Odling av Human Nasal epitelceller på Air Liquid Interface

1Center for Environmental Medicine, Asthma, and Lung Biology, The University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Pediatrics, The University of North Carolina at Chapel Hill, 3Pulmonary Diseases and Critical Care, The University of North Carolina at Chapel Hill, 4Curriculum in Toxicology, The University of North Carolina at Chapel Hill
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Nasala epitelceller, som erhållits genom ytliga skrap biopsi av frivilliga försökspersoner, expanderas och överförs till vävnadskulturinsatser. Vid ankomsten till konfluens odlas celler vid luft flytande gränssnitt, vilket ger kulturer av cilierade och icke-cilierade celler. Differentierade nasala epitelceller cellkulturer ger livskraftiga experimentella modeller för att studera luftvägarna slemhinna.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Müller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer II, W. A., Jaspers, I. Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface. J. Vis. Exp. (80), e50646, doi:10.3791/50646 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

In vitro-modeller med humana primära epitelceller är väsentliga för att förstå viktiga funktioner av respiratoriska epitelet i samband med mikrobiella infektioner eller inhalerade medel. Direkta jämförelser av celler från sjuka populationer tillåter oss att karakterisera olika fenotyper och dissekera de bakomliggande mekanismerna som förmedlar förändringar i epitelceller funktion. Odling epitelceller från human tracheobronchial regionen är väl dokumenterad, men begränsas av tillgången på lungvävnad eller humant invasivt i samband med att få bronkerna borstar biopsier. Nasala epitelceller erhålls genom mycket mindre invasiva ytliga nasal skrapa biopsier och ämnen kan biopsier flera gånger utan några signifikanta biverkningar. Dessutom är näsan inkörsport för luftvägarna och därmed en av de första platserna att utsättas för någon form av luftburna stressfaktor, t.ex. mikrobiella medel, föroreningar eller allergener.

I korthet är nasala epitelceller som erhållits från frivilliga människor expanderat på belagda vävnadsodlingsplattor, och sedan överförs till cellkulturinsatser. Vid ankomsten till konfluens, celler fortsätter att odlas på luft-vätske-gränssnitt (ALI), i flera veckor, vilket skapar mer fysiologiskt relevanta förhållanden. Den ALI kultur villkoret använder definierade medier leder till en differentierad epitel som uppvisar morfologiska och funktionella egenskaper som liknar den mänskliga nässlemhinnan, med både cilie och slemproducerande celler. Vävnadsodlings skär med differentierade nasala epitelceller kan manipuleras i en mängd olika sätt beroende på forskningsfrågor (behandling med farmakologiska medel, transduktion med Lentiviral vektorer, exponering för gaser eller infektion med mikrobiella medel) och analyserades för många olika slutpunkter som sträcker sig från cellulära och molekylära vägar, funktionell lmAnges, morfologi etc.

In vitro-modeller av differentierade humana nasala epitelceller kommer att göra det möjligt för utredarna att ta itu med nya och viktiga forskningsfrågor med hjälp organotypic experimentella modeller som i stor utsträckning efterlikna nässlemhinnan in vivo.

Introduction

Mål av tekniken

Epitelceller (ECS) i luftvägarna är bland de första platserna som direkt utsatta för inhalerade miljöpåverkande faktorer, såsom patogener, allergener och luftföroreningar. EC är mer än ett strukturellt hinder: De fungerar som en växel för att initiera och reglera luftvägarna immunsvar 1-3 via frisättningen av lösliga mediatorer 4-6 och uttrycket av ligander / receptorer på sin yt 7-9. Medan odödliga cellinjer kan användas som modeller för att studera andnings EC in vitro, misslyckas de att differentieras till heterogena cellpopulationer som består av polariserad cilierade och slemproducerande celler, liknande det som observerats in vivo. För att sammanfatta viktiga egenskaper hos det respiratoriska epitelet observerats in vivo, kan primära luftvägs EC användas. Därför är vårt mål var att optimera vår metod utnyttjar nasal EC (NEC) som erhållits från frivilliga. The NEC expanderas och odlas in vitro, vilket gav en cellkulturmodell för differentierade NEC som härmar många av funktionerna i det nasala epitelet ses in vivo.

Bakgrund

Användningen av in vitro-modeller med humana primära EC härma in vivo-situation - som beskrivs i denna studie - ger unika möjligheter att studera sjukdomsspecifika skillnader i EC, fysiologiska parametrar i samband med luftvägsslemhinnan, eller växelverkan mellan EC och andra celltyper, såsom dendritiska celler 10, naturliga mördarceller 11 eller makrofager. Flera befintliga metoder utnyttjar luftrörs EC, som kan erhållas invasivt via borst biopsier under bronchoscopies, eller från något annat kasslungvävnad 12-17. Dessutom kommersiella källor för att få fullt differentierade mänskliga luftvägarna epitelial cellkulturer existerar (EpiAirway modell från Mattek, Ashland, MA, Cloneticsfrån Lonza, Basel, Schweiz, MucilAir från Epithelix Sars, Genève Schweiz), där utredarna kan välja mellan olika givare. Men på grund av den begränsade pool av kommersiellt tillgängliga epitelceller, begränsade eller föreskriven uppsättning parametrar, kostnaden i samband med kommersiellt erhålla primära humana luftvägar EC, och den begränsade tillgången till kasselungvävnad eller nyligen erhållna human bronkial biopsivävnad, förbjuda många utredare från studier på fullt differentierade mänskliga luftvägs EC. Därför har vi på att utveckla en teknik som kommer att 1) ​​använda icke-invasivt erhållna humana NEC, 2) ge ett protokoll som ger kulturer av differentierad mänsklig luftvägsepitel, och 3) vara reproducerbar i de flesta lab inställningar med en befintlig vävnadskultur infrastruktur.

Fördelar jämfört med existerande tekniker / modeller

Erhållande färska NEC, jämfört med bronkial eller små luftvägar EC, är mycket mindre invasiva, individuells kan biopsier flera gånger utan några betydande biverkningar, och ytliga nasala skrap biopsier kan utföras på sjuka populationer som annars inte skulle vara kvalificerade för forskningsrelaterade bronchoscopies. Icke-invasiv ytliga skrap biopsier att få NEC tillåter forskaren att ställa donator specifikation a priori, inklusive ålder, kön, sjukdomsstatus, etc. i enlighet med forsknings mål som skall uppnås. Alltså, när man utformar forskningsstudier utredare inte begränsas av kliniskt tillgängliga vävnader / epiteliala prov, köpa dyra differentierade cellkulturmodeller från kommersiella leverantörer, eller design invasiva bronkoskopi studier. Dessutom den lätthet att erhålla NEC ökar förmågan att genomföra experiment i celler från olika givare, vilket förbättrar statistisk validering av observerade undersökningsresultat. Slutligen är näsan en av de första platserna att utsättas för någon form av luftburna stressfaktorer. Således genere organotypisk iodlings vitro-system som härmar det nasala epitelet är användbara för att studera inandning av virala partiklar, föroreningar, allergener, eller gaser, som lätt kan uppnås genom användning av denna cellkultursystem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Förbered Plast Ware: Coat Plate

  1. Addera 500 pl PureCol (1:100 spädd med sterilt vatten) till varje brunn i en 12-brunnars platta.
  2. Inkubera vid 37 ° C i en inkubator i 30 minuter, ta bort PureCol och skölj med HBSS precis innan cellerna tillsätts till plattan (se steg 3.1).

2. Att få och förbehandla Biopsi av Human NEC

  1. Nasal scrape biopsi
    1. Skaffa ytliga EC kantar nasala näsmusslan under direkt vision genom en 9 mm återanvändningsbar polypropylen nasal spekulum (modell 22009) på ett operativsystem otoskop med spekulum (modell 21700). Denna enhet ger optimal visualisering i näsans näsmusslan och flexibilitet i rörelse.
    2. Utför biopsier med motivet sitter upprätt i en rakryggad stol med huvudet lutas tillbaka något eller ligger i ryggläge på ett undersökningsbord.
    3. Sätt i otoskop spekulum i näsborren och sämre Turbinate visualiserades med belysning.
    4. Sätt i en steril termoplast kyrett genom spekulum med spetsen utvidgas distalt till baksidan av turbinata.
    5. Med hjälp av ett lätt tryck på den nedre ytan av turbinate är kyrett dras över slemhinneytan 5x och indragen. En lyckad hämtning av slemhinneceller innehas av kapillärkraften kommer att märkas i koppen av kyrett.
  2. Placera provet i en 15 ml koniskt rör som innehåller 8 ml RPMI 1640, transport på is.
  3. Använd pincett för att hämta sonden, få bort vävnad från noshörning sond med en P-1000 pipett, kasta sond
  4. Centrifug till pellets (4 ° C, 400 xg, 5 min), aspirera supernatanten (uppmärksamhet: noga med att inte aspirera pellets).
  5. Suspendera pelleten i 1 ml BEGM med 10 pl 100x DNas 1.
  6. Inkubera vid rumstemperatur under 20 min.
  7. Centrifug (4 ° C, 400 xg, 5 min), INTE aspirera supernatanten!

3. STE-cellerna på plast (Dag 0)

  1. Avlägsna PureCol från plattan och skölj med HBSS (se även steg 1.2).
  2. Lägg till en minimivolym av BEGM + + media (80-100 il, tills en menisk av media visas i mitten av brunnen) i 1-4 brunnar (beroende på biopsi storlek) av den belagda plattan.
  3. Använd en P-1000 pipett för att försiktigt ta bort pellet av biopsivävnad från röret, utan att aspirera för mycket media.
  4. Överför pelleten in i mitten av brunnarna, hålla biopsin tillsammans som ett kluster av celler, och inte bryter upp för att göra en enkelcellsuspension. En bra biopsi avkastning på upp till 4 brunnar som kan seedade. Placera plattan i vävnadsodlingsinkubator (37 ° C, 5% CO2,> 90% relativ fuktighet).
  5. Kontrollera efter två timmar för att säkerställa att det finns tillräckligt med medium (utan att störa menisken).
  6. Dag1, 24 h efter sådd: samla alla icke-vidhäftande celler i alla brunnar (lutningsplattan och samla media med celler i en P-1000, collect alla brunnar i en 1,5 ml centrifugrör).
  7. Centrifugera (4 ° C, 400 x g, 5 min).
  8. Medan centrifugering av cellsuspensionen: tillsätt ungefär 250 pl av BEGM + + och 250 | il av BEGM + medieblandningen till cellerna som ympats på dag 0.
  9. Upprepa steg från 3,1 till 3,5 för de icke-vidhäftande celler.
  10. Dag 2-5: förändring media av cellerna dagligen, Tillsätt 500 l media till varje brunn, minska mängden BEGM + + media stegvis (dag 2 efter sådd: 125 l BEGM + + plus 375 pl BEGM +, day3 efter sådd och följande dagar: 73 pl BEGM + + plus 427 pl BEGM +).

4. Utöka Celler i kolvarna

  1. Övervaka celler dagligen, när de har nått 80-90% sammanflytning (vanligtvis 5-7 dagar efter biopsi, om de tar längre tid att de inte kommer att växa med framgång) lyft celler som följande: Försiktigt aspirera media, tillsätt 500 l av 0,25% trypsin per brunn, förvara dem vid 37 ° C tills cellerna lösgörs (det tar vanligen 2-3 minuter).
  2. Förbered behovetutgåva volym av sojaböna trypsininhibitor (SBTI) (750 | il per 1 ml trypsin) i ett 15 ml rör.
  3. Rubba celler genom upprepad pipettering upp och ned den trypsinlösning; överförings lösgjorda celler i 15 ml koniska rör med SBTI.
  4. Skölj alla brunnar med totalt 1 ml HBSS, till HBSS till röret med cellerna.
  5. Centrifugera för att pelle (4 ° C, 400 x g, 5 min), suga ut mediet, återsuspendera i 1 ml BEGM + Medier och vortexblanda röret.
  6. Expandera celler i ett T25 eller T75 kolv beroende på pelletsstorlek (detta är p1, cirka två sammanflytande brunnar går in i en T75 kolv, väl räcker för en T25 en sammanhängande, vanligen 2 sammanflytande brunnar ger en T75).
    1. Lägg BEGM + till kolvarna (5 ml vardera för en T75, 3 ml vardera för en T25).
    2. Lägg cellsuspensionen till kolvarna. Överför kolvarna till en vävnadsodlingsinkubator.
  7. 24 timmar efter kolv-seeding: lägga till ytterligare BEGM + media till kolven (3 ml till en T25, 10 ml till en T75).

5. Seed cellerna på Tissue Culture Inserts

  1. Ta bort materialet från kolven och tillsätt trypsin (3 ml för T25, 4 ml för T75 kolv).
  2. Inkubera vid 37 ° C tills cellerna lösgörs (ca 2-3 min).
  3. Förbered SBTI (750 l per 1 ml trypsin> 2,25 ml för T25, 3 ml för T75) i en 15 ml tub.
  4. Rubba celler genom att tejpa kolven och pipettera upp och ner och överför till koniska rör med SBTI.
  5. Skölj kolven med HBSS (1 ml för T25, 2 ml för T75), tillsätt HBSS till 15 ml tub.
  6. Centrifugeraför att pelletera (4 ° C, 400 x g, 5 min), avlägsna supernatanten noggrant.
  7. Förbered plattorna: bestämma hur många plattor kommer att vara seedade, märka plattorna med exempelkod och nummer, passagenummer (dvs. p2) och datum. Lägg till 700 il BEGM + media till basalkammaren.
  8. Resuspendera cellpelleten i 1 ml BEGM ALI medier genom att vortexa röret.
  9. Räkna celler med en hemocytometer (en T25 producerar vanligtvis cirka 4 miljoner celler, en T75 kan ha upp till 20 miljoner celler beroende på den lilla ön, använd 1-2 miljoner celler för en 12-brunnar) och späd cellsuspensionen med BEGM ALI media till den totala volymen som krävs för den mängd plattor som ska seedas (1,2 x 10 6 celler i 2,5 ml medium per platta) (Obs:. Om en del av cellerna vill frysas, Märk röret och ta bort celler här: vi brukar frysa 2 x 10 6 celler i 2 ml frysmedier)
  10. Tillsätt 200 l cellsuspension till den apikala sidan av varje obestruket Corning 12well cellsätt in (> detta kommer att bli ca 80,000-150,000 celler / insert, 12 mm transwells med 0,4 ìm porstorlek polyester (polyetentereftalat (PET)) membraninsats), överför till vävnadskultur inkubator.
  11. Efter 24 timmar, ändra den apikala mediet (200 | il expansionsmedium).
  12. Att upprätthålla cellkulturer: Ändra media (BEGM ALI media, 700 l basolateral och 200 ul apikala) varannan dag. Vändskär måste bevaras submers tills cellerna är helt sammanflytande (inga hål i monoskiktet är synlig). Beroende på antalet celler detta brukar ta mellan 2-6 dagar, om det tar längre tid att cellerna kommer sannolikt inte att vara lönsamt.

6. Upprätta Air Liquid Interface När cellerna väl är helt Konfluenta (När cellerna på Transwells är helt konfluenta)

  1. När cellerna är helt sammanflytande ersätta både apikala och basolaterala media med BEGM ALI-medium kompletterat med 500 nM vitamin A-syra för 48 timmar.
  2. 48 timmar efter att ha lagt det retinoinsyra kompletterat BEGM ALI medier: Förbered PneumaCult-ALI Maintenance Medium (enligt tillverkarens anvisningar): Beräkna volymen av mediet som behövs (till en platta vanligen 8,5 ml för basala fack), till per 1 ml PneumaCult Complete Base Medium :

    10 pl PneumaCult 100x Underhålls Supplement
    2 | il heparin (av en 2 mg / ml stamlösning)
    5 | il Hydrocortisone (av en 96 | il / ml stamlösning).

  3. Ta bort allt material och tillsätt 700 l PneumaCult-ALI underhålls media till den basolaterala sidan (inga medel på den apikala sidan).
  4. Behåll cellkulturer för 4 veckor på ALI:
    1. Ändra media varannan dag (måndag, onsdag och fredag ​​schema fungerar bra för oss).
    2. Efter en vecka på ALI, en gång i veckan (onsdagar) den apikala ytan sköljs: tillsätt 200 l HBSS till den apikala sidan, hålla dem i 10 min i inkubatorn, försiktigt aspireraHBSS (använd en 9 i glaspipett bifogas vakuumfälla i biologiska säkerhetsskåp, använd 200 pl tips på spetsen av pipetten för att suga bort HBSS).

Anm: Ändra tips mellan plattor, samt ändra tips när man går från apikala yta kontra basolaterala. Efter ca 2 veckor vid ALI, cellerna börjar differentiera och cilier visas. Cellkulturer nå full differentiering efter ca 4 veckor vid ALI.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

NEC odlade efter det här beskrivna protokollet åter differentiera till en heterogen lager av EC består av cilierade och icke-cilierade celler, som representerar in vivo-situationen (figur 1). Några av de differentierade NEC är slem som producerar (celler färgning i blått med hjälp av AB / PAS, Figur 1B). Även om den här presenterade protokollet optimeras, kan differentiering variera med avseende på fördelningen av de totala cellpopulationer (dvs. olika förhållanden av cilierade celler: slemproducerande celler: icke-cilierade celler) eller till och med ge en mer skivepitel. Dessa variationer kan bero på givarpopulationen och därför representera rekapitulation av en underliggande sjukdom fenotyp, som vi tidigare har demonstrerats med användning av NEC från rökare 18. Figur 2 visar exempel på suboptimala re-differentierade NEC använder ett annat protokoll och medieformuleringar. Cellerna är skivepitelcancer ochvarken cuboidal eller cilierade och inte efterlikna en pseudostratified respiratoriskt epitel (Figur 2).

Figur 1
Figur 1. Re-differentierade humana NEC kultur. NEC fixerades med 4% PFA och inbäddades i paraffin. Kulturerna färgades med hematoxylin och eosin (A) och Alcian blue / perjodsyra-Schiff (B) (efter metoder som beskrivs i 19). Bilderna visar NEC med en tydlig organisation, en cuboidal struktur, slemproducerande bägarceller samt cilie EC.

Figur 2
Figur 2. Hematoxylin och eosin färgade paraffininbäddade sektionen av suboptimala kulturer. NEC kulturer med suboptimal differentiering. Celler verkar skivepitelcancer, ingen cuboidal struktur, inga cilierade celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Andnings EC ger inte bara en fysisk barriär för att skydda kroppen från exogena stimuli 20, men också fungera som en växel för att initiera och reglera andnings immunförsvar svar 1-3 via utsöndring av lösliga mediatorer eller direkta receptor-ligand-cell-cell interaktioner. För att ytterligare studera betydelsen av EC i immunsvaret, för att undersöka eventuella skillnader mellan EC från sjuka populationer, eller för att studera effekterna av exogena faktorer på EC, är det viktigt att sammanfatta situationen in vivo. De humana luftvägar innehålla mer än 40 olika celltyper 20 inklusive olika epitelceller, t.ex. cilieceller, gobletceller och basalceller 20. Vårt protokoll beskriver hur en ytlig nasal scrape biopsi kan bearbetas för erhållande av NEC som kan expanderas och odlas för att genomgå återdifferentiering, vilket gav NEC kulturer, som i stor utsträckning efterliknar det nasala epitelet in vivo.

Användningen av denna modell av organotypic primära humana differentierade NEC in vitro ger unika möjligheter för olika applikationer. Det gör att studera sjukdomsspecifika skillnader i NEC (t.ex. cystisk fibros, astma, rökning), bakomliggande mekanismer för en sjukdom, samt kontrollerade exponeringar mot luftföroreningar (t.ex. ozon, dieselavgaser, cigarettrök) 18,21-23. Dessutom differentierade NEC odlas på vävnadsodlingsinsatser lämpar sig för samodling med andra celltyper (t ex dendritiska celler, naturliga mördarceller eller makrofager) 10,11, vilket tillåter att undersöka cell-cell-interaktioner i en kontrollerad miljö.

Vi beskriver odlingen och återdifferentiering av NEC, och inte bronkiala epitelceller, som har använts i många tidigare publicerade studier 24-27. Vi ser olika skäl till varför användningen av NEC kan vara fördelaktigt i jämförelse med användningen avbronkial EC. Först att få ytliga nasal skrapa biopsier är billigare än att genomföra en bronkoskopi för att få pensel biopsier. För det andra, för en mängd olika redan existerande sjukdomar (t.ex. bryta astmatiker) det är orealistiskt att genomföra en forskningsrelaterad bronkoskopi till erhållits lägre epitelceller i luftvägarna. Däremot kan utföras på mindre ingrepp för att skrapa den sämre yta sämre nasala turbinata med en Rhino Probe i dessa ämnen. För det tredje, kan nasala skrap biopsier utföras på samma individer flera gånger (vanligtvis ca 4 veckor i mellan biopsier) utan några signifikanta biverkningar 28-30. För det fjärde, NEC är bland de första cellerna som ska exponeras för inandning miljöpåverkande faktorer, såsom luftföroreningar, patogener eller allergener och därför representerar värdefull in vitro-modeller för att studera effekterna av dessa stressfaktorer på epitelceller i luftvägarna.

Olika cellkultursystem för åter skiljerentiated human EC är kommersiellt tillgängliga (t.ex. EpiAirway modell från Mattek, Ashland, MA, Clonetics från Lonza, Basel, Schweiz, MucilAir från Epithelix Sars, Genève Schweiz). Dessa kommersiellt tillgängliga cellkulturer förblir stabila under en lång tidsperiod och är väl karakteriserade. De är emellertid dyra och de studier är vanligen begränsade till ett litet antal prover från olika individer. Dessutom är det svårt att kontrollera givaren befolkningen, som är beroende av tillgången presenteras av leverantören. Färskt erhålla NEC med ytliga skrap biopsier tillåter forskaren att styra ämnes egenskaper (såsom ålder, kön, ras, vikt, BMI, sjukdomsstatus, läkemedelsanvändning etc.) och att återsamtals volontärer tillbaka för en eventuell uppföljning upp.

I allmänhet, alla publicerade protokoll för åter differentiera mänskliga luftvägar (antingen bronkial eller nasal) ECS vid ALI inkluderar liknande förfaranden: obtaining EC, expandera cellerna i vävnadsodlingskolvar, och överföra dem till porös cellodling inlägg för differentiering vid ALI. Protokollen varierar i vilken typ av media, de tillväxtfaktor kosttillskott, antalet passaging, beläggningen av insatserna, och aktiveringen av NEC före inrättandet av ALI. Även i ett protokoll, efter att ha inhämtat och smälta, cellerna är seedade direkt på obelagda skär och hålls bara några dagar vid ALI före användning 13, andra protokoll omfattar odling i flera veckor att åter skilja på ALI 12,14,15 . Det finns ingen samstämmighet om att belägga skären med kollagen eller andra extracellulära matrixkomponenter: medan vissa protokoll kräver beläggning 12,15 andra använder obelagda skär 13,14. Emellertid odlingsbetingelser är av stor betydelse, särskilt de inkubator inställningar. Den relativa fuktigheten, som måste vara> 90% och CO2, som bör anpassas på 5% är mycketviktiga faktorer för att undvika uttorkning av ALI cellodling och hjälpa buffra mediet. För att dela vår erfarenhet, vill vi nämna att det inte finns någon 100% framgång. Vissa nasala skrapa biopsiprover inte hålla sig till vävnadsodlingsplatta, medan vissa NEC proverna inte kommer att ansluta sig till de insatser eller aldrig kommer att växa samman. Under årens lopp är vår övergripande framgång med användning av det protokoll som beskrivs här ungefär 80%. Vår erfarenhet visar att odling av NEC från definierade sjuka populationer, till exempel rökare, är mer utmanande än NEC från friska icke-rökare

Vår protokoll för odling av primära humana NEC innehåller flera viktiga steg som vi optimerade genom åren: 1. De NEC är bara expanderat två gånger innan de seedade på vävnadskulturinsatser. 2. Skären används obelagd. 3. När ympades på vävnadsodlingsplattor, är mängden av NuSerum stegvis minskas för att undvika att cellerna lyft bort från vävnadskulturplattor. 4. De NEC hålls minst 25-28 dagar på ALI innan du använder dem i experiment för att säkerställa fullständig re-differentiering. Sammanfattningsvis, det protokoll som beskrivs här innehåller ett optimerat protokoll för kultur och åter skilja mänskliga NEC vid ALI.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Lisa Dailey för hjälpingångarna.

Detta arbete har finansierats med bidrag från National Institutes of Health (ES013611 och HL095163), Flight Attendant Medical Research Institute (FAMRI) och Naturvårdsverket (CR83346301) och förklarar ingen intressekonflikt. Innehållet är ensamt ansvarig för författare och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter National Institutes of Health. Även den forskning som beskrivs i den här artikeln har finansierats delvis av US Environmental Protection Agency genom samarbetsavtal CR83346301 med Centrum för miljömedicin, Astma-och Lung biologi vid University of North Carolina-Chapel Hill, har det inte varit föremål för den byråns krävs inbördes och översyn av politiken och därför inte nödvändigtvis åsikterna hos myndigheten, och inget officiellt godkännande oavsiktliga. Nämn onamn f handel eller kommersiella produkter innebär inte stöds eller rekommenderas för användning. Loretta Müller stöds av Swiss National Science Foundation med ett personligt stipendium.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nasal speculum Welch Allyn Model 22009 9 mm, reusable polyproylene
Operating otoscope Welch Allyn Model 21700
Rhino probe cell cuvette Arlington Scientific SY-96-092 bend the head of the cuvette a little more
12-well culture plates Corning 3512
Transwell membrane cell culture inserts Corning 3460
Tissue culture flask Corning 430639 and 430641 T25 and T75 vented flask
RPMI 1640 media (with L-Glutamine) Gibco 11875
Bronchial/Tracheal Epithelial Cell Growth Medium Cell applications 511-500
BEGM Bronchial Epithelial Cell Growth Medium Lonza CC-3170 This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements.
Sodium Bicarbonate 7.5% solution Gibco 25080 Use as it is.
NuSerum BD Biosciences 355104 Use as it is.
BAMBANKER freezing media BAMBANKER 302-14681 Use as it is.
CoolCell Biocision HTBCS-136 (CryoPrep alcohol-free cell freezing container)
PureCol AdvancedBioMatrix 5005-B dilute 1:100 with sterile water (should be roughly 0.03 mg/ml)use 500 μl/well of a 12-well plate
HBSS with Ca2 and Mg2+ Gibco 14025
DNAse 1 Sigma DN25 Dissolve at 1.5 mg/ml, which is a 100x solution, add 10 μl to each ml of media
Trypsin, 0.25%, 1x, with phenol red Gibco 25200-056 Use at it is
Soy Bean Trypsin Inhibitor (SBTI) Sigma T6522 Use dissolved in HBSS at a concentration of 1 mg/ml
Retinoic acid Sigma R7632 Make it up 100 μM stock solution (see below), dilute to 10 μM with absolute alcohol, take 5 μl of this and add it to 1 ml BEGM media (our working solution).

All-trans Retinol has a coefficient of extinction of 52,480 in ethanol at 325 nm. Dissolve 25 mg in 50 ml absolute ethanol. Serial dilutions need to be made, dilute 50 ml of stock in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, and again take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute Ethanol, take 100 ml of this and dilute in 900 ml absolute ethanol and read in the spectrophotometer at 325 nm, this number is then multiplied by its’ dilution factor, then divided by the extinction coefficient of 52,480, this will give a number in mM. Make a 100 mM stock (store at -20 °C) and from this stock a 10 mM aliquot is made, the daily retinoic acid needed would be 5 ml of this 10 mM aliquot in 995 ml ALI media. Example: 325nm reading is 1.15. 1.15 x 10,000 (dilution factor) / 52,480 = 0.219 = 219 mM, make a 100 mM stock from this, in absolute ethanol.
DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine and sodium pyruvate Gibco 11995
Bovine Pituitary Extract Gibco 13028-014 Used for BEGM ALI media.
Nystatin Sigma N4014-50 mg Make up a solution of 3.3 mg/ml.
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1600-100 Make up a solution of 10 mg/ml solution in milliQ water.
PneumaCult-ALI media StemCell 5001 This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements. For details see below.
Hydrocortisone StemCell 7904 Dissolve 2.4 mg hydrocortisone in 1 ml ddH2O (used to make the 200x Hydrocortisone stock solution)
Heparin Sodium Salt in PBS (2 mg/ml) StemCell 7980 Use at it is.
Filter flasks (500 ml) Corning 431097 0.22 μm pore size
Filter tubes (50 ml) Millipore SCGP00525 Steriflip, 0.22 μm pore size
Pipette tips - ART Barrier Tips Molecular Bioproducts 2139RI, 2069RI, 2179RI
Conical tubes, sterile, 15 ml and 50 ml
ddH2O, absolute ethanol, ice
CO2 incubator
refrigerated centrifuge
biological safety cabinet
pipettes (p2, p200, p1000), 9 in glass pipettes
gloves
lab coat with tight cuffs
Media and solutions used: Recipe Used for
General remark: always warm the media to room temperature
BEGM media
  • 500 ml BEGM Cell Application media with one aliquot of retinoic acid
(mix them half-half and filter )
  • 500 ml BEGM Lonza media with one aliquot of single quot supplements
  • digestion of the biopsy
BEGM+ media
  • 50 ml BEGM media
  • maintaining cells on plastic in the plates (passage0)
  • 10 μl retinoic acid (working solution)
  • seeding cells in the flask (passage1; partially)
  • maintain the cells in the flask
BEGM++ media
  • 50 ml Lonza’s BEGM media with supplements
  • seeding fresh cells in 12-well plate on plastic
  • 1 ml Sodium BiCarb
  • maintaining cells in the plates on plastic (passage0; only partially)
  • 2.5 ml NuSerum
  • seeding cells in the flask (passage1; partially)
BEGM ALI media
  • 250 ml DMEM-H
  • Maintaining cells on the transwell before they go ALI
  • 250 ml BEGM including supplements
  • 2 ml Bovine Pituitary Extract (12.5 mg/ml solution)
  • 1 ml Nystatin (3.3 mg/ml solution)
  • 75 μl BSA (10 mg/ml solution)
200X Hydrocortisone Stock Solution (96 μl/ml solution)
  • 200 μl dissolved hydrocortisone
  • As a supplement to the PneumaCult-ALI Complete Base Medium for the last day in the flask and when cells are on inserts
  • 4250 μl dissolved sodium chloride
  • 540 μl ddH2O
  • 10 μl absolute ethanol
Filter solution through 0.22 μm filter, aliquot solution and store at -20 °C, avoid additional freeze/thaw cycles
PneumaCult-ALI Complete Base Media
  • 450 ml PneumaCult-ALI Basal Medium
  • Base medium for all three PneumaCult-ALI media
  • 50 ml PneumaCult 10x Supplement
  • The PneumaCult media is light sensitive, thus always keep it in the dark
(this is stable for 2 weeks at 2-8 °C or for up to 6 months at -20 °C)
PneumaCult-ALI Maintenance Medium Per 1 ml of PneumaCult-ALI Complete Base Medium add: ALI culture on inserts
  • 10 μl PneumaCult 100x Maintenance Supplement
  • 2 μl Heparin (of a 2 mg/ml stock solution)
  • 5 μl Hydrocortisone (of a 96 μl/ml stock solution)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Swamy, M., Jamora, C., Havran, W., Hayday, A. Epithelial decision makers: in search of the 'epimmunome. Nat. Immunol. 11, 656-665 (2010).
  2. Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. The airway epithelium: soldier in the fight against respiratory viruses. Clin. Microbiol Rev. 24, 210-229 (2011).
  3. Muller, L., Jaspers, I. Epithelial cells, the "switchboard" of respiratory immune defense responses: Effects of air pollutants. Swiss Med. Wkly. (2012).
  4. Sanders, C. J., Doherty, P. C., Thomas, P. G. Respiratory epithelial cells in innate immunity to influenza virus infection. Cell Tissue Res. 343, 13-21 (2011).
  5. Robertson, M. J. Role of chemokines in the biology of natural killer cells. J. Leukoc. Biol. 71, 173-183 (2002).
  6. Adachi, M., Matsukura, S., Tokunaga, H., Kokubu, F. Expression of cytokines on human bronchial epithelial cells induced by influenza virus. A. Int. Arch. Allergy Immunol. 113, 307-311 (1997).
  7. Borchers, M. T., Harris, N. L., Wesselkamper, S. C., Vitucci, M., Cosman, D. NKG2D ligands are expressed on stressed human airway epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 291, L222-L231 (2006).
  8. Groh, V., et al. Costimulation of CD8alphabeta T cells by NKG2D via engagement by MIC induced on virus-infected cells. Nat. Immunol. 2, 255-260 (2001).
  9. Obeidy, P., Sharland, A. F. NKG2D and its ligands. Int J. Biochem. Cell Biol. 41, 2364-2367 (2009).
  10. Horvath, K. M., Brighton, L. E., Zhang, W., Carson, J. L., Jaspers, I. Epithelial Cells From Smokers Modify Dendritic Cell Responses in the Context of Influenza Infection 1. Am. J. Resp. Cell. (2010).
  11. Muller, L., Brighton, L. E., Jaspers, I. Ozone exposed epithelial cells modify co-cultured natural killer cells. AJP Lung. (2013).
  12. Turi, J. L. Oxidative stress activates anion exchange protein 2 and AP-1 in airway epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, 791-798 (2002).
  13. Zimmermann, G. S., Neurohr, C., Villena-Hermoza, H., Hatz, R., Behr, J. Anti-inflammatory effects of antibacterials on human Bronchial epithelial cells. Respir. Res. 10, 89 (2009).
  14. Lopez-Souza, N., Avila, P. C., Widdicombe, J. H. Polarized cultures of human airway epithelium from nasal scrapings and bronchial brushings. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 39, (2003), 266-269 (2003).
  15. Gray, T. E., Guzman, K., Davis, C. W., Abdullah, L. H., Nettesheim, P. Mucociliary differentiation of serially passaged normal human tracheobronchial epithelial cells. Am. J. Respir. Cell Mo.l Biol. 14, 104-112 (1996).
  16. Adler, K. B., Schwarz, J. E., Whitcutt, M. J., Wu, R. A New Chamber System for Maintaining Differentiated Guinea-Pig Respiratory Epithelial-Cells between Air and Liquid-Phases. Biotechniques. 5, 462 (1987).
  17. Whitcutt, M. J., Adler, K. B., Wu, R. A biphasic chamber system for maintaining polarity of differentiation of cultured respiratory tract epithelial cells. In Vitro Cell. Dev. Biol. 24, 420-428 (1988).
  18. Jaspers, I. Reduced expression of IRF7 in nasal epithelial cells from smokers after infection with influenza. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 43, 368-375 (2010).
  19. Muller, L., Brighton, L. E., Jaspers, I. Ozone exposed epithelial cells modify cocultured natural killer cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 304, 332-341 (2013).
  20. Ochs, M., Weibel, E. R. Fishman's Pulmoary Diseases and Disorders. Fishmanetal, A. P., et al. 4, Mc Graw Hill. New York, NY. 23-69 (2008).
  21. Kesic, M. J., Meyer, M., Bauer, R., Jaspers, I. Exposure to Ozone Modulates Human Airway Protease/Antiprotease Balance Contributing to Increased Influenza A Infection. PLoS ONE. 7, e35108 (2012).
  22. Jaspers, I. Diesel exhaust enhances influenza virus infections in respiratory epithelial cells. Toxicol. Sci. 85, 990-1002 (2005).
  23. Jaspers, I., Flescher, E., Chen, L. C. Ozone-induced IL-8 expression and transcription factor binding in respiratory epithelial cells. Am. J. Physiol. 272, L504-L511 (1997).
  24. Blume, C., et al. Barrier responses of human bronchial epithelial cells to grass pollen exposure. Eur. Respir. J. (2012).
  25. Bauer, R. N. Influenza enhances caspase-1 in bronchial epithelial cells from asthmatic volunteers and is associated with pathogenesis. J. Allergy Clin. Immunol. 130, 958-967 (2012).
  26. Ostrowski, L. E., Stewart, D., Hazucha, M. Interferon gamma stimulates accumulation of gas phase nitric oxide in differentiated cultures of normal and cystic fibrosis airway epithelial cells. Lung. 190, 563-571 (2012).
  27. Jardim, M. J., Fry, R. C., Jaspers, I., Dailey, L., Diaz-Sanchez, D. Disruption of microRNA expression in human airway cells by diesel exhaust particles is linked to tumorigenesis-associated pathways. Environ. Health Perspect. 117, 1745-1751 (2009).
  28. Horvath, K. M., Brighton, L. E., Herbst, M., Noah, T. L., Jaspers, I. Live Attenuated Influenza Virus (LAIV) induces different mucosal T cell function in nonsmokers and smokers. Clin. Immunol. 142, 232-236 (2012).
  29. Horvath, K. M. Nasal lavage natural killer cell function is suppressed in smokers after live attenuated influenza virus. Respir. Res. 12, 102 (2011).
  30. Noah, T. L. Tobacco smoke exposure and altered nasal responses to live attenuated influenza virus. Environ. Health Perspect. 119, 78-83 (2011).

Comments

1 Comment

  1. Can you describe in more detail how the paraffin-embedding and sectioning is performed? We are experiencing technical issues with our attempts at H&E. The transwell membranes "curl" and cells are lost. Does the thickness of the sectioning matter (5 um)? Thank you for this great tutorial.

    Reply
    Posted by: Kathy S.
    February 22, 2016 - 12:22 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics