La inducción farmacológica de la melanina epidérmica y Protección contra las quemaduras solares en un modelo de ratón humanizado

Published 9/07/2013
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Medicine

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Summary

Melanina epidérmica es inducida por la aplicación tópica de forskolina en un modelo murino de lo humano-UV sensible de piel clara. La manipulación terapéutica de los niveles de AMPc en la piel y el oscurecimiento de la epidermis a proteger firmemente contra la inflamación mediado por UV (quemadura solar) según lo medido por la dosis eritematosa mínima (MED) de ensayo.

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Amaro-Ortiz, A., Vanover, J. C., Scott, T. L., D'Orazio, J. A. Pharmacologic Induction of Epidermal Melanin and Protection Against Sunburn in a Humanized Mouse Model. J. Vis. Exp. (79), e50670, doi:10.3791/50670 (2013).

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Abstract

La equidad de la piel, sensibilidad UV y riesgo de cáncer de piel en todo correlaciona con la función fisiológica del receptor de melanocortina 1, una proteína de señalización T s acoplado encuentra en la superficie de los melanocitos. Mc1r estimula la adenilciclasa y la producción de cAMP que, a su vez, hasta regula la producción melanocíticos de melanina en la piel. Con el fin de estudiar los mecanismos por los que la señalización Mc1r protege la piel frente a la lesión UV, este estudio se basa en un modelo de ratón con "piel humanizado", basada en la expresión epidérmica de factor de células madre (SCF). Ratones transgénicos K14-Scf conservan melanocitos en la epidermis y por lo tanto tienen la capacidad de depositar la melanina en la epidermis. En este modelo animal, de tipo salvaje resultados del estado Mc1r en la deposición sólida de pigmento eumelanina negro y un fenotipo con protección UV. En cambio, los animales K14-SCF defectuosa señalización Mc1r capacidad presentan una pigmentación rojo / rubio, muy poca eumelanina en la piel yun fenotipo sensible a UV. Razonando que la deposición de eumelanina que se podría mejorar por agentes tópicos que imitan la señalización Mc1r, encontramos que la aplicación directa de extracto de forscolina para la piel de ratones de piel clara Mc1r defectuosa como resultado robusto inducción eumelanina y la protección UV 1. A continuación se describe el método para la preparación y la aplicación de un extracto de la raíz natural que contiene forskolina a K14-Scf ratones de piel clara, y presentarán un método para medir la sensibilidad UV mediante la determinación de la dosis eritematosa mínima (MED). El uso de este modelo animal, es posible estudiar la forma en la inducción de AMPc epidérmica y melanización de la piel afectan a las respuestas fisiológicas a la exposición UV.

Introduction

La incidencia de melanoma, la forma más mortal de cáncer de piel, se ha incrementado dramáticamente en las últimas décadas en Estados Unidos, sobre todo entre las personas de piel clara. Evidencia molecular y epidemiológico fuerte implica la radiación UV como un importante factor ambiental causante 2-5. Aumento de la exposición UV en forma de exposición al sol y el uso de camas de bronceado es probable que sea responsable de gran parte de los aumentos en la incidencia de melanoma 6-7. Riesgo del melanoma parece especialmente vinculado con las quemaduras de sol 8, sobre todo los primeros años de vida 9-10. Riesgo de quemaduras de sol no sólo está ligada a la dosis y la intensidad de los rayos UV, sino también por factores hereditarios que influyen en la respuesta cutánea a la radiación UV. Pigmentación de la piel es uno de los determinantes más importantes de la sensibilidad UV, el riesgo de quemaduras solares y el riesgo de cáncer. El melanoma se presenta aproximadamente veinte veces más frecuente en personas de piel clara en comparación con la individualización de piel oscurals 11-13.

La melanina, un pigmento producido por los melanocitos en la epidermis, es el principal determinante de la tez de la piel. La melanina se presenta en dos variedades principales: (1) eumelanina, un pigmento de color marrón oscuro / negro eficaz en la absorción de la energía de la radiación UV, y (2) feomelanina, un color rojizo / pigmento rubia menos eficaz en la prevención de la penetración de los fotones UV en la piel. Color de la piel, sensibilidad UV y el riesgo de melanoma están determinados en gran medida por el contenido de eumelanina epidérmica 14-15. El más eumelanina en la epidermis, los menos fotones UV puede penetrar en la piel. Debido a los bajos niveles de la eumelanina innatas, las personas de piel clara son mucho más propensos a los efectos agudos y crónicos de la radiación UV 16-18.

