidant defense. The Journal of Biological Chemistry. 279, (46), 47939-47951 (2004).
  11. Tretter, L., Adam-Vizi, V. Inhibition of Krebs cycle enzymes by hydrogen peroxide: A key role of [alpha]-ketoglutarate dehydrogenase in limiting NADH production under oxidative stress. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20, (24), 8972-899 (2000).
  12. Nulton-Persson, A. C., Szweda, L. I. Modulation of mitochondrial function by hydrogen peroxide. The Journal of Biological Chemistry. 276, (26), 23357-23361 (2001).
  13. Gardner, P. R., Fridovich, I. Effect of glutathione on aconitase in Escherichia coli. Archives of Biochemistry and Biophysics. 301, (1), 98-102 (1993).
  14. Gardner, P. R., Raineri, I., Epstein, L. B., White, C. W. Superoxide radical and iron modulate aconitase activity in mammalian cells. The Journal of Biological Chemistry. 270, (22), 13399-13405 (1995).
  15. Schafer, F., Buettner, G. Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple. Free Radical Biology and Medicine. 30, (11), 1191-1212 (2001).
  16. Maechler, P., Wang, H., Wolheim, C. B. Continuous monitoring of ATP levels in living insulin secreting cells expressing cytosolic firefly luciferase. FEBS Lett. 422, 328-332 (1998).
  17. Ouhabi, R., Boue-Grabot, M., Mazat, J. P. Mitochondrial ATP synthesis in permeabilized cells: Assessment of the ATP/O values in situ. Anal. Biochem. 263, 169-175 (1998).
  18. Strehler, B. L., Totter, J. R. Firefly luminescence in the study of energy transfer mechanism in substrates and enzymes determinations. Arch. Biochem. Biophys. 40, 28-41 (1952).
  19. Lemasters, J. J., Backenbrock, C. R. Adenosine triphosphate: Continuous measurement in mitochondrial suspension by firefly luciferase luminescence. Biochem. Biophys. Res. Commun. 55, 1262-1270 (1973).
  20. Wibom, R., Lundin, A., Hultman, E. A sensitive method for measuring ATP formation in rat muscle mitochondria. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 50, 143-152 (1990).
  21. Manfredi, G., Spinazzola, A., Checcarelli, N., Naini, A. Assay of Mitochondrial ATP Synthesis in Animal Cells. Methods in Cell Biology, Mitochondria. Pon, L. A., Schon, E. A. 65, Academic Press. New York. 133-145 (2001).
  22. DeLuca, M. Firefly luciferase. Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 44, 37-68 (1976).
  23. Atamna, H., Frey, W. H. Mechanisms of mitochondrial dysfunction and energy deficiency in Alzheimer's disease. Mitochondrion. 7, 297-310 (2007).
  24. Hanson, G. T., Aggeler, R., et al. Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators. J. Biol. Chem. 279, (13), 13044-13053 (2004).
  25. Dooley, C. T., Dore, T. M., Hanson, G. T., Jackson, W. C., Remington, S. J., Tsien, R. Y. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. J. Biol. Chem. 279, (21), 22284-22293 (2004).
  26. Schwarzländer, M., Fricker, M. D., et al. Confocal imaging of glutathione redox potential in living plant cells. Journal of Microscopy. 231, (2), 299-316 (2008).
  27. Nakano, M., Imamura, H., Nagai, T., Noji, H. Ca2+ regulation of mitochondrial ATP synthesis visualized at the single cell level. ACS Chem Biol. 6, (7), 709-715 (2011).
  28. Berg, J., Hung, Y. P., Yellen, G. A genetically encoded fluorescent reporter of ATP:ADP Ratio. Nature Methods. 6, (2), 161-166 (2009).
  29. Gietz, R. D., Woods, R. A. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).
  30. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671-675 (2012).
  31. Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science (New York, N.Y.). 297, (5588), 1873-1877 (2002).
  32. Dairaku, N., Kato, K., et al. Oligomycin and antimycin A prevent nitric oxide-induced apoptosis by blocking cytochrome c leakage. J. Lab. Clin. Med. 143, (3), 141-153 (2004).
  33. Cannon, M. B., Remington, S. J. Re-engineering redox-sensitive green fluorescent protein for improved response rate. Protein Sci. 45-57 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics