Порядок Создание многоуровневой углубленным круглым сечением Endothelialized Микроканалы-на-чипе

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Микроканалов-на-чипе платформа была разработана комбинация фотолитографическая reflowable технику фоторезиста, мягкой литографии и микрофлюидики. Endothelialized платформы микроканалов имитирует трехмерную (3D) геометрии в естественных условиях микрососудов, работает в контролируемых непрерывного потока перфузии, позволяет качественно и изображений в реальном времени и может быть применен для микрососудистых исследований.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Li, X., Mearns, S. M., Martins-Green, M., Liu, Y. Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip. J. Vis. Exp. (80), e50771, doi:10.3791/50771 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Усилия были сосредоточены на разработке в пробирке анализов для изучения микрососудов, потому что в естественных условиях исследования на животных более трудоемким, дорогим и наблюдения и количественной очень сложным. Однако, обычные в пробирке анализов микрососудов имеют ограничения при представлении в естественных условиях микрососудов по отношению к трехмерной (3D) геометрии и обеспечение непрерывного потока жидкости. Используя комбинацию фотолитографическая reflowable технику фоторезиста, мягкой литографии и микрофлюидики, мы разработали несколько глубине круглого поперечного сечения микроканалов endothelialized-на-чипе, которая имитирует 3D геометрии в естественных условиях микрососудов и работает под управлением контролируемого непрерывной перфузии потока. Положительный reflowable фоторезиста был использован для изготовления мастер-формы с полукруглое поперечное сечение микроканала сети. По выравнивание и соединение двух полидиметилсилоксана (PDMS) микроканалов REPLвыделенному из главной формы, цилиндрической микроканальной сеть была создана. Диаметры микроканалов может быть хорошо контролируются. Кроме того, первичных человеческих эндотелиальных клеток пупочной вены (HUVECs) высевают в микросхеме показали, что клетки Вдоль внутренней поверхности микроканалов в контролируемых перфузии продолжительностью периода времени от 4 дней до 2 недель.

Introduction

Микрососуды, как часть системы кровообращения, опосредуют взаимодействие между крови и тканей, поддерживают метаболической активности, определяют ткани микросреду, и играют важную роль во многих здоровья и патологических состояний. Краткое изложение функциональных микрососудов в пробирке может обеспечить платформу для изучения сложных сосудистых явлений. Однако, обычные в пробирке анализов микрососудов, например, миграции эндотелиальных клеток анализы, анализы эндотелиальных формирования трубки и крысы и мыши анализов аорты кольцо, не в состоянии воссоздать в естественных условиях микрососудов в отношении трехмерной (3D) геометрии и непрерывный контроль потока 1-8. Исследования микрососудов с использованием животных моделей и в естественных анализов, таких как анализ ангиогенеза роговицы, хорионалантоисной мембраны ангиогенеза анализа и Матригель вилка анализа, более трудоемким, высокую стоимость, сложные по отношению к наблюдению и количественных иэтические вопросы, 1, 9-13.

Достижения в MicroManufacturing и микрожидкостной технологии чипа позволило различным понимание медико-биологических наук в то время как сокращение высоких экспериментальных затрат и сложностей, связанных с животными и в естественных условиях исследования 14, такие, как легко и жестко контролируется биологическими условиями и динамической жидкостной среды, который не будет иметь бы возможно при обычном макромасштабные методов.

Здесь мы представляем подход к построению endothelialized микроканалов-на-чипе который имитирует 3D геометрии в естественных условиях микрососудов и работает под управлением контролируемого непрерывного потока перфузии с помощью сочетания фотолитографическая reflowable технику фоторезиста, мягкой литографии и микрофлюидики.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Изготовление фотолитографии фоторезиста Master Mold

Следующий протокол показан процесс для изготовления микроканалов с диаметром 30-60 мкм. Чтобы получить микроканальной с меньшим диаметром (менее 30 мкм), одну спин-покрытия фоторезиста необходимо.

  1. Передача оплавления фоторезиста из холодильника при 4 ° С в чистом помещении 24 часов перед использованием и дайте ему прогреться до комнатной температуры.
  2. Очистите кремниевой пластины и испечь его в течение одного часа при температуре 150 ° C, чтобы позволить ему обезвоживает. Обезвоживание поможет адгезию фоторезиста на кремниевой подложке.
  3. Спин-слой первым слоем фоторезиста с помощью следующей рецептуры:
Шаг Время (в секундах) Скорость (RPM) Ускорение
1 2 </ TD> 300 наивысший
2 10 0
3 3 300 наивысший
4 60 600 наивысший
5 10 500 наивысший
6 10 600 наивысший
  1. Затем выпекать пластины на плите при температуре 110 ° С в течение 90 сек. После мягкого печь толщины фоторезиста составит 20-30 мкм.
  2. Спин слой второй слой фоторезиста следуя той же рецепт используется для первого слоя.
  3. Мягкие выпекать пластины снова, поместив его на плите при температуре 110 ° С в течение 90 сек. После этого мягкой печь толщины фоторезиста будет 40-60 мкм.
  4. Генерировать положительный моделей мастера, подвергая photoresist к ультрафиолетовому излучению с экспозиционной дозы 14 500 мДж / см 2 через пленку маску.
  5. Развести разработчик деионизированной (DI) воде (1:2 (объем / объем)). Промыть пластины повторно в раствор, пока рисунок не будет полностью развита. Затем промыть пластины дистиллированной водой и высушить его с использованием газообразного азота.
  6. Оплавления: Место пластины на плите при температуре 120 ° С в течение 4 мин и залить в стеклянную чашку Петри для предотвращения испарения растворителя. Снимите пластину с плитой и дайте ему остыть до комнатной температуры. Толщина фоторезиста после оплавления будет 50-60 мкм.

2. Изготовление мягкой Литография PDMS Microchannel Сети

  1. Подготовка полидиметилсилоксана (ПДМС) раствора при массовом соотношении 10:01 (основа: отвердитель) и тщательно перемешать с использованием планетарной центробежной смеситель.
  2. Литые решение PDMS на переформатированном формы мастер фоторезиста. Поместите литой PDMS в эксикаторе в течение 15 мин для дегазации. Использование газообразного азота, чтобы удалить оставшиеся пузырьки если это необходимо.
  3. Выпекать PDMS в сушильном шкафу при температуре 60 ° C в течение 3 часов, чтобы позволить ему вылечить. Затем удалите слой вылечить PDMS от мастера формы.
  4. Используйте заостренный перфоратор для создания на входе / выходе отверстия, пробивая отверстия в канал сети. Очистка поверхности PDMS с использованием газообразного азота.
  5. Лечение два PDMS слоев с кислородной плазмой в течение 30 сек в плазме уборщик при рабочем давлении 4,5 × 10 -2 торр и расход кислорода от 3,5 фут 3 / мин. Затем выравнивания поверхности PDMS вручную с помощью оптического микроскопа. Использование капли воды, если это необходимо для лучшего контроля выравнивания.
  6. Выпекать устройство в печи при 60 ° С в течение 30 мин для достижения постоянного соединения.

3. HUVEC культуры и заполнения в чип

  1. Культуры HUVECs с культуральной среде с L-глутамином, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Для йэлектронной эксперимент проходы между 2 и 5 были использованы.
  2. После HUVECs являются сливающийся, подсчет клеток и собирать их на первый промывания этих клеток HEPES-солевом буферном растворе (HEPES-BSS), а затем обрабатывать клетки с помощью трипсина / EDTA и инкубируют в течение 2-6 мин при 37 ° С. После обработки трипсином завершения нейтрализации трипсина / EDTA трипсином нейтрализующим раствором. Центрифуги и приостановить клеток в культуральной среде с 8% декстран, чтобы собрать их. Декстран была использована для увеличения средней вязкости, чтобы помочь в лучше посева клеток и крепления.
  3. Лечение устройства кислородной плазмой в течение 5 мин при рабочем давлении 4,5 × 10 -2 торр и расход кислорода от 3,5 фут 3 / мин. Затем загрузить устройство деионизированной водой и обрабатывают УФ-светом в течение 8 часов в ламинарном шкафу в течение биологической стерилизации.
  4. За один день до клетки готовы, мыть устройство с 1x фосфатным буферным раствором (1х PBS), затем слой с фибронектином (100 мкг / мл разбавленнойuted с 1x PBS) и инкубируют в холодильнике при температуре 4 ° С в течение ночи.
  5. После фибронектина покрытием, мыть устройство с 1x PBS затем загрузить с культуральной среды. Инкубируйте устройство при температуре 37 ° С в течение 15 мин.
  6. Загрузите HUVEC клеток в 8% культуральной среде декстрана с сотовым концентрации 3-4 х 10 6 клеток / мл. Поместите 20 мкл капли клеток на один вход устройства и наклонить его введения клеток в микрофлюидном канала. Через 15-20 мин клетки начинают прикрепить к боковым стенкам каналов. Поворот через каждые 15 мин, чтобы создать более равномерное распределение клеток. При необходимости дополнительной нагрузки может быть выполнена.

4. Долгосрочные перфузии Настройки

Через 5-6 ч статической культуры, прилагаемой HUVECs начнет в полной мере распространяться. Настройка перфузии помощью дистанционного управления системой шприцевой насос с постоянным расходом 10 мкл / час. Перфузии можно регулировать еили с большей скоростью потока, и может длиться в течение периода времени от 4 дней до 2 недель.

5. Окрашивание клеток и микроскоп характеристика

  1. Когда клетки достигают слияния внутри устройства, во-первых, мыть устройство с 1x PBS, чтобы тщательно удалить среды. После загрузки устройства с красным красителем разбавляют разбавителем (4 мкл-1 мл). Загрузите красителя аналогична процедуре загрузки ячейки. Инкубируйте устройство в темноте в течение 5 мин при комнатной температуре, а затем промыть устройство с культуральной средой, чтобы остановить окрашивания. Длинные инкубации краситель может привести к клеточной токсичности и disadhesion.
  2. Поместите устройство с голубой краситель разводили 1х PBS (2 капли на мл). Инкубируют в темноте в течение 5 мин при комнатной температуре, затем тщательно промыть устройство с 1x PBS.
  3. Изучите окрашивания клеток с помощью инвертированного оптического микроскопа. Если окрашивание было хорошо, загрузите микроканалов с фиксацией среды (3,5% параформальдегиде разбавляют 1x PBS), затем погрузитеУстройство фиксации в средних и полностью покрывать его алюминиевой фольгой. Храните прибор в холодильнике при температуре 4 ° С, чтобы предотвратить устройство от высыхания и фотообесцвечивания. Фиксированной Теперь устройство готово для конфокальной микроскопии, которое может быть сделано путем конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Наш подход для изготовления нескольких глубины микроканальной сеть имитирует сложные 3D геометрии в естественных условиях микрососудов, в котором микроканалов имеют закругленные сечений 15. Кроме того, диаметры родителей ветвления каналов и каналов дочь примерно подчиняются закону Мюррея для поддержания потока жидкости на необходимом уровне, так что общее сопротивление канала слишком низко, скоростях потока более равномерным по всей сети 16-18. Процессов и результатов для изготовления полукруглую форму мастер фоторезиста и круглое поперечное сечение PDMS микроканальной сети были продемонстрированы в фильме 1, рисунок 2 и кино 2 соответственно. Геометрических особенностей PDMS микроканальным сети были характерны и показано на рисунке 2. Наши результаты показывают, что фоторезиста техника оплавления может создавать многостраничные канал глубиной ветвления сетей яН.А. более удобный подход фоторезиста методов оплавления, проектирования и позволяют биомиметическую микрососудистой системы, которые примерно подчиняются закону Мюррея.

Во многих в пробирке моделей, сосудистые клетки, как правило, культивировали на плоских пластинах, фильтры, или эти подложек, покрытых гидрогелей. В этих условиях микрососудов генерируются случайным образом сотовой самостоятельной сборки. Кроме того, обычные методы имеют присущие трудности достижения постоянного потока на эндотелиальных клетках. Отсутствие долгосрочных и непрерывный поток средств массовой информации препятствует способности поддерживать стабильность эндотелиальные клетки монослоя с соответствующими функциями барьер. В нашей модели, в пользу применения микрофлюидики является удобство для доступа и контроля жидкости (различной расхода, продолжительности и моделей), а также избавления от отходов. Мы демонстрируем процессов первичных человеческих эндотелиальных клеток пупочной вены (HUVECs) посева в микроканалов и установить Ting долгосрочных жидкости перфузии системы для культивирования клеток (рис. 3). Кроме того, из-за сложной геометрии в естественных условиях микрососудов, мониторинг в реальном времени из тех небольших судов трудно. Разработанная на базе чипа PDMS предлагает хорошими оптическими свойствами и позволяет качественно и в режиме реального времени визуализации endothelialized микроканалов. (Рис. 4 и кино 3)

Фильм 1. Схема изготовления процедур фоторезиста форм мастера. Первоначально предварительно очищенную кремниевую подложку был подготовлен. Положительный слой фоторезиста оплавлением был спин-покрытием на кремниевой подложке и прокален и сушат. Фоторезиста подвергают воздействию ультрафиолетового света через маску с рисунком, а затем, узорные микроканалов были разработаны. Полукруглое поперечное сечение микроканала сеть была создана после пайки при температуре 120 ° С в течение 4 мин.movie1.wmv "целевых =" _blank "> Нажмите здесь для просмотра фильма.

