Microwell प्लेट का उपयोग कर आकार नियंत्रित ट्यूमर Spheroids की बड़ी संख्या का उत्पादन

Bioengineering
 

Summary

हम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध microwell प्लेट का उपयोग कर, समान आकार और संरचना के नियंत्रण वाले ट्यूमर spheroids की (हजारों की सैकड़ों करने के लिए हजारों) बड़ी संख्या की पीढ़ी के लिए एक प्रोटोकॉल परिचय.

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Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates. J. Vis. Exp. (81), e50665, doi:10.3791/50665 (2013).

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Abstract

ट्यूमर spheroids तेजी से तीन आयामों में ट्यूमर कोशिकाओं के व्यवहार के लिए एक महत्वपूर्ण में इन विट्रो मॉडल के रूप में पहचाने जाते हैं. अधिक physiologically प्रासंगिक पारंपरिक पक्षपाती पत्र संस्कृतियों से, वे और अधिक सही जटिलता और असली ट्यूमर में मौजूद बातचीत पुनरावृत्ति. बेहतर ट्यूमर जीव विज्ञान, या उपन्यास चिकित्सीय एजेंट की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए इस मॉडल का दोहन करने के लिए, यह एक नियंत्रित तरीके से और बड़ी संख्या में, reproducibly spheroids उत्पन्न करने में सक्षम होने के लिए आवश्यक है.

AggreWell प्रणाली एकल कक्षों के निलंबन centrifuged है जो में पिरामिड के आकार microwells की एक उच्च घनत्व सरणी के होते हैं. कोशिकाओं की संख्या प्रत्येक microwell के तल पर क्लस्टरिंग, और इसमें शामिल अलग प्रकार की कोशिकाओं की संख्या और अनुपात प्रयोगकर्ता द्वारा शुरू निलंबन के गुणों पर ही निर्भर करते हैं. इस प्रकार, हम साथ मनमाना आकार और संरचना का ट्यूमर spheroids उत्पन्न करने में सक्षम हैंअंतर्निहित प्रौद्योगिकी मंच को संशोधित करने की आवश्यकता होगी, बाहर. बदले में संस्कृति सतह क्षेत्र के प्रति वर्ग सेंटीमीटर microwells के सैकड़ों अत्यंत उच्च उत्पादन के स्तर को एक सरल, nonlabor गहन प्रक्रिया के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है कि यह सुनिश्चित करें. इसलिए हम इस प्रोटोकॉल ट्यूमर उपगोल क्षेत्र में शोधकर्ताओं के लिए मोटे तौर पर उपयोगी हो जाएगा उम्मीद है.

Introduction

ट्यूमर कोशिकाओं को एक अधिक physiologically प्रासंगिक प्रणाली 1 में परिवर्तित जब पारंपरिक ऊतक संस्कृति प्लेटफार्मों पर पहचान की चिकित्सीय एजेंट प्रभावकारिता खो सकते हैं कि वे जब प्लास्टिक पर संवर्धित कर की तुलना में तीन आयामी संस्कृतियों में अलग तरीके से व्यवहार, और कहा कि सबूत के एक बढ़ती शरीर है. यह दोनों अपनी अंतर्निहित जीव विज्ञान में अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए, इन परिस्थितियों में कैंसर कोशिकाओं के व्यवहार का अध्ययन करने के लिए, और भी क्लिनिक के लिए स्क्रीनिंग की सुविधा से नए चिकित्सीय एजेंट संक्रमण की सफलता की दर को बढ़ाने के लिए इसलिए भी जरूरी है. एक लंबा इतिहास के साथ एक उपयोगी मॉडल प्रणाली ट्यूमर spheroids 1,2 के रूप में जाना जाता कैंसर कोशिकाओं के तीन आयामी समूहों को रोजगार. आदर्श रूप में, अंडाकार आकृति गठन के लिए तकनीक जिसका आकार और संरचना प्रयोगकर्ता के द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं वर्दी spheroids की बड़ी संख्या के उत्पादन की अनुमति होगी. फांसी ड्रॉप और अच्छी तरह से थाली दृष्टिकोण जबकि 3,4 इन फिर से कुछ को पूरा करने में सक्षम हैंquirements, throughput आम तौर पर सीमित है, और spheroids की बड़ी संख्या की पीढ़ी एक श्रम प्रधान कार्य हो जाता है.

हमने हाल पुनर्योजी चिकित्सा क्षेत्र 5 में इसी तरह की चुनौतियों को हल करने के लिए एक प्रणाली विकसित की है. (चित्रा 1 देखें) घनी पैक माइक्रोन पैमाने कुओं की एक श्रृंखला के भीतर मजबूर एकत्रीकरण रोजगार, इस दृष्टिकोण अनेक प्रकार की कोशिकाओं 6 का मिश्रण है, साथ ही विभिन्न biomaterials 7 के समावेश सहित कोशिकाओं का मनमाना संख्या से spheroids पीढ़ी के परमिट. हजारों या अधिक के सैकड़ों के लिए हजारों - - spheroids बड़ी संख्या में गठन कर रहे हैं और तुरंत निकाले या वे दो (अप्रकाशित अवलोकन) सप्ताह के लिए कम से कम एक 8 के लिए मध्यम मुद्रा के साथ गठन किया गया जिसमें microwells में बनाए रखा जा सकता है. इस प्रणाली इसलिए अच्छी तरह से प्रभावी तरीके के आकलन के लिए वर्दी की बड़ी संख्या और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य ट्यूमर spheroids की पीढ़ी के लिए अनुकूल हैउपन्यास अर्बुदरोधी एजेंटों या बुनियादी जैविक जांच की ctiveness.

Protocol

नोट: microwell प्लेटें वांछित परिणाम के आधार पर, विभिन्न प्रारूपों में उपलब्ध हैं. विनिर्देशों के रूप में अच्छी तरह से प्रत्येक प्रारूप के साथ प्रयोग किया जाना चाहिए कि कोशिकाओं की न्यूनतम और अधिकतम संख्या के लिए अनुमानित दिशा निर्देशों तालिका 1 में दिखाया गया. छोटे microwells एक तेज मुद्दे पर शंकु, और spheroids के बीच परिवर्तनशीलता छोटे आकार में और अधिक महत्वपूर्ण हो जाता है, हालांकि इस तरह कोई कम आकार सीमा नहीं है. के रूप में छोटा रूप में 20 कोशिकाओं प्रत्येक के एक औसत से spheroids का नियमित उत्पादन सीधा 8 है. बड़ा microwell आकार पूरी तरह पतला नहीं है, इसलिए प्रत्येक microwell में कई छोटे spheroids में हो सकता है कोशिकाओं की कम संख्या से spheroids बनाने का प्रयास करती. AggreWell 400Ex प्लेटों का उपयोग करते समय होने के कारण सतह के गुणों में मतभेद मामूली, surfactant समाधान (1.2 चरण) के साथ तैयारी वैकल्पिक नहीं है.

इस प्रोटोकॉल AggreWell 400 प्लेटों के उपयोग पर आधारित है - अन्य प्रारूपों विपक्ष के लिएULT तालिका 1. प्रत्येक कुएं में लोड करने के लिए कक्षों की संख्या यह प्रत्येक अंडाकार आकृति के लिए क्लस्टर किया जा कोशिकाओं की संख्या से होता microwells की संख्या से गुणा करके निर्धारित किया जाता है. उदाहरण के लिए, प्रत्येक 1000 कोशिकाओं से spheroids उत्पन्न करने के लिए, प्रत्येक अच्छी तरह से (1200 spheroids बार 1000 कोशिकाओं को एक =) 1.2 x 10 6 कोशिकाओं के साथ लोड किया जाना चाहिए. सेल घनत्व कोशिकाओं 0.4 मिलीलीटर की एक मात्रा में लोड किया जाएगा कि दिए गणना की जानी चाहिए. तो 1000 कोशिकाओं को एक से गठित spheroids के उदाहरण के लिए, 0.4 मिलीलीटर में 1.2 एक्स 10 6 कोशिकाओं मिलीग्राम प्रति 3 x 10 6 कोशिकाओं की एक घनत्व के लिए अनुवाद.

1. कोशिकाओं प्राप्त करने के लिए तैयार कर रहा है microwells

  1. Microwell प्लेटों के रूप में प्रदान बाँझ हैं, और केवल इस तरह के एक लामिना का प्रवाह जैव सुरक्षा कैबिनेट के रूप में एक बाँझ वातावरण में उनकी पैकेजिंग से हटा दिया जाना चाहिए. बाँझपन प्रोटोकॉल भर में बनाए रखा जाना चाहिए. बाँझपन कुओं का उपयोग कर पानी में 70% इथेनॉल का उपयोग resterilized रहे हैं, समझौता हो जाना चाहिएवैकल्पिक चरणों का पालन.
    1. प्रत्येक अप्रयुक्त अच्छी तरह से करने के लिए 70% इथेनॉल के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें. कुछ microwells होगा जाल हवाई बुलबुले, यह एक पक्ष में तरल जोड़ने, और यह उससे भी सतह पर खड़ी इसे छोड़ने से, सतह भर में फैल करने की अनुमति देकर कम किया जा सकता है. ढक्कन बदलें.
    2. इथेनॉल वाष्प जल्दी से किसी भी बुलबुले तर करना चाहिए जबकि वहां बड़ी संख्या में हैं, यह उन्हें दूर करने के लिए वांछनीय हो सकता है. 2,000 x जी पर 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र. यह रोटर ठीक से इस गति से संतुलित है यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि ध्यान दें.
    3. एक कम बढ़ाई उलटा माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, सत्यापित बुलबुले microwells से हटा दिया गया है.
    4. कमरे के तापमान पर ढक्कन पर साथ 5 मिनट के लिए सेते हैं.
    5. महाप्राण इथेनॉल. प्लेट अब तत्काल उपयोग के लिए बाँझ पानी या पीबीएस के साथ धोया, या भंडारण के लिए हवा सूखे किया जा सकता है.
  2. कोशिकाओं microwell सतह के साथ बातचीत नहीं करते, यह सुनिश्चित करने के लिए, यह एक surfactant का उपयोग कर तैयार किया जा सकता है. सामान्य तौर पर यह हैबाद में शुरू में इस चरण को पूरा करने के लिए सलाह दी जाती है, और साथ और surfactant में लिपटे microwells बिना उत्पन्न spheroids की तुलना करें.
    1. प्रत्येक अच्छी तरह से Rinsing समाधान के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें. कुछ microwells होगा जाल हवाई बुलबुले, यह एक पक्ष में तरल जोड़ने, और यह उससे भी सतह पर खड़ी इसे छोड़ने से, सतह भर में फैल करने की अनुमति देकर कम किया जा सकता है. ढक्कन बदलें.
    2. बुलबुले को दूर करने के लिए 2,000 XG पर 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र. यह रोटर ठीक से इस गति से संतुलित है यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि ध्यान दें.
    3. एक कम बढ़ाई उलटा माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, सत्यापित बुलबुले microwells से हटा दिया गया है.
    4. कमरे के तापमान पर ढक्कन पर साथ कम से कम तीस मिनट के लिए सेते हैं, या रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर ठीक से बाहर सुखाने से रोकने के लिए सील अगर जरूरत तक प्लेट्स कुओं में surfactant समाधान के साथ चार डिग्री पर संग्रहित किया जा सकता है.
    5. बाँझ पानी या उपयोग करने के लिए पीबीएस तुरंत पहले साथ प्लेट धो लें. प्लेटों की अनुमति न देंकोटिंग के बाद बाहर सुखाने के लिए.

2. कोशिकाओं की तैयारी

नोट: सेल तैयारी का ब्यौरा विशेष सेल प्रकार का अध्ययन किया जा रहा है के साथ कुछ हद तक अलग अलग होंगे. हालांकि हम यहाँ पर चर्चा की लाइनों, साथ ही मानव और murine भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ईएससी), मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSC), fibroblasts, ख्यात आदिम अन्तर्जनस्तर सहित कोशिकाओं, का एक व्यापक रेंज के साथ प्रभावी होने के लिए इन शर्तों मनाया और stromal कोशिकाओं. अन्य समूहों mesenchymal स्टेम सेल 9 से उपास्थिजनन सहित आवेदन की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए सफलतापूर्वक इस प्रणाली कार्यरत है, pluripotent स्टेम सेल 10 से तंत्रिका व्यापारियों के मानकीकृत पीढ़ी, विषाक्तता hepatocytes 11 और सैलामैंडर 12 में रीढ़ की हड्डी के उत्थान के आकलन में विश्लेषण करती है. HT29 कोशिकाओं के साथ काम करने के लिए विशिष्ट प्रोटोकॉल यहाँ दिखाया गया है.

  1. DMEM में सुसंस्कृत HT29 कोशिकाओं की एक T75 फ्लास्क के साथ शुरू+ 10% FBS
  2. महाप्राण विकास कुप्पी से मध्यम, और trypsin के 3 मिलीलीटर जोड़ें.
  3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते
  4. मध्यम विकास के 3 मिलीलीटर जोड़कर trypsin पाचन बंद करो. सेल गिनती के लिए एक विभाज्य ले लो और एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में शेष हस्तांतरण.
  5. 200 x जी पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र.
  6. Centrifugation के कार्य प्रगति पर है, वहीं कोशिकाओं गिनती.
  7. महाप्राण trypsin / मध्यम मिश्रण और ऊपर की गणना के रूप में आवश्यक सेल घनत्व द्वारा निर्धारित ताजा मध्यम विकास, मात्रा के साथ बदलें.
  8. (वैकल्पिक) किसी भी झुरमुटों को दूर करने के क्रम में एक झरनी के माध्यम से सेल निलंबन गुजरती हैं. नोट: सेल कटाई शर्तों लाइनों के बीच कुछ हद तक अलग अलग होंगे. जैसे ब्याज की कोशिकाओं passaging के लिए एक हदबंदी प्रोटोकॉल उपलब्ध है, तो है कि एक शुरुआती बिंदु के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए. Trypsin के संवेदनशील सेल लाइनों का उपयोग के साथ अत्यधिक कोशिका मृत्यु में परिणाम हो सकता है. इन मामलों में हम एक वैकल्पिक dissociati रूप TrypLE का उपयोग कर अच्छे परिणाम देखा हैअभिकर्मक 8 पर. कोशिकाओं हदबंदी के दौरान clumped हो गई और व्यवहार्यता खो देते हैं, एंजाइम समाधान के लिए DNase के अलावा इस को हल कर सकते हैं. हदबंदी समय को कम करने और सेल clumps को तोड़ने के लिए एक विचूर्णन कदम को रोजगार भी व्यवहार्यता को बढ़ा सकते हैं.

3. उपगोल गठन

नोट: Spheroids हालांकि प्रारंभिक परीक्षणों कोशिकाओं मध्यम संरचना को बदलने के परिणामों से एक 3 आयामी संस्कृति प्रणाली में संक्रमण के परिणाम हैं भेद करने के लिए, सुसंस्कृत थे जिसमें माध्यम का उपयोग कर बाहर किया जाना चाहिए, मध्यम योगों की एक किस्म में उत्पन्न किया जा सकता है.

  1. प्रत्येक अच्छी तरह से मध्यम विकास की 0.4 मिलीलीटर जोड़ें.
  2. बुलबुले को दूर करने के लिए 2,000 XG पर 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र. यह रोटर ठीक से पूर्व centrifugation के लिए इस गति से संतुलित है यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि ध्यान दें.
  3. एक कम बढ़ाई उलटा माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, सत्यापित बुलबुले microwells से हटा दिया गया है.
  4. 0.4 मिलीलीटर जोड़ें(उपरोक्त गणना) की आवश्यकता घनत्व पर सेल निलंबन. धीरे microwells में हवाई बुलबुले शुरू करने के बिना, ऊपर और नीचे pipetting और से मिश्रण. यह कोशिकाओं को समान रूप से लगातार spheroids प्राप्त करने के लिए, अच्छी तरह से भर में वितरित कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है.
  5. 200 x जी पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र. थाली centrifugation के दौरान स्वयं स्तर नहीं करता है, संवहन धाराओं microwells भर में कोशिकाओं के असमान वितरण में परिणाम है कि उत्पन्न हो सकती है. वजन प्लेट वाहक के दोनों पक्षों को समान रूप से वितरित किया जाता है, ताकि इसलिए, प्लेट, अन्य थाली के खिलाफ है और साथ ही आंतरिक रूप से संतुलित किया जाना चाहिए.

नोट: असमान सेल वितरण का सबूत देखा जाता है, यह थाली वाहक पर धुरी अंक को स्नेहन की एक छोटी राशि लागू करने के लिए आवश्यक हो सकता है - निर्देशों के लिए अपकेंद्रित्र निर्माता के साथ परामर्श करें.

नोट: कोशिकाओं microwells में centrifuged किया गया है एक बार, वे काफी प्रतिरोध कर रहे हैंथाली की मामूली गतियों से बाहर धोने के लिए उग्रवादी. मध्यम के स्लोशिंग में परिणाम है कि अचानक आंदोलनों से बचा जाना चाहिए, लेकिन खुर्दबीन के लिए अपकेंद्रित्र से थाली या इनक्यूबेटर का स्थानांतरण महत्वपूर्ण सेल विस्थापन में परिणाम नहीं किया जाना चाहिए.

  1. एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, कोशिकाओं microwells भीतर क्लस्टर, और वे समान रूप से अच्छी तरह से भर में वितरित कर रहे हैं कि है कि सत्यापित.
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते
  3. एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, उपगोल गठन की प्रक्रिया का पालन. कुछ सेल लाइनों दूसरों में लंबा समय लग सकता है, 24 घंटे के भीतर कॉम्पैक्ट spheroids बनेगी. HT29 कोशिकाओं में कुल करने के लिए क्लस्टर से प्रगति चित्रा 2 में दिखाया गया है.
  4. Microwells से spheroids में स्वस्थ और धीरे से एक विंदुक के साथ उन्हें बाहर jetting द्वारा निलंबन संस्कृति को हस्तांतरण. वैकल्पिक रूप से, मध्यम प्रतिस्थापन 8 के साथ बगल में spheroids बनाए रखने - अवधि उनकी प्रारंभिक आकार और विकास दर पर निर्भर करता है, जो डेफवे का गठन किया गया जिसमें microwells विकसित हो जाना जब तक समय ine.
    1. एक पाश्चर पिपेट का उपयोग अच्छी तरह से किनारे पर spheroids, महाप्राण मध्यम खोने के बिना मध्यम बदलें. धीरे धीरे यह meniscus से तरल आकर्षित करने के लिए शुरू होता है जब तक नीचे टिप लाने, और यह बूंदों के रूप में meniscus नीचे का पालन करें. फिर उसी जगह में अच्छी तरह से दीवार के खिलाफ ताजा मध्यम जोड़ें. कुछ spheroids मध्यम हमेशा aspirated और एक ही स्थिति में बदल दिया जाता है फिर भी, यदि इस संख्या में अच्छी तरह से बड़ी संख्या की तुलना में छोटा ही रहेगा, हानि हो सकती है.

Representative Results

भिन्न संरचनात्मक मूल के कई ट्यूमर लाइनों से spheroids आसानी से उत्पन्न होती है और निलंबन संस्कृति में निकाला जा सकता है. 3 प्रत्येक शर्त के तहत अत्यधिक वर्दी अंडाकार आकृति आबादी के साथ इस पद्धति के माध्यम से प्राप्य अनुरूप आकार नियंत्रण, दिखाता है चित्रा. LNCaP प्रोस्टेट कैंसर की कोशिकाओं को अनियमित सीमाओं के साथ कम सुसंगत spheroids को जन्म दिया है, जबकि व्यवहार में स्पष्ट अंतर - लाइन मतभेद (संभावित कारणों से चर्चा देखते हैं, तेजी से परिभाषित सीमाओं के साथ घनी पैक spheroids बनाने HT29 पेट के कैंसर कोशिकाओं और TE6 ​​esophageal कैंसर कोशिकाओं के साथ, यह भी दिखाई दे रहे हैं ). अधिक सुसंगत समुच्चय में मजबूत आंतरिक बलों ने भी, जबकि अभी भी वे गठन किया गया जिसमें microwells में एक अधिक सममित फार्म, विशेष रूप से बड़े आकार में LNCaP समुच्चय, जाहिरा के वर्ग पिरामिड ज्यामिति को बनाए रखने, जबकि करने के ढहने के परिणामस्वरूप microwells. इनपुट सेल नंबर और मानसिक के बीच संबंध परिणामस्वरूप अंडाकार आकृति के राजनैतिक आकार चर की संख्या पर निर्भर करेगा. सेल प्रति मात्रा और नियोजित कोशिकाओं की संख्या के उत्पाद के आधार पर सैद्धांतिक संस्करणों में बारी के कारण एकल कक्ष निलंबन चरण के दौरान कोशिकाओं की कमी है, साथ ही जरूरत से ज्यादा छोटे समुच्चय से नुकसान शामिल हो सकते हैं जो सेल हानि, के द्वारा कम किया जा सकता है अपर्याप्त पड़ोसियों की संख्या, और कोर में सीमाओं और नेक्रोसिस के परिवहन की वजह से जरूरत से ज्यादा बड़े समुच्चय से. साइज भी एकत्रीकरण की प्रक्रिया के दौरान हो सकता है कि किसी भी प्रसार से प्रभावित हो जाएगा. इन मापदंडों सेल लाइन से सेल लाइन के लिए अलग अलग होंगे, विशिष्ट भौतिक आयामों की spheroids वांछित हैं अगर शुरू करने की कोशिकाओं की सही संख्या प्रयोगात्मक निर्धारित किया जाना चाहिए. कोशिकाओं की संख्या में एक 8 गुना वृद्धि अंडाकार आकृति व्यास का दोहरीकरण में परिणाम चाहिए जैसे - एक पहली सन्निकटन के रूप में, अंडाकार आकृति व्यास शामिल कोशिकाओं की संख्या का घनमूल साथ वृद्धि की संभावना है.

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चित्रा 1. अंडाकार आकृति उत्पादन के योजनाबद्ध. Microwell प्रणाली की कोशिकाओं centrifuged किया जा सकता है जो में कसकर बांध वर्ग पिरामिड microwells की एक सरणी (400 μ मीटर आकार के लिए 2 सेमी प्रति 625), के होते हैं. कोशिकाओं झुका हुआ sidewalls द्वारा एक साथ लाया जाता है, और जिसके परिणामस्वरूप अंडाकार आकृति का आकार कार्यरत सेल निलंबन का घनत्व अलग से नियंत्रित किया जाता है.

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चित्रा 2. Spheroids में क्लस्टर कोशिकाओं की सभा. Spheroids सात सौ HT29 कोशिकाओं को एक से गठन किया गया. तुरंत Centrifugation के बाद (एक), कोशिकाओं शिथिल प्रत्येक microwell के तल में clustered रहे हैं. समूहों समान रूप से इस मामले में निचले सही दिशा में भरपाई कर रहे हैं ध्यान दें. इस क्लस्टर आकार सरणी भर में लगातार बने हुए प्रदान की स्वीकार्य है. महत्वपूर्ण क्लस्टर आकार मतभेद दूसरे से सरणी के एक तरफ से देखा जाता है, तो 3.5 चरण में नोट देखें. 24 घंटा (बी) के लिए ऊष्मायन के बाद, कहनेवाला चिपकने वाला बलों समूहों तो निकाला जा सकता है जो सुसंगत spheroids, (सी) समग्र और फार्म के कारण होता है.

चित्रा 3 आर /> चित्रा 3. Microwell प्लेटों में उत्पन्न spheroids. Spheroids से गठन किया गया सात सौ (ए, सी, ई) या एक हजार पांच सौ (बी, डी, एफ) HT29 पेट के कैंसर की कोशिकाओं (ए, बी), LNCaP प्रोस्टेट कैंसर की कोशिकाओं (सी, डी) या TE6 esophageal कैंसर कोशिकाओं (ई, एफ). अधिक घनी पैक HT29 और TE6 ​​कोशिकाओं की तुलना में विशेष रूप से ढीला LNCaP समुच्चय - एक तैयारी भीतर spheroids की स्थिरता, और भी सेल लाइनों के बीच भिन्नता नोट. स्केल बार 200 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है.

Microwell प्रारूप
AggreWell 400 AggreWell 40EX AggreWell 800
Microwell चौड़ाई (al;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;">µm ) 400 400 800
2 सेमी प्रति microwells 625 625 156.25
अच्छी तरह से प्रति microwells 1,200 4,700 300
Microwell प्रति न्यूनतम कोशिकाओं * N / A N / A 2000
Microwell प्रति अधिकतम कोशिकाओं * 2,000 2,000 10,000
अच्छी तरह से प्रति न्यूनतम कोशिकाओं * N / A N / A 6 x 10 5
अच्छी तरह से प्रति अधिकतम कोशिकाओं * 2.4 x 10 6 9.4 x 10 6 3 एक्स 10 6
1.1.1 - 70% इथेनॉल मात्रा (एमएल) 0.5 2.0 0.5
1.2.1 - Rinsing समाधान मात्रा (एमएल) 0.5 2.0 0.5
3.2 - मध्यम प्रीलोड मात्रा (एमएल) 0.4 1.6 0.4
3.5 - सेल लोड हो रहा है मात्रा (एमएल) 0.4 1.6 0.4
इस मूल्य कार्यरत विशिष्ट कोशिकाओं के आकार के साथ अलग अलग होंगे, और अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए के रूप में * microwell प्रति कोशिकाओं की संख्या केवल एक सन्निकटन हैं

तालिका 1. AggreWell विकल्प और प्रोटोकॉल संशोधनों.

Discussion

हम वर्दी spheroids की बड़ी संख्या को विभिन्न स्रोतों से कई सेल लाइनों से उत्पन्न हो सकता है, जिसके तहत एक ऐसी प्रणाली की स्थापना की है. हम इन परिस्थितियों में spheroids फार्म नहीं करता है कि एक पक्षपाती सेल लाइन का सामना करने के लिए अभी तक है. हम पहले हालांकि तारीख को इस मुद्दे ट्यूमर लाइनों के साथ पैदा हुई नहीं है, anoikis 5,8 होने का खतरा आबादी में सेल नुकसान मनाया है. प्रणाली 24 अच्छी तरह से और 6 अच्छी तरह से प्रारूप है, साथ ही वर्तमान में विकास के तहत 50,000 microwells प्रत्येक युक्त प्रोटोटाइप बायोरिएक्टर में microwells भर में लगातार व्यवहार के साथ, सतह क्षेत्र के साथ मनमाने ढंग से स्केलेबल है.

विषमता एक चिंता का विषय हो उपगोल चाहिए, कदम 4.8 में ऊष्मायन समय दो या तीन दिनों के लिए बढ़ाया जा सकता है. Spheroids भी हालांकि इस मामले में ख्याल एक दूसरे वाई के साथ संपर्क में spheroids के रूप में पर्याप्त रूप से कम संस्कृति घनत्व रखने के लिए लिया जाना चाहिए, समरूपता बढ़ाने के लिए microwells से निकासी के बाद एक अवधि के लिए incubated किया जा सकता हैकरूँगा अक्सर व्यापक ढांचे में फ्यूज. इस कारण से, हम पहले से समुच्चय प्राथमिक सीमा अंडाकार आकृति का आकार होने के साथ गठन किया गया जिसमें microwells भीतर संस्कृतियों को बनाए रखा है. यह बदले में वृद्धि दर और प्रारंभिक आकार 8 दोनों का एक समारोह है, और microwell प्लेट के भीतर बढ़ाया संस्कृति की योजना बनाई है, तो यह पहले से विचार किया जाना चाहिए. अतिवृद्धि को रोकने के लिए विकल्प है, यह हो जाना चाहिए, छोटे spheroids की शुरुआत के साथ, या AggreWell 800 प्लेट का बड़ा microwells रोजगार या तो शामिल हैं.

Spheroids समय के साथ जुटना में वृद्धि करने में विफल चाहिए, एक संभावित कारण कोशिका मृत्यु हो सकती है. विशेष रूप से अत्यधिक metabolically सक्रिय कोशिकाओं का बड़ा समुच्चय में, ऑक्सीजन और आवश्यक पोषक तत्वों के वितरण पर जन परिवहन सीमाओं एक परिगलित कोर 2 में परिणाम कर सकते हैं - इस प्रकार एक गैर एकजुट उपगोल बस अत्यधिक कोशिका मृत्यु का एक परिणाम हो सकता है. वैकल्पिक रूप से, यांत्रिक cohe की मापspheroids के सायन एक दिया सेल लाइन 13 के metastatic क्षमता के संबंध में, कहनेवाला बंधन बलों का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. यह शायद इस तरह के क्षेत्र अनुपात को गोलाई और परिधि के रूप में morphometric मापदंडों का उपयोग, अंडाकार आकृति आकार और metastatic क्षमता के बीच संबंध की जांच करने के लिए दिलचस्प होगा.

Spheroids के यांत्रिक और morphometric संपत्तियों की जांच करने के अलावा, microwell प्रणाली में विधानसभा अनेक प्रकार की कोशिकाओं और / या biomaterials 6,7 के संयोजन से मिलकर मिश्रित रचना spheroids का बड़े पैमाने पर उत्पादन परमिट. अन्य प्रकार की कोशिकाओं के साथ ट्यूमर कोशिकाओं की बातचीत इस प्रकार यह उदाहरण के लिए, fibroblasts और endothelial कोशिकाओं के साथ संयोजन में ट्यूमर कोशिकाओं से spheroids उत्पन्न करने के लिए ब्याज की हो सकती है, और अधिक बारीकी से विवो 14 में ट्यूमर के व्यवहार मॉडल के लिए महत्वपूर्ण हैं. विभिन्न biomaterials के microparticles भी शामिल किया जा सकता है, और SPH प्रभावित कर सकते हैंसीधे कोशिकाओं 7,15, और भी उपगोल 16 के इंटीरियर में वृद्धि कारकों और साइटोकिन्स के नियंत्रित रिहाई के लिए जलाशयों के रूप में के साथ उनकी बातचीत के माध्यम से दोनों eroid गुण.

बाँझपन के बारे में कोई चिंता नहीं है, तो पिछले एक प्रयोग के हिस्से के रूप में एक मशीन में कुछ समय खर्च हो सकता है कि कुछ कुओं पहले से इस्तेमाल किया गया है, जिसमें एक microwell प्लेट, के साथ काम करते हैं, उदाहरण के लिए, कुओं 70% इथेनॉल के साथ resterilized किया जा सकता है पानी में.

Spheroids का गठन किया गया है, वे भी एक सेल छलनी पर निलंबन गुजर द्वारा अवशिष्ट अनिगमित कोशिकाओं से अलग किया जा सकता है. Spheroids बनाए रखा जाएगा, जबकि व्यक्ति की कोशिकाओं, के माध्यम से समाप्त हो जाएगी. उपगोल संस्कृति के पाठ्यक्रम पर संभावित metastatic कोशिकाओं बहा का संदेह है, तो यह इस प्रक्रिया को कई बार प्रदर्शन करने के लिए वांछनीय हो सकता है - शुरू में अनिगमित कोशिकाओं को दूर करने के लिए, और बाद में purifie अलग करने के लिएकोशिकाओं के विकास आबादी spheroids से उतर दिया.

Disclosures

डॉ. Ungrin एक आविष्कारक के रूप में AggreWell प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में एक वित्तीय हित है.

Acknowledgments

इस काम के डॉ. Ungrin के लिए एक नई अन्वेषक शुरू हुआ अनुदान के तहत, कैलगरी विश्वविद्यालय द्वारा वित्त पोषित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AggreWell 400 plate StemCell Technologies Inc. 27845/27945
Rinsing Solution StemCell Technologies Inc. 07010
Cell strainer (37 µm) StemCell Technologies Inc. 27215
PBS VWR / LONZA CA12001-676
Trypsin-Versene (EDTA) VWR / LONZA CA12001-660
DMEM VWR / LONZA CA12002-212
FBS VWR / LONZA CA-95042-112
TrypLE Invitrogen / Life Technologies 12605010
Inverted microscope VWR / Motic CA19000-610
Allegra X15R centrifuge with carriers for standard well plates VWR / Beckman CABKA99465, CABK369704, CABK392806
Laminar flow biosafety cabinet ESBE / Baker BKR-SG603AHEUVSP

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References

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