Microfabricação de Padrões de Ouro Nanoporosos para celular-primas estudos de interacção

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Bioengineering

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Summary

Nós relatamos em técnicas para micropattern nanoporous filmes finos de ouro através de impressão stencil e fotolitografia, bem como métodos para cultura de células sobre os padrões microfabricados. Além disso, descrevemos métodos de análise de imagem para caracterizar a morfologia do material e as células cultivadas utilizando electrónica de varrimento e técnicas de microscopia de fluorescência.

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Daggumati, P., Kurtulus, O., Chapman, C. A. R., Dimlioglu, D., Seker, E. Microfabrication of Nanoporous Gold Patterns for Cell-material Interaction Studies. J. Vis. Exp. (77), e50678, doi:10.3791/50678 (2013).

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Abstract

Materiais nanoestruturados com tamanhos recurso em dezenas de nanômetros têm melhorado o desempenho de várias tecnologias, incluindo as células de combustível, biossensores, revestimentos de dispositivos biomédicos, e ferramentas de administração de medicamentos. Ouro nanoporos (np-Au), produzido por um processo de auto-montagem nano-escala, é um material relativamente novo que apresenta grande área de superfície eficaz, de alta condutividade elétrica, e atividade catalítica. Estas propriedades tornaram-np Au um material atraente para a comunidade científica. A maioria dos estudos sobre a np-Au utilizar espécimes macro-escala e foco em ciência fundamental da suas aplicações catalíticas e sensor de materiais. Os espécimes macro-escala limitar o potencial de np-Au em sistemas miniaturizados, incluindo dispositivos biomédicos. A fim de abordar estas questões, inicialmente descrever dois métodos diferentes para micropattern np-Au filmes finos sobre substratos rígidos. O primeiro método utiliza máscaras de estêncil manualmente produzidos para a criação de milímetro escala padrões np-Au, while o segundo método usa lift-off fotolitografia para padrões sub-milímetro escala padrão. À medida que os filmes finos de NP-Au são obtidos por um processo de deposição por borrifamento, eles são compatíveis com as técnicas convencionais de microfabricação, assim passíveis de integração fácil em microssistemas. Estes sistemas incluem plataformas biossensor eletricamente endereçáveis ​​que beneficiam de área de alto eficaz superfície, condutividade elétrica, e bioconjugation superfície tiol à base de ouro. Descrevemos de cultura de células, a imunocoloração, e as técnicas de processamento de imagem para quantificar a interacção do np-Au com células de mamíferos, o que é um parâmetro de desempenho importante para algumas biossensores. Esperamos que as técnicas ilustradas aqui vai facilitar a integração das np-Au em plataformas em várias escalas de comprimento e em inúmeras aplicações, incluindo biossensores, sistemas de armazenamento de energia, e catalisadores.

Introduction

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Protocol

1. Nanoporous Fabrication Ouro

  1. Substratos limpos em solução Piranha
    1. Adicionar 25 ml de peróxido de hidrogénio (30%) a 100 ml de ácido sulfúrico (96%) em um prato de cristalização e aquecer a mistura a 65 ° C numa placa de aquecimento. AVISO: Os líquidos são extremamente corrosivo e deve ser manuseado com cuidado. A solução passou não deve ser armazenado num recipiente fechado, como pode explodir.
    2. Coloque 1 polegada por lâminas de microscópio de 3 polegadas na mistura usando uma pinça anti-ácido e limpá-los por 10 min. Use um barco immunostaining porcelana para lote limpeza pequenas lamelas. Tratar com pequenas lamelas de plasma de ar de 10 W durante 30 segundos antes da imersão na solução.
    3. Lavar as amostras limpas em pratos de cristalização sob água corrente deionizada (DI) por 3 min. Amostras secar com uma arma de nitrogênio mais sem fiapos toalhas.
  2. Prepare máscara stencil (Método 1: Use este para a criação de padrões milímetros escala)
    1. Perfurador 250 folhas de elastômero de silicone m de espessura com biópsia socos e / ou fora inciso regiões com um bisturi sobre uma superfície de plástico semi-rígido. Limpe as folhas de elastômero processados ​​em 70% isopropanol e seco com arma de nitrogênio.
    2. Coloque a folha de soco em uma toalha que não solte fiapos sala limpa e alinhar as lamelas piranha-limpos sobre o estêncil com a superfície da amostra de frente para o stencil.
  3. Padrão lift-off photoresist (Método 2: Usar isso para a criação de padrões sub-milímetro escala)
    1. Coloque uma piranha-limpa lâmina de microscópio girando chuck e explodir a qualquer partículas com arma de nitrogênio. Pipetar 1,5 ml de promotor de aderência (hexametildisilazano) sobre a lâmina de vidro usando uma pipeta de plástico. Espalhar o promotor girando a corrediça, sucessivamente, a 500 rpm durante 5 segundos e 1500 rpm durante 30 segundos. Asse o slide numa placa de aquecimento a 115 ° C por 7 min e deixe esfriar por 5 min.
    2. Dispensar 4 ml de material fotosensitivo sobre a lâmina de vidro (de 3 polegadas by 1 polegada). Espalhar o material fotosensitivo, girando o diapositivo com o mesmo protocolo como para o promotor de adesão. Asse o fotorresiste numa placa de aquecimento a 115 ° C por 1,5 min e deixe esfriar por 10 min.
    3. Expor o slide photoresist revestido com luz UV (intensidade: 22 mW / cm 2) por meio de uma máscara de transparência por 15 s. Coza a fotorresistência sobre uma placa quente a 115 ° C durante 1,5 min e esperar durante 45 min. Dissolve-se o foto-resistente exposta no revelador durante pelo menos 3,5 minutos. Enxaguar abundantemente com água DI. Inspecione os padrões desenvolvidos sob um microscópio óptico.
  4. Metais precursores de depósito para produzir np-Au filmes finos
    1. Coloque as amostras em uma máquina de pulverização catódica, que pode depositar independentemente de ouro, prata e cromo. Sputter-limpar as amostras por 90 segundos a 50 W com menos de 25 mTorr atmosfera processamento argônio antes de iniciar a deposição de metal.
    2. Sputter chrome por 10 min a 300 W em 10 mTorr argônio. Sputter ouro por 90 segundos a 400 W under 10 mTorr árgon. Co-pulverização catódica ouro e prata por 10 minutos com a prata em 200 W e potência de 100 W. Au Desligue ouro pulverização catódica fonte de cerca de 10 segundos antes de desligar a fonte de prata por pulverização catódica.
  5. Obter precursoras micropadrões de metal
    1. Sonicar amostras fotosensitivo revestidos em ~ 180 ml de extractor fotorresistência durante 10 ciclos de 20 segundos de sonicação e 2 minutos de pausa entre os ciclos. Lavar as amostras com água DI e seque com um arma de nitrogênio. Inspecionar os padrões de metal sob um microscópio.
    2. Descasque o stencil elastômero a partir de amostras não-fotossensíveis revestidos utilizando duas pinças para revelar o metal depositado.
  6. Dealloy precursor de metal e nanoestrutura modify via tratamento térmico
    1. Encher um copo de vidro de 200 ml com 170 ml de ácido nítrico (70%) e manter a temperatura da solução a 55 ° C numa placa de aquecimento. CUIDADO: O ácido nítrico é extremamente corrosivo e deve ser manuseado com equipamentos de proteção adequados. Tratar com pequenas lamelas de plasma de ar de 10 W durante 30 segundos antes da imersão em ácido nítrico. Local 1 polegada por lâminas de microscópio de 3 polegadas no copo usando fórceps ácido-resistentes e dealloy los durante 15 min. Use um barco immunostaining porcelana para batch-dealloying pequenas lamelas.
    2. Lavar as amostras dealloyed por imersão sucessivamente em duas provetas cheias com água DI fresco três vezes. Armazenar as amostras em água DI e substituir a água com água DI fresco todos os dias por pelo menos uma semana. Amostras secar com uma arma de nitrogênio sobre toalhas que não soltem fiapos antes do uso.
    3. Coloque as amostras em uma pastilha de silício limpa em um equipamento de processamento térmico rápido. Ajustar a temperatura para valores entre 200 ° C e 450 ° C e a taxa de rampa de 10 ° C / seg. Expor as amostras à temperatura prescrita durante 10 min sob azoto ambiente. Deixe a câmara fria (<100 ° C) e retirar as amostras. Alternativamente, lentamente colocar as amostras sobre a placa para tratam térmicaent.

2. Cultura de Células

  1. Prepare amostras np-Au para cultura de células
    1. Coloque np-Au amostras em pratos de poliestireno e tratar com plasma de ar de 10 W durante 30 segundos e transferir as amostras para placas de cultura de tecidos de 24 poços.
    2. Adicionar 500 ul de meio de cultura completo (Meio Eagle Modificado por Dulbecco com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina / estreptomicina) a cada poço. Armazenar num incubador humidificado a 37 ° C e 5% de CO 2 até semeando as células (<1 hr).
  2. Células manter, de passagem, e semente
    1. Manter as células de interesse (neste caso, os fibroblastos 3T3-NIH ou astrócitos murinos) em frascos T75 com meios de cultura e de passagem, quando as células são de 70% confluentes.
    2. Para passaging das células, remove material da garrafa, lavar duas vezes com 10 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS), adicionar 2 ml de 1x tripsina / EDTA e as células a incubar até separar (~ 5 minutos). Adicionar 3 ml novas mídias ecentrifugar a 1200 rpm durante 3 min. Aspirar o sobrenadante e suspender o sedimento em media de 2 ml.
    3. Remova o material gasto a partir dos poços e as células das sementes para as lamelas de vidro com uma densidade de 25.000 células / cm 2 com um volume final de 1 ml. Agite a placa de cultura voltada para trás e direita-esquerda para garantir um revestimento uniforme de células sobre as amostras. Incubar as células até a análise ao inspecionar diariamente.

3. Celular e Análise de Material

  1. Stain células para visualizar citoesqueleto e núcleos
    1. Remova a mídia passou dos poços e lavar as células duas vezes com PBS. Fixar as células em 4% de paraformaldeído em PBS, durante 15 min.
    2. Preparar a solução de coloração a 300 nm com Alexa Fluor 488 faloidina em PBS com 1% de albumina de soro bovino.
    3. Lave as células duas vezes com PBS, e elas permeabilizar em 500 ul 0.1% Triton X-100 em PBS durante 5 min.
    4. Lave as células duas vezes com PBS e transferi-los para limpar poços. Blot 50 - 200 mL de solução de coloração para as amostras e armazenar em escuro por 20 min.
    5. Lavar as células com PBS e de contra-coloração com 3 nM de DAPI em PBS durante 5 min.
    6. Lavar as células com PBS, e mergulhe em água deionizada antes da montagem em lâminas de vidro com tampa meios de montagem e vedação com claro unha polonês.
  2. Aquisição de imagens de amostras np-Au e culturas de células em superfícies np-Au
    1. Superfícies imagem np-Au com microscópio eletrônico de varredura (MEV) com ampliação de 50.000 X em 10 kV de energia do elétron usando detector de elétrons secundários.
    2. Capturar imagens de células compostas em diferentes pontos nas amostras utilizando um microscópio de fluorescência invertido em aumento de 10x com os cubos de filtros adequados.
  3. Processamento de imagens para determinar a morfologia dos poros e celular
    1. Abertura de imagens no ImageJ e dividida em canais individuais se aplicável. Converta as imagens em 8 bits, subtrair o fundo, e alisá-los por filteri medianang. Ajuste o limiar de forma manual ou por built-in limiarizar algoritmos para destacar os poros (vazios) e corpos celulares / núcleos.
    2. Use o comando divisor de águas para separar poros incorporadas ou células. Definir parâmetros de análise de partículas e executar o comando para extrair o número de partículas, área média e cobertura por cento de partículas. Use imagens de células DAPI manchadas para contagem celular e imagens de células phalloidin manchadas para quantificar a cobertura de celular por cento.
    3. Modifique os arquivos de macro incluídos para realizar a análise de múltiplas imagens em lote.

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Representative Results

A Figura 1 apresenta os principais passos processuais, incluindo a criação de padrões de np-Au, cultura de células, quantificando a nanoestrutura, e caracterizar a morfologia celular. A matriz de elastómero mostrado na Figura 2a (superior) é usada para criar os padrões de np-Au mostrados nas imagens subjacentes. Figura 2b é uma fotografia do barco de porcelana para amostras de processamento em lote. Figura 2c mostra a mudança de cor dos padrões de metal depositadas antes e depois dealloying. O acabamento prateado (antes de dealloying) deve-se a prata rico teor de liga. Após dealloying, a película adquire uma coloração laranja-castanho visível. Figura 2d ilustra as características mais finas produzidas pela padronização fotolitográfica do metal. Diferentes morfologias de poro pode ser obtido por tratamento térmico de np-Au filmes 9, conforme mostrado na Figura 3. A imagem de corte transversal (Fig.ra 3) revela se os filmes são dealloyed uniforme através da espessura da película. As imagens SEM pode ser segmentado (thresholded) em imagens binárias (Figura 3 fileira de baixo) para determinar o tamanho ea percentagem de cobertura por vazios (código 1). Uma imagem representativa de fluorescência de células de astrócitos de murino aderentes cultivados sobre uma superfície de NP-Au é mostrado na Figura 4. Os canais individuais da imagem pode ser dividida e segmentado para produzir imagens digitais para análise de interacção em material celular. Citoesqueleto imagens segmentadas podem ser usadas para quantificar a área de cobertura da superfície celular e (código 2), enquanto as imagens núcleo celular segmentados são úteis para a contagem de células (código 3). Figura 5 é um resumo visual de falhas comuns na fabricação de estruturas de np-Au , incluindo falta de adesão do filme, a ausência de porosidade, e no tratamento térmico excessivo.


Figura 1. Ilustração esquemática das principais etapas de processamento. Substratos ácido limpos ou são mascarados com uma máscara de stencil manual de corte ou photolithographically-padrão camada fotossensível. Os alvos de ouro e prata são atomizados simultaneamente para criar uma liga de ouro-prata rico, onde as máscaras transferir os padrões sobre os substratos de vidro. Padrões de liga leve são dealloyed em ácido nítrico para criar ouro nanoporous (np-Au) padrões. Células de interesse são cultivadas nas amostras e são fotografadas com fluorescência e microscópios eletrônicos de varredura para extrair ambos os recursos biológicos e morfológicos. Clique aqui para ver a figura maior .


Figura 2. Imagens ópticas A (a) stencil silicone (top) usado para precursor liga de ouro-prata padronização, que produz a matriz np-Au (inferior);. (B) barco de porcelana para amostras de processamento em lote, (c) de cor típica da balbuciou AuAg liga (em cima) e cinema dealloyed (parte inferior), e (d) maior resolução padrões np-Au produzidos pela máscara de fotolitografia durante a deposição de ouro-prata.

Figura 3
Figura 3. Np-Au imagens de MEV (linha superior) e as imagens segmentadas correspondentes (linha inferior) que são utilizados para a extração de tamanho médio de um vaziond por cento de cobertura vazio imagem. SEM (canto superior direito) de uma amostra clivada np-Au apresenta estrutura porosa homogênea através da espessura do filme. Clique aqui para ver a figura maior .

Figura 4
Figura 4. Um núcleo (azul) célula corada, que é segmentada para extrair a cobertura de celular por cento a partir do canal verde e contagem de células do azul composto f-actina (verde) e.

Figura 5
Figura 5. Imagens de falhas típicas. (A) delaminaçãodurante dealloying devido a uma camada adesiva insuficiente de crómio, (b) ausência de porosidade após dealloying devido à insuficiente teor de prata na liga; película e (c) sinterização completa de np-Au, devido à temperatura do tratamento térmico ser demasiado elevado.

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Discussion

Nós demonstramos duas técnicas diferentes para micropattern np-Au filmes para a expansão do uso destes filmes em microssistemas e estudos biológicos. Sputter ouro e prata-revestimento é um método versátil para criar padrões de np-Au, como pulverização catódica é compatível com os processos convencionais de microfabricação e da composição da liga e a espessura pode ser facilmente controlada através da variação das potências individuais pistola de pulverização (para objectivos de ouro e prata) e o tempo de deposição, respectivamente. Película np-Au espessuras típicas variam de 200 nm a 2 um. O método de stencil (Método 1, Figura 2a), utilizando punções e bisturi permite a criação de padrões milímetros escala evitando a necessidade de fotolitografia. Padrões mais complexos pode ser produzida por um corte a laser programável. O elastômero de silicone compatível com estêncil auto-aderente em superfícies de vidro, evitando a deposição de metal por baixo da máscara e aumentando a resolução padrão. No entanto, f menoreatures (<1 mm), são tipicamente difíceis de produzir com este método, como a espessura da matriz evita a deposição de metal uniforme através das aberturas na máscara. Aplicações que requerem maior resolução recurso pode ser alcançado com padronização de fotolitografia (Método 2, Figura 2d). As máscaras de transparência para transferir os padrões através de fotolitografia pode ser obtido de várias empresas (por exemplo, da cidade de Saída, Bandon, OR) e são alternativas econômicas para máscaras de cromo de vidro quando os tamanhos mínimos de recursos desejados são mais do que ~ 20 mM. A deposição metálica na matriz compatível, por vezes, leva à perda da matriz a partir do substrato, devido à geração de tensão não uniforme. Nós normalmente atenuar esse problema, garantindo o stencil ao substrato subjacente usando uma fita de poliimida nas bordas.

Quando amostras de menores dimensões, como lamelas circulares (12 mm de diâmetro) tipicamente usado nos nossos estudos, barcos porcelana mostrado na (por exemplo, limpo, dealloy) várias amostras pequenas. O processamento das amostras do grupo aumenta a uniformidade da nanoestrutura produzido em diferentes amostras. Pequenas amostras tendem a flutuar quando imergindo em piranha dealloying ou soluções, tal como eles se tornem hidrofóbicas quando armazenado em ar. Antes de qualquer passo requerendo amostras a ser imersa no líquido, tratando-os de plasma (10 W durante 30 segundos) torna a superfície de vidro hidrófilo e contribui para atenuar o problema de flutuação. O problema mais comum na produção de np-Au filmes é a delaminação durante o passo dealloying. Isto é tipicamente atribuído à acumulação de tensão de tração devido ao encolhimento do volume durante dealloying 21. A fim de evitar a delaminação, é importante ter uma forte adesão entre a película de np-Au e do substrato. Isto é conseguido por uma espessura suficiente de crómio (~ 150 nm) e intermediário gold camada (~ 200 nm). Filmes depositados deve aparecer luz para cinzento escuro quando visto a partir do lado traseiro de um substrato transparente. A película desenrolada apresentado na Figura 5a é um bom exemplo de como a parte de trás da película não deveria ser - o revestimento de ouro indica que a camada de cromo não é suficientemente espessa para assegurar a aderência forte. Outra razão para a delaminação é a superfície da amostra impura, portanto, é essencial para superfícies piranha-limpas antes da deposição de metal. Além disso, é importante para garantir que o foto-resistente está completamente desenvolvida antes de depositar a película, como qualquer material fotosensitivo residual impede a adesão forte de metal depositado sobre a superfície do vidro.

O tratamento térmico de np-Au filmes é um método conveniente e controlável para a modificação da morfologia dos poros (Figura 3). Enquanto um instrumento de recozimento térmico rápido é desejável para tratamento térmico, fornos e fogão também produzir resultados aceitáveis. Tele de forma térmica e a temperatura deve ser monitorizada cuidadosamente, como elevadas temperaturas (> 500 ° C) pode conduzir a uma sinterização do np-Au e desaparecimento de porosidade (Figura 5c). Insuficiente teor de prata na liga depositada (menos de 60% ​​de prata, pelo.%) Também evita a formação de porosidade (Figura 5b).

A fim de estabelecer culturas de células viáveis ​​na referida np-Au superfícies revestidas, é importante saturar as amostras em água desionizada, com várias mudanças de água para eliminar completamente o resíduo de ácido nítrico a partir da rede porosa. Embora não tenha sido necessário para tratar as superfícies com proteínas específicas de matriz extracelular (ECM), antes de semear as células, observou-se que o tratamento com plasma e embebendo as amostras em meio de cultura de célula antes de semear as células melhorar drasticamente a aderência celular e a viabilidade. Esta melhoria deve-se provavelmente a adsorção não específica de proteínas de adesão, a partir do soro em cemeios de cultura ll sobre a superfície np-Au. As condições de cultura de células que requerem meio isento de soro, pode ser necessário pré-tratar a superfície de NP-Au com moléculas de ECM (por exemplo fibronectina).

Para a determinação dos poros / size vazio e cobertura, bem como a contagem de células e cobertura de celular, as imagens precisam ser convertidas para imagens em preto e branco binários (ver Figuras 3 e 4) - o processo também é conhecido como segmentação. Isto requer a escolha de um valor de cinza limiar que está propenso a tendência usuário. Portanto, os valores absolutos determinados por processamento de imagem deve ser relatado com cautela. A maioria dos estudos requerem uma comparação de diferentes morfologias de células e de nanoestrutura e, portanto, desde que os parâmetros de análise de limiar (por exemplo, a janela de tamanho de partículas) são mantidos consistentes entre amostras, a significância estatística pode ser alcançado com um número relativamente pequeno de amostras. Antes de segmentação da imagem, é também útilpara suavizar as imagens e subtrair o fundo usando os comandos embutidos em ImageJ (ou uma versão mais especializada, Fiji). Nós ajustar os parâmetros no macro incluído (arquivos de código suplementares 1-3) para processamento em lote várias imagens.

Esperamos que as técnicas demonstradas aqui vai ajudar a comunidade científica a integrar np-Au em microssistemas, incluindo vários conjuntos de eletrodos para eletrofisiologia, biossensores, e esquemas de armazenamento de energia em miniatura. Além disso, acreditamos que os métodos de processamento de imagem semi-quantitativos será útil para uma ampla gama de estudos sobre a interacção de materiais e as células aderentes.

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Disclosures

Os autores não têm interesse financeiro conflitantes.

Acknowledgments

O. Kurtulus e D. Dimlioglu são suportados por um laboratório taxas Research Award Programa Universidade da Califórnia 12-LR-237197. P. Daggumati é apoiado por uma Universidade da Califórnia Davis investimentos em pesquisa no (RISE) Prêmio de Ciência e Engenharia. CA Chapman é apoiado por um departamento de pós-graduação Áreas de Assistência de Fellowship Nacional Need. Este trabalho foi apoiado pelo Programa Lab UC taxas Research, UC Davis RISE, e UC Davis Faculdade de Engenharia fundos start-up.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gold target Lesker EJTAUXX403A2 Precursor to alloy for producing np-Au
Chrome target Lesker EJTCRXX353A2 Adhesive layer
Silver target Lesker EJTAGXX403A2 Precursor to alloy for producing np-Au
Porcelain boat Thomas Scientific 8542E40 Used for processing small samples
Nitric acid Sigma-Aldrich 43873 Used at 70% for dealloying
Sulfuric acid J.T Baker 7664-93-9 Used at 96% for piranha cleaning
Hydrogen peroxide J.T Baker 7722-84-1 Used at 30% for piranha cleaning
Biopsy punches Ted Pella 150xx Available in several sizes
Silicone elastomer sheets Rogers Corporation HT 6240 Available in several thicknesses
Hexamethyldisilazane Sigma-Aldrich 440191-100ML Used as adhesion promoter for positive resist
Microposit MF CD26 Shipley 38490 Positive photoresist developer
PRS 3000 J.T Baker JT6403-5 Positive photoresist stripper
Circular glass coverslips (12 mm) Ted Pella 26023 Used as substrate for metal patterns and cell culture
Glass slides (1 x 3 inch) Ted Pella 26007 Used as substrate for metal patterns
Kapton polyimide tape VWR 82030-950 Used for securing elastomer
Transparency masks Output City Used in photolithography http://www.outputcity.com/
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G Used for activating glass surfaces
Sputtering machine Kurt J. Lesker LAB18 Used for depositing metals

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References

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