Coltura di cellule umane nasale epiteliali presso l'Air Interface Liquid

1Center for Environmental Medicine, Asthma, and Lung Biology, The University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Pediatrics, The University of North Carolina at Chapel Hill, 3Pulmonary Diseases and Critical Care, The University of North Carolina at Chapel Hill, 4Curriculum in Toxicology, The University of North Carolina at Chapel Hill
Biology

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Summary

Cellule epiteliali nasali, ottenuti attraverso superficiale raschiare la biopsia di volontari umani, vengono ampliati e trasferite su inserti di coltura tissutale. Dopo aver raggiunto la confluenza, le cellule sono coltivate a interfaccia liquido aria, ottenendo colture di cellule ciliate e non ciliate. Colture di cellule epiteliali nasali differenziate offrono modelli sperimentali validi per lo studio della mucosa respiratoria.

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Müller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer II, W. A., Jaspers, I. Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface. J. Vis. Exp. (80), e50646, doi:10.3791/50646 (2013).

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Abstract

Modelli in vitro utilizzando cellule epiteliali umane primarie sono essenziali per comprendere funzioni chiave epitelio respiratorio nel contesto di infezioni microbiche o agenti inalati. Il confronto diretto di cellule ottenute da popolazioni malate ci permettono di caratterizzare diversi fenotipi e sezionare i meccanismi di fondo che mediano i cambiamenti nella funzione delle cellule epiteliali. Coltura di cellule epiteliali della regione tracheobronchiale umana è stata ben documentata, ma è limitata dalla disponibilità di tessuto polmonare umano o invasività associata a ottenere i pennelli bronchiali biopsie. Cellule epiteliali nasali sono ottenuti attraverso molto meno invasivi superficiali biopsie raschiare nasale e soggetti possono essere sottoposte a biopsia più volte senza effetti collaterali significativi. Inoltre, il naso è il punto di ingresso per il sistema respiratorio e quindi uno dei primi siti ad essere esposti a qualsiasi tipo di stress per via aerea, quali agenti microbici, inquinanti o allergeni.

Brevemente, le cellule epiteliali nasali ottenuti da volontari umani sono espansi su piastre di coltura dei tessuti rivestiti, e poi trasferite su inserti di coltura cellulare. Dopo aver raggiunto la confluenza, le cellule continuano ad essere coltivate all'interfaccia aria-liquido (ALI), per diverse settimane, il che crea più fisiologicamente condizioni pertinenti. La condizione di cultura ALI usa mezzi definiti che conducono ad un epitelio differenziato che presenta caratteristiche morfologiche e funzionali simili all'epitelio nasale umana, con le cellule ciliate sia e producono muco. Inserti di coltura tissutale con cellule epiteliali nasali differenziate possono essere manipolati in vari modi a seconda delle domande di ricerca (trattamento con agenti farmacologici, trasduzione con vettori lentivirali, esposizione a gas o infezione da agenti microbici) ed analizzati per numerosi endpoint differenti che vanno dalla vie cellulari e molecolari, ch funzionaleanges, morfologia, ecc

Nei modelli in vitro di cellule epiteliali nasali umane differenziati consentirà ai ricercatori di affrontare nuove e importanti domande di ricerca utilizzando modelli sperimentali organotipica che gran parte imitare l'epitelio nasale in vivo.

Introduction

Obiettivo della tecnica

Le cellule epiteliali (ECS) nelle vie aeree sono tra i primi siti ad essere direttamente esposti ai fattori di stress ambientale per via inalatoria, come agenti patogeni, allergeni o inquinanti atmosferici. EC sono più di una barriera strutturale: Agiscono come un centralino per avviare e regolare la risposta immunitaria respiratorio 1-3 tramite il rilascio di mediatori solubili 4-6 e l'espressione dei ligandi / recettori sulla loro surfac 7-9. Mentre linee cellulari immortalizzate possono essere utilizzati come modelli per studiare i CE respiratorio in vitro, non riescono a differenziarsi in popolazioni cellulari eterogenee composte ciliated polarizzata e cellule che producono muco, simile a quello osservato in vivo. Ricapitolando caratteristiche importanti del epitelio respiratorio osservate in vivo, possono essere usate EC vie aeree primarie. Pertanto, il nostro obiettivo era quello di ottimizzare il nostro metodo utilizza nasale EC (CNE) ha ottenuto da volontari umani. CNE sono espansi e coltivate in vitro, ottenendo un modello di coltura cellulare di CNE differenziate che imita molte delle caratteristiche dell'epitelio nasale visto in vivo.

Fondamento logico

L'utilizzo di modelli in vitro con cellule endoteliali umane primarie mimano situazione in vivo - come descritto in questo studio - dà possibilità uniche per studiare le malattie specifiche differenze di EC, parametri fisiologici associati con l'epitelio delle vie aeree, ovvero l'interazione tra cellule endoteliali e altri tipi di cellule, come cellule dendritiche 10, cellule natural killer 11 o macrofagi. Diversi metodi esistenti utilizzino EC bronchiali, che possono essere ottenute tramite biopsie invasivo spazzola durante broncoscopie, o altrimenti dismesse da tessuto polmonare 12-17. Inoltre, fonti commerciali per ottenere delle vie respiratorie umane colture di cellule epiteliali completamente differenziate esistono (modello EpiAirway da MatTek, Ashland, MA, Cloneticsda Lonza, Basilea, Svizzera, MucilAir da Epithelix Sars, Ginevra Svizzera), dove i ricercatori possono scegliere tra diversi donatori. Tuttavia, a causa del gruppo limitato di cellule epiteliali disponibili in commercio, delimitato o prescritta di parametri, il costo connesso con l'ottenimento commercialmente vie respiratorie umane primarie EC, e l'accesso limitato al tessuto polmonare scartata o tessuto biopsia bronchiale umano appena ottenuto, proibiscono molti ricercatori dalla realizzazione di studi in piena differenziati EC vie respiratorie umane. Pertanto, abbiamo deciso di sviluppare una tecnica che 1) utilizzare CNE umani non invasivo ottenuti, 2) fornire un protocollo di cedimento culture differenziata epitelio delle vie aeree umana, e 3) essere riproducibile nella maggior parte degli ambienti di laboratorio attraverso una infrastruttura esistente coltura di tessuti.

Vantaggi rispetto esistenti Techniques / Modelli

Ottenere CNE freschi, rispetto al bronchiale o piccole vie aeree EC, è molto meno invasiva, individuales possono essere sottoposte a biopsia più volte con effetti collaterali significativi e superficiali biopsie raschiare nasali possono essere condotti in popolazioni malate che non sarebbero altrimenti beneficiare di broncoscopie connesse alla ricerca. Non invasive biopsie raschiare superficiali per ottenere LNE consentono al ricercatore di impostare specifiche donatore a priori, tra cui l'età, il sesso, lo stato di malattia, ecc in linea con l'obiettivo della ricerca da compiere. Così, quando si progetta studi di ricerca gli investigatori non sono limitati dai tessuti clinicamente disponibili / campioni epiteliali, l'acquisto di costosi modelli di coltura cellulare differenziati da fornitori commerciali, o di progettazione studi broncoscopia invasive. Inoltre, la facilità di ottenere CNE aumenta la capacità di condurre esperimenti in cellule da donatori diversi, che migliora validazione statistica dei risultati osservati. Infine, il naso è uno dei primi siti ad essere esposti a qualsiasi tipo di stress aerodispersi. Così, generando in organotipicovitro sistemi di coltura che mimano all'epitelio nasale sono utili per studiare inalazione di particelle virali, inquinanti, allergeni o gas, che può essere facilmente ottenuto utilizzando questo sistema di coltura cellulare.

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Protocol

1. Preparare Plastic Ware: Cappotto Piatto

  1. Aggiungere 500 microlitri PureCol (1:100 diluito con acqua sterile) a ciascun pozzetto di una piastra 12 pozzetti.
  2. Incubare a 37 ° C in un incubatore per 30 minuti, rimuovere il PureCol e risciacquare con HBSS destra prima che le cellule vengono aggiunti alla piastra (vedere il punto 3.1).

