Dyrking av menneskelig Nasal Epitelceller på Air Flytende Interface

1Center for Environmental Medicine, Asthma, and Lung Biology, The University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Pediatrics, The University of North Carolina at Chapel Hill, 3Pulmonary Diseases and Critical Care, The University of North Carolina at Chapel Hill, 4Curriculum in Toxicology, The University of North Carolina at Chapel Hill
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Nese epitelceller, innhentet gjennom overfladisk skrape biopsi av frivillige, er utvidet og overført til vevskulturstudier inserts. Når du har nådd konfluens, er celler dyrket på luft væske-grensesnittet, som gir kulturer av ciliated og ikke-ciliated celler. Differensiert nasal epitel cellekulturer gi levedyktige eksperimentelle modeller for å studere luftslimhinnen.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Müller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer II, W. A., Jaspers, I. Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface. J. Vis. Exp. (80), e50646, doi:10.3791/50646 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

In vitro-modeller med humane primære epitelceller er avgjørende for å forstå viktige funksjoner av respiratorisk epitel i sammenheng med mikrobielle infeksjoner eller inhalert agenter. Direkte sammenligninger av celler hentet fra syke populasjoner tillate oss å karakterisere ulike fenotyper og dissekere de underliggende mekanismene som medierer endringer i epiteliale cellefunksjon. Dyrking epitelceller fra den menneskelige trakeobronkialområdet har vært godt dokumentert, men er begrenset av tilgjengeligheten av menneskelig lungevev eller invasivitet forbundet med å skaffe bronkial børster biopsier. Nese epitelceller er innhentet gjennom mye mindre invasive overfladiske nasal skrape biopsier og fagene kan vevsprøve flere ganger uten vesentlige bivirkninger. I tillegg er nesen inngangspunkt for luftveiene og derfor en av de første stedene å bli utsatt for noen form for luftbåren stressor, som for eksempel mikrober, forurensning, eller allergener.

Kort fortalt blir nasale epitelceller oppnådd fra frivillige mennesker utvidet på belagte vevskulturplater, og deretter overført til cellekulturinnsatser. Da nådde konfluens, cellene fortsette å bli dyrket ved luft-væske-grensesnittet (ALI), i flere uker, noe som skaper mer fysiologisk relevante betingelser. Den ALI kultur tilstand bruker definerte medier fører til en differensiert epitel som viser morfologiske og funksjonelle egenskaper som ligner på den menneskelige nasal epitel, med både ciliated og slim produserende celler. Tissue culture innsatser med differensierte nasale epitelceller kan manipuleres på en rekke måter, avhengig av de problemstillinger (behandling med farmakologiske midler, transduksjon med lentiviral vektorer, eksponering mot gasser, eller infeksjon med mikrobielle midler) og analysert for en rekke forskjellige sluttpunkter som strekker seg fra cellulære og molekylære stier, funksjonell lmanges, morfologi, etc.

In vitro modeller for differensierte menneskelige nese epitelceller vil gjøre det mulig etterforskerne å løse nye og viktige forskningsspørsmål ved hjelp av organotypic eksperimentelle modeller som i stor grad etterligne neseepitel in vivo.

Introduction

Målet med teknikken

Epitelceller (ECS) i luftveiene er blant de første stedene å bli direkte utsatt for inhalert miljømessige stressfaktorer, som patogener, allergener eller luftforurensning. Egenkapitalbevis er mer enn en strukturell barriere: De fungerer som et sentralbord for å initiere og regulere luftimmunrespons 1-3 via utgivelsen av løselige meklere 4-6 og uttrykket av ligander / reseptorer på deres surfac 7-9. Mens foreviget cellelinjer kan brukes som modeller for å studere luftegenkapitalbevis in vitro, klarer de ikke å differensiere i heterogene celle populasjoner består av polarisert ciliated og slim produserende celler, i likhet med hva som er observert in vivo. For å rekapitulere viktige kjennetegn ved respiratorisk epitel observert in vivo, kan primærluftveisegenkapitalbevis benyttes. Derfor, målet vårt var å optimalisere vår metode å benytte nasal egenkapitalbevis (NEC) innhentet fra frivillige. De NEC skal utvides og dyrket in vitro, noe som gir en cellekultur modell av differensierte NEC som etterligner mange av funksjonene i neseepitel sett in vivo.

Rasjonale

Bruken av in vitro-modeller med humane primære EKB etterligne in vivo situasjon - slik det er beskrevet i denne studien - gir unike muligheter for å studere sykdomsspesifikke forskjeller av EKB, fysiologiske parametere forbundet med luftveiene epitel, eller interaksjonen mellom EKB-og andre celletyper, slik som dendrittiske cellen 10, naturlige drepeceller 11 eller makrofager. Flere eksisterende metoder utnytte bronkial egenkapitalbevis, som kan fås invasively via pensel biopsier under bronchoscopies, eller fra annet kasserte lungevev 12-17. I tillegg, kommersielle kilder for å få fullt differensierte menneskelige luftveis epitelial cellekulturer eksisterer (EpiAirway modell fra Mattek, Ashland, MA, Cloneticsfra Lonza, Basel, Sveits, MucilAir fra Epithelix Sars, Genève Sveits), hvor etterforskere kan velge fra ulike givere. Imidlertid, på grunn av den begrensede pool av kommersielt tilgjengelige epitelceller, begrenset eller foreskrevet sett av parametre, er kostnadene forbundet med kommersielt skaffe primære humane luftveier ECS, og den begrensede tilgang på kassert lungevev eller ferskt oppnådd human bronkial vevsprøver, forbyr mange forskere fra å gjennomføre studier i fullt differensierte menneskelige luftveisegenkapitalbevis. Derfor setter vi ut for å utvikle en teknikk som gjør en) utnytte ikke-invasiv innhentet menneskelige NEC, 2) gi en protokoll som gir kulturer av differensiert menneskelige luftveis epitel, og 3) kunne reproduseres i de fleste lab innstillinger med en eksisterende vev kultur infrastruktur.

Fordeler fremfor eksisterende teknikker / modeller

Innhenting av ferske NEC, sammenlignet med bronkial eller små luftveier EKB, er mye mindre invasiv, individuelles kan vevsprøve flere ganger uten vesentlige bivirkninger, og overfladiske nese skrape biopsier kan gjennomføres i syke populasjoner som ellers ikke ville kvalifisere for forskningsrelaterte bronchoscopies. Invasiv overfladiske skrape biopsier å få NEC skal tillate etterforsker for å sette donor spesifikasjonen a priori, inkludert alder, kjønn, sykdomsstatus, etc. i henhold til forskning mål å være dyktig. Dermed når du utformer forskningsstudier etterforskere er ikke begrenset av klinisk tilgjengelige vev / epitel prøven, kjøpe dyre differensierte cellekultur modeller fra kommersielle leverandører, eller design invasive bronkoskopi studier. I tillegg er lette å få tak i NEC øker evnen til å utføre eksperimenter på celler fra forskjellige donorer, noe som forbedrer statistisk validering av observerte resultater. Til slutt, er nesen en av de første stedene å bli utsatt for noen form for luftbåren stressfaktorer. Dermed genererer organotypic ivitro kultursystemer etterligne den nasale epitel er nyttige for å studere inhalering av virale partikler, forurensninger, allergener, eller gasser, som lett kan oppnås ved å bruke denne cellekultursystem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Forbered Plastic Ware: Coat Plate

  1. Legg 500 mL PureCol (1:100 fortynnet med sterilt vann) til hver brønn av en 12-brønns plate.
  2. Inkuber ved 37 ° C i en inkubator i 30 minutter, fjern PureCol og skylles med HBSS rett før cellene blir tilsatt til platen (se trinn 3.1 nedenfor).

2. Innhenting og pretreating Biopsi of Human NEC

  1. Nasal skrape biopsi
    1. Skaffe overfladiske egenkapitalbevis langs nesemusling i direkte visjon gjennom en 9 mm gjenbruk polypropylen nasal spekulum (Modell 22009) på en drifts otoscope med spekulum (modell 21700). Denne enheten gir optimal visualisering av nesemusling og fleksibilitet av bevegelse.
    2. Utfør biopsier med faget sitter oppreist i en rettrygget stol med hodet tiltet litt tilbake eller ligge i en liggende stilling på en undersøkelse bord.
    3. Sett otoskop spekulum inn i neseboret og mindreverdig TurbiNate visualisert med belysning.
    4. Sett inn en steril termo curette gjennom spekulum med utvidet distalt til baksiden av turbinate spissen.
    5. Ved hjelp av et lett trykk på den nedre overflate av turbinate blir curette trukket over slimhinneoverflaten 5x og trukket. En vellykket gjenfinning av slimhinneceller holdt av kapillær handlingen vil være tydelig i koppen av kyrette.
  2. Plasser prøven i et 15 ml konisk rør inneholdende 8 ml av RPMI 1640, transport på is.
  3. Bruk pinsett til å hente sonden, løsne vev fra neshorn sonde med en P-1000 pipette, forkaste probe
  4. Sentrifuger til pellets (4 ° C, 400 xg, 5 min), aspirer supernatant (oppmerksomhet: Pass på å ikke suge pellet).
  5. Resuspender pellet i 1 ml BEGM med 10 mL av 100x DNase en.
  6. Inkuber ved RT i 20 min.
  7. Sentrifuge (4 ° C, 400 xg, 5 min), IKKE aspirer supernatanten!

Tre. Seed cellene på plast (Dag 0)

  1. Fjern PureCol fra platen og skyll med HBSS (se også trinn 1.2).
  2. Til et minimum volum av BEGM + + medier (80-100 ul, inntil et menisk av mediet i nedre venstre hjørne av brønnen) på 1-4 brønner (avhengig av størrelsen) biopsi av den belagte plate.
  3. Bruk en P-1000 pipette å forsiktig fjerne pellet av vevsprøver fra røret, uten å aspirere for mye media.
  4. Overfør pelleten inn i midten av brønnen, holde biopsi sammen som en klynge av celler, og ikke brytes opp for å gjøre en enkelt cellesuspensjon. En god biopsi gir opp til fire brønner som kan bli seedet. Sett platen i vevskultur-inkubator (37 ° C, 5% CO2,> 90% relativ fuktighet).
  5. Kontroller etter to timer for å sikre at det er nok media (uten å forstyrre den menisk).
  6. Dag1, 24 timers post-seeding: samle alle ikke-heftende celler av alle brønner (tilt plate og samle media med celler i et P-1000, cUtlevering alle brønner i en 1,5 ml sentrifugerør).
  7. Sentrifuge (4 ° C, 400 x g, 5 min).
  8. Mens sentrifugecellesuspensjon: legge til ca 250 mL av BEGM + +, og 250 pl av BEGM + media blanding til cellene sådd på dag 0.
  9. Gjenta trinn 03.01 til 03.05 for de ikke-heftende celler.
  10. Dag 2-5: endring media av cellene daglig, legg 500 mL media til hver brønn, redusere mengden av BEGM + + media trinnvis (dag 2 etter seeding: 125 mL BEGM + + pluss 375 mL BEGM +, day3 etter såing og de følgende dager: 73 mL BEGM + + pluss 427 mL BEGM +).

4. Utvide cellene i Krukker

  1. Overvåk celler daglig, en gang de har nådd 80-90% konfluens (vanligvis 5-7 dager etter biopsi, hvis de tar lenger de vil ikke vokse vellykket) lift celler som følgende: nøye aspirer media, legg 500 mL av 0,25% trypsin per brønn, holde dem ved 37 ° C inntil cellene er frittliggende (det tar vanligvis 2-3 minutter).
  2. Forbered behoveted volum av soya Trypsin Inhibitor (SBTI) (750 ul per 1 ml Trypsin) i et 15 ml rør.
  3. Løsne cellene ved gjentatt pipettering opp og ned i trypsin-løsning; overføringsfrittliggende celler i 15 ml koniske rør med SBTI.
  4. Skyll alle brønner med i alt 1 ml HBSS, tilsett HBSS til røret med cellene.
  5. Sentrifuger til pellets (4 ° C, 400 xg, 5 min), aspirer media, resuspender i 1 ml BEGM + media og vortex røret.
  6. Utvid celler i en T25 eller T75 kolbe avhengig pellet størrelse (dette er p1, omtrent to konfluente brønner gå inn i en T75 kolbe, er en konfluent godt nok for en T25, vanligvis to konfluente brønner gi en T75).
    1. Legg BEGM + til kolbene (5 ml hver for en T75, 3 ml hver for en T25).
    2. Til cellesuspensjonen til kolbene. Overfør flaskene inn i en vev kultur inkubator.
  7. 24 timers post-kolbe-seeding: legge til ekstra BEGM + media til kolben (3 ml til en T25, 10 ml til en T75).

5. Seed cellene på vev kultur Setter

  1. Fjern materialet fra flaska og legge Trypsin (3 ml for T25, 4 ml for T75 kolbe).
  2. Inkuber ved 37 ° C inntil cellene er frittliggende (ca. 2-3 minutter).
  3. Forbered SBTI (750 mL per 1 ml Trypsin> 2,25 ml for T25, 3 ml for T75) i en 15 ml tube.
  4. Løsne cellene ved taping kolben og pipettering opp og ned og overføres til konisk rør med SBTI.
  5. Skyll kolben med HBSS (1 ml for T25, 2 ml til T75), legger HBSS til 15 ml tube.
  6. Sentrifugertil pellets (4 ° C, 400 xg, 5 min), fjern supernatanten forsiktig.
  7. Forbered platene: bestemme hvor mange plater kommer til å bli seedet, merke platene med eksempelkode og nummer, passasje nummer (dvs. p2) og dato. Legg 700 mL BEGM + media til basal kammeret.
  8. Resuspender cellepelleten i 1 ml BEGM ALI media ved å virvle i røret.
  9. Telle celler med en hemocytometer (en T25 gir vanligvis ca 4 millioner celler, en T75 kan ha opptil 20 millioner celler avhengig av holmen, bruke 1-2 millioner av celler for en 12-brønns plate) og fortynne cellesuspensjonen med BEGM ALI media til det totale volumet som trengs for mengden av plater som skal bli seedet (1,2 x 10 6 celler i 2,5 ml media per plate) (Merk:. Hvis deler av cellene vil bli frosset, etikett røret og fjerne celler her: vi vanligvis fryse 2 x 10 6-celler i 2 ml iskaldt medium)
  10. Tilsett 200 ul cellesuspensjon til den apikale side av hver ubelagt Corning 12well celleSett (> dette vil være ca 80,000-150,000 celler / insert, 12 mm transwells med 0,4 mikrometer pore polyester (polyetylentereftalat (PET)) membran innsats), overføre til vev kultur kuvøse.
  11. Etter 24 timer, endrer den apikale media (200 mL utvidelse medium).
  12. Vedlikeholde cellekulturer: Endre media (BEGM ALI media; 700 mL basolateral og 200 mL apikal) annenhver dag. Setter inn må opprettholdes nedsenket til cellene er helt konfluent (ingen hull i monolayer er synlige). Avhengig celle nummer dette tar vanligvis mellom 2-6 dager, hvis det tar lenger cellene vil mest sannsynlig ikke være levedyktig.

6. Etablere Air Flytende Interface Når cellene er fullstendig Confluent (Når cellene på Transwells er helt Confluent)

  1. Når cellene er helt sammenflytende erstatte både apikale og basolateral medier med BEGM ALI media supplert med 500nM retinsyre i 48 timer.
  2. 48 timer etter at den retinsyre supplert BEGM ALI media: Forbered PneumaCult-ALI Maintenance Medium (etter produsentens anvisninger): Beregn volumet av medium nødvendig (for én plate vanligvis 8,5 ml for basal avdelinger), legg per 1 ml PneumaCult Komplett Base Medium :

    10 mL PneumaCult 100x Vedlikehold Supplement
    2 mL heparin (av en 2 mg / ml stamløsning)
    5 pl Hydrokortison (av en 96 ul / ml stamløsning).

  3. Fjern alle medier og tilsett 700 mL PneumaCult-ALI vedlikehold media til basolateral siden bare (ingen medium på den apikale siden).
  4. Opprettholde cellekulturer for fire uker på ALI:
    1. Endre media annenhver dag (mandag, onsdag og fredag ​​planen fungerer godt for oss).
    2. Etter én uke på ALI, en gang i uken (onsdager) den apikale overflaten skylles: Tilsett 200 mL HBSS til den apikale siden, holde dem i 10 min i kuvøse, nøye aspirerHBSS (bruke et 9 i glass-pipette festet til vakuum felle i biologisk sikkerhetsskap, bruk 200 mL tips på spissen av pipetten for å suge av HBSS).

Merk: Endre tips mellom platene, samt endre tipsene når du går fra apikale overflaten versus basolateral. Etter ca to uker på ALI, cellene begynner å differensiere og flimmerhårene vises. Cellekulturer nå full differensiering etter ca fire uker på ALI.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

NEC dyrket etter den her beskrevne protokoll re-differensieres til et heterogent lag av EKB sammensatt av ciliated og ikke-ciliated celler, som representerer in vivo situasjonen (fig. 1). Noen av de differensierte NEC skal slim produserende (celler flekker i blått ved hjelp av AB / PAS, Figur 1B). Selv om det her presenteres protokollen er optimalisert, kan differensiering variere med hensyn til fordelingen av de samlede cellepopulasjoner (dvs. ulike prosenter av ciliated celler: slim-produserende celler: non-ciliated celler) eller til og med gi en mer plateepiteldysplasi. Disse variasjonene kan avhenge av donor befolkningen og derfor representere gjentagelse av en underliggende sykdom fenotype, som vi tidligere har demonstrert ved hjelp av NEC fra røykere 18. Figur 2 viser eksempler på suboptimale re differensiert NEC bruker en annen protokoll og medie formuleringer. Cellene er plateepitel ogverken cuboidal heller ciliated og ikke etterligne en pseudostratified respiratorisk epitel (figur 2).

Figur 1
Figur 1. Re-differensiert menneskelig NEC kultur. NEC ble løst med 4% PFA og innebygd i parafin. Kulturene ble farget med hematoxylin og eosin (A) og Alcian blått / periodsyre-Schiff (B) (etter fremgangsmåter som er beskrevet i 19). Bildene viser NEC med en klar organisasjon, en kubisk struktur, slim-produserende beger celler samt ciliated egenkapitalbevis.

Fig. 2
Figur 2. Hematoxylin og eosin farget parafininnleiret delen av suboptimale kulturer. NEC kulturer med suboptimal differensiering. Cellene synes plateepitel, ingen cuboidal struktur, ingen ciliated celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Luftveisegenkapitalbevis gir ikke bare en fysisk barriere for å beskytte kroppen fra eksogene stimuli 20, men også fungere som et sentralbord for å initiere og regulere luftveisimmunforsvarsresponser 1-3 via sekresjon av løselige meglere eller direkte reseptor-ligand celle-celle interaksjoner. For ytterligere å studere rollen til ECS i immunresponsen, for å undersøke mulige forskjeller mellom ECS fra syke populasjoner, eller for å studere virkningene av eksogene belastninger på ECS, er det viktig å rekapitulere in vivo-situasjon. De menneskelige luftrom inneholde mer enn 40 forskjellige celletyper 20 inkludert ulike epitelceller, som ciliated celler, goblet celler og basal celler 20. Vår protokollen beskriver hvordan en overfladisk nasal skrape biopsi kan behandles for å gi NEC som kan utvides og dyrket til å gjennomgå re-differensiering, hvilket gav NEC kulturer, noe som i stor grad etterligner det nasale epitel in vivo.

Bruken av denne in vitro modell av organotypic primære humane differensierte NEC gir unike muligheter for ulike bruksområder. Den lar studere sykdomsspesifikke forskjeller i NEC (f.eks cystisk fibrose, astma, røyking), underliggende mekanismene for en sykdom, samt kontrollert eksponering for luftforurensning (f.eks ozon, dieseleksos, sigarettrøyk) 18,21-23. I tillegg differensierte NEC skal dyrkes på vevskulturstudier inserts egner seg til å co-kultur med andre celler typer (f.eks dendrittiske celler, naturlige drepeceller eller makrofager) 10,11, slik at for å undersøke celle-celle interaksjoner i en kontrollert setting.

Vi beskriver dyrking og re-differensiere av NEC, og ikke bronkial epitelceller, som har vært brukt i mange tidligere publiserte studier 24-27. Vi ser forskjellige grunner til at bruken av NEC kan være fordelaktig sammenlignet med bruken avbronkial egenkapitalbevis. Først, få overfladiske nasal skrape biopsier er rimeligere enn å utføre en bronkoskopi å få pensel biopsier. For det andre, for en rekke pre-eksisterende sykdommer (f.eks bryte astmatikere) det er urealistisk å foreta en forskningsmessig bronkoskopi å framkommet nedre luftveier epitelceller. Imidlertid kan mindre inngrep med skrape dårligere overflate av mindreverdig nasal turbinate med Rhino Probe utføres i disse fagene. Tredje, kan nasal skrape biopsier utføres på de samme individene flere ganger (vanligvis ca 4 uker i mellom biopsier) uten vesentlige bivirkninger 28-30. Fjerde, NEC er blant de første cellene til å bli utsatt for inhalert miljømessige stressfaktorer, som for eksempel luftforurensning, patogener eller allergener og derfor representere verdifull in vitro modeller for å studere effekter av disse stressfaktorene på luftveis epitelceller.

Ulike systemer for re-forskjellig cellekulturrensierte menneskelig egenkapitalbevis er kommersielt tilgjengelig (f.eks EpiAirway modell fra Mattek, Ashland, MA, Clonetics fra Lonza, Basel, Sveits, MucilAir fra Epithelix Sars, Genève Sveits). De kommersielt tilgjengelige cellekulturer forblir stabile i en lang tidsperiode og er godt karakterisert. De er imidlertid kostbare og studier er vanligvis begrenset til et lite antall prøver fra forskjellige individer. I tillegg er det vanskelig å få tak i donorpopulasjon, som er avhengig av tilgjengeligheten presentert av leverandøren. Freshly skaffe NEC med overfladiske skrape biopsier lar etterforsker for å kontrollere underlagt egenskaper (for eksempel alder, kjønn, rase, vekt, kroppsmasseindeks, sykdomsstatus, medisinering bruk, etc.) og å re-call frivillige tilbake for en potensiell oppfølging opp.

Generelt, alle publiserte protokoller for re-differensiere menneskelige airway (enten bronkial eller nasal) egenkapitalbevis på ALI inkluderer lignende prosedyrer: obtaining egenkapitalbevis, utvide cellene i vevskulturflasker, og overføre dem til porøs cellekultur setter inn for differensiering på ALI. Protokollene variere i type media, vekstfaktor kosttilskudd, antall aging, belegg av innleggene, og aktivering av NEC skal før etablering av ALI. Mens i en protokoll, etter å ha innhentet og fordøye, cellene er seeded direkte på ubestrøket inserts og bare holdt noen få dager på ALI før bruk 13, andre protokoller omfatter dyrking i flere uker for å re-differensiere på ALI 12,14,15 . Det er ingen konsistens om belegg innsatser med kollagen eller andre ekstracellulære matrix komponenter: mens noen protokoller krever belegg 12,15 andre bruker ubestrøket inserts 13,14. Men kultur forhold er av stor betydning, spesielt inkubator innstillinger. Den relative fuktighet, noe som må være> 90%, og det CO 2, som skal reguleres til 5% er megetviktige faktorer for å unngå uttørking av ALI cellekultur og å bufre mediet. For å dele våre erfaringer, ønsker vi å nevne her at det ikke er 100% suksess rate. Noen nasal skrape biopsiprøver ikke holder seg til vevskulturplaten, mens noen NEC prøvene ikke vil forholde seg til innstikk eller vil aldri nå konfluens. I løpet av årene, er vår samlede suksessraten ved bruk av protokollen beskrevet her ca 80%. Vår erfaring viser at dyrking av NEC fra definerte syke populasjoner, for eksempel røykere, er mer utfordrende enn NEC fra friske ikke-røykere

Vår protokoll for dyrking av primære humane NEC inneholder flere viktige tiltak som vi optimalisert gjennom årene: en. De NEC er bare utvidet to ganger før de blir sådd på vevskulturstudier inserts. 2. Skjærene er brukt ubestrøket. Tre. Når utsådd på vevskultur-plater, er mengden av NuSerum trinnvis redusert for å unngå at cellene løftes av fra vevskulturplater. 4. De NEC skal holdes minst 25-28 dager på ALI før du bruker dem i eksperimenter for å sikre fullstendig re-differensiering. I sammendraget, protokollen beskrevet her inkluderer en optimalisert protokoll til kultur og re-differensiere menneskelige NEC på ALI.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å takke Lisa Dailey for nyttige innspill.

Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Institutes of Health (ES013611 og HL095163), Flight Attendant Medical Research Institute (FAMRI), og Environmental Protection Agency (CR83346301) og erklærer ingen interessekonflikt. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis de offisielle visningene av National Institutes of Health. Selv om forskningen er beskrevet i denne artikkelen har blitt finansiert delvis av US Environmental Protection Agency gjennom samarbeidsavtale CR83346301 med Center for Environmental Medicine, astma og lungesyke Biology ved University of North Carolina-Chapel Hill, det har ikke vært utsatt for den etatens nødvendig peer og politisk vurdering, og derfor ikke nødvendigvis gjenspeiler synspunktene til etaten, og ingen offisiell anbefaling skal kunne utledes. Nevn of varemerker eller kommersielle produkter innebærer ingen godkjennelse eller anbefaling til bruk. Loretta Müller er støttet av den sveitsiske National Science Foundation med en personlig stipend.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nasal speculum Welch Allyn Model 22009 9 mm, reusable polyproylene
Operating otoscope Welch Allyn Model 21700
Rhino probe cell cuvette Arlington Scientific SY-96-092 bend the head of the cuvette a little more
12-well culture plates Corning 3512
Transwell membrane cell culture inserts Corning 3460
Tissue culture flask Corning 430639 and 430641 T25 and T75 vented flask
RPMI 1640 media (with L-Glutamine) Gibco 11875
Bronchial/Tracheal Epithelial Cell Growth Medium Cell applications 511-500
BEGM Bronchial Epithelial Cell Growth Medium Lonza CC-3170 This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements.
Sodium Bicarbonate 7.5% solution Gibco 25080 Use as it is.
NuSerum BD Biosciences 355104 Use as it is.
BAMBANKER freezing media BAMBANKER 302-14681 Use as it is.
CoolCell Biocision HTBCS-136 (CryoPrep alcohol-free cell freezing container)
PureCol AdvancedBioMatrix 5005-B dilute 1:100 with sterile water (should be roughly 0.03 mg/ml)use 500 μl/well of a 12-well plate
HBSS with Ca2 and Mg2+ Gibco 14025
DNAse 1 Sigma DN25 Dissolve at 1.5 mg/ml, which is a 100x solution, add 10 μl to each ml of media
Trypsin, 0.25%, 1x, with phenol red Gibco 25200-056 Use at it is
Soy Bean Trypsin Inhibitor (SBTI) Sigma T6522 Use dissolved in HBSS at a concentration of 1 mg/ml
Retinoic acid Sigma R7632 Make it up 100 μM stock solution (see below), dilute to 10 μM with absolute alcohol, take 5 μl of this and add it to 1 ml BEGM media (our working solution).

All-trans Retinol has a coefficient of extinction of 52,480 in ethanol at 325 nm. Dissolve 25 mg in 50 ml absolute ethanol. Serial dilutions need to be made, dilute 50 ml of stock in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, and again take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute Ethanol, take 100 ml of this and dilute in 900 ml absolute ethanol and read in the spectrophotometer at 325 nm, this number is then multiplied by its’ dilution factor, then divided by the extinction coefficient of 52,480, this will give a number in mM. Make a 100 mM stock (store at -20 °C) and from this stock a 10 mM aliquot is made, the daily retinoic acid needed would be 5 ml of this 10 mM aliquot in 995 ml ALI media. Example: 325nm reading is 1.15. 1.15 x 10,000 (dilution factor) / 52,480 = 0.219 = 219 mM, make a 100 mM stock from this, in absolute ethanol.
DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine and sodium pyruvate Gibco 11995
Bovine Pituitary Extract Gibco 13028-014 Used for BEGM ALI media.
Nystatin Sigma N4014-50 mg Make up a solution of 3.3 mg/ml.
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1600-100 Make up a solution of 10 mg/ml solution in milliQ water.
PneumaCult-ALI media StemCell 5001 This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements. For details see below.
Hydrocortisone StemCell 7904 Dissolve 2.4 mg hydrocortisone in 1 ml ddH2O (used to make the 200x Hydrocortisone stock solution)
Heparin Sodium Salt in PBS (2 mg/ml) StemCell 7980 Use at it is.
Filter flasks (500 ml) Corning 431097 0.22 μm pore size
Filter tubes (50 ml) Millipore SCGP00525 Steriflip, 0.22 μm pore size
Pipette tips - ART Barrier Tips Molecular Bioproducts 2139RI, 2069RI, 2179RI
Conical tubes, sterile, 15 ml and 50 ml
ddH2O, absolute ethanol, ice
CO2 incubator
refrigerated centrifuge
biological safety cabinet
pipettes (p2, p200, p1000), 9 in glass pipettes
gloves
lab coat with tight cuffs
Media and solutions used: Recipe Used for
General remark: always warm the media to room temperature
BEGM media
  • 500 ml BEGM Cell Application media with one aliquot of retinoic acid
(mix them half-half and filter )
  • 500 ml BEGM Lonza media with one aliquot of single quot supplements
  • digestion of the biopsy
BEGM+ media
  • 50 ml BEGM media
  • maintaining cells on plastic in the plates (passage0)
  • 10 μl retinoic acid (working solution)
  • seeding cells in the flask (passage1; partially)
  • maintain the cells in the flask
BEGM++ media
  • 50 ml Lonza’s BEGM media with supplements
  • seeding fresh cells in 12-well plate on plastic
  • 1 ml Sodium BiCarb
  • maintaining cells in the plates on plastic (passage0; only partially)
  • 2.5 ml NuSerum
  • seeding cells in the flask (passage1; partially)
BEGM ALI media
  • 250 ml DMEM-H
  • Maintaining cells on the transwell before they go ALI
  • 250 ml BEGM including supplements
  • 2 ml Bovine Pituitary Extract (12.5 mg/ml solution)
  • 1 ml Nystatin (3.3 mg/ml solution)
  • 75 μl BSA (10 mg/ml solution)
200X Hydrocortisone Stock Solution (96 μl/ml solution)
  • 200 μl dissolved hydrocortisone
  • As a supplement to the PneumaCult-ALI Complete Base Medium for the last day in the flask and when cells are on inserts
  • 4250 μl dissolved sodium chloride
  • 540 μl ddH2O
  • 10 μl absolute ethanol
Filter solution through 0.22 μm filter, aliquot solution and store at -20 °C, avoid additional freeze/thaw cycles
PneumaCult-ALI Complete Base Media
  • 450 ml PneumaCult-ALI Basal Medium
  • Base medium for all three PneumaCult-ALI media
  • 50 ml PneumaCult 10x Supplement
  • The PneumaCult media is light sensitive, thus always keep it in the dark
(this is stable for 2 weeks at 2-8 °C or for up to 6 months at -20 °C)
PneumaCult-ALI Maintenance Medium Per 1 ml of PneumaCult-ALI Complete Base Medium add: ALI culture on inserts
  • 10 μl PneumaCult 100x Maintenance Supplement
  • 2 μl Heparin (of a 2 mg/ml stock solution)
  • 5 μl Hydrocortisone (of a 96 μl/ml stock solution)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Swamy, M., Jamora, C., Havran, W., Hayday, A. Epithelial decision makers: in search of the 'epimmunome. Nat. Immunol. 11, 656-665 (2010).
  2. Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. The airway epithelium: soldier in the fight against respiratory viruses. Clin. Microbiol Rev. 24, 210-229 (2011).
  3. Muller, L., Jaspers, I. Epithelial cells, the "switchboard" of respiratory immune defense responses: Effects of air pollutants. Swiss Med. Wkly. (2012).
  4. Sanders, C. J., Doherty, P. C., Thomas, P. G. Respiratory epithelial cells in innate immunity to influenza virus infection. Cell Tissue Res. 343, 13-21 (2011).
  5. Robertson, M. J. Role of chemokines in the biology of natural killer cells. J. Leukoc. Biol. 71, 173-183 (2002).
  6. Adachi, M., Matsukura, S., Tokunaga, H., Kokubu, F. Expression of cytokines on human bronchial epithelial cells induced by influenza virus. A. Int. Arch. Allergy Immunol. 113, 307-311 (1997).
  7. Borchers, M. T., Harris, N. L., Wesselkamper, S. C., Vitucci, M., Cosman, D. NKG2D ligands are expressed on stressed human airway epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 291, L222-L231 (2006).
  8. Groh, V., et al. Costimulation of CD8alphabeta T cells by NKG2D via engagement by MIC induced on virus-infected cells. Nat. Immunol. 2, 255-260 (2001).
  9. Obeidy, P., Sharland, A. F. NKG2D and its ligands. Int J. Biochem. Cell Biol. 41, 2364-2367 (2009).
  10. Horvath, K. M., Brighton, L. E., Zhang, W., Carson, J. L., Jaspers, I. Epithelial Cells From Smokers Modify Dendritic Cell Responses in the Context of Influenza Infection 1. Am. J. Resp. Cell. (2010).
  11. Muller, L., Brighton, L. E., Jaspers, I. Ozone exposed epithelial cells modify co-cultured natural killer cells. AJP Lung. (2013).
  12. Turi, J. L. Oxidative stress activates anion exchange protein 2 and AP-1 in airway epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, 791-798 (2002).
  13. Zimmermann, G. S., Neurohr, C., Villena-Hermoza, H., Hatz, R., Behr, J. Anti-inflammatory effects of antibacterials on human Bronchial epithelial cells. Respir. Res. 10, 89 (2009).
  14. Lopez-Souza, N., Avila, P. C., Widdicombe, J. H. Polarized cultures of human airway epithelium from nasal scrapings and bronchial brushings. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 39, (2003), 266-269 (2003).
  15. Gray, T. E., Guzman, K., Davis, C. W., Abdullah, L. H., Nettesheim, P. Mucociliary differentiation of serially passaged normal human tracheobronchial epithelial cells. Am. J. Respir. Cell Mo.l Biol. 14, 104-112 (1996).
  16. Adler, K. B., Schwarz, J. E., Whitcutt, M. J., Wu, R. A New Chamber System for Maintaining Differentiated Guinea-Pig Respiratory Epithelial-Cells between Air and Liquid-Phases. Biotechniques. 5, 462 (1987).
  17. Whitcutt, M. J., Adler, K. B., Wu, R. A biphasic chamber system for maintaining polarity of differentiation of cultured respiratory tract epithelial cells. In Vitro Cell. Dev. Biol. 24, 420-428 (1988).
  18. Jaspers, I. Reduced expression of IRF7 in nasal epithelial cells from smokers after infection with influenza. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 43, 368-375 (2010).
  19. Muller, L., Brighton, L. E., Jaspers, I. Ozone exposed epithelial cells modify cocultured natural killer cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 304, 332-341 (2013).
  20. Ochs, M., Weibel, E. R. Fishman's Pulmoary Diseases and Disorders. Fishmanetal, A. P., et al. 4, Mc Graw Hill. New York, NY. 23-69 (2008).
  21. Kesic, M. J., Meyer, M., Bauer, R., Jaspers, I. Exposure to Ozone Modulates Human Airway Protease/Antiprotease Balance Contributing to Increased Influenza A Infection. PLoS ONE. 7, e35108 (2012).
  22. Jaspers, I. Diesel exhaust enhances influenza virus infections in respiratory epithelial cells. Toxicol. Sci. 85, 990-1002 (2005).
  23. Jaspers, I., Flescher, E., Chen, L. C. Ozone-induced IL-8 expression and transcription factor binding in respiratory epithelial cells. Am. J. Physiol. 272, L504-L511 (1997).
  24. Blume, C., et al. Barrier responses of human bronchial epithelial cells to grass pollen exposure. Eur. Respir. J. (2012).
  25. Bauer, R. N. Influenza enhances caspase-1 in bronchial epithelial cells from asthmatic volunteers and is associated with pathogenesis. J. Allergy Clin. Immunol. 130, 958-967 (2012).
  26. Ostrowski, L. E., Stewart, D., Hazucha, M. Interferon gamma stimulates accumulation of gas phase nitric oxide in differentiated cultures of normal and cystic fibrosis airway epithelial cells. Lung. 190, 563-571 (2012).
  27. Jardim, M. J., Fry, R. C., Jaspers, I., Dailey, L., Diaz-Sanchez, D. Disruption of microRNA expression in human airway cells by diesel exhaust particles is linked to tumorigenesis-associated pathways. Environ. Health Perspect. 117, 1745-1751 (2009).
  28. Horvath, K. M., Brighton, L. E., Herbst, M., Noah, T. L., Jaspers, I. Live Attenuated Influenza Virus (LAIV) induces different mucosal T cell function in nonsmokers and smokers. Clin. Immunol. 142, 232-236 (2012).
  29. Horvath, K. M. Nasal lavage natural killer cell function is suppressed in smokers after live attenuated influenza virus. Respir. Res. 12, 102 (2011).
  30. Noah, T. L. Tobacco smoke exposure and altered nasal responses to live attenuated influenza virus. Environ. Health Perspect. 119, 78-83 (2011).

Comments

1 Comment

  1. Can you describe in more detail how the paraffin-embedding and sectioning is performed? We are experiencing technical issues with our attempts at H&E. The transwell membranes "curl" and cells are lost. Does the thickness of the sectioning matter (5 um)? Thank you for this great tutorial.

    Reply
    Posted by: Kathy S.
    February 22, 2016 - 12:22 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics