Culture de cellules humaines épithéliales nasales à l'interface Air Liquide

1Center for Environmental Medicine, Asthma, and Lung Biology, The University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Pediatrics, The University of North Carolina at Chapel Hill, 3Pulmonary Diseases and Critical Care, The University of North Carolina at Chapel Hill, 4Curriculum in Toxicology, The University of North Carolina at Chapel Hill
Biology

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Summary

Cellules épithéliales nasales, obtenues par grattage superficiel de la biopsie des volontaires humains, sont expansées et transférées sur des inserts de culture tissulaire. Après avoir atteint la confluence, les cellules sont cultivées à l'interface air-liquide, ce qui donne des cultures de cellules ciliées et non ciliées. Cultures de cellules épithéliales nasales différenciées fournissent des modèles expérimentaux viables pour l'étude de la muqueuse respiratoire.

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Müller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer II, W. A., Jaspers, I. Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface. J. Vis. Exp. (80), e50646, doi:10.3791/50646 (2013).

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Abstract

Les modèles in vitro en utilisant des cellules epitheliales primaires humaines sont essentiels à la compréhension des fonctions principales de l'épithélium des voies respiratoires dans le cadre d'infections microbiennes ou des agents inhalés. Des comparaisons directes de cellules obtenues à partir de populations malades permettent de caractériser différents phénotypes et disséquer les mécanismes sous-jacents de médiation changements dans la fonction des cellules épithéliales. La culture de cellules épithéliales provenant de la région trachéo-bronchique humain a été bien documenté, mais est limitée par la disponibilité de tissu pulmonaire humain ou de caractère invasif associé à l'obtention de biopsies bronchiques les brosses. Cellules épithéliales nasales sont obtenus par biopsies superficielles nasale de gratter beaucoup moins invasives et les sujets peuvent être biopsiés plusieurs fois, sans effets secondaires importants. En outre, le nez est le point pour le système respiratoire d'entrée et donc l'un des premiers sites à être exposés à tout type de stress d'origine atmosphérique, tels que des agents microbiens, polluants ou allergènes.

Brièvement, les cellules épithéliales nasales obtenues à partir de volontaires humains sont expansés sur des plaques de culture revêtues de tissu, et ensuite transférés sur des inserts de culture cellulaire. Après avoir atteint la confluence, les cellules continuent à être cultivées à l'interface air-liquide (ALI), pendant plusieurs semaines, ce qui crée plus physiologiquement conditions pertinentes. La condition de culture ALI utilise des milieux définis menant à un épithélium différencié qui présente des caractéristiques morphologiques et fonctionnelles similaires à l'épithélium nasal humain, avec des cellules ciliées, et la fois la production de mucus. des inserts de culture tissulaire avec des cellules épithéliales nasales différenciées peuvent être manipulées dans une variété de façons en fonction des questions de recherche (traitement avec des agents pharmacologiques, la transduction avec des vecteurs lentiviraux, l'exposition à des gaz ou de l'infection par des agents microbiens) et analysés pour de nombreux paramètres différents, allant de voies cellulaires et moléculaires, ch fonctionnelleanges, morphologie, etc

Dans les modèles in vitro de cellules épithéliales nasales humaines différenciées permettra aux enquêteurs de répondre roman et questions de recherche importantes en utilisant des modèles expérimentaux organotypiques que reproduire en grande partie de l'épithélium nasal in vivo.

Introduction

Objectif de la technique

Les cellules épithéliales (ECS) dans les voies respiratoires sont parmi les premiers sites à être directement exposés à des facteurs de stress environnementaux inhalés, comme les agents pathogènes, des allergènes ou polluants atmosphériques. CE sont plus un obstacle structurel: Ils agissent comme un standard pour initier et réguler la réponse immunitaire respiratoire 1-3 par la libération de médiateurs solubles 4-6 et l'expression de ligands / récepteurs sur leur surfactant 7-9. Bien que des lignées de cellules immortalisées peuvent être utilisés comme modèles pour étudier les EC respiratoires in vitro, ils ne parviennent pas à se différencier en des populations cellulaires hétérogènes constitués de cellules ciliées polarisée et de la production de mucus, similaire à ce qui est observé in vivo. Pour résumer les caractéristiques importantes de l'épithélium respiratoire observée in vivo, les EC des voies respiratoires primaires peuvent être utilisées. Par conséquent, notre objectif était d'optimiser notre méthode utilisant nasale EC (CNE) a obtenu des volontaires humains. Les CNE sont étendues et mises en culture in vitro, ce qui donne un modèle de culture de cellules différenciées de CNE qui imite un grand nombre des caractéristiques de l'épithélium nasal vu in vivo.

Raisonnement

L'utilisation de modèles in vitro avec EC primaires humains imitant dans la situation in vivo - comme décrit dans cette étude - offre des possibilités uniques pour étudier les différences spécifiques de la maladie d'ECS, les paramètres physiologiques associés à l'épithélium des voies respiratoires, ou les interactions entre les CE et d'autres types de cellules, telles que les cellules dendritiques 10, les cellules tueuses naturelles 11 ou des macrophages. Plusieurs procédés existants utilisent les EC bronchiques, qui peuvent être obtenus par l'intermédiaire de biopsies invasive de la brosse au cours de bronchoscopies, ou à partir de tissus pulmonaires autrement mis au rebut 12 à 17. En outre, les sources commerciales pour obtenir des voies respiratoires humaines cultures de cellules épithéliales différenciées entièrement existent (Modèle EpiAirway de MatTek, Ashland, MA, Cloneticsde Lonza, Bâle, Suisse, MucilAir de Epithelix Sars, Genève Suisse), où les enquêteurs peuvent choisir parmi différents bailleurs de fonds. Cependant, à cause de la piscine limité de cellules épithéliales disponibles dans le commerce, limitées ou ensemble de paramètres prescrits, le coût associé à l'obtention commerce respiratoire humain primaire EC, et l'accès limité aux tissus pulmonaires jetés ou tissu fraîchement obtenue de biopsie bronchique humaine, interdisent de nombreux chercheurs de mener des études dans complètement différenciées EC des voies respiratoires humaines. Par conséquent, nous avons décidé de développer une technique qui 1) utiliser CNE humains non invasive obtenus, 2) fournir un protocole rendement des cultures de différenciée épithélium respiratoire humain, et 3) être reproductible dans la plupart des paramètres de laboratoire avec une infrastructure existante de culture de tissus.

Avantages par rapport aux techniques / modèles existants

Obtention CNE frais, par rapport à bronchique ou petit voies EC, est beaucoup moins invasive, individuels peut être biopsiés plusieurs fois, sans effets secondaires importants, et des biopsies superficielles gratter nasales peuvent être menées dans des populations malades qui ne seraient pas admissibles à des bronchoscopies liées à la recherche. Non invasives biopsies superficielles gratter pour obtenir CNE permettent à l'enquêteur pour définir les spécifications des donateurs a priori, y compris l'âge, le sexe, l'état de la maladie, etc, conformément à l'objectif de la recherche à faire. Ainsi, lors de la conception des études de recherche enquêteurs ne sont pas limités par les tissus disponibles en clinique / de spécimens épithéliales, acheter des modèles de culture cellulaire différenciées coûteux auprès de fournisseurs commerciaux, ou la conception des études de bronchoscopie envahissantes. En outre, la facilité à obtenir CNE augmente la capacité de mener des expériences dans les cellules de différents bailleurs de fonds, ce qui améliore la validation statistique des résultats observés. Enfin, le nez est l'un des premiers sites à être exposés à toute sorte de facteurs de stress dans l'air. Ainsi, en générant organotypiqueLes systèmes de culture in vitro mimant l'épithélium nasal sont utiles pour étudier l'inhalation de particules virales, des polluants, des allergènes, ou des gaz, qui peuvent être facilement atteintes par l'utilisation de ce système de culture cellulaire.

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Protocol

Une. Préparer plastique Ware: Manteau Plate

  1. Ajouter 500 ul PureCol (1:100 dilué avec de l'eau stérile) dans chaque puits d'une plaque à 12 puits.
  2. Incuber à 37 ° C dans un incubateur pendant 30 min, retirer le PureCol et rincer avec du HBSS juste avant les cellules sont ajoutées à la plaque (voir l'étape 3.1 ci-dessous).

2. L'obtention et le prétraitement de biopsie de CNE humain

  1. Nasale gratter biopsie
    1. Obtenir EC superficielles qui tapissent les cornets nasaux sous vision directe à travers un spéculum réutilisable polypropylène nasale 9 mm (modèle 22009) sur un otoscope d'exploitation avec spéculum (modèle 21700). Ce dispositif fournit une visualisation optimale des fosses nasales et la flexibilité de mouvement.
    2. Effectuez les biopsies avec le sujet assis droit sur une chaise à dossier droit avec la tête légèrement basculée en arrière ou se trouvant dans une position couchée sur une table d'examen.
    3. Insérez le spéculum otoscope dans la narine et la turbi inférieureNate visualisé avec éclairage.
    4. Insérez une curette thermoplastique stérile à travers le spéculum avec la pointe distale étendu à l'arrière du cornet.
    5. En utilisant une légère pression sur la surface inférieure du cornet, la curette est attirée sur le 5x de surface de la muqueuse et rétracté. Une récupération réussie de cellules de la muqueuse détenus par capillarité sera évident dans la coupe de la curette.
  2. Placer l'échantillon dans un tube conique de 15 ml contenant 8 ml de RPMI 1640, le transport sur de la glace.
  3. Utilisez une pince pour récupérer la sonde, déloger les tissus de la sonde de rhinocéros avec une pipette P-1000, jeter la sonde
  4. Centrifugeuse pour obtenir un culot (4 ° C, 400 xg, 5 min), aspirer le surnageant (attention: attention à ne pas aspirer le culot).
  5. Remettre en suspension le culot dans 1 ml BEGM avec 10 ul de DNase 1 100x.
  6. Incuber à température ambiante pendant 20 min.
  7. Centrifugeuse (4 ° C, 400 xg, 5 min), ne pas aspirer le surnageant!

3. SEED les cellules sur plastique (jour 0)

  1. Retirez le PureCol de la plaque et rincer avec du HBSS (voir aussi l'étape 1.2).
  2. Ajouter un volume minimal de supports BEGM + + (80 à 100 ul, jusqu'à ce qu'un ménisque de support apparaît au centre du puits) dans les puits 1-4 (selon la taille de biopsie) de la plaque revêtue.
  3. Utiliser une pipette P-1000 pour retirer délicatement le culot du tissu de biopsie du tube, sans aspirer trop médias.
  4. Transférer le culot dans le milieu des puits, garder la biopsie ensemble comme un amas de cellules, et ne pas casser pour faire une suspension cellulaire unique. A de bons rendements biopsie jusqu'à 4 puits qui peuvent être ensemencés. Placer la plaque dans l'incubateur de culture tissulaire (37 ° C, 5% CO 2,> 90% d'humidité relative).
  5. Vérifiez après deux heures afin d'assurer qu'il ya suffisamment de médias (sans perturber le ménisque).
  6. Jour 1, 24 h après l'ensemencement: collecter toutes les cellules non-adhérentes de tous les puits (plaque d'inclinaison et de recueillir les médias avec des cellules dans un P-1000, collect tous les puits dans un tube de 1,5 ml centrifugeuse).
  7. Centrifuger (4 ° C, 400 x g, 5 min).
  8. Alors que la centrifugation de la suspension de cellules: ajouter 250 ul d'BEGM + + et 250 ul de mélange de médias BEGM + aux cellules ensemencées le jour 0.
  9. Répéter les étapes 3.1 à 3.5 pour les cellules non adhérentes.
  10. Jour 2-5: changement médias des cellules quotidiennes; ajouter 500 médias ul à chaque puits, réduire la quantité de BEGM + + par étapes de médias (jour 2 après le semis: 125 pi BEGM + + plus 375 pi BEGM +, day3 après le semis, et les jours suivants: 73 ul BEGM + + plus 427 pi BEGM +).

4. L'expansion des cellules dans les flacons

  1. Surveillance de cellules par jour, une fois qu'ils ont atteint 80-90% de confluence (habituellement 5-7 jours après la biopsie, si elles prennent plus de temps qu'ils ne poussent pas avec succès) les cellules de levage comme suit: médias soigneusement aspirer, ajouter 500 ul de trypsine à 0,25% par bien, gardez-les à 37 ° C jusqu'à ce que les cellules sont détachées (cela prend habituellement 2-3 min).
  2. Préparer la nécessitéle volume de haricot de soja ed inhibiteur de trypsine (SBTI) (750 pi par ml de trypsine 1) dans un tube de 15 ml.
  3. Déloger les cellules par pipetage de haut en bas plusieurs fois la solution de trypsine; transfert de cellules individuelles dans le tube conique de 15 ml avec SBTI.
  4. Rincez tous les puits avec au total 1 ml de HBSS, ajouter HBSS au tube avec les cellules.
  5. Centrifugeuse pour obtenir un culot (4 ° C, 400 xg, 5 min), aspirer les médias, remettre en suspension dans 1 ml BEGM + médias et le tube vortex.
  6. Développer cellules dans un flacon T25 ou T75 selon la grosseur des granules (c'est p1; environ deux puits confluentes aller dans un flacon T75, un confluent est bien assez pour un T25, généralement de 2 puits confluentes donnent un T75).
    1. Ajouter BEGM + pour les flacons (5 ml chacune pour un T75, 3 ml chacun pour un T25).
    2. Ajouter la suspension de cellules dans les flacons. Transférer les flacons dans un incubateur de culture tissulaire.
  7. 24 h post-ballon-semis: ajouter un média supplémentaire BEGM + dans le ballon (3 ml à un T25, 10 ml à un T75).

5. Ensemencer les cellules sur la culture tissulaire Inserts

  1. Retirez le support du ballon et ajouter la trypsine (3 ml pour T25, 4 ml pour flacon T75).
  2. Incuber à 37 ° C jusqu'à ce que les cellules sont décollées (environ 2-3 min).
  3. Préparer SBTI (750 ul pour 1 ml de trypsine> 2,25 ml pour T25, T75 pour 3 ml) dans un tube de 15 ml.
  4. Déloger les cellules en enroulant le ballon et le pipetage de haut en bas et de les transférer à tube conique avec le SBTI.
  5. Rincer la fiole avec du HBSS (1 ml pour T25, T75 2 ml d'), ajouter la HBSS au tube de 15 ml.
  6. Centrifugeusepour obtenir un culot (4 ° C, 400 xg, 5 min), enlever le surnageant avec précaution.
  7. Préparer les plaques: décider du nombre de plaques vont être tête de série, l'étiquette des plaques avec des exemples de code et le numéro, le numéro de passage (c.-à-p2) et la date. Ajouter 700 ul BEGM + médias à la chambre de base.
  8. Reprendre le culot cellulaire dans 1 ml médias BEGM ALI par vortex le tube.
  9. Compter les cellules avec un hémocytomètre (T25 produit habituellement environ 4 millions de cellules, un T75 peut avoir jusqu'à 20 millions de cellules en fonction de l'îlot; utiliser 1-2000000 des cellules pour une plaque de 12 puits) et diluer la suspension cellulaire avec médias BEGM Ali le volume total nécessaire pour la quantité de plaques qui doivent être ensemencées (1,2 x 10 6 cellules dans 2,5 ml de milieu par boîte) (Note:. Si une partie des cellules veulent être gelés, étiqueter le tube et éliminer les cellules ici: on gèle habituellement de 2 x 10 6 cellules dans 2 ml de gel médias)
  10. Ajouter 200 pi de suspension cellulaire sur le côté apical de chaque cellule Corning 12well non revêtueinsérer (> ce sera environ 80,000-150,000 cellules / insert; 12 mm transwells avec 0,4 um pores polyester (polyéthylène téréphtalate (PET)) de l'insert de membrane), le transfert de la culture de tissu incubateur.
  11. Après 24 heures, changer les médias apicale (200 milieu d'expansion pi).
  12. Le maintien des cultures de cellules: Changer les médias (BEGM ALI médias; 700 pi basolatéral et apical 200 pi) tous les deux jours. Inserts doivent être maintenus immergé jusqu'à ce que les cellules sont totalement confluent (pas de trous dans monocouche sont visibles). Selon le nombre de cellules ce qui prend habituellement entre 2-6 jours, si cela prend plus les cellules seront plus susceptibles de ne pas être viable.

6. Établir Air Interface liquide Une fois que les cellules sont complètement Confluent (lorsque les cellules sur les Transwells sont complètement Confluent)

  1. Une fois que les cellules sont complètement confluentes remplacer les deux médias apical et basolatéral avec les médias BEGM ALI complétées avec l'acide rétinoïque 500 nM pendant 48 heures.
  2. 48 heures après l'ajout de l'acide rétinoïque complété BEGM ALI médias: Préparer PneumaCult-ALI milieu d'entretien (les Instructions du fabricant ci-dessous): Calculer le volume de milieu nécessaire (pour une plaque habituellement 8,5 ml pour compartiments basales); ajouter par 1 ml PneumaCult base Milieu complet :

    Supplément de maintenance 10 pi PneumaCult 100x
    2 pl héparine (d'une solution stock de 2 mg / ml)
    5 ul d'hydrocortisone (d'une solution stock de 96 pl / ml).

  3. Retirez tous les supports et ajouter PneumaCult-ALI médias d'entretien de 700 pi sur le côté basolatéral uniquement (pas de support sur le côté apical).
  4. Maintenir les cultures de cellules de 4 semaines à l'ALI:
    1. Modifiez les médias tous les jours (lundi, mercredi et vendredi horaire fonctionne bien pour nous).
    2. Après une semaine à ALI, une fois par semaine (le mercredi) la surface apicale est rincé: ajouter 200 ul de HBSS du côté apical, gardez-les pendant 10 minutes dans l'incubateur, soigneusement aspirer leHBSS (utiliser un 9 en pipette en verre fixé au piège à vide dans l'enceinte de sécurité biologique, utiliser 200 conseils de pi sur le bout de la pipette pour aspirer au large de la HBSS).

Remarque: Changer conseils entre les plaques, ainsi que la modification des conseils lors du passage de la surface apicale par rapport à basolatérale. Après environ 2 semaines à l'ILA, les cellules commencent à se différencier et de cils apparaissent. Les cultures cellulaires atteignent différenciation complète après environ 4 semaines à l'ILA.

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Representative Results

CNE cultivée en suivant le protocole décrit ici re-différencier en une couche hétérogène de EC composé de cellules ciliées et non ciliées, représentant la situation in vivo (Figure 1). Certains des CNE sont différenciées mucus de production (cellules colorées en bleu en utilisant AB / PAS, figure 1B). Même si le protocole présenté ici est optimisée, la différenciation peut varier en ce qui concerne la distribution des populations de cellules totales (c'est à dire les différents ratios de cellules ciliées: les cellules productrices de mucus: cellules non ciliées) ou encore donner un épithélium plus épidermoïde. Ces variations peuvent dépendre de la population de donneurs et donc représenter récapitulation d'un phénotype de la maladie sous-jacente, comme nous l'avons déjà démontré en utilisant CNE de fumeurs 18. Figure 2 montre des exemples de CNE re différenciée sous-optimales en utilisant un protocole différent et formulations des médias. Les cellules sont squameux etni cubique ni ciliée et ne pas imiter un épithélium respiratoire pseudostratifié (Figure 2).

Figure 1
Figure 1. Re différenciés culture NEC humaine. CNE ont été fixées avec 4% de PFA et inclus en paraffine. Les cultures ont été colorées avec de l'hématoxyline et de l'éosine (A) et le bleu Alcian / acide périodique-Schiff (B) (en suivant les méthodes décrites dans 19). Les images montrent CNE avec une organisation claire, une structure cubique, les cellules à mucus mucus production ainsi que ciliées EC.

Figure 2
Figure 2. Hématoxyline et l'éosine cultures NEC avec la différenciation optimale colorées section de paraffine des cultures sous-optimales.. Les cellules apparaissent squameuses, sans cuboidal la structure, pas de cellules ciliées.

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Discussion

EC respiratoires fournissent non seulement une barrière physique pour protéger le corps humain de stimuli exogènes 20, mais aussi agir comme un standard pour initier et réguler les réponses respiratoires de défense immunitaire 1-3 via la sécrétion de médiateurs solubles ou des interactions cellule-cellule récepteur-ligand directs. Afin d'étudier le rôle des EC dans la réponse immunitaire, pour examiner les différences potentielles entre les EC des populations malades, ou pour étudier les effets des facteurs de stress exogènes sur les CE, il est important de récapituler la situation in vivo. Les voies respiratoires humaines contiennent plus de 40 différents types de cellules 20 différentes, y compris les cellules epitheliales, telles que les cellules ciliées, les cellules caliciformes et des cellules basales 20. Notre protocole décrit comment une éraflure nasale biopsie superficielle peut être traitée pour donner CNE qui peuvent être développés et culture de subir un nouvel différenciation, ce qui donne cultures NEC, qui imitent largement l'épithélium nasal in vivo.

L'utilisation de ce modèle in vitro de CNE différenciées humaines primaires organotypiques offre des possibilités uniques pour diverses applications. Il permet d'étudier les différences spécifiques de la maladie de CNE (par exemple la mucoviscidose, l'asthme, le tabagisme), les mécanismes sous-jacents d'une maladie, ainsi que des expositions contrôlées aux polluants atmosphériques (par exemple la couche d'ozone, gaz d'échappement diesel, la fumée de cigarette) 18,21-23. En outre, NEC différenciées cultivées sur des inserts de culture de tissus se prêtent à la co-culture avec d'autres types de cellules (par exemple les cellules dendritiques, les cellules tueuses naturelles, ou macrophages) 10,11, ce qui permet d'examiner les interactions cellule-cellule dans un environnement contrôlé.

Nous décrivons la mise en culture et de re-différenciation de CNE, et non les cellules épithéliales bronchiques, qui ont été utilisés dans de nombreuses études publiées antérieurement 24-27. Nous voyons plusieurs raisons pour lesquelles l'utilisation de CNE peut être avantageux par rapport à l'utilisation d'bronchique EC. Tout d'abord, l'obtention de biopsies superficielles nasale de grattage est moins cher que l'exécution d'une bronchoscopie pour obtenir des biopsies de pinceau. Deuxièmement, pour une variété de maladies pré-existantes (par exemple couper les asthmatiques) il n'est pas réaliste de procéder à une bronchoscopie liées à la recherche sur les cellules épithéliales des voies respiratoires inférieures obtenues. Toutefois, la procédure moins invasive de raclage de la surface inférieure du cornet nasal inférieur avec un Rhino sonde peut être réalisée dans ces matières. Troisièmement, les biopsies de grattage du nez peuvent être effectuées sur les mêmes personnes plusieurs fois (habituellement environ quatre semaines entre les biopsies) sans effets secondaires significatifs 28-30. Quatrièmement, les CNE sont parmi les premières cellules à être exposés à l'inhalation de facteurs de stress environnementaux, tels que les polluants, pathogènes ou allergènes aériens et représentent donc précieux dans des modèles in vitro pour étudier les effets de ces facteurs de stress sur les cellules épithéliales des voies respiratoires.

Divers systèmes de culture de cellules de re-différerEC humaine entiated sont disponibles dans le commerce (par exemple le modèle de EpiAirway MatTek, Ashland, MA, Clonetics de Lonza, Bâle, Suisse, MucilAir de Epithelix Sars, Genève Suisse). Ces cultures de cellules disponibles dans le commerce restent stables pendant une longue période de temps et sont bien caractérisés. Cependant, ils sont chers et les études sont généralement limités à un faible nombre d'échantillons provenant d'individus différents. En outre, il est difficile de contrôler la population des donneurs, qui dépend de la disponibilité présenté par le fournisseur. Obtenir fraîchement CNE avec des biopsies de grattage superficiel permet au chercheur de contrôler les caractéristiques des sujets (comme l'âge, le sexe, la race, le poids, indice de masse corporelle, l'état de la maladie, la consommation de médicaments, etc) et aux bénévoles de nouveau appel de retour pour un suivi éventuel up.

En général, tous les protocoles publiés pour re-différenciation respiratoire humain (soit bronchique ou nasale) ECS au ALI comprennent des procédures similaires: obtaining EC, l'expansion des cellules en flacons de culture tissulaire, et les transférer à la culture cellulaire poreuse insère pour la différenciation à l'ILA. Les protocoles varient dans le type de support, les suppléments de facteurs de croissance, le nombre de passages, l'enrobage des inserts et l'activation des CNE avant d'établir la ALI. Alors que dans un protocole, après l'obtention et la digestion, les cellules sont ensemencées directement sur ​​inserts couchés et non seulement conservés quelques jours à l'ALI avant utilisation 13; autres protocoles comprennent la culture pendant plusieurs semaines pour re-différencier au ALI 12,14,15 . Il n'ya pas de cohérence sur le revêtement des inserts avec du collagène ou d'autres composants de la matrice extracellulaire: tandis que certains protocoles exigent revêtement 12,15 d'autres utilisent des inserts non couchés 13,14. Cependant, les conditions de culture sont d'une grande importance, en particulier les paramètres de l'incubateur. L'humidité relative, laquelle doit être> 90%, et le CO 2, qui doit être ajustée à 5% sont trèsfacteurs importants pour éviter le dessèchement de la culture cellulaire ALI et aider tampon médias. Afin de partager notre expérience, nous voulons mentionner ici qu'il n'y a pas de taux de réussite de 100%. Certains échantillons de biopsie nasale de grattage n'adhèrent pas à la plaque de culture de tissu, alors que certains échantillons NEC ne seront pas respecter les inserts ou n'atteindront jamais la confluence. Au fil des ans, notre taux de réussite global selon le protocole décrit ici est d'environ 80%. Notre expérience montre que la culture du CNE de populations malades définis, tels que les fumeurs, est plus difficile que les CNE des non-fumeurs en bonne santé

Notre protocole pour la culture de CNE humains primaires comporte plusieurs étapes clés qui nous avons optimisé au fil des ans: 1. Les CNE ne sont expansées deux fois avant d'être ensemencées sur des inserts de culture tissulaire. 2. Les inserts sont utilisés non revêtu. 3. Une fois ensemencées sur des plaques de culture de tissus, la quantité de NuSerum est réduite par paliers pour éviter que les cellules se soulèvent de la culture tissulaireplaques. 4. Les CNE sont conservés au moins 25-28 jours à l'ALI avant de les utiliser dans des expériences pour assurer la réfection complète de la différenciation. En résumé, le protocole décrit ici comprend un protocole optimisé pour la culture et la re-différencier CNE droits à l'ILA.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier Lisa Dailey pour les entrées utiles.

Ce travail a été soutenu par des subventions des Instituts nationaux de la santé (ES013611 et HL095163), l'agent de bord Institut de recherche médicale (FAMRI), et l'Environmental Protection Agency (CR83346301) et déclare aucun conflit d'intérêt. Le contenu est exclusivement la responsabilité de leurs auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles des National Institutes of Health. Bien que la recherche décrite dans cet article a été financée en partie par l'Agence américaine de protection de l'environnement par le biais coopérative CR83346301 accord avec le Centre de médecine environnementale, de l'asthme et de la biologie du poumon à l'Université de Caroline du Nord à Chapel Hill, il n'a pas été soumis à la agence de pairs nécessaires et révision de la politique et ne reflète donc pas nécessairement les vues de l'agence, et aucune approbation officielle doit être déduite. Mention onoms commerciaux de f ou de produits commerciaux ne constitue pas une approbation ou une recommandation à l'emploi. Loretta Müller est soutenu par le Fonds national suisse grâce à une subvention personnelle.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nasal speculum Welch Allyn Model 22009 9 mm, reusable polyproylene
Operating otoscope Welch Allyn Model 21700
Rhino probe cell cuvette Arlington Scientific SY-96-092 bend the head of the cuvette a little more
12-well culture plates Corning 3512
Transwell membrane cell culture inserts Corning 3460
Tissue culture flask Corning 430639 and 430641 T25 and T75 vented flask
RPMI 1640 media (with L-Glutamine) Gibco 11875
Bronchial/Tracheal Epithelial Cell Growth Medium Cell applications 511-500
BEGM Bronchial Epithelial Cell Growth Medium Lonza CC-3170 This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements.
Sodium Bicarbonate 7.5% solution Gibco 25080 Use as it is.
NuSerum BD Biosciences 355104 Use as it is.
BAMBANKER freezing media BAMBANKER 302-14681 Use as it is.
CoolCell Biocision HTBCS-136 (CryoPrep alcohol-free cell freezing container)
PureCol AdvancedBioMatrix 5005-B dilute 1:100 with sterile water (should be roughly 0.03 mg/ml)use 500 μl/well of a 12-well plate
HBSS with Ca2 and Mg2+ Gibco 14025
DNAse 1 Sigma DN25 Dissolve at 1.5 mg/ml, which is a 100x solution, add 10 μl to each ml of media
Trypsin, 0.25%, 1x, with phenol red Gibco 25200-056 Use at it is
Soy Bean Trypsin Inhibitor (SBTI) Sigma T6522 Use dissolved in HBSS at a concentration of 1 mg/ml
Retinoic acid Sigma R7632 Make it up 100 μM stock solution (see below), dilute to 10 μM with absolute alcohol, take 5 μl of this and add it to 1 ml BEGM media (our working solution).

All-trans Retinol has a coefficient of extinction of 52,480 in ethanol at 325 nm. Dissolve 25 mg in 50 ml absolute ethanol. Serial dilutions need to be made, dilute 50 ml of stock in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, and again take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute Ethanol, take 100 ml of this and dilute in 900 ml absolute ethanol and read in the spectrophotometer at 325 nm, this number is then multiplied by its’ dilution factor, then divided by the extinction coefficient of 52,480, this will give a number in mM. Make a 100 mM stock (store at -20 °C) and from this stock a 10 mM aliquot is made, the daily retinoic acid needed would be 5 ml of this 10 mM aliquot in 995 ml ALI media. Example: 325nm reading is 1.15. 1.15 x 10,000 (dilution factor) / 52,480 = 0.219 = 219 mM, make a 100 mM stock from this, in absolute ethanol.
DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine and sodium pyruvate Gibco 11995
Bovine Pituitary Extract Gibco 13028-014 Used for BEGM ALI media.
Nystatin Sigma N4014-50 mg Make up a solution of 3.3 mg/ml.
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1600-100 Make up a solution of 10 mg/ml solution in milliQ water.
PneumaCult-ALI media StemCell 5001 This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements. For details see below.
Hydrocortisone StemCell 7904 Dissolve 2.4 mg hydrocortisone in 1 ml ddH2O (used to make the 200x Hydrocortisone stock solution)
Heparin Sodium Salt in PBS (2 mg/ml) StemCell 7980 Use at it is.
Filter flasks (500 ml) Corning 431097 0.22 μm pore size
Filter tubes (50 ml) Millipore SCGP00525 Steriflip, 0.22 μm pore size
Pipette tips - ART Barrier Tips Molecular Bioproducts 2139RI, 2069RI, 2179RI
Conical tubes, sterile, 15 ml and 50 ml
ddH2O, absolute ethanol, ice
CO2 incubator
refrigerated centrifuge
biological safety cabinet
pipettes (p2, p200, p1000), 9 in glass pipettes
gloves
lab coat with tight cuffs
Media and solutions used: Recipe Used for
General remark: always warm the media to room temperature
BEGM media
  • 500 ml BEGM Cell Application media with one aliquot of retinoic acid
(mix them half-half and filter )
  • 500 ml BEGM Lonza media with one aliquot of single quot supplements
  • digestion of the biopsy
BEGM+ media
  • 50 ml BEGM media
  • maintaining cells on plastic in the plates (passage0)
  • 10 μl retinoic acid (working solution)
  • seeding cells in the flask (passage1; partially)
  • maintain the cells in the flask
BEGM++ media
  • 50 ml Lonza’s BEGM media with supplements
  • seeding fresh cells in 12-well plate on plastic
  • 1 ml Sodium BiCarb
  • maintaining cells in the plates on plastic (passage0; only partially)
  • 2.5 ml NuSerum
  • seeding cells in the flask (passage1; partially)
BEGM ALI media
  • 250 ml DMEM-H
  • Maintaining cells on the transwell before they go ALI
  • 250 ml BEGM including supplements
  • 2 ml Bovine Pituitary Extract (12.5 mg/ml solution)
  • 1 ml Nystatin (3.3 mg/ml solution)
  • 75 μl BSA (10 mg/ml solution)
200X Hydrocortisone Stock Solution (96 μl/ml solution)
  • 200 μl dissolved hydrocortisone
  • As a supplement to the PneumaCult-ALI Complete Base Medium for the last day in the flask and when cells are on inserts
  • 4250 μl dissolved sodium chloride
  • 540 μl ddH2O
  • 10 μl absolute ethanol
Filter solution through 0.22 μm filter, aliquot solution and store at -20 °C, avoid additional freeze/thaw cycles
PneumaCult-ALI Complete Base Media
  • 450 ml PneumaCult-ALI Basal Medium
  • Base medium for all three PneumaCult-ALI media
  • 50 ml PneumaCult 10x Supplement
  • The PneumaCult media is light sensitive, thus always keep it in the dark
(this is stable for 2 weeks at 2-8 °C or for up to 6 months at -20 °C)
PneumaCult-ALI Maintenance Medium Per 1 ml of PneumaCult-ALI Complete Base Medium add: ALI culture on inserts
  • 10 μl PneumaCult 100x Maintenance Supplement
  • 2 μl Heparin (of a 2 mg/ml stock solution)
  • 5 μl Hydrocortisone (of a 96 μl/ml stock solution)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Comments

1 Comment

  1. Can you describe in more detail how the paraffin-embedding and sectioning is performed? We are experiencing technical issues with our attempts at H&E. The transwell membranes "curl" and cells are lost. Does the thickness of the sectioning matter (5 um)? Thank you for this great tutorial.

    Reply
    Posted by: Kathy S.
    February 22, 2016 - 12:22 PM

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