2. Ottenere e pretrattamento Biopsia del CNE umano

  1. Nasale biopsia raschiare
    1. Ottenere EC superficiali che rivestono i turbinati nasali sotto visione diretta attraverso un speculum riutilizzabili in polipropilene nasale 9 mm (modello 22009) su un otoscopio operativo con speculum (modello 21700). Questo dispositivo fornisce una visualizzazione ottimale dei turbinati nasali e la flessibilità di movimento.
    2. Eseguire le biopsie con il soggetto seduto in posizione verticale su una sedia a schienale diritto con la testa leggermente piegata all'indietro o sdraiati in posizione supina su un lettino.
    3. Inserire lo speculum otoscopio nella narice e Turbi inferiorenate visualizzato con illuminazione.
    4. Inserire una curetta termoplastico sterile attraverso lo speculum con la punta estesa distalmente alla parte posteriore del turbinato.
    5. Utilizzando una leggera pressione sulla superficie inferiore del turbinato, la curetta viene tracciata attraverso il 5x superficie mucosa e retratto. Un recupero di successo di cellule della mucosa detenute da un'azione capillare sarà evidente nella tazza del curetta.
  2. Posizionare campione in una provetta conica da 15 ml contenente 8 ml di RPMI 1640, trasporto su ghiaccio.
  3. Usare pinze per recuperare la sonda, rimuovere il tessuto da sonda rinoceronte con una pipetta P-1000, scartare sonda
  4. Centrifuga a pellet (4 ° C, 400 xg, 5 min), aspirare il surnatante (attenzione: attenzione a non aspirare il pellet).
  5. Risospendere il pellet in 1 ml BEGM con 10 ml di 100x DNasi 1.
  6. Incubare a temperatura ambiente per 20 min.
  7. Centrifuga (4 ° C, 400 xg, 5 min), NON aspirare il surnatante!

3. SEED celle di plastica (giorno 0)

  1. Rimuovere il PureCol dalla piastra e risciacquare con HBSS (vedi anche passo 1.2).
  2. Aggiungere un volume minimo di BEGM supporti + + (80-100 microlitri, fino a visualizzare un menisco di supporto nel centro del pozzetto) in 1-4 pozzetti (a seconda delle dimensioni biopsia) della piastra rivestita.
  3. Utilizzare una pipetta P-1000 per rimuovere con attenzione il pellet del tessuto bioptico dal tubo, senza aspirazione troppo media.
  4. Trasferire il pellet in mezzo pozzi, tenere la biopsia insieme come un ammasso di cellule, e non rompere a fare una sospensione singola cella. Un buon rendimento biopsia fino a 4 pozzi che possono essere seminati. Mettere la piastra nel tessuto culturale incubatore (37 ° C, 5% CO 2,> 90% di umidità relativa).
  5. Controllare dopo due ore per assicurare che vi sia sufficiente supporti (senza disturbare il menisco).
  6. Day1, 24 ore di post-semina: raccogliere tutte le cellule non aderenti di tutti i pozzetti (piastre tilt e raccogliere mezzi di comunicazione con le cellule in un P-1000, collect tutti i pozzetti in una provetta da centrifuga da 1,5 ml).
  7. Centrifugare (4 ° C, 400 xg, 5 min).
  8. Mentre centrifugazione sospensione cellulare: aggiungere circa 250 ml di BEGM + + e 250 microlitri della miscela Mezzi BEGM + alle cellule seminate al giorno 0.
  9. Ripetere i passaggi 3.1-3.5 per le cellule non aderenti.
  10. Giorno 2-5: variazione media dei cellule giornalieri, aggiungere 500 mezzi microlitri di ogni bene, ridurre la quantità di BEGM + + supporti graduale (giorno 2 dopo la semina: 125 ml BEGM + + oltre 375 microlitri BEGM +, day3 dopo la semina e nei seguenti giorni: 73 pl BEGM + + più 427 ml BEGM +).

4. Ampliare le cellule nelle Boccette

  1. Monitorare le cellule quotidiana; una volta che hanno raggiunto il 80-90% di confluenza (solitamente 5-7 giorni dopo la biopsia, se prendono più essi non crescere con successo) le cellule di sollevamento come segue: i media accuratamente aspirato, aggiungere 500 ml di 0,25% tripsina per pozzetto, tenerli a 37 ° C finché le cellule vengono staccate (richiede solitamente 2-3 min).
  2. Preparare la necessitàEd volume di soia inibitore della tripsina (SBTI) (750 pl per 1 ml di tripsina) in una provetta da 15 ml.
  3. Staccare le cellule da pipettare ripetutamente su e giù per la soluzione di tripsina; trasferimento di cellule staccate nel tubo da 15 ml con SBTI.
  4. Lavare tutti i pozzetti con un totale di 1 ml HBSS, aggiungere HBSS al tubo con le cellule.
  5. Centrifuga a pellet (4 ° C, 400 xg, 5 min), aspirare i media, risospendere in 1 ml BEGM + supporti e agitare la provetta.
  6. Espandere le cellule in un pallone T25 o T75 a seconda delle dimensioni del pellet (questo è p1; circa due pozzetti confluenti andare in un pallone T75, uno confluenti bene è abbastanza per un T25, di solito due pozzetti confluenti producono un T75).
    1. Aggiungi BEGM + ai palloni (5 ml ciascuno per un T75, 3 ml ciascuno per un T25).
    2. Aggiungere la sospensione cellulare nei flaconi. Trasferire i flaconi in un tessuto culturale incubatore.
  7. 24 ore post-pallone-semina: aggiungere ulteriori supporti BEGM + al pallone (3 ml ad un T25, 10 ml ad un T75).

5. Seed Celle sul tessuto Cultura Inserti

  1. Rimuovere il supporto dal pallone e aggiungere tripsina (3 ml per T25, 4 ml per pallone T75).
  2. Incubare a 37 ° C finché le cellule vengono staccate (circa 2-3 min).
  3. Preparare SBTI (750 pl per 1 ml di tripsina> 2,25 ml per T25, T75 per 3 ml) in una provetta da 15 ml.
  4. Staccare le cellule con nastro adesivo il pallone e pipettando su e giù e trasferimento a tubo conico con il SBTI.
  5. Lavare il pallone con HBSS (1 ml per T25, 2 ml per T75), aggiungere la HBSS al tubo 15 ml.
  6. Centrifugaa pellet (4 ° C, 400 xg, 5 min), rimuovere con attenzione il surnatante.
  7. Preparare i piatti: decidere quanti piatti stanno per essere testa di serie, etichettare i piatti con il codice di esempio e il numero, il numero di passaggio (cioè p2) e la data. Aggiungere 700 microlitri BEGM + supporto alla camera basale.
  8. Risospendere il pellet di cellule in 1 ml di mezzi BEGM ALI vortex la provetta.
  9. Contare le cellule con un emocitometro (un T25 solito produce circa 4 milioni di cellule, un T75 può avere fino a 20 milioni di cellule a seconda delle isolotto; utilizzare 1-2 milioni di cellule per una piastra 12 pozzetti) e diluire la sospensione cellulare con supporti BEGM ALI al volume totale necessario per la quantità di piatti che dovrebbe essere testa di serie (1,2 x 10 6 cellule in 2,5 ml di supporti per piastra). (Nota: Se parte delle cellule vogliono essere congelati, etichettare il tubo e rimuovere le cellule qui: di solito congelare 2 x 10 6 cellule in 2 ml di congelamento media)
  10. Aggiungere 200 microlitri di sospensione cellulare lato apicale di ciascuna cella Corning 12well patinatainserire (> questo sarà di circa 80,000-150,000 cellule / inserto; 12 millimetri transwells con 0,4 micron pori poliestere (polietilene tereftalato (PET)) inserto a membrana); trasferire nella coltura tissutale incubatore.
  11. Dopo 24 ore, cambiare il supporto apicale (200 microlitri media espansione).
  12. Il mantenimento delle colture cellulari: Cambiare il supporto (BEGM ALI media; 700 microlitri basolaterale e 200 apicale pl) ogni altro giorno. Inserti devono essere mantenuti sommerso fino celle sono completamente confluenti (senza fori in monostrato sono visibili). A seconda del numero di cellule questo avviene di solito tra 2-6 giorni, se ci vuole più tempo le cellule saranno molto probabilmente non essere praticabile.

6. Stabilire Air Interface Liquid Una volta che le cellule sono completamente confluenti (Quando le cellule sulle Transwells sono completamente confluenti)

  1. Una volta che le cellule sono completamente confluenti sostituire entrambi i media apicale e basolaterale con i media BEGM ALI integrato con 500nm acido retinoico per 48 ore.
  2. 48 ore dopo aver aggiunto l'acido retinoico completato BEGM ALI supporti: Preparare PneumaCult-ALI Maintenance Medium (le istruzioni del seguente produttore): Calcolare il volume di terreno necessari (per un piatto di solito 8,5 ml per i vani basali); aggiungere per 1 ml PneumaCult Complete Piano Base :

    10 microlitri PneumaCult 100x Manutenzione Supplemento
    2 ml eparina (di una soluzione madre 2 mg / ml)
    5 ml idrocortisone (di una soluzione madre 96 microlitri / ml).

  3. Rimuovere tutti i supporti e aggiungere 700 microlitri PneumaCult-ALI manutenzione dei media al lato basolaterale soltanto (nessun mezzo sul lato apicale).
  4. Mantenere le colture cellulari per 4 settimane al ALI:
    1. Modificare i mezzi di ogni altro giorno (Lunedi, Mercoledì e Venerdì orario funziona bene per noi).
    2. Dopo una settimana a ALI, una volta a settimana (mercoledì) la superficie apicale viene risciacquato: aggiungere 200 microlitri HBSS al lato apicale, tenerli per 10 minuti in incubatrice, con attenzione aspirare ilHBSS (usare una pipetta di vetro 9 in allegato alla trappola vuoto nella cabina di sicurezza biologica, utilizzare punte 200 microlitri sulla punta della pipetta di aspirazione fuori HBSS).

Nota: Cambiare punte tra piastre, così come cambiare le punte quando si passa dalla superficie apicale rispetto basolaterale. Dopo circa 2 settimane al ALI, le cellule iniziano a differenziarsi e appaiono ciglia. Le colture cellulari raggiungono la piena differenziazione dopo circa 4 settimane al ALI.

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Representative Results

CNE coltura seguendo il protocollo qui descritto re-differenziarsi in uno strato eterogeneo di EC composto da cellule ciliate e non ciliate, che rappresentano la situazione in vivo (Figura 1). Alcuni dei CNE differenziati sono muco che producono cellule (colorazione in blu con AB / PAS, Figura 1B). Anche se il protocollo qui presentato è ottimizzato, differenziazione può variare in relazione alla distribuzione delle popolazioni cellulari totali (cioè differenti rapporti di cellule ciliate: cellule che producono muco: cellule non ciliate) o anche produrre un epitelio squamoso più. Queste variazioni possono dipendere dalla popolazione dei donatori e quindi rappresentare ricapitolazione di un fenotipo malattia di base, come abbiamo precedentemente dimostrato utilizzando CNE dai fumatori 18. Figura 2 mostra esempi di CNE ri-differenziata ottimali utilizzando un protocollo diverso e formulazioni multimediali. Le cellule sono squamose ené cuboidali né ciliate e non imitare un epitelio respiratorio pseudostratificato (Figura 2).

Figura 1
Figura 1. Re-differenziata cultura NEC umana. CNE sono state fissate con PFA 4% ed inclusi in paraffina. Le colture sono state colorate con ematossilina ed eosina (A) e Alcian blue / acido periodico di Schiff (B) (seguendo metodi descritti in 19). Le immagini mostrano CNE con una chiara organizzazione, una struttura cubica, cellule caliciformi che producono muco, così come ciliato EC.

Figura 2
Figura 2. Ematossilina e eosina sezione inclusi in paraffina di culture non ottimali macchiati. Culture NEC con differenziazione ottimale. Le cellule appaiono squamose, non cuboidastruttura l, non le cellule ciliate.

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Discussion

EC respiratorie non solo forniscono una barriera fisica per proteggere il corpo umano da stimoli esogeni 20, ma anche agire come un centralino per avviare e regolare le risposte di difesa immunitario respiratorie 1-3 tramite la secrezione di mediatori solubili o interazioni dirette cellula-cellula recettore-ligando. Per studiare ulteriormente il ruolo di EC nella risposta immunitaria, per esaminare differenza di potenziale tra i CE da popolazioni malate, o per studiare gli effetti dei fattori di stress esogeni sull'ECS, è importante ricapitolare la situazione in vivo. Le vie aeree umane contengono più di 40 diversi tipi di cellule, tra cui 20 diverse cellule epiteliali, come le cellule ciliate, cellule caliciformi e cellule basali 20. Il nostro protocollo descrive come un superficiale nasale biopsia del raschiamento può essere processato per produrre CNE che può essere espansa e colte di sottoporsi re-differenziazione, producendo culture NEC, che in gran parte imitano l'epitelio nasale in vivo.

L'utilizzo di questo modello in vitro di organotipica CNE differenziati umani primari fornisce possibilità uniche per varie applicazioni. Esso consente lo studio di malattie specifiche differenze di CNE (ad esempio la fibrosi cistica, asma, fumo), sottesi ai meccanismi di una malattia, così come le esposizioni controllate agli inquinanti atmosferici (es. ozono, gas di scarico diesel, fumo di sigaretta) 18,21-23. Inoltre, CNE differenziati cresciuti su inserti di coltura di tessuti si prestano a co-coltura con altri tipi di cellule (per esempio cellule dendritiche, cellule natural killer, o macrofagi) 10,11, permettendo di esaminare le interazioni cellula-cellula in un ambiente controllato.

Descriviamo la coltura e ri-differenziante di CNE, e non cellule epiteliali bronchiali, che sono stati utilizzati in molti studi precedentemente pubblicati 24-27. Vediamo vari motivi per cui l'uso di CNE può essere vantaggiosa rispetto all'uso dibronchiale EC. In primo luogo, ottenendo superficiali biopsie raschiare nasale è meno costoso di eseguire una broncoscopia per ottenere biopsie pennello. In secondo luogo, per una varietà di malattie preesistenti (ad es recidere asmatici) è irrealistico effettuare una broncoscopia ricerca legate alle cellule epiteliali delle vie aeree inferiori ottenuti. Tuttavia, la procedura meno invasiva di raschiare la superficie inferiore del turbinato nasale inferiore con una sonda Rhino può essere eseguita in questi soggetti. In terzo luogo, biopsie raschiare nasali possono essere eseguite sugli stessi individui più volte (di solito circa 4 settimane tra biopsie), senza significativi effetti collaterali 28-30. Quarto, CNE sono tra le prime cellule ad essere esposte a inalato stress ambientali, quali inquinanti atmosferici, agenti patogeni o allergeni e quindi rappresentano preziosi modelli in vitro per studiare gli effetti di questi fattori di stress sulle cellule epiteliali delle vie aeree.

Vari sistemi di coltura cellulare di re-differirerenziata EC umano sono disponibili in commercio (per esempio il modello EpiAirway da MatTek, Ashland, MA, Clonetics da Lonza, Basilea, Svizzera, MucilAir da Epithelix Sars, Ginevra, Svizzera). Tali colture cellulari disponibili in commercio sono stabili per un lungo periodo di tempo e sono ben caratterizzati. Tuttavia, essi sono costosi e gli studi sono in genere limitati ad un basso numero di campioni provenienti da diversi individui. Inoltre, è difficile controllare la popolazione donatore, che dipende dalla disponibilità del fornitore presentata. Appena ottenendo CNE con biopsie superficiali raschiare consente al ricercatore di controllare le caratteristiche soggetti (quali età, sesso, razza, peso, indice di massa corporea, stato di malattia, uso di farmaci, ecc) e ai volontari re-call back per un potenziale di follow- up.

In generale, tutti i protocolli pubblicati per ri-differenziazione vie respiratorie umane (sia bronchiale o nasale) ECS al ALI includono procedure simili: obtaining EC, ampliando le cellule in tessuti fiasche di coltura, e il loro trasferimento alla coltura cellulare porosa inserisce per la differenziazione al ALI. I protocolli variano nel tipo di supporto, il fattore di integratori di crescita, il numero di passaging, il rivestimento degli inserti, e l'attivazione dei CNE prima di stabilire la ALI. Mentre in un protocollo, dopo aver ottenuto e digerire, le cellule sono seminati direttamente su inserti patinati e conservati solo pochi giorni al ALI prima dell'uso 13; altri protocolli includono coltura per diverse settimane di ri-differenziare al ALI 12,14,15 . Non c'è coerenza in merito a rivestire gli inserti con collagene o di altri componenti della matrice extracellulare: mentre alcuni protocolli richiedono rivestimento altri 12,15 utilizzano inserti rivestiti 13,14. Tuttavia, condizioni di coltura sono di grande importanza, in particolare le impostazioni dell'incubatrice. L'umidità relativa, che deve essere> 90%, e la CO 2, che devono essere adeguati al 5% sono moltofattori importanti per evitare l'essiccazione della coltura cellulare ALI e aiutare tampone media. Al fine di condividere la nostra esperienza, vogliamo qui ricordare che non esiste un tasso di successo del 100%. Alcuni campioni di biopsia raschiare nasale non aderiscono alla piastra di coltura tissutale, mentre alcuni campioni NEC non rispettare gli inserti o non raggiungeranno mai la confluenza. Nel corso degli anni, il tasso di successo globale utilizzando il protocollo qui descritto è di circa 80%. La nostra esperienza dimostra che la coltura del CNE da popolazioni malati definiti, come i fumatori, è più impegnativo di CNE da non-fumatori sani

Il nostro protocollo per la coltura del CNE umani primari incorpora diversi passaggi chiave che abbiamo ottimizzato nel corso degli anni: 1. CNE sono espansi solo due volte prima di essere seminate sugli inserti di coltura tissutale. 2. Gli inserti sono utilizzati non rivestito. 3. Una volta seminate su piastre di coltura di tessuto, la quantità di NuSerum viene gradualmente ridotta per evitare che le cellule vengono staccati dalla coltura tissutalepiastre. 4. I NEC sono conservati almeno 25-28 giorni al ALI prima di utilizzarli in esperimenti per assicurare la completa re-differenziazione. In sintesi, il protocollo qui descritto comprende un protocollo ottimizzato per cultura e ri-differenziare CNE umani a ALI.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Gli autori desiderano ringraziare Lisa Dailey per gli ingressi voti.

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Institutes of Health (ES013611 e HL095163), l'assistente di volo Medical Research Institute (FAMRI), e l'Environmental Protection Agency (CR83346301) e dichiara alcun conflitto di interessi. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health. Anche se la ricerca descritta in questo articolo è stato finanziato in parte dalla US Environmental Protection Agency attraverso accordo di cooperazione CR83346301 con il Centro di Medicina Ambientale, Asma e Polmone di Biologia presso la University of North Carolina-Chapel Hill, non è stato sottoposto alla L'agenzia del peer richiesto e revisione della politica e quindi non riflettono necessariamente il punto di vista dell'agenzia, e nessuna approvazione ufficiale dovrebbe essere dedotto. Menzione of nomi commerciali o di prodotti commerciali non costituisce approvazione o raccomandazione per l'uso. Loretta Müller è sostenuta dalla National Science Foundation svizzera con un contributo personale.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nasal speculum Welch Allyn Model 22009 9 mm, reusable polyproylene
Operating otoscope Welch Allyn Model 21700
Rhino probe cell cuvette Arlington Scientific SY-96-092 bend the head of the cuvette a little more
12-well culture plates Corning 3512
Transwell membrane cell culture inserts Corning 3460
Tissue culture flask Corning 430639 and 430641 T25 and T75 vented flask
RPMI 1640 media (with L-Glutamine) Gibco 11875
Bronchial/Tracheal Epithelial Cell Growth Medium Cell applications 511-500
BEGM Bronchial Epithelial Cell Growth Medium Lonza CC-3170 This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements.
Sodium Bicarbonate 7.5% solution Gibco 25080 Use as it is.
NuSerum BD Biosciences 355104 Use as it is.
BAMBANKER freezing media BAMBANKER 302-14681 Use as it is.
CoolCell Biocision HTBCS-136 (CryoPrep alcohol-free cell freezing container)
PureCol AdvancedBioMatrix 5005-B dilute 1:100 with sterile water (should be roughly 0.03 mg/ml)use 500 μl/well of a 12-well plate
HBSS with Ca2 and Mg2+ Gibco 14025
DNAse 1 Sigma DN25 Dissolve at 1.5 mg/ml, which is a 100x solution, add 10 μl to each ml of media
Trypsin, 0.25%, 1x, with phenol red Gibco 25200-056 Use at it is
Soy Bean Trypsin Inhibitor (SBTI) Sigma T6522 Use dissolved in HBSS at a concentration of 1 mg/ml
Retinoic acid Sigma R7632 Make it up 100 μM stock solution (see below), dilute to 10 μM with absolute alcohol, take 5 μl of this and add it to 1 ml BEGM media (our working solution).

All-trans Retinol has a coefficient of extinction of 52,480 in ethanol at 325 nm. Dissolve 25 mg in 50 ml absolute ethanol. Serial dilutions need to be made, dilute 50 ml of stock in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, and again take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute Ethanol, take 100 ml of this and dilute in 900 ml absolute ethanol and read in the spectrophotometer at 325 nm, this number is then multiplied by its’ dilution factor, then divided by the extinction coefficient of 52,480, this will give a number in mM. Make a 100 mM stock (store at -20 °C) and from this stock a 10 mM aliquot is made, the daily retinoic acid needed would be 5 ml of this 10 mM aliquot in 995 ml ALI media. Example: 325nm reading is 1.15. 1.15 x 10,000 (dilution factor) / 52,480 = 0.219 = 219 mM, make a 100 mM stock from this, in absolute ethanol.
DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine and sodium pyruvate Gibco 11995
Bovine Pituitary Extract Gibco 13028-014 Used for BEGM ALI media.
Nystatin Sigma N4014-50 mg Make up a solution of 3.3 mg/ml.
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1600-100 Make up a solution of 10 mg/ml solution in milliQ water.
PneumaCult-ALI media StemCell 5001 This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements. For details see below.
Hydrocortisone StemCell 7904 Dissolve 2.4 mg hydrocortisone in 1 ml ddH2O (used to make the 200x Hydrocortisone stock solution)
Heparin Sodium Salt in PBS (2 mg/ml) StemCell 7980 Use at it is.
Filter flasks (500 ml) Corning 431097 0.22 μm pore size
Filter tubes (50 ml) Millipore SCGP00525 Steriflip, 0.22 μm pore size
Pipette tips - ART Barrier Tips Molecular Bioproducts 2139RI, 2069RI, 2179RI
Conical tubes, sterile, 15 ml and 50 ml
ddH2O, absolute ethanol, ice
CO2 incubator
refrigerated centrifuge
biological safety cabinet
pipettes (p2, p200, p1000), 9 in glass pipettes
gloves
lab coat with tight cuffs
Media and solutions used: Recipe Used for
General remark: always warm the media to room temperature
BEGM media
  • 500 ml BEGM Cell Application media with one aliquot of retinoic acid
(mix them half-half and filter )
  • 500 ml BEGM Lonza media with one aliquot of single quot supplements
  • digestion of the biopsy
BEGM+ media
  • 50 ml BEGM media
  • maintaining cells on plastic in the plates (passage0)
  • 10 μl retinoic acid (working solution)
  • seeding cells in the flask (passage1; partially)
  • maintain the cells in the flask
BEGM++ media
  • 50 ml Lonza’s BEGM media with supplements
  • seeding fresh cells in 12-well plate on plastic
  • 1 ml Sodium BiCarb
  • maintaining cells in the plates on plastic (passage0; only partially)
  • 2.5 ml NuSerum
  • seeding cells in the flask (passage1; partially)
BEGM ALI media
  • 250 ml DMEM-H
  • Maintaining cells on the transwell before they go ALI
  • 250 ml BEGM including supplements
  • 2 ml Bovine Pituitary Extract (12.5 mg/ml solution)
  • 1 ml Nystatin (3.3 mg/ml solution)
  • 75 μl BSA (10 mg/ml solution)
200X Hydrocortisone Stock Solution (96 μl/ml solution)
  • 200 μl dissolved hydrocortisone
  • As a supplement to the PneumaCult-ALI Complete Base Medium for the last day in the flask and when cells are on inserts
  • 4250 μl dissolved sodium chloride
  • 540 μl ddH2O
  • 10 μl absolute ethanol
Filter solution through 0.22 μm filter, aliquot solution and store at -20 °C, avoid additional freeze/thaw cycles
PneumaCult-ALI Complete Base Media
  • 450 ml PneumaCult-ALI Basal Medium
  • Base medium for all three PneumaCult-ALI media
  • 50 ml PneumaCult 10x Supplement
  • The PneumaCult media is light sensitive, thus always keep it in the dark
(this is stable for 2 weeks at 2-8 °C or for up to 6 months at -20 °C)
PneumaCult-ALI Maintenance Medium Per 1 ml of PneumaCult-ALI Complete Base Medium add: ALI culture on inserts
  • 10 μl PneumaCult 100x Maintenance Supplement
  • 2 μl Heparin (of a 2 mg/ml stock solution)
  • 5 μl Hydrocortisone (of a 96 μl/ml stock solution)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Comments

1 Comment

  1. Can you describe in more detail how the paraffin-embedding and sectioning is performed? We are experiencing technical issues with our attempts at H&E. The transwell membranes "curl" and cells are lost. Does the thickness of the sectioning matter (5 um)? Thank you for this great tutorial.

    Reply
    Posted by: Kathy S.
    February 22, 2016 - 12:22 PM

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