Pigmentación de la piel, el riesgo de melanoma y la capacidad de "tan" después de la exposición UV todo se correlacionan con la capacidad de señalización de la melanocortina 1 del receptor (Mc1r), un G s acoplado y siete transmembrana sreceptor urface en melanocitos 19-22. Cuando Mc1r se une a su ligando cognado de alta afinidad, la hormona estimulante de melanocitos α-(α-MSH), hay una activación de la adenilato ciclasa y la producción del segundo mensajero AMPc 23. La respuesta fisiológica normal de la piel después de la exposición UV incluye la producción epidérmica de α-MSH por los queratinocitos 24-29. Nosotros y otros la hipótesis de que los queratinocitos derivados de α-MSH se une a Mc1r en melanocitos epidérmicos, iniciando la producción aguas abajo del segundo mensajero AMPc a través de la activación de la adenilato ciclasa 30. niveles de cAMP controlan muchos aspectos de la diferenciación de los melanocitos, incluidas las vías de supervivencia, la reparación del ADN y la síntesis del pigmento. De señalización Mc1r y AMPc inducen claramente los niveles de enzimas y la producción de pigmento eumelanina. Cuando la señalización Mc1r está intacto y los niveles de cAMP melanocíticos son robustos, la eumelanina se produce y la piel se oscurece. Sin embargo, si la señalización Mc1r es defectuoso yniveles de cAMP citoplasmáticos siguen siendo bajos, la feomelanina se produce en lugar de 1. Síntesis de eumelanina se puede estimular farmacológicamente por los agentes que elevan los niveles de cAMP 1,14,31-35.

Dado que la proteína Mc1r es un importante regulador de riesgo de melanoma en humanos 36-46, estamos interesados ​​en los mecanismos por los cuales Mc1r protege melanocitos contra la carcinogénesis inducida por UV. Como base para nuestros estudios, hemos generado un modelo murino Mc1r variante transgénica en una pura C57BL / 6 antecedentes genéticos 1. En este modelo, factor de células madre (SCF) se expresa constitutivamente en la epidermis basal y epidérmicas melanocitos interfollicular se retienen en la piel durante toda la vida 47, en contraste con los ratones no transgénicos en los que los melanocitos se localizan en la dermis en los folículos pilosos. Con el transgén K14-Scf incorporada, la epidermis se vuelve pigmenta con la característica de pigmentos de melanina en particular del pigmentocepa del animal 1. ratones K14-Scf en el fondo genético C57BL / 6 con el tipo salvaje señalización Mc1r tiene la piel de color negro azabache que se caracteriza por niveles muy altos de pigmento eumelanina. No es sorprendente que estos animales son altamente resistente a rayos UV. En contraste, genéticamente compatibles K14-Scf C57BL / 6 animales que albergan un mutante inactivo Mc1r casi no tienen eumelanina en la epidermis. En cambio, estos animales "extensión" (Mc1r e / e) tienen una tez de piel blanca causada por el depósito de pigmento feomelanina (Figura 1A) y son mucho más sensibles a la radiación UV-48-49.

Compuestos farmacológicos con propiedades químicas que permiten la penetración en la piel han demostrado inducir potentemente eumelanina en la extensión (Mc1r E / E) modelo animal K14 SCF por la manipulación directa de los niveles de cAMP en los melanocitos epidérmicos en la piel. La regulación positiva de melanina en este modelo ha sido reported por la activación de la adenilato ciclasa 1, así como la inhibición de la fosfodiesterasa 4 35. En este artículo, se demuestra la preparación y aplicación tópica de forskolina en extensión (Mc1r e / e) animales K14-Scf qué modelo de lo humano-UV sensible de piel clara. Se demuestra que la aplicación dos veces al día del medicamento promueve melanización acelerado, este oscurecimiento de la piel es debido a la deposición epidérmica de pigmento de melanina y que la melanina epidérmica inducida protege contra las quemaduras solares inducidas por UV a través de la medición de la "dosis mínima eritematosa" (MED) 48.

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Protocol

1. Preparación de forskolina para la administración tópica de un extracto de la raíz cruda de la planta Plectranthus barbatus (Cohleus forskohlii)

  1. Los protocolos para experimentos murinos siguen las pautas de conducta ética en el cuidado y uso de animales y fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales institucional y Uso de la Universidad de Kentucky (Protocolo # 00768M2004). El extracto de raíz se compone en peso 40% / volumen en una base dermatológica estándar de etanol al 70%, 30% de glicol de propileno.
  2. Pesar 200 g de extracto de raíz de forskolina crudo y transferirla a un vaso de precipitados. Para hacer 500 ml de un 40% (w / v) de solución, volver a suspender 200 g de extracto de raíz de forskolina crudo mediante la adición de la mayoría, pero no todo el volumen del vehículo (etanol 70%, 30% de glicol de propileno) y llevar la solución a aproximadamente 450 ml.
  3. Se agita durante una hora a temperatura ambiente. La solución será algo viscoso y puede requerir agitación manual para "levantar" el extracto en solución antes dela barra de agitación es capaz de tomar el relevo.
  4. Después de una hora de agitación, se vierte la mezcla en un cilindro graduado y llevar el volumen a 500 ml utilizando vehículo que ha sido utilizado para "enjuagar" el vaso de precipitados que se usó para agitar la suspensión (para maximizar la recuperación de forskolina del vaso de precipitados) .
  5. Transferir la suspensión a 50 ml de tubos de centrífuga de polipropileno. Se centrifuga (1.500 xg, la temperatura ambiente, 15 min), utilizando una centrífuga de mesa. En este punto, el material insoluble será bastante compactado, permitiendo que el sobrenadante sea fácilmente por vertido.
  6. Filtrar la solución a través de una membrana de acetato de celulosa de 0,22 micras para eliminar cualquier material insoluble residual a partir del extracto. Nosotros utilizamos un sistema de botella de la parte superior diseñada para el cultivo celular, junto con el uso de pre-filtros que vienen con la unidad para evitar la obstrucción prematura de la membrana a partir de componentes insolubles del extracto de la raíz. Al hacer grandes volúmenes de extracto, aproximadamente 100 ml de filtrado a la vez, el cambio de la apuesta pre-filtroween cada volumen añadido.
  7. Cuando se almacena a temperatura ambiente, el extracto mantiene la actividad biológica hasta para un máximo de un año.

2. Preparación de C57Bl / 6 K14-Scf Ratones para Tratamientos tópicos

  1. Retire la piel dorsal de los animales por cizallamiento eléctrica. Brevemente anestesiar a los animales con isoflurano inhalado para facilitar la esquila de la piel dorsal con cizallas eléctricas equipadas con un cabezal de preparación quirúrgica de 0,25 mm (Fisher Scientific). Preferentemente utilice sólo un tipo de anestesia (por ejemplo, la ketamina / xilazina) para minimizar el riesgo de una sobredosis de anestesia. La cámara de inhalación saturada lleva riesgos laborales cuando se utiliza fuera una campana de extracción y entrega cantidades desconocidas de anestesia a los animales. Lo ideal sería que un vaporizador de precisión se debe utilizar.
  2. Para quitar el rastrojo de pelo residual, tratar a los animales con un depilatorio químico. Administrar anestesia al animal con una inyección ip de ketamina 40 mg / kg de xilazina y 4 mg / kg Una vez que los animales son anestesiados adecuadamente (a juzgar por la pizca dedo del pie), aplique una cantidad del tamaño de la yema del dedo de la crema depilatoria a la piel dorsal cortado usando un dedo enguantado. Frote la crema sobre la piel durante 30 a 60 segundos o hasta que los pelos se pueden ver claramente en la crema, ya que se mueve alrededor. Deje la crema en sólo por la cantidad mínima de tiempo que se requiere para la depilación como la exposición prolongada conduce a quemaduras químicas en la piel, la ruptura de la epidermis y la muerte por la pérdida de la integridad de la epidermis.
  3. Limpie la piel dorsal con gasas empapadas de agua varias veces hasta que toda la crema se ha eliminado. Animales secos utilizando toallas de papel suave, y permitir que se recuperen en un lugar aislado en caliente (por ejemplo, jaulas limpias colocan en una almohadilla de calentamiento). Depilar los animales de uno en uno y vigilar de cerca durante todo el procedimiento.

3. La administración tópica de forskolina o de control del vehículo

  1. Los animales deben ser tratados uno a la vez. Brevemente anestesiar con inhalard isoflurano colocando el ratón encima de un nylon filtro permeable al aire en formularios provistos bajo el cual se ha colocado una toalla de papel isoflurano-saturada en un frasco de vidrio con tapa transparente isoflurano-saturada en una campana de humos. Exponer el ratón para isoflurano durante un tiempo suficiente como para suprimir los movimientos musculares voluntarios pero para preservar la respiración espontánea (típicamente 10-20 seg). Saliendo del animal en el isoflurano demasiado tiempo dará lugar a la supresión respiratoria y muerte. Es mejor errar en el lado de "ir la luz" y tener que volver a exponer el ratón brevemente para más isoflurano en lugar de a la sobre-exponer al animal a la muerte de drogas y el riesgo.
  2. Retire el animal de la cámara de isoflurano y colocar en un bloc banco absorbente limpio.
  3. Utilizando una micropipeta 1000 l equipado con una punta desechable de polipropileno, elaborar 400 l de extracto crudo forskolina 40% (animales de control de vehículos recibirán etanol al 70%, el 30% de propilenglicol solo).
  4. Transferir el extracto sobre lalomo del animal por goteo que sobre la piel y, a continuación, usando el lado de la punta de pipeta, manchar el extracto sobre la piel dorsal hasta que toda la piel ha sido cubierto. No hay necesidad de secar la piel después de la aplicación.
  5. Devuelva el ratón a su jaula, y observar con cuidado hasta que se recupere de la anestesia.
  6. Con el fin de que los efectos de cAMP no pigmentos no deben confundir a experimentos de sensibilidad UV, deje todos los tratamientos tópicos 2 días antes de la exposición UV (pigmento de efecto dura varios días más allá del último tratamiento tópico).

4. Piel de medición del color por Reflective Colorimetría

  1. Brevemente anestesiar al ratón con isoflurano inhalado (véase más arriba).
  2. Calibrar un colorímetro Minolta colocando la cabeza portátil en la superficie blanca estandarizada proporcionada con el colorímetro.
  3. Coloque el cabezal de medición portátil de la descarga colorímetro con la piel dorsal del animal asegurando que la apertur ronda 1 cm2e está completamente presionado sobre la piel. Tome al menos tres mediciones separadas en diferentes áreas de la piel dorsal.
  4. Calcula media L * Partitura ± SD por animal y por grupo de tratamiento. Colorimetría reflectante se puede hacer en cualquier punto en el experimento.

5. Determinación de la sensibilidad UV mediante el cálculo de "Mínimo eritematosa Dose" (MED)

  1. Utilice los animales que han sido pre-tratadas con vehículo o forskolina como se describió anteriormente. Anestesie animales con inyección intraperitoneal de una mezcla estándar de ketamina y xilazina (véase más arriba).
  2. Prepare un trozo de cinta-UV oclusiva para las pruebas de MED. Para generar agujeros en la cinta, utilice una perforadora de alta resistencia con un recorte circular de 1 cm 2 (Figuras 2A y B). Tener orificios de un tamaño definido y la disposición simétrica de la cinta facilita el reconocimiento de los cambios en la piel después de la irradiación. Sobre cada agujero en la cinta, aplique una pequeña pero fácilmente desmontable pieza de cinta que se puede quitar en momentos definidos durante la exposición UV para permitir la administración de diferentes dosis de UV.
  3. Una vez que el animal está sedado adecuadamente, coloque la cinta en la superficie dorsal. Lubricante de ojos siempre se debe utilizar bajo anestesia.
  4. Encienda la fuente de UV consiste en dos Westinghouse F15T8UV-B lámparas con una potencia máxima de 313 nm y un rango de 280-370 nm. Deje que la lámpara se equilibre a una salida de UV constante, medida por un fotómetro UV con un sensor de UVB (generalmente toma unos pocos minutos para las lámparas para calentar).
  5. Sobre la base de la tasa de transmisión de luz UV tal como se mide por el fotómetro UV, calcular el tiempo de exposición UV para cada dosis deseada. Por ejemplo, las medidas de producción de UVB de nuestra lámpara de 2,4 mW / cm 2. Por lo tanto, para administrar 5 kJ / m 2, tendría que ser expuesto a 208 seg (que es 3 min y 28 seg) de la radiación UVB, tal como se calcula por debajo de la piel:
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  6. Coloca los animales sedados (cada uno con cinta oclusiva en su lugar) ventral superficie hacia abajo para asegurar una visibilidad aún UV. Para administrar las dosis escogidas de la radiación UV, eliminar secuencialmente las pequeñas cintas oclusivos que cubren los agujeros para exponer 1 cm 2 zonas de la piel a las dosis correctas de la radiación. Por lo tanto, usando el ejemplo anterior, si 40 kJ / m 2 es la dosis más grande en el experimento, entonces el animal estaría bajo la lámpara durante 27 min y 47 seg total y la piel en la condición de 40 kJ / m 2 no tendría ningún cinta que recubre todo el tiempo. Sin embargo, la cinta que recubre la condición 5 kJ / m 2 sería eliminado cuando hay 208 seg restante en la exposición. Momento de la eliminación de la cinta se debe hacer de manera que cada condición termina simultáneamente.
  7. Después de la exposición UV, despegue la cinta adhesiva de la piel dorsal con cuidado, con cuidado de no rasgar la piel con movimientos bruscos o excesivamente contundentes. Coloque los animales en un lugar cálido tranquilo para permitirrecuperación de la anestesia.
  8. Monitorear ratones durante 24-48 h para buscar áreas discretas de eritema (enrojecimiento) o edema (hinchazón) que corresponde a los sitios anatómicos expuestos a la dosis específica de radiación UV. Documentar los hallazgos cutáneos fotográficamente.
  9. Valor MED corresponde a la dosis mínima de rayos UV que causa la inflamación tal como se define por eritema y / o edema de todo el círculo de la piel expuesta. Tenga en cuenta que la pigmentación de la piel puede impugnar la determinación del MED, sin embargo, eritema y edema todavía pueden generalmente ser evaluados con precisión, gracias en parte a la forma definida de las aberturas en la cinta durante la exposición UV.

6. Análisis estadístico

Analizar los datos entre las cohortes de ratones mediante ANOVA de una vía con post test de Bonferroni (Graph Pad PRISM). Valores de p <0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

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Representative Results

C57BL / 6 ratones fueron generados sobre fondos eumelanotic, pheomelanotic o amelanóticos que incorporan el transgén K14 SCF tal como se describe (Figura 1A). Cohortes de extensión de piel clara (Mc1r E / E, + / + Tyr) los ratones se trataron tópicamente con dosis dos veces al día de vehículo (etanol 70%, 30% de glicol de propileno) o 40% de extracto de raíz de Coleus forskohlii crudo (80 micras por dosis) durante 5 días (Figura 2 B). Efectos de los tratamientos tópicos sobre la pigmentación epidérmica se determinaron tanto por inspección visual y por colorimetría de reflexión (Figura 1B). Aplicación del extracto de la raíz se asoció con robusta oscurecimiento de la epidermis en el fondo transgénico K14 SCF pero no en los animales no transgénicos que coincide genéticamente. Interpretamos estos resultados para indicar que los melanocitos epidérmicos interfoliculares deben estar presentes para que la melanina inducida farmacológicamente-que se deposita en la unidad epideIGR. Aunque el extracto de la raíz está profundamente coloreado debido a la presencia de fitoquímicos vegetales además de forskolina, oscurecimiento de la piel no puede ser únicamente debido a un efecto de teñido de la droga, como animales no transgénicos fracasan para exhibir oscurecimiento con el extracto de la raíz (Figura 1B) de la piel. Cuando se aplica de una manera dos veces al día, los efectos de forskolina aplicado tópicamente melanizing Podrá hacerlo en tan sólo 2 días, aunque el oscurecimiento máximo se dio cuenta después de varios días más (Figura 1C). Grado de melanización es dependiente de la dosis, como se muestra por tinción de melanina Fontana-Masson de las secciones de piel dorsal tratados con diferentes concentraciones del fármaco (Figura 1D).

A continuación, el efecto de la forskolina de aplicación tópica sobre la sensibilidad a los rayos UV se determinó mediante la prueba de MED en ratones de extensión (Mc1r E / E, Tyr + / +) como se describe anteriormente (Figuras 2 A y B). Determinación MED se comparó entre los animales tratados con un tratamiento farmacológico acelerada (dos veces al día la administración durante 5 días, 10 dosis en total) frente a un enfoque estándar (la administración una vez al día durante 15 días, 15 dosis en total). Los ratones no transgénicos fueron incluidos para controlar los efectos de la droga no melanina. Ambos tratamientos produjeron cantidades similares de oscurecimiento de la piel en los animales K14-Scf forskolina tratados. En concreto, los valores de L * (colorimetría reflexivo escala blanco-negro) para los animales forskolina expuesta fueron 31,9 ± 1,8 y 31,1 ± 1,6 para la aplicación acelerada vs aplicación estándar, respectivamente. No se observaron efectos tóxicos obvios de la exposición forskolina en cualquier grupo de tratamiento, por lo tanto, llegamos a la conclusión de que la administración forskolina acelerado (dos veces al día durante 10 dosis en total, 80 M por dosis) promovió melanization seguro de la piel dorsal tan eficazmente como la utilizada previamente (una vez al día durante 15 dosis en total, 80 mM por dosis).

Inducida por forskolina-epidérmica melanization resultó enprofunda protección UV a juzgar por MED (Figuras 2C-D). Así, mientras que significa MED para los ratones de extensión K14-Scf tratadas por dos veces durante 5 días con vehículo fue de 5,0 ± 0,0 kJ / m 2, MED promedio para las cohortes tratadas con forskolina tópico fue> 30,0 ± 0,0 kJ / m 2 (Figuras 2 A y C). De hecho, una dosis de 30,0 kJ / m 2 fue insuficiente para generar eritema en este experimento. El uso de dosis forskolina estándar (una vez al día durante 15 dosis en total, 80 M por dosis), encontramos que el MED promedio para los ratones de extensión K14-Scf tratadas con forskolina fue 50,0 ± 7,1 kJ / m 2 (Figura 2 B, D). Es importante destacar que, el tratamiento previo forskolina no afectó MED de animales incapaces de melanización, ya sea debido a la falta de melanocitos epidérmicos mediadas-K14-SCF (figuras 2C, D) o debido a la deficiencia de la tirosinasa (Figura 2E). Dado que las aplicaciones forskolina fueron dadosContinuamos 2 días antes de la exposición UV y no se continuaron después de la exposición UV, llegamos a la conclusión de que los efectos de cAMP no pigmentarias no jugaron un papel en los resultados de MED. Más bien, los datos sugieren que la melanización epidérmica fue el mecanismo por el cual inducida por forskolina protección UV en este modelo.

Figura 1
Figura 1. Tratamiento tópico de forskolina promueve oscurecimiento de la piel en la extensión de piel clara (Mc1r e / e) ratones. (A) Las fotografías de C57BL / 6 animales utilizados en este estudio. Los animales son genéticamente compatibles excepto en la melanocortina 1 receptor (Mc1r) y tirosinasa (Tyr) loci. Tenga en cuenta que la pigmentación es eumelanotic (negro) cuando Mc1r es funcional pero pheomelanotic (rubio) cuando Mc1r es defectuoso, como es el caso con laextensión (Mc1r e / e) mutante. Pigmentación epidérmica depende de la retención de los melanocitos epidérmicos interfoliculares en la piel por el transgén K14-Scf, y se puede ver fácilmente en los oídos. (B) Las fotografías de extensión (Mc1r e / e) K14-Scf o animales no transgénicos tratados con 400 l de control del vehículo (70% de etanol 30% de glicol propil) o 40% w / v (80 M) forskolina aplican dos veces al día a la piel dorsal afeitada durante 5 días, total de 10 aplicaciones. Mediciones de color de la piel por colorimetría de reflexión se realizaron para cada grupo. Resultados de colorimetría reflectantes son reportados como unidades de media (± DE) de reflectometría en el eje L * color (blanco-negro). Tenga en cuenta que la administración tópica de la piel causada forskolina robusta oscurecimiento en K14-Scf animales transgénicos, pero no en ratones no transgénicos. (C) Tiempo supuesto experimento mostrando oscurecimiento de la oreja forskolina tratados de K14-Scfratones de extensión para los tiempos indicados (oídos forskolina tratados están indicados por los triángulos azules). Vehículo se aplicó a la oreja derecha para la comparación. Fontana-Masson secciones de piel teñidas tomadas de animales tratados con las dosis indicadas de forskolina como se describe. (D) Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Figura 2
Figura 2. Melanización inducida por forskolina protege contra la inflamación mediado por UV como se determina por la dosis mínima eritematosa (MED) de pruebas. (A, B) Posición de cinta oclusiva UV y UVB dosis de los animales tratados dos veces al día durante 5 días (A, C) o una vez al día durante 15 días (B, D, E), ya sea con vehículo o forskolina. Th e último tratamiento tópico se aplicó 48 horas antes de la irradiación. Piel dorsal se expuso a varias dosis de UVB mediante el uso de cinta de UV-oclusiva con sacabocados 1 cm 2 aberturas circulares, y diferentes tiempos de exposición para producir la dosis apropiada. Después de la irradiación, los círculos de la piel expuesta se marcaron con un lápiz en algunos experimentos. MED del, definido por el eritema y / o edema de todo el círculo de la piel expuesta a una dosis particular, se determinaron 48 horas después de la exposición. El MED ± SD resultados son reportados como kJ / m 2 UVB, * p ≤ 0,001. (E) reflectometría Color de la piel y los valores MED para K14-Scf ratones extensión albino-tirosina deficientes tratados durante 10 días con vehículo o forskolina. Click aquí para ver más grande la figura .

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Figura 3. Esquema general del experimento. Cohortes de extensión (Mc1r E / E) K14 SCF o animales no transgénicos se prepararon mediante la eliminación de la piel dorsal por cizallamiento eléctrica y / o depilación química. Los animales se trataron entonces con las aplicaciones tópicas de vehículo (etanol 70%, 30% de glicol de propileno) o con extracto de forscolina en bruto 40% en los programas de dosificación indicados. Efectos sobre la pigmentación de la piel se documentaron fotográficamente, colorimetría y mediante tinción melanina Fontana-Masson. Sensibilidad UV se determinó mediante la dosis eritematosa mínima (MED) de pruebas.

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Discussion

Usando un modelo animal de la humana de piel clara, nos encontramos con que la aplicación tópica de un extracto de la raíz cruda forskolina ricos oscurece robustamente la epidermis estimulando la producción de melanina en la piel. Melanización epidérmico es dependiente de la expresión de factor de células madre en la epidermis basal, como ocurre en la piel humana pero no en la piel sin modificar genéticamente-ratón. La piel dorsal de los ratones genéticamente-no modificada carece de un número suficiente de melanocitos interfollicular pigmento para impartir a la piel. Sólo en el ajuste de la expresión constitutiva de un factor de crecimiento de los melanocitos tal como el factor de células madre (ligando kit) o factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) pueden ser retenidos en los melanocitos de la capa basal de la epidermis durante toda la vida del animal 50-51. Nuestro modelo animal de la humana de piel clara se basa en la incorporación del transgén K14-Scf en la variante de pigmento extensión de la línea murina C57BL / 6. Aunque los animales de cualquier edad pueden serutilizado, nuestros experimentos implican típicamente ratones adultos jóvenes (4-12 semanas de edad). A causa de un tronco de melanocortina 1 receptor (Mc1r) que conduce a la pérdida de la señalización cAMP, los ratones de extensión expresan feomelanina preferentemente en el pelaje y la piel (en los estados transgénicos K14-Scf o HGF-Met) en lugar de eumelanina 52-54. Como un resultado de la expresión alterada de melanina, los ratones de extensión K14-Scf son mucho más sensibles a los rayos UV que sus homólogos de tipo salvaje-MC1R, que tienen la piel de chorro de negro debido a la abundante deposición de eumelanina pigmento epidérmica 1. Estamos motivado que desde la producción de eumelanina disminuye en gran medida en el establecimiento de un Mc1r mutante, que los estimulantes farmacológicos que imitan la señalización Mc1r podrían rescatar la producción de eumelanina. Mc1r es un receptor G transmembrana s acoplado a que, tras la unión de su ligando de alta afinidad α-hormona estimulante de melanocitos (α-MSH), transmite señales a favor de la diferenciación a la melanocitoplasma cyte través de la activación adenilciclasa y la producción del segundo mensajero AMPc. Por lo tanto, la hipótesis de que la aplicación tópica de forskolina, un diterpenoide permeable a las células que es un activador potente directo de la adenilil ciclasa, podría ser capaz de promover la producción de eumelanina en el, estado pheomelanotic-Mc1r defectuoso.

Uso de forskolina purificada para estos estudios, sin embargo, resultó un costo prohibitivo. Los primeros experimentos que determinan la cantidad mínima de forskolina requerido para el oscurecimiento de la epidermis en el modelo de extensión K14-Scf sugirieron que el oscurecimiento máxima se produjo con el uso de un peso 40% por volumen de solución utilizando extracto crudo que contenía 20% (peso por peso) de forskolina. Calculamos que la aplicación de 400 l de forskolina final de un 8% (peso por volumen; 40% x 20%) solución daría lugar a la entrega de aproximadamente 80 M de forscolina para la piel dorsal de cada aplicación. Por supuesto, gran parte de la dosis administradano se absorbe por la piel, en lugar de ser absorbido por la piel que rodea o se caiga del animal en el momento de la aplicación. Por lo tanto, es difícil de reportar la dosis exacta dado cuenta de que los animales reciben con cada aplicación de la droga. Sin embargo, cuando se aplica de esta manera, los resultados de forskolina en la inducción robusta de enzimas de pigmento en la piel y la producción de eumelanina. De hecho, K14-Scf animales de extensión transgénicos demostraron clara oscurecimiento de la piel después de la segunda aplicación (Figura 1C).

Aunque hemos publicado anteriormente oscureciendo con la aplicación diaria de la droga 1,48-49 piel, aquí se muestra que la aplicación dos veces al día se asoció con una robusta oscurecimiento de la epidermis y la protección UV significativa, lo que sugiere que la melanización-inducida farmacológico puede ser optimizado mediante la administración de la drogas con más frecuencia que una vez al día. Oscurecimiento de la piel, lo cual es debido a la inducción de eumelanina en la epidermis, tiene una duración de tanMientras se continúan los tratamientos tópicos forskolina. Incluso la aplicación crónica (a través de tres meses) parecía bien tolerados por los ratones 49. El aumento de oscurecimiento de la piel se debe a la síntesis de melanina en lugar de la proliferación de melanocitos en la epidermis. 49. Una vez que los tratamientos tópicos son descontinuados, la piel se desvanece poco a poco volver a su tez clara línea de base (más de 2-3 semanas), como la melanina de la epidermis se pierde con la renovación normal de los queratinocitos. El oscurecimiento de la piel se puede determinar fácilmente por la simple inspección visual de los ratones, sin embargo color de la piel se puede cuantificar objetivamente utilizando la colorimetría de reflexión 55-56. Este método es un método rápido e indoloro no invasivo para medir el color de la piel. El color puede ser descrito con precisión utilizando el sistema L * a * b * (LAB) de color modelo de espacio de 57 a 58.

Para estos experimentos nos basamos en un extracto de la raíz cruda de la planta forskolii coleo, la fuente natural de forskolina. Esta preparaciónse utilizó debido a la alta coste de realización de estos experimentos con forskolina purificado. Este experimento, por ejemplo, requiere más o menos 2 g del total de forscolina para la aplicación dos veces al día a seis animales durante cinco días. 2 g de la venta en tiendas forskolina purificado por HPLC costaría más de $ 20.000, en comparación con menos de $ 5 para el extracto crudo. Aunque forskolina purificado indujo melanina epidérmica en nuestro modelo animal 1, no podemos descartar posibles efectos de otros compuestos derivados de plantas en el extracto de raíz cruda incluyendo alcaloides, fenoles y taninos. De hecho, el trabajo previo utilizando cobayas o explantes de piel humana sugiere que los compuestos en el extracto de raíz de crudo pueden favorecer la absorción cutánea de forskolina 59. Hasta el momento, sin embargo, la identidad y el mecanismo de estos compuestos siguen siendo desconocidos. Por lo tanto, no podemos descartar efectos de otros compuestos presentes de forma natural en el extracto de raíz de la modificación de crudo.

La mezcla de forskolina compuesto esun líquido de color marrón oscuro con un atractivo aroma de especias como el que se aplica fácilmente sobre la piel para la aplicación tópica. Debido a que se han eliminado los materiales insolubles, la aplicación diaria no deja ninguna formación de costras o depósitos una vez absorbida por la piel. A pesar de la extracto de raíz de crudo es de color marrón oscuro cuando preparado de esta manera, oscurecimiento en la piel inducido por la droga no es simplemente un efecto colorante, tal como se demuestra por el hecho de que la aplicación tópica del compuesto en animales incapaces de melanización la piel (por ejemplo, Mc1r e / e tirosinasa animales albinos deficientes o no ratones transgénicos que carecen de melanocitos epidérmicos) no tuvieron efecto sobre el oscurecimiento (Figuras 1B y 2E) de la piel. Consideramos que estos experimentos como prueba-de-concepto demostraciones de que la manipulación de cAMP en la piel puede inducir pigmentación de la piel oscura con protección UV. Sin embargo, es poco probable que la administración tópica de forskolina es una opción terapéutica viable o práctico debido a la naturaleza no específica de la droga. Yopodría esperarse ndiscriminate y la activación no específica de adenylyl ciclasas y la inducción de cAMP para causar toxicidades inaceptables. Es importante destacar que, otros han demostrado que la administración tópica de un inhibidor de la fosfodiesterasa 4 (rolipram), potentemente hasta reguladas melanina en el modelo animal de extensión K14 SCF, lo que demuestra que la inducción de AMPc cutánea y melanización pueden ser alcanzados por farmacológica alternativa focalización 35. Es evidente que antes de la manipulación tópica de los niveles de cAMP en la piel podría ser traducido para el uso humano, la seguridad tendrá que ser evaluado cuidadosamente. Sin embargo, nuestros datos sugieren fuertemente que la melanización farmacológicamente inducida por UV es-protector como se determina por la dosis mínima eritematosa (MED) de pruebas.

En resumen, la administración tópica de forskolina, un activador de la adenilato ciclasa, resultó en una fuerte melanización de la epidermis de un modelo murino de la humana de piel clara basado en AMPc defectuoso de señalización hacia abajocorriente de un defecto de la melanocortina 1 receptor (Mc1r). Melanización epidérmico era de protección UV, tal como se mide por la dosis mínima eritematosa (MED) de pruebas. Nuestra hipótesis es que la manipulación farmacológica de cAMP puede no sólo el rescate de protección UV eumelanization de la epidermis, pero otras respuestas con protección UV Mc1r dependientes también.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgements

Los autores desean agradecer a Malinda Spry para la asistencia técnica. También reconocemos las fuentes de financiación actuales y pasados: el Instituto Nacional del Cáncer (R01 CA131075, R01 CA131075-02S1), el Fondo de Investigación Wendy Will Caso del Cáncer, la Fundación de Cáncer de Markey, Red del Milagro de los Niños y la Jennifer y David Melanoma Research Foundation Dickens.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Coleus Forskoli extract 20% Buckton Scott USA Inc. n/a Princeton, NJ
Isothesia, Isoflurane , USP Butler Schein NCD 11695-6776-1 Dublin, OH, USA
Xylazine Anased Injection LA04612 Shenandoah, Iowa, USA
Ketamine HCl, USP Putney NDC 26637-411-01 St. Joseph, MO, USA
Ethanol Decon Labs. 2705
Propylene glycol Adesco 05751L Solon, OH, USA
Depilatory cream, Nair Church Dwight JF-11 4381322 Priceton, NJ
EQUIPMENT
Germicidal Hg Lamp UV-B Westinghouse F15T8UV-B
Radiometer photometer International light 1LT400A Peabody, MA,USA
Chromameter Konica Minolta CR-400 Ramsey, NJ, USA
Data Processor for Chromameter CR-400 Konica Monilta DR-400 Ramsey, NJ, USA

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