Рисунок 1
Рисунок 1. SEM показывает разработаны фоторезиста) перед оплавлением;. Б) после пайки, в) формования PDMS показывает поперечное сечение резиста перед оплавлением; показано на рисунке прямоугольного сечения, г) формования PDMS показывает полукруглое поперечное сечение сопротивление после пайки; поперечное сечение после пайки контролировалась первоначальной конструкции измерение образца и обратной температуры. (Перепечатано с разрешения Ссылка 15). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Фильм 2. Схематические процедуры изготовления цилиндрических микроканальным сети PDMS. Решение PDMS заливали на фоторезист форму и отверждают в печи при температуре 60 ° С в течение 3 часов. Два идентичных вылечить PDMS слоев, каждый из которых имеет полукруглое поперечное сечение микроканала сети были выровнены и связаны вместе с образованием микроканалов с круглым сечением. Нажмите здесь для просмотра фильма .

Рисунок 2
Рисунок 2. а) выровнены и связанный цилиндрический микроканальной сети в PDMS. BD) круглого поперечного сечения формы PDMS показывают размеры канала на каждом уровне ветвления (1-1 ', 2-2' и 3-3 '). Кроме того, эти цифры показывают, создание и многофилиальность multidepth круглого поперечного сечения микрожидкостной сетевого канала.

страница = "всегда"> Рисунок 3
Рисунок 3. Схематическая диаграмма, показывающая долгосрочного перфузии через чипов с помощью дистанционного управления шприцевой насос.

Рисунок 4
Рисунок 4. Микроскопией изображений с использованием флуоресцентного клеточных мембран краситель (красный) и клетки ядерный краситель (синий) показывают, что линия HUVECs внутренней поверхности цилиндрического микроканальной сети в различных регионах ветвления.) Сверху, б) средние, в) Bottom. Г) конфокальной микроскопии изображение показывает круглое поперечное сечение HUVECs выстилающих канал сети. Масштабные линейки: 100 мкм.

Фильм 3. Конфокальной фильм, показывающий, облицовка элемента по кольцевой сети канала.iles/ftp_upload/50771/50771movie3.wmv ​​"целевых =" _blank "> Нажмите здесь для просмотра фильма.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

1. Мастер изготовления форм

Один из проектирования и руководящих принципов сосудистой морфометрией известен как закон Мюррея 16, в котором говорится, что распределение диаметре сосудов по всей сети регулируется минимальная рассмотрения энергии. В нем также говорится, что куб диаметров родитель сосуде при бифуркации равна сумме кубов диаметров дочь сосудов ( Уравнение 1 ) 19 Кроме того, закон Пуазейля была использована для оценки величины напряжения сдвига в большинстве сосудистой как Уравнение 2 . , в котором1eq3.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50771/50771eq3.jpg "ширина =" 25px "/> является гемодинамический напряжения сдвига, μ является вязкость крови, Q является расходом, а R-радиус Судно 20,21. Для симметричных бифуркации, важное следствие основано на законе Мюррея и закон Пуазейля является то, что натяжение стенок сосудов, остается постоянной в течение сосудистой сети. Таким образом, для симметричного сфабрикованы микрожидкостной сетевого канала с круглым сечением, если канал размеры по закону подчиняются бифуркации Мюррея, напряжение сдвига, испытываемые эндотелиальные клетки должно быть постоянным на разных ветвления каналов.

Многие методы микротехнологий и процессы были применены к изготовлению микроканалов используемый для сосудистых клеток 22-25, однако, в результате микроканалов привело к прямоугольной, квадратной или трапецеидального поперечного сечения каналов. Прямоугольного поперечного сечения каналов конпостроенные с острыми углами и резких переходов на бифуркации, которые могут налагать самые различные жидкости сдвиговые напряжения и нефизиологических геометрии на клетки в различных положениях канал, в результате чего изменение физиологии клеток 26,27.

Фоторезиста процесс пайки, в результате чего закругленный профиль канала, включает в себя две процедуры, 1) плавление фоторезиста узорный и жидкость сопротивление поверхности втягивается в форму, которая минимизирует энергию системы 28,29 и 2) охлаждения и затвердевания следует фаза процесса плавления. Формы переформатированном каналов хорошо аппроксимируются полуцилиндрическое поверхности. Вслед за переформатированном изготовления форм мастера, стандартный подход мягкой литографии был использован для изготовления PDMS микрожидкостных канал сети с круглым поперечным сечением. Наши результаты показали, что фоторезиста техника оплавления может создавать многостраничные глубиной ветвления микроканальным сетей в более прямт подход вперед и позволяет разрабатывать микрососудистых биомиметических систем, приблизительно подчиняется закону Мюррей и имитировать геометрии в естественных условиях микрососудов, так что общее сопротивление канала является низким, и сдвига вариации напряжения при различной разветвленности уровни могут быть минимизированы в изготовленном микрожидкостной канала сети.

Физиологических микрососудов крови принять примерно круглого поперечного сечения с радиусом 30-300 мкм между 30. Размеры для продемонстрировал микроканальным сети в данной работе были разнообразны около 60 мкм до 100 мкм на различных уровнях ветвления. Для изготовления микроканалов с различным диапазоном диаметров для имитации микрососудов в естественных условиях, мы рекомендуем использовать одну выделяемых оплавления слоя сопротивляться (ограниченный до 30 мкм) или другие более низкой вязкостью сопротивляется. Для микроканальной с большим диаметром (30-60 мкм), двойное покрытие процедура может быть применена, чтобы получить более толстой пленки фоторезиста15. Дополнительные спин-покрытия выше двух слоев следует избегать, чтобы предотвратить неоднородной толщине пленки, что может привести к неточному доза облучения. При толщине пленки 60 мкм выше, другие высшие вязкой фоторезистами оплавления рекомендуется.

В идеальном состоянии, для изготовления противостоять форму с полукруглым поперечным сечением, толщина пленки может быть первоначально заданной давая требуемой ширины и фокусное расстояние микроканала в качестве Уравнение 4 , Где Н необходимые выделяемых толщины пленки, г равна половине ширины канала, R является постоянным радиусом кривизны, ч является центральным высота кривизны, а Е представляет собой отношение объема противостоять микроканала до и после оплавления 31. Для цилиндрической поверхности заданной ширины микроканала, один определенный объем резиста повторнотребуется. Тем не менее, некоторые параметры, как сообщалось, влияют на переформатированном фоторезиста и сделать результате профилей канала более сложными, такие как критический угол и граница движение между фоторезиста и твердой подложки, материал испарения при оплавлением выпечки, температуры и времени для пайки оплавлением, дегазации, подложки единообразия, и противостоять свойства 32-34. Например, температура пайки и времени может привести к изменению объема в результате чего граница движение и, следовательно, различной критического угла и конечной оплавленной противостоять профиль 33. Как сообщили нашей предыдущей работе 15, оплавления процесса снизилась ширины канала на 2% в среднем, потому что фоторезиста сокращения объема и границ движения. Кроме того, для получения объема цилиндрической поверхности необходимо делать поправку на эффект испарения материала во время процесса оплавления 35,36. Если цилиндрических поверхностей с различными радиусами требуются черезмикроканальной сети необходимо изменять ширину микроканалов, в результате чего изменение объема в различных регионах в сети 15. Для успешного изготовления цилиндрических каналов сети с разными диаметрами, сопротивляется ширины / томов, температурам оплавления и сроки, критические углы, границы движения, противостоять вязкости и протоколов центрифугирования и свойств подложки должны быть рассмотрены и проверены.

2. Долгосрочные культуре клеток

Важность потока и сдвига связанного напряжения стенки была хорошо известна в регуляции эндотелиального биологии. Это было замечено в таких областях, как вызывая изменение формы клеток и ориентации, секреции и организации, пролиферации и дифференцировки, внутриклеточная сигнализация, производство белков цитоскелета и экспрессии генов, созревание судна и структуру, и барьерные функции 37-47. В настоящее время в пробирке методы формирования конецothelial труб обычно полагаются на эндотелиальных клеток (ECS) самоорганизации с или без мезенхимальных клеток в внеклеточного матрикса (ECM) (типа я коллагена, фибрина или Матригель) 48-54. Хотя эти культуры успешно воспроизводит несколько микрососудистые поведения, искусственные кровеносные образована в результате случайного процесса формообразования хватает нужной пространственной ориентации и воспроизводимость. Кроме того, воздействие потока на микрососудистых стабильность остается в значительной степени неизвестны, потому что эти самоорганизующихся суда не легко комбинировать просвета потока с 3D организации трубчатые 55, бросают вызов суда инженерных крови, чтобы иметь барьерные функции и долгосрочную сосудистой стабильности.

Микрофлюидных системы оказались практичным и полезным для введения потоков в различных биохимических и биологических анализов 56,57. Наш подход обеспечивает удобный способ представить потока текучей среды по культуре клеток. Мы использовалипередовые дистанционным управлением шприцевой насос для достижения удобном и устойчивое и точное управление потоком через микроканалов для долгосрочного культуры клеток (от 4 дней и 2 недели).

3. Клеточные культуры в чипе

С помощью плазмы окисление микроканалов PDMS вводит силанольные группы (SiOH) на поверхности, которое делает поверхность гидрофильных и помогает в дальнейшем покрытий белка. Различные белки ECM (фибронектин, желатин и коллаген) были протестированы на прикрепление клеток и лучший результат было установлено, что фибронектин покрытием. HUVECs готовили при концентрации 3 × 10 6 клеток / мл в культуральной среде дополнен 8% декстрана (70 кДа) для посева. Декстрана увеличивает вязкость носителя Для точного управления плотность посева ЭК.

Монослоя развернулась между 2-4 дней HUVECs подвергаясь постоянным потоком среды. Для визуализации клеток послекультура клеток, мы меченых клеток при окрашивании мембран и красителей окрашенным ядром, эти красители выставлены более низкую цитотоксичность, 58. Мы окрашивали клетки, прилипшие монослой культивировали в чипе. Полный 1x PBS стирки необходимо предотвратить дополнительные красители ловушке внутри чипа.

Таким образом, комбинация оплавлением фоторезиста техники и PDMS репликации, развитыми несколькими глубина микроканальной сеть была аппроксимирована круговой поверхностью и диаметры каналов в каждой бифуркации приблизительно подчиняется закону Мюррей. Вариации напряжения сдвига на различных уровнях ветвления может быть минимизирована по сфабрикованному микрожидкостной сетевого канала. Кроме того, результаты из клеточной культуры указанных здорового состояния эндотелиальных клеток. Таким образом, разработанная endothelialized микроканалов-на-чипе обеспечивает быстрый и воспроизводимый подход к созданию круглого поперечного сечения нескольких ветвления и multidepth микроканальным сетей, которая имитируетгеометрии в естественных условиях микрососудов. Процедура иллюстрирует использование уникальных возможностей в странах с развитой и MicroManufacturing микрожидкостной технологий для создания микрососудов модель с долгосрочным, непрерывный контроль перфузии, а также качественные и изображений в реальном времени возможности. С ростом полезности микроканалов для клеточной биологии, тканевой инженерии и биотехнологии приложений, endothelialized микроканалов-на-чипе является потенциальным анализ на микрососудистых исследований.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Это исследование было частично поддержана Национальным научным фондом (NSF 1227359), WVU EPSCoR программы, финансируемой Национальным научным фондом (EPS-1003907), WVU ADVANCE офиса под эгидой Национального научного фонда (1007978), и WVU PSCoR соответственно. Микротехнологий работа была проделана в WVU общих исследовательских сооружений (чистых помещений объектов) и интегративной Микрофлюидных сотовой исследований на кристалле лаборатории (Microchip Lab) в Университете Западной Вирджинии. Конфокальной микроскопии было сделано в Западной Вирджинии фонда визуализации микроскопа.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
Reflow Photoresist AZ Electronic Materials AZP4620
Developer AZ Electronic Materials AZ 400K
PDMS Dow Corning Corporation Sylgard 184
MCDB 131 Culture Medium Invitrogen 10372-019
NacBlue Nuclei Staining Invitrogen H1399
PKH Red Stain Sigma MINI26 and PKH26GL
Fibronectin Gibco PHE0023
L-Glutamine Sigma G7513
Phosphate Buffered Saline Invitrogen 14040-133
HEPES Buffered Saline Solution Lonza CC-5024
Trypsin/EDTA Invitrogen 25300-062
Trypsin Neutralizing Solution Lonza CC-5002
PDMS Curing Agent Dow Corning Corporation Sylgard 184
Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells Lonza CC-2517
Fetal Bovine Serum Lonza 14-501F
Diluent C Sigma CGLDIL
Hoechst33342 Invitrogen, Molecular Probes R37605
Dextran Sigma 95771
3.5% Paraformaldehyde Electron Microscopy Science 15710-S
Equipment
Spinner Laurell Technologies Corporation WS-400BZ-6NPP/LITE
Desiccator BelArt Products 999320237
Inverted Microscope Nikon Eclipse Ti
Syringe Pump System Harvard Apparatus PHD Ultra
Laminar Biosafety Hood Thermo Scientific 1300 Series A2
Planetary Centrifugal Mixer Thinky ARE-310
Isotemp Oven Fisher Scientific 13-246-516GAQ
Optical Microscope Zeiss Invertoskop 40C
Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Hotplate Barnstead/Thermolyne Cimarec SP131635
Laser Scanning Confocal Microscope Zeiss LSM 510

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Adair, T. H. Angiogenesis: Integrated systems physiology: from molecule to function to disease. 1st edition, Biota Publishing. (2011).
  2. Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvasc. Res. 74, 172-183 (2007).
  3. Smith, E. J., Staton, C. A. Tubule formation assays. Angiogenesis assays: A critical appraisal of current techniques. John Wiley & Sons Ltd. West Sussex, UK. 65-87 (2006).
  4. Nakatsu, M. N., Davis, J. J., Hughes, C. C. W. Optimized fibrin gel bead assay for the study of angiogenesis. J. Vis. Exp. (3), e186 (2007).
  5. Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Lab. Invest. 63, 115-122 (1990).
  6. Aplin, A. C., Fogel, E., Zorzi, P., Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis. Methods Enzymol. 443, 119-136 (2008).
  7. Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: A quarter century of search and discovery. J. Cell. Mol. Med. 13, 4113-4136 (2009).
  8. Griffith, L. G., Swart, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 211-224 (2006).
  9. Folkman, J. History of angiogenesis. Angiogenesis: An integrative approach from science to medicine. Springer. (2008).
  10. Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: A critical overview. Clin. Chem. 49, 32-40 (2003).
  11. Auerbach, R., Akhtar, N., Lewis, R. L., Shinners, B. L. Angiogenesis assays: Problems and pitfalls. Cancer Metastasis Rev. 19, 167-172 (2000).
  12. Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int. J. Exp. Pathol. 90, 195-221 (2009).
  13. Staton, C. A., Stribbling, S. M., et al. Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo. Int. J. Exp. Pathol. 85, 233-248 (2004).
  14. Moraes, C., Mehta, G., Lesher-Perez, S. C., Takayama, S. Organs-on-a-Chip: A focus on compartmentalized microdevices. Ann. Biomed. Eng. 40, (6), 1211-1227 (2012).
  15. Huang, Z., Li, X., Martins-Green, M., Liu, Y. Microfabrication cylindrical microfluidic channel networks for microvascular research. Biomedical Microdevices. 14, (5), 873-883 (2012).
  16. Murray, C. D. The physiological principle of minimum work applied to the angle of branching of arteries. J. Gen. Physiol. 9, (6), 835-841 (1926).
  17. Zamir, M., Medeiros, J. A. Arterial branching in man and monkey. J. Gen. Physiol. 79, 353-360 (1982).
  18. Gafiychuk, V. V., Lubashevsky, I. A. On the principles of the vascular network branching. J. Theor. Biol. 212, 1-9 (2001).
  19. Sherman, T. F. On connecting large vessels to small. The meaning of Murray's law. J. Gen. Physiol. 78, (4), 431-453 (1981).
  20. Kamiya, A., Bukhari, R., Togawa, T. Adaptive regulation of wall shear stress optimizing vascular tree function. Bull Math Biol. 46, (1), 127-137 (1984).
  21. LaBarbera, M. Principles of design of fluid transport systems in zoology. Science. 249, 992-1000 (1990).
  22. Emerson, D. R., Cieslicki, K., Gu, X., Barber, R. W. Biomimetic design of microfluidic manifolds based on a generalized Murray's law. Lab Chip. 6, 447-454 (2006).
  23. Lu, H., Koo, L. Y., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Anal. Chem. 76, 5257-5264 (2004).
  24. Shevkoplyas, S. S., Gifford, S. C., Yoshida, T., Bitensky, M. W. Prototype of an in vitro model of the microcirculation. Microvasc. Res. 65, 132-136 (2003).
  25. Kaihara, S., Borenstein, J., et al. Silicon micromachining to tissue engineer branched vascular channels for liver fabrication. Tissue Eng. 6, 105-117 (2000).
  26. Fisher, A. B., Chien, S., Barakat, A. I., Nerem, R. M. Endothelial cellular response to altered shear stress. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 281, (3), L529-L533 (2001).
  27. Nerem, R. M., Alexander, R. W., et al. The study of the influence of flow on vascular endothelial biology. Am. J. Med. Sci. 316, (3), 169-175 (1998).
  28. Daly, D., Stevens, R. F., Hutley, M. C., Davies, N. The manufacture of microlenses by melting photoresist. Meas. Sci. Technol. 1, (8), 759-766 (1990).
  29. Schilling, A., Merz, R., Ossmann, C., Herzig, H. P. Surface profiles of reflow microlenses under the influence of surface tension and gravity. Opt. Eng. 39, (8), 2171-2176 (2000).
  30. Young, B., Heath, J. W. Wheater's functional histology: A text and colour atlas. 4th edition, Churchill Livingstone. (2000).
  31. O'Neill, F. T., Sheridan, J. T. Photoresist reflow method of microlens production. Part 1: Background and experiments. Optik Int. J. Light Electron Opt. 113, 391-404 (2002).
  32. de Gennes, P. G. Wetting: statics and dynamics. Rev. Mod. Phys. 57, 827-863 (1985).
  33. Elias, H. G. An Introduction to Polymer Science. VCH Publishers. New York. (1997).
  34. Voinov, O. V. Dynamic edge angles of wetting upon spreading of a drop over a solid surface. J. Appl. Mech. Tech. Phys. 40, 86-92 (1999).
  35. Daly, D., Stevens, R. F., Hutley, M. C., Davies, N. The manufacture of microlenses by melting photoresist. Meas. Sci. Technol. 1, 759 (1990).
  36. Jay, T. R., Stern, M. B. Preshaping photoresist for refractive microlens fabrication. Opt. Eng. 33, 3552-3555 (1994).
  37. Nerem, R. M., Alexander, R. W., et al. The Study of the influence of flow on vascular endothelial biology. Am. J. Med. Sci. 316, (3), 169-175 (1998).
  38. Chien, S., Li, S., Shyy, Y. J. Effects of mechanical forces on signal transduction and gene expression in endothelial cells. Hypertension. 31, 162-169 (1998).
  39. Li, Y. S., Haga, J. H., Chien, S. Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells. J. Biomech. 38, 1949-1971 (2005).
  40. Lee, E. J., Vunjak-Novakovic, G., Wang, Y., Niklason, L. E. A biocompatible endothelial cell delivery system for in vitro tissue engineering. Cell Transplant. 18, 731-743 (2009).
  41. Lee, E. J., Niklason, L. E. A novel flow bioreactor for in vitro microvascularization. Tissue Eng. Part C Methods. 16, 1191-1200 (2010).
  42. Chau, L., Doran, M., Cooper-White, J. A novel multishear microdevice for studying cell mechanics. Lab Chip. 9, 1897-1902 (2009).
  43. Meeson, A., Palmer, M., Calfon, M., Lang, R. A relationship between apoptosis and flow during programmed capillary regression is revealed by vital analysis. Development. 122, 3929-3938 (1996).
  44. Van Royen, N. J., Piek, J., Schaper, W., Bode, C., Buschmann, I. Arteriogenesis: mechanisms and modulation of collateral artery development. J. Nucl. Cardiol. 8, 687-693 (2001).
  45. Schaper, W. Therapeutic arteriogenesis has arrived. Circulation. 104, (17), 1994-1995 (2001).
  46. Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovas. Res. 87, (2), 320-330 (2010).
  47. Potter, C. M., Lundberg, M. H., et al. Role of shear stress in endothelial cell morphology and expression of cyclooxygenase isoforms. Arterioscler. Thromb. Vasc Biol. 31, 384-391 (2011).
  48. Montesano, R. In vitro rapid organization of endothelial cells into capillary-like networks is promoted by collagen matrices. J. Cell Biol. 97, 1648-1652 (1983).
  49. Darland, D. C., D'Amore, P. A. TGF beta is required for the formation of capillary-like structures in three-dimensional cocultures of 10T1/2 and endothelial cells. Angiogenesis. 4, (1), 11-20 (2001).
  50. Lawley, T. J., Kubota, Y. Induction to morphologic differentiation of endothelial cells in culture. J. Invest. Dermatol. 93, 59S-61S (1989).
  51. Kanzawa, S., Endo, H., Shioya, N. Improved in vitro angiogenesis model by collagen density reduction and the use of type III collagen. Ann. Plast. Surg. 30, 244-251 (1993).
  52. Davis, G. E., Bayless, K. J., Mavila, A. Molecular basis of endothelial cell morphogenesis in three-dimensional extracellular matrices. Anat. Rec. 268, 252-275 (2002).
  53. Velazquez, O. C., Snyder, R., Liu, Z., Fairman, R. M., Herlyn, M. Fibroblast-dependent differentiation of human microvascular endothelial cells into capillary-like 3-dimensional networks. FASEB J. 16, 1316-1318 (2002).
  54. Donovan, D., Brown, N. J., Bishop, E. T. Comparison of three in vitro human "angiogenesis" assays with capillaries formed in vivo. Angiogenesis. 4, 113-121 (2001).
  55. Tang, D. G., Conti, C. J. Endothelial cell development, vasculogenesis, angiogenesis, and tumor neovascularization: an update. Semin. Thromb. Hemost. 30, 109-117 (2004).
  56. Takayama, S., McDonald, J. C., et al. Patterning cells and their environments using multiple laminar fluid flows in capillary networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 5545-5548 (1999).
  57. Cho, B. S., Schuster, T. G., et al. Passively driven integrated microfluidic system for separation of motile sperm. Anal. Chem. 75, 1671-1675 (2003).
  58. Parsa, H., Upadhyay, R., Sia, S. K. Uncovering the behaviors of individual cells within a multicellular microvascular community. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, (12), 5133-5138 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics