Culturing של אדם תאי אפיתל באף בממשק האוויר הנוזלי

1Center for Environmental Medicine, Asthma, and Lung Biology, The University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Pediatrics, The University of North Carolina at Chapel Hill, 3Pulmonary Diseases and Critical Care, The University of North Carolina at Chapel Hill, 4Curriculum in Toxicology, The University of North Carolina at Chapel Hill
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

תאי אפיתל באף, שהושגו באמצעות ביופסיה לגרד שטחית של מתנדבים אנושיים, הם התרחבו ומועברים על גבי מוסיף בתרבית רקמה. בהגיעם confluency, תאים גדלים בממשק נוזל האוויר, מניב תרביות של תאי ריסי ולא ריסי. תרביות תאי אפיתל באף מובחנות לספק מודלים ניסויים מעשי ללימוד הרירית בדרכי הנשימה.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Müller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer II, W. A., Jaspers, I. Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface. J. Vis. Exp. (80), e50646, doi:10.3791/50646 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

במודלים של מבחנה באמצעות תאי האפיתל אנושיים עיקריים חיוניים בהבנת פונקציות עיקריות של האפיתל בדרכי הנשימה בהקשר של זיהומי חיידקים או סוכנים בשאיפה. השוואה ישירה של תאים המתקבלות מאוכלוסיות חולות מאפשרת לנו לאפיין פנוטיפים שונים ולנתח את מנגנוני תיווך שינויים בתפקוד תאי אפיתל. Culturing תאי האפיתל מאזור tracheobronchial האנושי תועד היטב, אך מוגבל על ידי הזמינות של רקמה אנושית ריאות או הפולשנות הקשורים בקבלת ביופסיות מברשות הסימפונות. מתקבלים תאי אפיתל באף באמצעות ביופסיות לגרד באף שטחיות הרבה פחות פולשנית ויכולים להיות ביופסיה נושאים מספר פעמים ללא תופעות לוואי משמעותיים. בנוסף, האף הוא נקודת הכניסה למערכת הנשימה, ולכן אחד מהאתרים הראשונים שנחשפו לכל סוג של לחץ באוויר נישא, כגון סוכני חיידקים, מזהמים, או אלרגנים.

בקצרה, תאי אפיתל באף שהתקבלו ממתנדבים אנושיים מורחבים על צלחות תרבית רקמה מצופים, ולאחר מכן מועברים על גבי מוסיף תרבית תאים. בהגיעם confluency, תאים ממשיכים להיות מתורבת בממשק האוויר הנוזלי (עלי), למשך מספר שבועות, שיוצרים יותר מבחינה פיזיולוגית תנאים רלוונטיים. מצב תרבות ALI משתמש בתקשורת מוגדרת מובילה לאפיתל הבדיל שמפגין מאפיינים מורפולוגיים ופונקציונליים דומים לאפיתל באף אדם, עם תאי שני ריסי וריר ייצור. מוסיף תרבית רקמה עם תאי אפיתל באף מובחנים ניתן להשפיע במגוון דרכים בהתאם לשאלות המחקר (טיפול עם סוכנים תרופתיים, התמרה עם וקטורי lentiviral, חשיפה לגזים או זיהום עם סוכני חיידקים) וניתחתי עבור נקודות קצה שונות ומשונות החל מסלולים תאיים ומולקולריים, ch הפונקציונליAnges, מורפולוגיה, וכו '

במודלים של מבחנה של תאי אפיתל באף אנושיים מובחנים יאפשר לחוקרים לכתובת חדש ושאלות מחקר חשובות על ידי שימוש במודלים ניסיוניים organotypic כי במידה רבה לחקות את האפיתל האף in vivo.

Introduction

מטרה של הטכניקה

תאי אפיתל (ECs) בדרכי הנשימה הם בין האתרים הראשונים שנחשפו באופן ישיר ללחץ סביבתי בשאיפה, כגון פתוגנים, אלרגנים או מזהמי אוויר. ECs יותר ממכשול מבני: הם מתנהגים כמו מרכזייה ליזום ולווסת את התגובה החיסונית בדרכי הנשימה 1-3 באמצעות השחרור של מתווכים מסיסים 4-6 ואת הביטוי של ליגנד / קולטנים על surfac 7-9. בעוד שניתן להשתמש שורות תאים הנציחו כמודלים ללמוד ECs נשימה במבחנה, הם אינם מצליחים להתמיין לאוכלוסיות תאים הטרוגנית מורכבות מריסים מקוטבים ותאי ריר ייצור, בדומה למה שרואה בגוף חי. כדי לשחזר מאפיינים חשובים של אפיתל הנשימה נצפה in vivo, ניתן להשתמש ECs דרכי הנשימה העיקרי. לכן, המטרה שלנו הייתה לייעל את השיטה שלנו תוך ניצול האף ECS (NECs) המתקבלת ממתנדבים אנושיים. NECs מורחבים ותרבית במבחנה, מניב מודל תרבית תאים של NECs המובחן אשר מחקה רבות מהתכונות של אפיתל האף ראה in vivo.

רציונל

השימוש במודלים חוץ גופית עם ECs האנושי העיקרי מחקה במצב vivo - כפי שתואר במחקר זה - נותן אפשרויות ייחודיות ללמוד את הבדלי מחלה ספציפיים של ECS, פרמטרים פיסיולוגיים הקשורים לאפיתל דרכי הנשימה, או האינטראקציות בין ECS ו סוגי תאים אחרים, כגון תאים דנדריטים 10, תאים טבעיים רוצח 11 או מקרופאגים. שיטות קיימות כמה לנצל ECs הסימפונות, אשר ניתן להשיג פולשני באמצעות ביופסיות מברשת במהלך bronchoscopies, או מרקמת ריאה שהושלכה אחרת 12-17. בנוסף, מקורות מסחריים כדי להשיג תרביות תאי אפיתל דרכי הנשימה אנושית מובחנות באופן מלא קיימים (מודל EpiAirway מMatTek, אשלנד, MA, CloneticsמLonza, באזל, שוויץ, MucilAir מEpithelix סארס, ז'נבה שוויץ), שבו חוקרים יכולים לבחור מתורמים שונים. עם זאת, בגלל המאגר המצומצם של תאים זמינים מסחרי אפיתל, מוגבלים או סט קבוע של פרמטרים, העלות כרוכה בהשגה באופן מסחרי בדרכי הנשימה אנושיות ראשוניות ECS, והגישה המוגבלת לרקמת ריאה שהושלכה או רקמת ביופסיה הסימפונות טריים הושגה אנושית, אוסרים על חוקרים רבים ממנהלת מחקרים בECs נשימה האנושית המובחן באופן מלא. לכן, אנו יצאנו לפתח טכניקה ש1) לנצל NECs אדם הלא פולשני הושג, 2) מספק פרוטוקול מניב תרבויות של אפיתל דרכי הנשימה אנושית המובחן, ו3) להיות לשעתקו ברוב הגדרות מעבדה עם תשתית תרבית רקמה הקיימת.

יתרונות על פני שיטות / מודלים קיימים

קבלת NECs הטרי, בהשוואה לסימפונות או דרכי הנשימה קטנה ECS, הוא הרבה פחות פולשני, פרטים יכול להיות ביופסיה מספר פעמים ללא תופעות לוואי משמעותיים, ויכולה להיות שנערכו ביופסיות לגרד באף שטחיות באוכלוסיות חולות שאחרת לא היה זכאיות לbronchoscopies הקשורות למחקר. ביופסיות לגרד שטחיות פולשנית כדי להשיג NECs מאפשרות לחוקר לקבוע מפרט תורם מראש, כולל גיל, מין, מצב מחלה, וכו 'בהתאם למטרת המחקר כדי להיות מושלם. לפיכך, בעת תכנון מחקרי חוקרים אינם מוגבלים על ידי רקמות זמינות קליני / דגימת אפיתל, לרכוש מודלים תא תרבות מובחנים יקרים מספקים מסחריים, או לימודים ברונכוסקופיה פולשנית עיצוב. בנוסף, הקלות להשיג NECs מגבירה את היכולת לבצע ניסויים בתאים מתורמים שונים, אשר משפר את האימות סטטיסטית של ממצאים שנצפו. לבסוף, האף הוא אחד האתרים הראשונים שנחשפו לכל סוג של לחץ באוויר נישא. לפיכך, יצירת organotypic במבחנה מערכות תרבות מחקות את האפיתל האף שימושיות ללימוד שאיפה של חלקיקים נגיפיים, מזהמים, אלרגן, או גזים, אשר יכול להיות מושגת בקלות על ידי שימוש במערכת תרבית תאים זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכן את כלי פלסטיק: צלחת מעיל

  1. הוספת PureCol 500 μl (1:100 דילול עם מים סטריליים) היטב בכל צלחת 12 היטב.
  2. לדגור על 37 ° C בחממה במשך 30 דקות, להסיר את PureCol ולשטוף עם זכות HBSS לפני התאים מתווספים לצלחת (ראה שלב 3.1 בהמשך).

2. קבלת וpretreating ביופסיה של NECs האדם

  1. ביופסיה לגרד באף
    1. השג ECs השטחי המצפה את האף turbinates תחת חזון ישיר באמצעות ספקולום 9 מ"מ לשימוש חוזר באף פוליפרופילן (דגם 22009) באוטוסקופ הפעלה עם ספקולום (דגם 21700). מכשיר זה מספק להדמיה אופטימלית של turbinates והגמישות של תנועה באף.
    2. לבצע ביופסיות בנושא יושב זקוף בכיסא בגב ישר עם הראש מוטה לאחור מעט או שוכב בתנוחת פרקדן על שולחן בדיקה.
    3. הכנס את ספקולום Otoscope לתוך הנחיר וturbi הנחותיםנייט דמיינו עם תאורה.
    4. הכנס מגרד תרמופלסטיים סטרילי דרך ספקולום עם הקצה הרחיב distally לחלק האחורי של חלזוני.
    5. שימוש בלחץ עדין על פני השטח הנחות של חלזוני, המגרד נמשך על פני 5x המשטח הרירי וחזר בו. שליפה מוצלחת של תאים הריריים שנערכו על ידי פעולת נימים תהיה ניכרה בכוס המגרד.
  2. הנח לדוגמא בצינור חרוטי 15 מיליליטר המכיל 8 מיליליטר של RPMI 1640, תחבורה על קרח.
  3. שימוש במלקחיים כדי לאחזר את הבדיקה, לסלק רקמה מחללית קרנף עם טפטפת P-1000, לבטל בדיקה
  4. צנטריפוגה לגלולה (4 ° C, 400 XG, 5 דקות), לשאוב supernatant (תשומת לב: היזהר שלא לשאוב את הכדור).
  5. Resuspend גלולה ב 1 מיליליטר BEGM עם 10 μl של 100x DNase 1.
  6. לדגור על RT עבור 20 דקות.
  7. צנטריפוגה (4 ° C, 400 XG, 5 דקות), לא לשאוב supernatant!

3. Seed על התאים בפלסטיק (יום 0)

  1. הסר את PureCol מהצלחת ולשטוף עם HBSS (ראה גם צעד 1.2).
  2. הוספת נפח מינימאלי של BEGM + + תקשורת (80-100 μl, עד המניסקוס של תקשורת מופיע במרכז גם) ל1-4 בארות (תלוי בגודל ביופסיה) של הצלחת המצופה.
  3. השתמש פיפטה P-1000 להסיר בזהירות את גלולה של רקמת הביופסיה מהצינור, בלי הנשיפה יותר מדי תקשורת.
  4. העבר את הכדור לאמצע הבארות, לשמור יחד הביופסיה כמו מקבץ של תאים, ולא לשבור את לעשות השעיה תא בודדת. תשואות ביופסיה טובות עד 4 בארות שניתן זורעים. שים את הצלחת לתוך תרבות רקמות חממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2,> 90% לחות יחסית).
  5. בדוק לאחר שעות כדי להבטיח שיש מספיק מדיה (מבלי להפריע את המניסקוס).
  6. Day1, 24 שעות לאחר זריעה: לאסוף את כל התאים שאינם חסיד של כל הבארות (צלחת הטיה ולאסוף תקשורת עם תאים בP-1000, גollect כל הבארות בצינור צנטריפוגות 1.5 מיליליטר).
  7. צנטריפוגה (4 ° C, 400 XG, 5 דקות).
  8. בעוד צנטריפוגה השעיה תא: להוסיף כ -250 μl של BEGM + + ו250 μl של תערובת מדיה BEGM + לתאים שנזרעו ביום: 0.
  9. חזור על שלבים 3.1-3.5 לתאים שאינם חסיד.
  10. יום 2-5: שינוי בתקשורת של התאים יומיים; להוסיף 500 תקשורת μl היטב כל אחד, להפחית את כמות BEGM + + בשלבים תקשורת (יום 2 לאחר זריעה: 125 μl BEGM + + בתוספת 375 μl BEGM +, Day3 לאחר זריעת והימים הבאים: 73 μl + תוספת + 427 μl BEGM + BEGM).

4. הרחבת התאים בצלוחיות

  1. לעקוב אחר תאים יומיים; ברגע שהם הגיעו confluency 80-90% (בדרך כלל 5-7 ימים לאחר הביופסיה, אם הם ייקחו זמן רב יותר שהם לא יגדלו בהצלחה) תאי מעלית כבא: תקשורת לשאוב בזהירות; להוסיף 500 μl של טריפסין 0.25% לכל טוב, לשמור אותם על 37 מעלות צלזיוס עד התאים מנותקים (זה בדרך כלל לוקח 2-3 דק ').
  2. הכן את הצורךed נפח של סויה שעועית טריפסין מונעי (SBTI) (750 μl לכל 1 מיליליטר טריפסין) בצינור 15 מיליליטר.
  3. לסלק תאים על ידי pipetting למעלה ולמטה שוב ושוב את פתרון טריפסין; תאים מנותקים העברה בצינור חרוטי 15 מיליליטר עם SBTI.
  4. יש לשטוף את כל הבארות בסך 1 מיליליטר HBSS, להוסיף HBSS לצינור עם התאים.
  5. צנטריפוגה לגלולה (4 ° C, 400 XG, 5 דקות), לשאוב את התקשורת, resuspend ב 1 מיליליטר BEGM + תקשורת ומערבולת הצינור.
  6. הרחב את התאים בבקבוק T25 או T75 תלוי בגודל גלולה (זה P1; כשתי בארות מחוברות להיכנס לבקבוק T75 אחד, מחוברות אחת גם היא מספיק לT25 אחד, בדרך כלל 2 בארות מחוברות להניב T75 אחד).
    1. הוספת BEGM + לצלוחיות (5 מיליליטר כל אחד עבור T75, 3 מיליליטר כל אחד עבור T25).
    2. מוסיף את ההשעיה התא לצלוחיות. העבר את צלוחיות לחממה בתרבית רקמה.
  7. 24 שעות לאחר בקבוק-זריעה: להוסיף מדיה BEGM + נוספת לצפחה (3 מיליליטר לT25, 10 מיליליטר לT75).

5. זרע על התאים ברקמות תרבות מוסיפה

  1. הסר את המדיה מהבקבוק ולהוסיף טריפסין (3 מיליליטר לT25, 4 מיליליטר לבקבוק T75).
  2. לדגור על 37 מעלות צלזיוס עד התאים מנותקים (כ 2-3 דקות).
  3. הכן SBTI (750 μl לכל 1 מיליליטר טריפסין> 2.25 מיליליטר לT25, 3 מיליליטר לT75) בצינור 15 מיליליטר.
  4. לסלק תאים על ידי מקליט את הבקבוק וpipetting למעלה ולמטה ולהעביר לצינור חרוטי עם SBTI.
  5. יש לשטוף את הבקבוק עם HBSS (1 מיליליטר לT25, 2 מיליליטר לT75), מוסיף את HBSS לצינור 15 מיליליטר.
  6. סרכזתלגלולה (4 ° C, 400 XG, 5 דקות), להסיר supernatant בזהירות.
  7. הכן את הצלחות: להחליט כמה צלחות הולכים להיות seeded, לתייג את הצלחות עם דוגמאות קוד ומספר, מספר קטע (כלומר P2) ותאריך. הוסף 700 BEGM + תקשורת μl לתא הבסיסי.
  8. Resuspend התא גלולה ב 1 מיליליטר תקשורת BEGM ALI ידי vortexing הצינור.
  9. ספירת התאים עם hemocytometer (T25 בדרך כלל מייצר כ -4 מיליון תאים; T75 יכול לקבל עד 20 מיליון תאים בהתאם לאיון; להשתמש 1-2 מיליון של תאים לצלחת 12 גם אחד) ולדלל את ההשעיה התא עם תקשורת BEGM ALI לסך הנפח הדרוש לכמות של צלחות שיש זרע (1.2 x 10 6 תאים ב2.5 מיליליטר תקשורת לכל צלחת) (הערה:. אם חלק מהתאים רוצה להיות קפוא, לתייג את הצינור ולהסיר תאים כאן: אנחנו בדרך כלל להקפיא 2 x 10 6 תאים ב2 מיליליטר של הקפאת תקשורת)
  10. הוסף 200 השעיה תא μl לצד הפסגה של כל תא 12well קורנינג ללא ציפויהכנס (> זה יהיה על 80,000-150,000 תאים / הוספה; 12 transwells מ"מ עם 0.4 מיקרומטר פוליאסטר הנקבובית (terephthalate פוליאתילן (PET)) להוסיף קרום); להעביר לתוך חממה בתרבית רקמה.
  11. לאחר 24 שעות, לשנות את תקשורת הפסגה (200 בינוני הרחבת μl).
  12. שמירה על תרביות תאים: שנה את התקשורת (מדיה BEGM ALI; 700 μl basolateral ו200 פסגת μl) בכל יום אחר. מוסיף צריכה להישמר שקוע במים עד התאים ומחוברות לחלוטין (אין חורים בmonolayer נראים לעין). בהתאם למספר תא זה בדרך כלל לוקח בין 2-6 ימים, אם זה לוקח יותר זמן התאים סביר להניח שלא יהיו בת קיימא.

6. להקים אוויר נוזלי ממשק ברגע שהתאים לחלוטין מחוברות (כאשר התאים בTranswells לחלוטין מחוברות)

  1. ברגע שהתאים הם מחוברות לחלוטין להחליף גם תקשורת הפסגה וbasolateral עם תקשורת BEGM ALI בתוספת חומצה רטינואית 500nm ל48 שעות.
  2. 48 שעות לאחר הוספת החומצה הרטינואית בתוספת תקשורת BEGM ALI: הכן PneumaCult-ALI תחזוקה בינונית (הוראות היצרן הבא): חישוב נפח בינוני צורך (לצלחת אחת בדרך כלל 8.5 מיליליטר לתאים הבזליים), להוסיף לכל 1 מיליליטר PneumaCult בסיס בינוני מלא :

    מוסף תחזוקת 100x PneumaCult 10 μl
    2 μl הפרין (של פתרון מניות 2 מ"ג / מיליליטר)
    5 μl הידרוקורטיזון (של פתרון מניות 96 μl / מיליליטר).

  3. הסר את כל התקשורת ולהוסיף 700 μl תקשורת תחזוקת PneumaCult-ALI לצד basolateral בלבד (ללא בינוני בצד הקודקוד).
  4. לשמור על תרביות תאים במשך 4 שבועות בALI:
    1. לשנות את התקשורת בכל יום אחר (יום שני, רביעי ושישי בלוח זמנים עובד היטב עבורנו).
    2. אחרי שבוע אחד בALI, פעם בשבוע (ימי רביעי) משטח הפסגה הוא שטף: להוסיף 200 μl HBSS לצד הפסגה, לשמור אותם ל10 דקות בחממה, לשאוב בזהירותHBSS (השתמש 9 בפיפטה זכוכית מחוברת למלכודת האבק בארון הבטיחות הביולוגית, השתמש 200 טיפים μl על קצה פיפטה כדי לשאוב את HBSS).

הערה: טיפים שינוי בין לוחות, כמו גם לשנות את הטיפים כשהולכים ממשטח הפסגה לעומת basolateral. לאחר כ -2 שבועות בALI, תאים מתחילים להתמיין וcilia מופיע. תרביות תאים להגיע לבידול מלא לאחר כ -4 שבועות בALI.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

NECs תרבית בעקבות הפרוטוקול שתואר כאן מחדש להתמיין לשכבה הטרוגנית של ECs המורכב של תאי ריסי ולא ריסי, המייצגים את המצב vivo (איור 1). חלק מNECs המובחן הוא ריר הפקה (תאים מכתים בכחול באמצעות א.ב. / PAS, איור 1). למרות שהפרוטוקול שהוצג כאן הוא מותאם, בידול יכול להשתנות בכל הקשור להפצה של אוכלוסיות תאים הכוללות (יחסים שונים כלומר תאי ריסי: תאים מייצרי ליחה: תאים שאינם ריסי) או אפילו להניב אפיתל קשקש יותר. וריאציות אלו יכולות להיות תלויות באוכלוסייה התורמת ולכן מייצגות שחזור של פנוטיפ מחלה בסיסי, כפי שכבר הוכיחו בעבר באמצעות NECs ממעשנים 18. איור 2 מציג דוגמאות של NECs בדיל מחדש הכי מוצלח באמצעות פרוטוקול שונה וניסוחי תקשורת. תאי קשקש ולא cuboidal ולא ריסי ולא לחקות אפיתל נשימה pseudostratified (איור 2).

איור 1
איור 1. התרבות מובחנת מחדש אנושית NEC. NECs תוקנו עם PFA 4% ומשובצים בפרפין. תרבויות הוכתמו hematoxylin ו eosin () וכחול / תקופתי Alcian חומצה שיף (ב) (להלן שיטות שתוארו ב19). התמונות מראות NECs עם ארגון ברור, מבנה cuboidal, תאי גביע מייצרי ליחה כמו גם ECs ריסים.

איור 2
איור 2. Hematoxylin ו eosin מוכתם חתך מוטבע פרפין של תרבויות שאינן אופטימליות. תרבויות NEC עם בידול שאינו אופטימלי. תאי קשקש מופיעים, לא cuboidaמבנה ליטר, לא תאי ריסי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ECs הנשימה לספק לא רק מכשול פיזי כדי להגן על גוף האדם מפני גירויים אקסוגניים 20, אלא גם לפעול כמרכזייה ליזום ולווסת את תגובות הגנה חיסונית בדרכי הנשימה 1-3 באמצעות הפרשה של מתווכים מסיסים או תאי תאי אינטראקציות רצפטור ליגנד ישירים. כדי ללמוד עוד יותר את תפקידו של ECs בתגובה החיסונית, לבחון הבדלים אפשריים בין ECs מאוכלוסיות חולות, או כדי לחקור את ההשפעות של לחצים אקסוגניים על ECS, חשוב לסכם את מצב in vivo. דרכי הנשימה האנושית מכילה יותר מ -40 סוגי תאים שונים 20 כוללים תאי אפיתל שונים, כגון תאי ריסים, תאי גביע ותאי בסיס 20. הפרוטוקול שלנו מתאר כיצד ביופסיה לגרד באף שטחית יכולה להיות מעובד להניב NECs כי ניתן להרחיב ותרבותי לעבור מחדש בידול, מניב תרבויות NEC, אשר במידה רבה לחקות את האפיתל האף in vivo.

השימוש במודל זה במבחנה של NECs המובחן האנושי הראשוני organotypic מספק אפשרויות ייחודיות ליישומים שונים. זה מאפשר לימוד הבדלי מחלה ספציפיים של NECs (למשל סיסטיק פיברוזיס, אסטמה, עישון), מנגנון בסיסי של מחלה, כמו גם חשיפות מבוקרות למזהמי אוויר (למשל אוזון, דיזל, עשן סיגריות) 18,21-23. בנוסף, NECs הבדיל גדל על התרבות מוסיף רקמה להשאיל את עצמם לתרבות משותפת עם סוגי תאים אחרים (לדוגמא, תאים דנדריטיים, תאי רוצח טבעיים, או מקרופאגים) 10,11, ומאפשר לבחון תאי תאי אינטראקציות בסביבה מבוקרת.

אנו מתארים את culturing מחדש ההתמיינות של NECs, ולא בתאי אפיתל הסימפונות, אשר היה בשימוש במחקרים שפורסמו בעבר רבים 24-27. אנחנו רואים את הסיבות שונות מדוע השימוש בNECs יכול להיות יתרון בהשוואה לשימושECs הסימפונות. ראשית, קבלת ביופסיות לגרד באף שטחיות היא זולה יותר מאשר ביצוע ברונכוסקופיה להשיג ביופסיות מברשת. שנית, עבור מגוון רחב של מחלות קיימות (למשל לנתק חולי אסטמה) אין זה מציאותי לבצע ברונכוסקופיה הקשורים למחקר לתאי האפיתל בדרכי הנשימה המתקבלים נמוכים יותר. עם זאת, ההליך פחות פולשני של לגרד את פני השטח הנחות של חלזוני באף הנחות עם בדיקה קרנף יכול להתבצע בנושאים אלה. שלישית, ניתן לבצע ביופסיות לגרד באף באותו האדם מספר רב של פעמים (בדרך כלל כ -4 שבועות בין הביופסיה) ללא כל תופעות לוואי משמעותיות 28-30. הרביעית, NECs הם בין התאים הראשונים להיחשף לשאיפת גורמי לחץ סביבתי, כגון זיהום אוויר, מחוללי מחלה או אלרגנים ולכן מייצג ערך רב במודלים חוץ גופית כדי לחקור את ההשפעות של הלחצים הללו על תאי האפיתל בדרכי הנשימה.

מערכות תרבית תאים שונות מחדש שונהECs אדם entiated זמין מסחרי (לדוגמא: מודל EpiAirway מMatTek, אשלנד, MA, Clonetics מLonza, באזל, שוויץ, MucilAir מEpithelix סארס, ז'נבה שוויץ). תרביות תאים זמינות מסחרי אלו יישארו יציבים לתקופת זמן ארוך ומאופיינות היטב. עם זאת, הם יקרים והמחקרים בדרך כלל מוגבלים למספר נמוך של דגימות מאנשים שונים. בנוסף, קשה לשלוט באוכלוסייה התורמת, אשר תלוי בזמינות שהוצגה על ידי הספק. טרי קבלת NECs עם ביופסיות לגרד שטחיות מאפשרת לחוקר לשלוט במאפייני נושא (כגון גיל, מין, גזע, משקל, אינדקס מסת גוף, מצב מחלה, שימוש בתרופות, וכו ') ולמתנדבים מחדש להתקשר שוב למעקב פוטנציאלי עד.

באופן כללי, בכל הפרוטוקולים שפורסמו לנשימה אנושית מחדש הבחנה (או הסימפונות או האף) ECs בALI כוללים הליכים דומים: obtaininגרם ECS, הרחבת התאים בצלוחיות תרבית רקמה, ומעביר אותם לתרבית תאים נקבובית מוסיפה לבידול בALI. הפרוטוקולים להשתנות בסוג של מדיה, תוספי גורם הגדילה, מספר passaging, הציפוי של מוסיף וההפעלה של NECs לפני הקמת ALI. בעוד שבפרוטוקול אחד, לאחר קבלת ועיכול, התאים זרע ישירות על מוסיף ציפוי והמשיכו רק כמה ימים בALI לפני השימוש 13; פרוטוקולים אחרים כוללים culturing במשך כמה שבועות מחדש להבחין בALI 12,14,15 . אין עקביות על הציפוי מוסיף עם קולגן או רכיבי מטריצה ​​תאיים אחרים: בעוד כמה פרוטוקולים דורשים ציפוי 12,15 אחרים להשתמש מוסיף ציפוי 13,14. עם זאת, תנאי התרבות הם בעלי חשיבות רבה, במיוחד הגדרות החממה. הלחות יחסית, אשר צריך להיות> 90%, וה-CO 2, שאמורה להיות מותאמת ב5% הם מאודגורמים חשובים כדי למנוע התייבשות של תרבית התאים עלי ולעזור חיץ התקשורת. כדי לחלוק את הניסיון שלנו, אנחנו רוצים להזכיר כאן כי אין 100% אחוזי הצלחה. דגימות ביופסיה לגרד באף חלק לא לדבוק צלחת תרבית רקמה, ואילו כמה דוגמאות NEC לא ידבקו למוסיפה או לעולם לא יגיעו confluency. במהלך השנים, שיעור ההצלחה הכולל שלנו באמצעות הפרוטוקול המתואר כאן הוא כ 80%. הניסיון שלנו מראה כי culturing של NECs מאוכלוסיות מוגדרות חולות, כגון מעשנים, הוא יותר מאתגר מאשר NECs מהלא מעשנים בריאים

הפרוטוקול שלנו לculturing של NECs האנושי הראשוני משלב מספר שלבים העיקריים בו אנו מותאמים לאורך השנים: 1. NECs מורחבים רק פעמיים לפני שהם זורעים על מוסיף בתרבית הרקמה. 2. מוסיף משמשים ללא ציפוי. 3. ברגע שנזרע על צלחות תרבית רקמה, כמות NuSerum מצטמצמת בשלבים, כדי למנוע שהתאים להמריא מתרבית הרקמהצלחות. 4. NECs נשמרים לפחות 25-28 ימים בALI לפני השימוש בהם בניסויים כדי להבטיח מלא מחדש בידול. לסיכום, הפרוטוקול המתואר כאן כולל פרוטוקול מותאם לתרבות וNECs אדם מחדש להבחין בALI.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות לליזה Dailey לתשומות מועילות.

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות (ES013611 וHL095163), דיילת מכון מחקר רפואי (FAMRI), והסוכנות להגנת הסביבה (CR83346301) ומצהירה שאין ניגוד העניינים. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות. למרות שהמחקר המתואר במאמר זה כבר מומן בחלקו על ידי המשרד להגנת הסביבה בארה"ב דרך CR83346301 הסכם שיתוף פעולה עם המרכז לרפואה סביבתית, אסטמה וביולוגיה ריאות באוניברסיטת צפון קרוליינה, צ'אפל היל, זה לא היה נתון ל סוכנות עמיתים הנדרשים וביקורת מדיניות, ולכן אינו בהכרח משקף את הדעות של הסוכנות, ואין אישור רשמי צריכה להיות מוסקת. להזכיר oשמות המסחריים f או מוצרים מסחריים אינו מהווים אישור או המלצה לשימוש. לורטה Müller נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע השוויצרי עם מענק אישי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nasal speculum Welch Allyn Model 22009 9 mm, reusable polyproylene
Operating otoscope Welch Allyn Model 21700
Rhino probe cell cuvette Arlington Scientific SY-96-092 bend the head of the cuvette a little more
12-well culture plates Corning 3512
Transwell membrane cell culture inserts Corning 3460
Tissue culture flask Corning 430639 and 430641 T25 and T75 vented flask
RPMI 1640 media (with L-Glutamine) Gibco 11875
Bronchial/Tracheal Epithelial Cell Growth Medium Cell applications 511-500
BEGM Bronchial Epithelial Cell Growth Medium Lonza CC-3170 This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements.
Sodium Bicarbonate 7.5% solution Gibco 25080 Use as it is.
NuSerum BD Biosciences 355104 Use as it is.
BAMBANKER freezing media BAMBANKER 302-14681 Use as it is.
CoolCell Biocision HTBCS-136 (CryoPrep alcohol-free cell freezing container)
PureCol AdvancedBioMatrix 5005-B dilute 1:100 with sterile water (should be roughly 0.03 mg/ml)use 500 μl/well of a 12-well plate
HBSS with Ca2 and Mg2+ Gibco 14025
DNAse 1 Sigma DN25 Dissolve at 1.5 mg/ml, which is a 100x solution, add 10 μl to each ml of media
Trypsin, 0.25%, 1x, with phenol red Gibco 25200-056 Use at it is
Soy Bean Trypsin Inhibitor (SBTI) Sigma T6522 Use dissolved in HBSS at a concentration of 1 mg/ml
Retinoic acid Sigma R7632 Make it up 100 μM stock solution (see below), dilute to 10 μM with absolute alcohol, take 5 μl of this and add it to 1 ml BEGM media (our working solution).

All-trans Retinol has a coefficient of extinction of 52,480 in ethanol at 325 nm. Dissolve 25 mg in 50 ml absolute ethanol. Serial dilutions need to be made, dilute 50 ml of stock in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, and again take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute Ethanol, take 100 ml of this and dilute in 900 ml absolute ethanol and read in the spectrophotometer at 325 nm, this number is then multiplied by its’ dilution factor, then divided by the extinction coefficient of 52,480, this will give a number in mM. Make a 100 mM stock (store at -20 °C) and from this stock a 10 mM aliquot is made, the daily retinoic acid needed would be 5 ml of this 10 mM aliquot in 995 ml ALI media. Example: 325nm reading is 1.15. 1.15 x 10,000 (dilution factor) / 52,480 = 0.219 = 219 mM, make a 100 mM stock from this, in absolute ethanol.
DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine and sodium pyruvate Gibco 11995
Bovine Pituitary Extract Gibco 13028-014 Used for BEGM ALI media.
Nystatin Sigma N4014-50 mg Make up a solution of 3.3 mg/ml.
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1600-100 Make up a solution of 10 mg/ml solution in milliQ water.
PneumaCult-ALI media StemCell 5001 This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements. For details see below.
Hydrocortisone StemCell 7904 Dissolve 2.4 mg hydrocortisone in 1 ml ddH2O (used to make the 200x Hydrocortisone stock solution)
Heparin Sodium Salt in PBS (2 mg/ml) StemCell 7980 Use at it is.
Filter flasks (500 ml) Corning 431097 0.22 μm pore size
Filter tubes (50 ml) Millipore SCGP00525 Steriflip, 0.22 μm pore size
Pipette tips - ART Barrier Tips Molecular Bioproducts 2139RI, 2069RI, 2179RI
Conical tubes, sterile, 15 ml and 50 ml
ddH2O, absolute ethanol, ice
CO2 incubator
refrigerated centrifuge
biological safety cabinet
pipettes (p2, p200, p1000), 9 in glass pipettes
gloves
lab coat with tight cuffs
Media and solutions used: Recipe Used for
General remark: always warm the media to room temperature
BEGM media
  • 500 ml BEGM Cell Application media with one aliquot of retinoic acid
(mix them half-half and filter )
  • 500 ml BEGM Lonza media with one aliquot of single quot supplements
  • digestion of the biopsy
BEGM+ media
  • 50 ml BEGM media
  • maintaining cells on plastic in the plates (passage0)
  • 10 μl retinoic acid (working solution)
  • seeding cells in the flask (passage1; partially)
  • maintain the cells in the flask
BEGM++ media
  • 50 ml Lonza’s BEGM media with supplements
  • seeding fresh cells in 12-well plate on plastic
  • 1 ml Sodium BiCarb
  • maintaining cells in the plates on plastic (passage0; only partially)
  • 2.5 ml NuSerum
  • seeding cells in the flask (passage1; partially)
BEGM ALI media
  • 250 ml DMEM-H
  • Maintaining cells on the transwell before they go ALI
  • 250 ml BEGM including supplements
  • 2 ml Bovine Pituitary Extract (12.5 mg/ml solution)
  • 1 ml Nystatin (3.3 mg/ml solution)
  • 75 μl BSA (10 mg/ml solution)
200X Hydrocortisone Stock Solution (96 μl/ml solution)
  • 200 μl dissolved hydrocortisone
  • As a supplement to the PneumaCult-ALI Complete Base Medium for the last day in the flask and when cells are on inserts
  • 4250 μl dissolved sodium chloride
  • 540 μl ddH2O
  • 10 μl absolute ethanol
Filter solution through 0.22 μm filter, aliquot solution and store at -20 °C, avoid additional freeze/thaw cycles
PneumaCult-ALI Complete Base Media
  • 450 ml PneumaCult-ALI Basal Medium
  • Base medium for all three PneumaCult-ALI media
  • 50 ml PneumaCult 10x Supplement
  • The PneumaCult media is light sensitive, thus always keep it in the dark
(this is stable for 2 weeks at 2-8 °C or for up to 6 months at -20 °C)
PneumaCult-ALI Maintenance Medium Per 1 ml of PneumaCult-ALI Complete Base Medium add: ALI culture on inserts
  • 10 μl PneumaCult 100x Maintenance Supplement
  • 2 μl Heparin (of a 2 mg/ml stock solution)
  • 5 μl Hydrocortisone (of a 96 μl/ml stock solution)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Swamy, M., Jamora, C., Havran, W., Hayday, A. Epithelial decision makers: in search of the 'epimmunome. Nat. Immunol. 11, 656-665 (2010).
  2. Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. The airway epithelium: soldier in the fight against respiratory viruses. Clin. Microbiol Rev. 24, 210-229 (2011).
  3. Muller, L., Jaspers, I. Epithelial cells, the "switchboard" of respiratory immune defense responses: Effects of air pollutants. Swiss Med. Wkly. (2012).
  4. Sanders, C. J., Doherty, P. C., Thomas, P. G. Respiratory epithelial cells in innate immunity to influenza virus infection. Cell Tissue Res. 343, 13-21 (2011).
  5. Robertson, M. J. Role of chemokines in the biology of natural killer cells. J. Leukoc. Biol. 71, 173-183 (2002).
  6. Adachi, M., Matsukura, S., Tokunaga, H., Kokubu, F. Expression of cytokines on human bronchial epithelial cells induced by influenza virus. A. Int. Arch. Allergy Immunol. 113, 307-311 (1997).
  7. Borchers, M. T., Harris, N. L., Wesselkamper, S. C., Vitucci, M., Cosman, D. NKG2D ligands are expressed on stressed human airway epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 291, L222-L231 (2006).
  8. Groh, V., et al. Costimulation of CD8alphabeta T cells by NKG2D via engagement by MIC induced on virus-infected cells. Nat. Immunol. 2, 255-260 (2001).
  9. Obeidy, P., Sharland, A. F. NKG2D and its ligands. Int J. Biochem. Cell Biol. 41, 2364-2367 (2009).
  10. Horvath, K. M., Brighton, L. E., Zhang, W., Carson, J. L., Jaspers, I. Epithelial Cells From Smokers Modify Dendritic Cell Responses in the Context of Influenza Infection 1. Am. J. Resp. Cell. (2010).
  11. Muller, L., Brighton, L. E., Jaspers, I. Ozone exposed epithelial cells modify co-cultured natural killer cells. AJP Lung. (2013).
  12. Turi, J. L. Oxidative stress activates anion exchange protein 2 and AP-1 in airway epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, 791-798 (2002).
  13. Zimmermann, G. S., Neurohr, C., Villena-Hermoza, H., Hatz, R., Behr, J. Anti-inflammatory effects of antibacterials on human Bronchial epithelial cells. Respir. Res. 10, 89 (2009).
  14. Lopez-Souza, N., Avila, P. C., Widdicombe, J. H. Polarized cultures of human airway epithelium from nasal scrapings and bronchial brushings. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 39, (2003), 266-269 (2003).
  15. Gray, T. E., Guzman, K., Davis, C. W., Abdullah, L. H., Nettesheim, P. Mucociliary differentiation of serially passaged normal human tracheobronchial epithelial cells. Am. J. Respir. Cell Mo.l Biol. 14, 104-112 (1996).
  16. Adler, K. B., Schwarz, J. E., Whitcutt, M. J., Wu, R. A New Chamber System for Maintaining Differentiated Guinea-Pig Respiratory Epithelial-Cells between Air and Liquid-Phases. Biotechniques. 5, 462 (1987).
  17. Whitcutt, M. J., Adler, K. B., Wu, R. A biphasic chamber system for maintaining polarity of differentiation of cultured respiratory tract epithelial cells. In Vitro Cell. Dev. Biol. 24, 420-428 (1988).
  18. Jaspers, I. Reduced expression of IRF7 in nasal epithelial cells from smokers after infection with influenza. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 43, 368-375 (2010).
  19. Muller, L., Brighton, L. E., Jaspers, I. Ozone exposed epithelial cells modify cocultured natural killer cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 304, 332-341 (2013).
  20. Ochs, M., Weibel, E. R. Fishman's Pulmoary Diseases and Disorders. Fishmanetal, A. P., et al. 4, Mc Graw Hill. New York, NY. 23-69 (2008).
  21. Kesic, M. J., Meyer, M., Bauer, R., Jaspers, I. Exposure to Ozone Modulates Human Airway Protease/Antiprotease Balance Contributing to Increased Influenza A Infection. PLoS ONE. 7, e35108 (2012).
  22. Jaspers, I. Diesel exhaust enhances influenza virus infections in respiratory epithelial cells. Toxicol. Sci. 85, 990-1002 (2005).
  23. Jaspers, I., Flescher, E., Chen, L. C. Ozone-induced IL-8 expression and transcription factor binding in respiratory epithelial cells. Am. J. Physiol. 272, L504-L511 (1997).
  24. Blume, C., et al. Barrier responses of human bronchial epithelial cells to grass pollen exposure. Eur. Respir. J. (2012).
  25. Bauer, R. N. Influenza enhances caspase-1 in bronchial epithelial cells from asthmatic volunteers and is associated with pathogenesis. J. Allergy Clin. Immunol. 130, 958-967 (2012).
  26. Ostrowski, L. E., Stewart, D., Hazucha, M. Interferon gamma stimulates accumulation of gas phase nitric oxide in differentiated cultures of normal and cystic fibrosis airway epithelial cells. Lung. 190, 563-571 (2012).
  27. Jardim, M. J., Fry, R. C., Jaspers, I., Dailey, L., Diaz-Sanchez, D. Disruption of microRNA expression in human airway cells by diesel exhaust particles is linked to tumorigenesis-associated pathways. Environ. Health Perspect. 117, 1745-1751 (2009).
  28. Horvath, K. M., Brighton, L. E., Herbst, M., Noah, T. L., Jaspers, I. Live Attenuated Influenza Virus (LAIV) induces different mucosal T cell function in nonsmokers and smokers. Clin. Immunol. 142, 232-236 (2012).
  29. Horvath, K. M. Nasal lavage natural killer cell function is suppressed in smokers after live attenuated influenza virus. Respir. Res. 12, 102 (2011).
  30. Noah, T. L. Tobacco smoke exposure and altered nasal responses to live attenuated influenza virus. Environ. Health Perspect. 119, 78-83 (2011).

Comments

1 Comment

  1. Can you describe in more detail how the paraffin-embedding and sectioning is performed? We are experiencing technical issues with our attempts at H&E. The transwell membranes "curl" and cells are lost. Does the thickness of the sectioning matter (5 um)? Thank you for this great tutorial.

    Reply
    Posted by: Kathy S.
    February 22, 2016 - 12:22 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics