הליך הפיתוח של Multi-עגול עומק חתך Endothelialized microchannels-on-a-chip

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

פלטפורמת microchannels-on-a-chip פותחה על ידי שילוב של טכניקת photolithographic reflowable photoresist, ליטוגרפיה הרכה, ומיקרופלואידיקה. פלטפורמת microchannels endothelialized מחקה את הגיאומטריה (3D) תלת ממדית של in vivo microvessels, פועלת תחת זרימת זלוף רציפה מבוקרת, מאפשרת הדמיה באיכות גבוהה ובזמן אמת, ויכולה להיות מיושמת למחקר כלי הדם.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Li, X., Mearns, S. M., Martins-Green, M., Liu, Y. Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip. J. Vis. Exp. (80), e50771, doi:10.3791/50771 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

מאמצים כבר התמקדו בפיתוח במבחני חוץ גופית ללימוד microvessels משום in vivo מחקרים בבעלי החיים נמצאים זמן רב יותר, יקר, ותצפית וכימות הם מאוד מאתגרים. עם זאת, יש לי קונבנציונלי במבחני microvessel מבחנה מגבלות כאשר מייצגים in vivo microvessels ביחס לגיאומטריה תלת ממדי (3D) ומתן זרימת נוזל רציף. באמצעות שילוב של טכניקת photolithographic reflowable photoresist, ליטוגרפיה הרכה, ומיקרופלואידיקה, פיתחנו endothelialized חתך עגול רב מעמיק microchannels-on-a-chip, אשר מחקה את הגיאומטריה 3D של in vivo microvessels ופועל תחת זלוף הרציף המבוקר זרימה. Photoresist reflowable חיובי שימש לפברק עובש הורים עם רשת microchannel חתך חצי עגולה. על ידי היישור והמליטה של ​​שני polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels replicated מעובש האב, רשת microchannel גלילית נוצרה. בקטרים ​​של microchannels יכולים להיות מבוקרים היטב. בנוסף לכך, תאים ראשוניים אדם טבור וריד אנדותל (HUVECs) נזרעו בתוך השבב הראו כי התאים מרופדים משטח הפנימי של microchannels תחת זלוף המבוקר שנמשך פרק זמן בין 4 ימים ועד 2 שבועות.

Introduction

Microvessels, כחלק ממערכת מחזור הדם, לתווך האינטראקציות בין דם וברקמות, תומך בפעילות המטבולית, להגדיר microenvironment רקמות, ולשחק תפקיד קריטי במצבים פתולוגיים רבות ובריאות. שחזור של microvessels תפקודי במבחנה יכול לספק פלטפורמה למחקר של תופעות כלי דם מורכבות. עם זאת, מקובל במבחני microvessel מבחנה, כגון מבחני נדידת תאי אנדותל, מבחני היווצרות צינור אנדותל, מבחני טבעת אבי העורקים חולדה ועכבר, לא מצליחין לשחזר את in vivo microvessels ביחס לגיאומטריה (3D) תלת ממדים ובקרת זרימה רציפה 1-8. מחקרים של microvessels באמצעות מודלים של בעלי חיים ובמבחני vivo, כגון assay אנגיוגנזה בקרנית, assay אנגיוגנזה קרום chorioallantoic אפרוח, וassay תקע Matrigel, הם יותר גוזלים זמן, גבוהים בעלות, מאתגרים ביחס להתבוננות וquantifications, ולהעלות סוגיות אתיות 1, 9-13.

התקדמות בmicromanufacturing וטכנולוגיות שבב microfluidic אפשרה מגוון של תובנות המדעים ביו תוך צמצום העלויות והמורכבויות הניסיוניות הגבוהות הקשורות בבעלי חיים ובvivo 14 מחקרים, כגון תנאים ביולוגיים לשלוט בקלות ובאופן הדוק וסביבות fluidic דינמיות, שלא היה היה אפשרי עם טכניקות macroscale קונבנציונליות.

כאן, אנו מציגים גישה לבנות endothelialized microchannels-on-a-chip אשר מחקה את הגיאומטריה 3D של in vivo microvessels ופועל תחת זרימת זלוף רציפה מבוקרת על ידי שימוש בשילוב של טכניקת photolithographic reflowable photoresist, ליטוגרפיה הרכה, ומיקרופלואידיקה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ייצור photolithography של עובש מאסטר Photoresist

הפרוטוקול הבא מציג את התהליך לפברק את microchannels עם קטרים ​​בין 30-60 מיקרומטר. כדי לקבל microchannel בקוטר קטן (פחות מ 30 מיקרומטר), ציפוי ספין יחיד של photoresist יש צורך.

  1. העבר photoresist הזרמה מחדש מהמקרר ב 4 מעלות צלזיוס לחדר הנקיה 24 שעות לפני השימוש ולאפשר לו להתחמם לטמפרטורת חדר.
  2. יש לנקות את פרוסות סיליקון ולאפות אותו במשך שעה אחת בכל 150 ° C כדי לאפשר לו להתייבש. ההתייבשות תסייע להידבקות photoresist מצע סיליקון.
  3. ספין מעיל השכבה הראשונה של photoresist באמצעות המתכון הבא:
שלב זמן (שניות) מהירות (סל"ד) ההאצה
1 2 </ P> 300 הגבוה ביותר
2 10 0
3 3 300 הגבוה ביותר
4 60 600 הגבוה ביותר
5 10 500 הגבוה ביותר
6 10 600 הגבוה ביותר
  1. ואז, לאפות את רקיק על פלטה חמה עם טמפרטורה של 110 מעלות צלזיוס למשך 90 שניות. לאחר לאפות הרכה בעובי של photoresist יהיה 20-30 מיקרומטר.
  2. ספין מעיל שכבה שנייה של photoresist בעקבות אותו המתכון המשמש לשכבה הראשונה.
  3. לאפות רך רקיק שוב על ידי הצבתו על פלטה חמה עם טמפרטורה של 110 מעלות צלזיוס למשך 90 שניות. לאחר לאפות רך זה העובי של photoresist יהיה 40-60 מיקרומטר.
  4. ליצור דפוסי אב חיוביים על ידי חשיפת photoresist לאור UV עם מינון חשיפה של 14,500 mJ / 2 ס"מ באמצעות מסכת סרט.
  5. לדלל את היזם עם מים (DI) deionized (1:2 (V / V)). שוטפים את פרוסות שוב ושוב בפתרון עד שהדפוס הוא מפותח. לאחר מכן לשטוף עם מים די רקיק ולייבש אותו באמצעות גז חנקן.
  6. הזרמה מחדש: הנח את פרוסות על פלטה חמה עם טמפרטורה של 120 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות ומכסים בצלחת פטרי זכוכית כדי למנוע אידוי ממס. הסר את רקיק מהפלטה החמה ולאפשר לו להתקרר לטמפרטורת חדר. עובי photoresist לאחר הזרמה מחדש יהיה 50-60 מיקרומטר.

2. ייצור יתוגרפיה רך של רשת microchannel PDMS

  1. הכן את פתרון polydimethylsiloxane (PDMS) במשקל היחס של 10:1 (בסיס: סוכן ריפוי) ולערבב אותו ביסודיות בעזרת מערבל צנטריפוגלי פלנטרית.
  2. להטיל את פתרון PDMS על תבנית המאסטר photoresist הוזרם מחדש. הנח את PDMS casted בייבוש למשך 15 דקות לדגה. השתמש בגז חנקן כדי להסיר כל בועות שנותרו במידת צורך.
  3. אופים בתנור PDMS בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות כדי לאפשר לו לרפא. ואז להסיר את שכבת PDMS נרפא מעובש האב.
  4. השתמש אגרופן חידד ליצור חורי כניסה / יציאה על ידי ניקוב חורים ברשת הערוץ. נקה את פני השטח של PDMS שימוש בגז חנקן.
  5. טיפול בשתי שכבות PDMS עם פלזמה חמצן במשך 30 שניות בתוך שואב פלזמה בלחץ הפעלה של טור 4.5 x 10 -2 וקצב זרימת חמצן של 3.5 רגל 3 / דקה. לאחר מכן, ליישר את פני השטח של PDMS ידני תחת מיקרוסקופ אופטי. השתמש בטיפת מים במידת צורך לשליטה טובה יותר ביישור.
  6. אופים את המכשיר בתנור בחום של 60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי להשיג מליטה קבועה.

3. תרבות HUVEC וזריעה בצ'יפ

  1. תרבות HUVECs עם מדיום התרבות עם L-גלוטמין בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS). עבור הקטעי ניסוי דואר בין 2 ל 5 היו בשימוש.
  2. ברגע שהם HUVECs מחוברות, לספור את התאים ולקצור אותם על ידי השטיפה הראשונה את התאים עם HEPES נאגר תמיסת מלח (HEPES-BSS), ולאחר מכן טיפול בתאים עם טריפסין / EDTA דגירה של 2-6 דקות על 37 ° C. לאחר trypsinization הושלם, לנטרל את טריפסין / EDTA עם פתרון נטרול טריפסין. צנטריפוגה ולהשעות את התאים במדיום התרבות עם 8% dextran כדי לאסוף אותם. Dextran שימש כדי להגדיל את הצמיגות בינונית כדי לסייע בזריעת תאים טובה יותר וקובץ מצורף.
  3. פנק את המכשיר עם פלזמה חמצן במשך 5 דקות עם לחץ הפעלה של 10 -2 טור x 4.5 וקצב זרימת חמצן של 3.5 רגל 3 / דקה. ואז לטעון את המכשיר עם מים די ולטפל עם אור UV במשך 8 שעות בבטיחות ביולוגית ברדס למינרית לעיקור.
  4. יום אחד לפני שהתאים מוכנים, לשטוף את המכשיר עם 1x בופר פוספט (1x PBS) ולאחר מכן עם מעיל פיברונקטין (100 מיקרוגרם / מ"ל, דילuted עם 1x PBS) ודגירה במקרר ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  5. לאחר ציפוי פיברונקטין, לשטוף את המכשיר עם 1x PBS לאחר מכן לטעון עם מדיום לתרבות. דגירה את המכשיר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  6. לטעון את תאי HUVEC ב8% מדיום תרבות dextran עם ריכוז תא של 3-4 x 10 6 תאים / מ"ל. מקום טיפת μl 20 של תאים בכניסה לאחד את המכשיר ולהטות אותו כדי להציג את התאים לתוך ערוץ microfluidic. לאחר 15-20 דקות התאים יתחילו לצרף את הקירות הצדדיים של הערוצים. לסובב את המכשיר כל 15 דקות כדי ליצור התפלגות אחידה יותר של תאים. במידת צורך, ניתן לבצע טעינה נוספת.

4. התקנת זלוף לטווח ארוך

לאחר 5-6 שעות של תרבות סטטי, את HUVECs המצורף יתחיל להתפזר באופן מלא. הגדר זלוף באמצעות מערכת משאבת מזרק נשלט מרחוק עם זרם קבוע של 10 μl / שעה. זלוף יכול להיות מותאם Fאו שיעור גבוה יותר זרימה, ויכול להימשך פרק זמן שבין 4 ימים לשבועות 2.

5. מכתים תא ואפיון מיקרוסקופ

  1. כאשר התאים מגיעים למפגש בתוך המכשיר, ראשית, לשטוף את המכשיר עם 1x PBS להסיר את המדיום באופן יסודי. ואז לטעון את המכשיר עם צבע אדום מדוללים עם מדלל (4 μl-1 מ"ל). טען את הצבע הדומה להליך טוען תא. דגירה את המכשיר בחושך במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר, ולאחר מכן לשטוף את המכשיר עם התרבות בינונית כדי לעצור את הכתמים. דגירה ארוכה של הצבע יכולה לגרום לרעילות וdisadhesion סלולריות.
  2. טען את המכשיר בצבע כחול מדוללים עם 1x PBS (2 טיפות לכל מ"ל). דגירה בחושך במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר ולאחר מכן לשטוף ביסודיות את המכשיר עם 1x PBS.
  3. לבחון את מכתים התא תחת מיקרוסקופ אופטי הפוך. אם הכתמים היו טובים, לטעון את microchannels עם מדיום קיבוע (3.5% בדילול paraformaldehyde עם 1x PBS), ואז לצלולהמכשיר בתיקון בינוני ולכסות אותו לחלוטין עם רדיד אלומיניום. אחסן את המכשיר במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי למנוע את המכשיר מהתייבשות וphotobleaching. המכשיר הקבוע מוכן כעת להדמית confocal, אשר יכול להיעשות על ידי סריקת לייזר מיקרוסקופ confocal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הגישה שלנו לפברק רשת microchannel רב מעמיקה מחקה את גיאומטריות 3D המורכבות של in vivo microvessels, שבו יש לי microchannels מעוגל חתכים 15. בנוסף, בקטרים ​​של ערוצי הסתעפות הוריים ובת הערוצים כ לציית לחוק של מוריי לשמירה על זרימת הנוזל ברמה נדרשת, כך שהתנגדות הערוץ הכללית היא נמוכה, ומהירויות זרימה יותר אחידות בכל הרשת 16-18. התהליכים והתוצאות עבור הייצור של עובש אב photoresist חצי עגול ורשת PDMS חתך עגולה microchannel הודגמו בסרט 1, איור 2, וסרט 2, בהתאמה. התכונות הגיאומטריות של רשת microchannel PDMS אופיינו ומוצגות באיור 2. התוצאות שלנו מראות כי טכניקת הזרמה מחדש photoresist יכולה ליצור רשתות ערוץ מסעף רב המעמיקותנה גישה נוחה יותר על ידי טכניקות reflow photoresist, ולאפשר תכנון מערכות biomimetic כלי הדם אשר כ לציית לחוק של מוריי.

ברבים במודלים חוץ גופית, תאי כלי דם בדרך כלל על צלחות תרבית מישוריים, מסננים, או מצעים אלה מצופים הידרוג. בתנאים אלה את microvessels נוצרים באופן אקראי על ידי הרכבה עצמית הסלולר. בנוסף, יש לי מבחני קונבנציונליים קשיים הכרוכים בהשגת תזרים קבוע לאורך תאי אנדותל. חוסר זרימת מדיה לטווח ארוך ומתמשכת מונע את היכולת לשמור על יציבותו של תא האנדותל monolayer עם פונקציות מכשול מתאימות. במודל שלנו, היתרון של מיקרופלואידיקה החלים הוא נוחות גישה לנוזל ובקרה (משתנה ספיקות, משך ודפוסים), כמו גם להיפטר מפסולת. אנחנו מדגימים את התהליכים לתאי וריד טבור אנושיים עיקריים אנדותל (HUVECs) הזריעה בmicrochannels ולהגדיר טינג מערכת לטווח ארוך נוזל זלוף לתרבית תאים (איור 3). יתר על כן, בגלל הגיאומטריות המורכבות של in vivo microvasculature, ניטור בזמן אמת של כלי הדם הקטנים האלה הוא קשה. השבב מבוסס פיתחה PDMS מציע תכונות אופטיות טובות ומאפשר הדמיה באיכות גבוהה ובזמן אמת של microchannels endothelialized. (איורים 4 ו Movie 3)

סרט 1. הליכי ייצור Schematic לתבניות אב photoresist. בתחילה, מצע סיליקון לניקוי הוכן מראש. שכבת photoresist הזרמה מחדש החיובית הייתה ספין מצופה על גבי מצע סיליקון והיה אפויה ומיובשים. Photoresist נחשף לאור UV באמצעות מסכה בדוגמת, ולאחר מכן, את microchannels הדוגמת פותחו. רשת microchannel חתך חצי עגולה נוצרה לאחר הזרמה מחדש ב 120 מעלות צלזיוס במשך 4 דקות."Target =" _blank movie1.wmv "> לחץ כאן לצפייה בסרט.

איור 1
איור 1. SEM מראה photoresist פיתחה) לפני הזרמה מחדש;. ב) לאחר הזרמה מחדש; ג) יצוק PDMS מציג החתך של להתאפק לפני reflowing; התמונה מראה חתך מלבני; ד) יצוק PDMS מראה חתך חצי עגול של להתנגד לאחר reflowing; החתך לאחר הזרמה מחדש נשלט על ידי עיצוב הממד הראשוני של הדפוס וטמפרטורת הזרמה מחדש. (הודפס מחדש באישור מהעיון 15). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

סרט 2. הליכי הייצור סכמטית לרשת microchannel גלילית בPDM S. פתרון PDMS לוהק על תבנית photoresist ונרפא בתנור בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות. שתי שכבות זהות נרפאו PDMS, כל אחד מהם יש רשת microchannel חתך חצי עגולה, היו מיושרות ומלוכדות יחד כדי ליצור microchannels עם חתכים מעגליים. לחצו כאן לצפייה בסרט.

איור 2
איור 2. א) רשת microchannel גלילית מיושרת ומלוכדת בPDMS. BD) חוזר חתכים של תבניות PDMS להראות ממדי ערוץ בכל הסתעפות רמה (1-1 ', 2-2 ", ו3-3"). בנוסף, נתונים אלה מראים את היצירה של multibranching ורשת ערוץ microfluidic multidepth המעגלי חתך.

דף = "תמיד"> איור 3
איור 3. תרשים סכמטי המציג זלוף לטווח ארוך באמצעות השבב באמצעות משאבת מזרק בשלט רחוקה.

איור 4
איור 4. תמונות מיקרוסקופית באמצעות ניאון קרום תא צבע (אדום) ותא תכנית גרעינית צבע (כחול) כי קו HUVECs המשטח הפנימי של רשת microchannel גלילית באזורי הסתעפות שונים.) למעלה, ב) התיכון, וג) תחתון. ד) תמונת מיקרוסקופיה confocal מראה את תצוגת החתך המעגלית של HUVECs המצפים את רשת הערוץ. סולם ברים: 100 מיקרומטר.

סרט 3. סרט Confocal מראה רירית התא יחד רשת הערוץ המעגלית."Target =" _blank iles/ftp_upload/50771/50771movie3.wmv ​​"> לחץ כאן לצפייה בסרט.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

1. ייצור עובש מאסטר

אחד העקרונות המנחים את עיצוב ולmorphometry כלי דם ידוע כדין של מוריי 16, שבו נקבע כי חלוקת קטרי כלי ברחבי הרשת נשלטת על ידי שיקול מינימום אנרגיה. גם הוא קובע כי הקובייה של הקטרים ​​של כלי הורה בהסתעפות שווה לסכום את הקוביות של הקטרים ​​של בת כלי ( משוואת 1 ) 19 בנוסף לכך, כבר בשימוש של חוק Poiseuille להעריך את גודל מאמץ הגזירה ברוב של כלי הדם כ משוואה 2 . בי1eq3.jpg "src =" "width =" / files/ftp_upload/50771/50771eq3.jpg 25px "/> הוא מאמץ גזירת hemodynamic, μ הוא צמיגות הדם, Q הוא קצב הזרימה, ו-R הוא רדיוס כלי 20,21. להסתעפויות סימטריות, תוצאה חשובה המבוססת על החוק והמשפט של Poiseuille של מוריי הוא שמאמץ גזירת הקיר נשאר קבוע לאורך כל רשת כלי הדם. כך, רשת ערוץ מפוברק סימטרית microfluidic עם חתכים מעגליים, אם הערוץ ממדים בחוק של ההסתעפויות לציית מאריי, מאמץ הגזירה חווה על ידי תאי האנדותל צריך להיות קבועים בערוצי הסתעפות שונים.

טכניקות microfabrication רבות ותהליכים שיושמו לייצור של microchannels המשמש לתאי כלי דם 22-25, לעומת זאת, את microchannels התוצאה הסתיים בחתכים מלבניים, מרובעים או טרפז של ערוצים. את החתכים המלבניים של ערוצים הם קוןstructed עם פינות חדות ומעברים פתאומיים בהסתעפויות, אשר יכול להטיל מגוון רחב של נפחי לחצי גזירה נוזלים וגיאומטריות nonphysiological על תאים בתפקידים שונים בערוץ, ובכך וכתוצאה משינויים בתא הפיסיולוגיה 26,27.

תהליך הזרמה מחדש photoresist, וכתוצאה מערוץ פרופיל מעוגל, כרוך בשני הליכים, 1) היתוך של photoresist הדוגמת והנוזל להתנגד משטחים נמשכים לתוך צורה שמקטינה את האנרגיה של המערכת 28,29 ו2) וקירור השלב הבא מיצוק תהליך ההיתוך. הצורות של ערוצי reflowed הן מקורבים היטב על ידי משטח semicylindrical. ואחריו ייצור עובש אב הוזרם מחדש, גישה ליתוגרפיה רכה סטנדרטית שימש לפברק רשת PDMS microfluidic הערוץ עם חתך עגול. התוצאות שלנו הראו כי טכניקת הזרמה מחדש photoresist יכולה ליצור רשתות microchannel הסתעפות רב מעמיקות בstraigh יותרגישה קדימה לא, ומאפשר לנו לתכנן מערכות כלי הדם biomimetic כי כ לציית לחוק של מוריי ולחקות את הגיאומטריה של in vivo microvasculature, כך שהתנגדות הערוץ הכללית היא נמוכה, ואת וריאציות מתח הגזירה ברמות הסתעפות שונות ניתן למזער במפוברק רשת ערוץ microfluidic.

את microvessels הדם הפיזיולוגי לאמץ חתך עגול פחות או יותר עם ​​רדיוסים בין 30-300 מיקרומטר 30. הממדים עבור רשת microchannel הפגינה בעיתון זה היו מגוון סביב 60 מיקרומטר עד 100 מיקרומטר ברמות הסתעפות שונות. לפברק microchannels עם מגוון רחב של קטרים ​​לחיקוי in vivo microvessels שונה, אנו ממליצים להשתמש בהזרמה מחדש של שכבה סובב יחידה להתנגד (מוגבלת ל 30 מיקרומטר) או צמיגות נמוכה אחרת מתנגדת. לmicrochannel עם קוטר גדול יותר (30-60 מיקרומטר), ניתן ליישם הליך כפול ציפוי כדי לקבל סרט photoresist עבה15. נוסף ספין ציפוי מעל שתי שכבות יש להימנע כדי למנוע עובי סרט לא אחיד, מה שיכול לגרום למינון חשיפה מדויקת. לעובי סרט מעל 60 מיקרומטר, photoresists reflow צמיג גבוהה יותר אחר מומלץ.

במצב אידיאלי, לפברק להתנגד עובש עם חתך חצי עגול, עובי הסרט יכול להיות קבוע מראש בתחילה על ידי מתן רוחב הנדרש ואורך מוקד של כmicrochannel משוואה 4 , שבו H הוא העובי סובב הסרט הנדרש, R הוא חצי מרוחב הערוץ, R הוא הרדיוס המתמיד של עקמומיות, h הוא הגובה של העקמומיות המרכזי, ו-E היא היחס בין להתנגד כרכים של microchannel לפני ואחרי reflowing 31. למשטח גלילי של רוחב נתון של microchannel, נפח מסוים אחד הוא להתנגד מחדשרכישתו. עם זאת, כבר דיווחו כמה פרמטרים כדי להשפיע photoresist הוזרם מחדש ולהפוך את פרופילי הערוץ הביאו מורכבים יותר, כגון זווית ביקורתית ותנועת גבול בין photoresist והמצע המוצק, אידוי חומר במהלך הזרמה מחדש אפייה, טמפרטורה ועיתוי לתהליך הזרמה מחדש, outgassing, אחידות מצע, ולהתנגד למאפיינים 32-34. לדוגמה, טמפרטורת הזרמה מחדש ותזמון יכולים לגרום לשינוי נפח התנועה גורם לגבול, ולכן משתנות הזווית הביקורתית והסופית reflowed להתנגד פרופיל 33. כפי שדווח על ידי העבודה הקודמת שלנו 15, בתהליך ירידה בהזרמה מחדש את רוחב הערוץ ב -2% בממוצע בשל ירידה בנפח ותנועת photoresist גבול. בנוסף, הנפח להשגת משטח גלילי צריך לעשות הפרשה להשפעה של אידוי חומרים במהלך תהליך הזרמה מחדש 35,36. אם משטחים גליליים עם רדיוסים שונים נדרשים באמצעותרשת microchannel יש צורך לשנות את הרוחב של microchannels, וכתוצאה משינויים בהיקפים באזורים שונים ברשת 15. לפברק הצלחת רשת ערוץ גלילית בקטרים ​​שונים, מתנגד רוחב / כרכים, טמפרטורות reflow ועיתוי קריטיות, זוויות, תנועת גבול, להתנגד צמיגויות ופרוטוקולי ציפוי ספין, ונכסים מצע יש לקחת בחשבון ונבדק.

2. תרבית תאים לטווח ארוך

חשיבותה של זרימה ולחץ גזירת הקיר המשויך הוכרה גם בויסות הביולוגיה אנדותל. זה כבר ראה בתחומים כגון גרימת שינויים בצורת תא ואת הכיוון, הפרשה וארגון, ריבוי והתמיינות, איתות תאיות, ייצור חלבוני שלד תא ועל ביטוי גנים, התבגרות כלי ומבנה ופונקציות מכשול 37-47. הנוכחי בשיטות מבחנה לגיבוש הסוףצינורות othelial בדרך כלל להסתמך על תאי אנדותל '(ECS) ארגון עצמי עם או בלי תאי mesenchymal במטריקס (ECM) (סוג אני קולגן, פיברין, או Matrigel) 48-54. למרות שתרבויות אלה עיצב בהצלחה כמה התנהגויות כלי הדם, את כלי המלאכותיים, הנוצרים באמצעות תהליך אקראי של המורפוגנזה חסר את שחזור המרחבי הרצוי וכיוון. בנוסף, ההשפעה של זרימה בכלי דם נשארה יציבות במידה רבה ידועה כי כלי עצמי התאספו אלה לא לשלב בקלות זרימת luminal עם ארגון צינורי 55 3D, שהתחזו לאתגר הנדסי לכלי דם יש פונקציות מכשול ויציבות כלי דם לטווח ארוך.

מערכות microfluidic הוכיחו להיות מעשי ושימושי להחדרת תזרימי למגוון של ניתוח ביוכימי והביולוגי 56,57. הגישה שלנו מספקת דרך נוחה להציג את זרימת נוזל על התאים בתרבית. אנחנו השתמשנומשאבה מתקדמת נשלט מרחוק מזרק כדי להשיג שליטה נוחה אך יציבה ומדויקת זרימה דרך microchannels לתרבית תאים לטווח ארוך (בין 4 ימים ו -2 שבועות).

3. תרבית תאים בשבב

חמצון פלזמה בסיוע של microchannels PDMS מציג קבוצות silanol (SiOH) על המשטחים אשר הופך את המשטח הידרופילי ועזר בציפויי חלבון נוספים. חלבוני ECM שונים (פיברונקטין, ג'לטין, קולגן ו) נבדקו לקובץ מצורף תא, ואת התוצאה הטובה ביותר נמצא להיות ציפוי פיברונקטין. את HUVECs הוכנו בריכוז של 3 x 10 6 תאים / מ"ל בתקשורת והתרבות בתוספת 8% dextran (70 KDA) לזריעה. Dextran מגביר את הצמיגות של התקשורת כדי לאפשר בקרה טובה על זריעת צפיפות של ECS.

Monolayer ומחוברת פותחה בין 2-4 ימים של HUVECs להיות חשוף לזרימה מתמדת בינונית. כדי להמחיש את התאים אחריתרבית תאים, אנחנו שכותרתו תאים עם קרום מכתים וצבעים מכתים גרעינים, צבעים אלה הציגו cytotoxicity נמוך יותר 58. אנו מוכתמים את התאים כmonolayer חסיד בתרבית בשבב. לשטוף 1x PBS מלא נחוץ כדי למנוע צבעים נוספים שנלכדו בתוך השבב.

לסיכום, על ידי שילוב של טכניקת הזרמה מחדש photoresist ושכפול PDMS, רשת microchannel רב עומק המפותח הייתה מקורב על ידי משטח עגול וקטרי הערוץ בכל הסתעפות כ לציית לחוק של מוריי. את וריאציות מתח הגזירה ברמות שונות הסתעפות ניתן למזער ברשת ערוץ microfluidic המפוברק. בנוסף, התוצאות מתרבית תאים שצוינו המצב הבריא של תאי האנדותל. לפיכך, microchannels-on-a-chip endothelialized המפותחים מספק גישה מהירה ושחזור ליצירה מעגלית רשתות microchannel multidepth רבת הסתעפות חתך ו, אשר מחקהגיאומטריה של in vivo microvessels. ההליך מדגים את השימוש ביכולות ייחודיות בmicromanufacturing המתקדם וטכנולוגיות microfluidic ליצור מודל microvasculature עם שליטה לטווח ארוך, מתמשכת זלוף, כמו גם באיכות גבוהה ובזמן אמת יכולת הדמיה. עם השירות הולך וגדל של ערוצי microfluidic לביולוגיה של תא, הנדסת רקמות, ויישומי Bioengineering, את microchannels-on-a-chip endothelialized הוא assay פוטנציאל למחקר כלי הדם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך בחלקו על ידי הקרן הלאומית למדע (NSF 1,227,359), תכנית WVU EPSCoR מומנה על ידי הקרן הלאומית למדע (EPS-1,003,907), המשרד מראש WVU בחסות הקרן הלאומי למדע (1,007,978), וWVU PSCoR, בהתאמה. עבודת microfabrication נעשתה במתקני WVU משותפים מחקר (מתקני חדר נקיים) ומחקר נייד אינטגרטיבית Microfluidic במעבדת צ'יפ (שבב מעבדה) באוניברסיטת וירג'יניה המערבית. ההדמיה confocal נעשתה במתקן ההדמיה מיקרוסקופ WVU.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
Reflow Photoresist AZ Electronic Materials AZP4620
Developer AZ Electronic Materials AZ 400K
PDMS Dow Corning Corporation Sylgard 184
MCDB 131 Culture Medium Invitrogen 10372-019
NacBlue Nuclei Staining Invitrogen H1399
PKH Red Stain Sigma MINI26 and PKH26GL
Fibronectin Gibco PHE0023
L-Glutamine Sigma G7513
Phosphate Buffered Saline Invitrogen 14040-133
HEPES Buffered Saline Solution Lonza CC-5024
Trypsin/EDTA Invitrogen 25300-062
Trypsin Neutralizing Solution Lonza CC-5002
PDMS Curing Agent Dow Corning Corporation Sylgard 184
Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells Lonza CC-2517
Fetal Bovine Serum Lonza 14-501F
Diluent C Sigma CGLDIL
Hoechst33342 Invitrogen, Molecular Probes R37605
Dextran Sigma 95771
3.5% Paraformaldehyde Electron Microscopy Science 15710-S
Equipment
Spinner Laurell Technologies Corporation WS-400BZ-6NPP/LITE
Desiccator BelArt Products 999320237
Inverted Microscope Nikon Eclipse Ti
Syringe Pump System Harvard Apparatus PHD Ultra
Laminar Biosafety Hood Thermo Scientific 1300 Series A2
Planetary Centrifugal Mixer Thinky ARE-310
Isotemp Oven Fisher Scientific 13-246-516GAQ
Optical Microscope Zeiss Invertoskop 40C
Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Hotplate Barnstead/Thermolyne Cimarec SP131635
Laser Scanning Confocal Microscope Zeiss LSM 510

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Adair, T. H. Angiogenesis: Integrated systems physiology: from molecule to function to disease. 1st edition, Biota Publishing. (2011).
  2. Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvasc. Res. 74, 172-183 (2007).
  3. Smith, E. J., Staton, C. A. Tubule formation assays. Angiogenesis assays: A critical appraisal of current techniques. John Wiley & Sons Ltd. West Sussex, UK. 65-87 (2006).
  4. Nakatsu, M. N., Davis, J. J., Hughes, C. C. W. Optimized fibrin gel bead assay for the study of angiogenesis. J. Vis. Exp. (3), e186 (2007).
  5. Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Lab. Invest. 63, 115-122 (1990).
  6. Aplin, A. C., Fogel, E., Zorzi, P., Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis. Methods Enzymol. 443, 119-136 (2008).
  7. Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: A quarter century of search and discovery. J. Cell. Mol. Med. 13, 4113-4136 (2009).
  8. Griffith, L. G., Swart, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 211-224 (2006).
  9. Folkman, J. History of angiogenesis. Angiogenesis: An integrative approach from science to medicine. Springer. (2008).
  10. Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: A critical overview. Clin. Chem. 49, 32-40 (2003).
  11. Auerbach, R., Akhtar, N., Lewis, R. L., Shinners, B. L. Angiogenesis assays: Problems and pitfalls. Cancer Metastasis Rev. 19, 167-172 (2000).
  12. Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int. J. Exp. Pathol. 90, 195-221 (2009).
  13. Staton, C. A., Stribbling, S. M., et al. Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo. Int. J. Exp. Pathol. 85, 233-248 (2004).
  14. Moraes, C., Mehta, G., Lesher-Perez, S. C., Takayama, S. Organs-on-a-Chip: A focus on compartmentalized microdevices. Ann. Biomed. Eng. 40, (6), 1211-1227 (2012).
  15. Huang, Z., Li, X., Martins-Green, M., Liu, Y. Microfabrication cylindrical microfluidic channel networks for microvascular research. Biomedical Microdevices. 14, (5), 873-883 (2012).
  16. Murray, C. D. The physiological principle of minimum work applied to the angle of branching of arteries. J. Gen. Physiol. 9, (6), 835-841 (1926).
  17. Zamir, M., Medeiros, J. A. Arterial branching in man and monkey. J. Gen. Physiol. 79, 353-360 (1982).
  18. Gafiychuk, V. V., Lubashevsky, I. A. On the principles of the vascular network branching. J. Theor. Biol. 212, 1-9 (2001).
  19. Sherman, T. F. On connecting large vessels to small. The meaning of Murray's law. J. Gen. Physiol. 78, (4), 431-453 (1981).
  20. Kamiya, A., Bukhari, R., Togawa, T. Adaptive regulation of wall shear stress optimizing vascular tree function. Bull Math Biol. 46, (1), 127-137 (1984).
  21. LaBarbera, M. Principles of design of fluid transport systems in zoology. Science. 249, 992-1000 (1990).
  22. Emerson, D. R., Cieslicki, K., Gu, X., Barber, R. W. Biomimetic design of microfluidic manifolds based on a generalized Murray's law. Lab Chip. 6, 447-454 (2006).
  23. Lu, H., Koo, L. Y., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Anal. Chem. 76, 5257-5264 (2004).
  24. Shevkoplyas, S. S., Gifford, S. C., Yoshida, T., Bitensky, M. W. Prototype of an in vitro model of the microcirculation. Microvasc. Res. 65, 132-136 (2003).
  25. Kaihara, S., Borenstein, J., et al. Silicon micromachining to tissue engineer branched vascular channels for liver fabrication. Tissue Eng. 6, 105-117 (2000).
  26. Fisher, A. B., Chien, S., Barakat, A. I., Nerem, R. M. Endothelial cellular response to altered shear stress. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 281, (3), L529-L533 (2001).
  27. Nerem, R. M., Alexander, R. W., et al. The study of the influence of flow on vascular endothelial biology. Am. J. Med. Sci. 316, (3), 169-175 (1998).
  28. Daly, D., Stevens, R. F., Hutley, M. C., Davies, N. The manufacture of microlenses by melting photoresist. Meas. Sci. Technol. 1, (8), 759-766 (1990).
  29. Schilling, A., Merz, R., Ossmann, C., Herzig, H. P. Surface profiles of reflow microlenses under the influence of surface tension and gravity. Opt. Eng. 39, (8), 2171-2176 (2000).
  30. Young, B., Heath, J. W. Wheater's functional histology: A text and colour atlas. 4th edition, Churchill Livingstone. (2000).
  31. O'Neill, F. T., Sheridan, J. T. Photoresist reflow method of microlens production. Part 1: Background and experiments. Optik Int. J. Light Electron Opt. 113, 391-404 (2002).
  32. de Gennes, P. G. Wetting: statics and dynamics. Rev. Mod. Phys. 57, 827-863 (1985).
  33. Elias, H. G. An Introduction to Polymer Science. VCH Publishers. New York. (1997).
  34. Voinov, O. V. Dynamic edge angles of wetting upon spreading of a drop over a solid surface. J. Appl. Mech. Tech. Phys. 40, 86-92 (1999).
  35. Daly, D., Stevens, R. F., Hutley, M. C., Davies, N. The manufacture of microlenses by melting photoresist. Meas. Sci. Technol. 1, 759 (1990).
  36. Jay, T. R., Stern, M. B. Preshaping photoresist for refractive microlens fabrication. Opt. Eng. 33, 3552-3555 (1994).
  37. Nerem, R. M., Alexander, R. W., et al. The Study of the influence of flow on vascular endothelial biology. Am. J. Med. Sci. 316, (3), 169-175 (1998).
  38. Chien, S., Li, S., Shyy, Y. J. Effects of mechanical forces on signal transduction and gene expression in endothelial cells. Hypertension. 31, 162-169 (1998).
  39. Li, Y. S., Haga, J. H., Chien, S. Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells. J. Biomech. 38, 1949-1971 (2005).
  40. Lee, E. J., Vunjak-Novakovic, G., Wang, Y., Niklason, L. E. A biocompatible endothelial cell delivery system for in vitro tissue engineering. Cell Transplant. 18, 731-743 (2009).
  41. Lee, E. J., Niklason, L. E. A novel flow bioreactor for in vitro microvascularization. Tissue Eng. Part C Methods. 16, 1191-1200 (2010).
  42. Chau, L., Doran, M., Cooper-White, J. A novel multishear microdevice for studying cell mechanics. Lab Chip. 9, 1897-1902 (2009).
  43. Meeson, A., Palmer, M., Calfon, M., Lang, R. A relationship between apoptosis and flow during programmed capillary regression is revealed by vital analysis. Development. 122, 3929-3938 (1996).
  44. Van Royen, N. J., Piek, J., Schaper, W., Bode, C., Buschmann, I. Arteriogenesis: mechanisms and modulation of collateral artery development. J. Nucl. Cardiol. 8, 687-693 (2001).
  45. Schaper, W. Therapeutic arteriogenesis has arrived. Circulation. 104, (17), 1994-1995 (2001).
  46. Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovas. Res. 87, (2), 320-330 (2010).
  47. Potter, C. M., Lundberg, M. H., et al. Role of shear stress in endothelial cell morphology and expression of cyclooxygenase isoforms. Arterioscler. Thromb. Vasc Biol. 31, 384-391 (2011).
  48. Montesano, R. In vitro rapid organization of endothelial cells into capillary-like networks is promoted by collagen matrices. J. Cell Biol. 97, 1648-1652 (1983).
  49. Darland, D. C., D'Amore, P. A. TGF beta is required for the formation of capillary-like structures in three-dimensional cocultures of 10T1/2 and endothelial cells. Angiogenesis. 4, (1), 11-20 (2001).
  50. Lawley, T. J., Kubota, Y. Induction to morphologic differentiation of endothelial cells in culture. J. Invest. Dermatol. 93, 59S-61S (1989).
  51. Kanzawa, S., Endo, H., Shioya, N. Improved in vitro angiogenesis model by collagen density reduction and the use of type III collagen. Ann. Plast. Surg. 30, 244-251 (1993).
  52. Davis, G. E., Bayless, K. J., Mavila, A. Molecular basis of endothelial cell morphogenesis in three-dimensional extracellular matrices. Anat. Rec. 268, 252-275 (2002).
  53. Velazquez, O. C., Snyder, R., Liu, Z., Fairman, R. M., Herlyn, M. Fibroblast-dependent differentiation of human microvascular endothelial cells into capillary-like 3-dimensional networks. FASEB J. 16, 1316-1318 (2002).
  54. Donovan, D., Brown, N. J., Bishop, E. T. Comparison of three in vitro human "angiogenesis" assays with capillaries formed in vivo. Angiogenesis. 4, 113-121 (2001).
  55. Tang, D. G., Conti, C. J. Endothelial cell development, vasculogenesis, angiogenesis, and tumor neovascularization: an update. Semin. Thromb. Hemost. 30, 109-117 (2004).
  56. Takayama, S., McDonald, J. C., et al. Patterning cells and their environments using multiple laminar fluid flows in capillary networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 5545-5548 (1999).
  57. Cho, B. S., Schuster, T. G., et al. Passively driven integrated microfluidic system for separation of motile sperm. Anal. Chem. 75, 1671-1675 (2003).
  58. Parsa, H., Upadhyay, R., Sia, S. K. Uncovering the behaviors of individual cells within a multicellular microvascular community. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, (12), 5133-5138 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics