في الجسم الحي بعد الولادة التثقيب الكهربائي والوقت الفاصل بين التصوير من أرومة عصبية الهجرة في الدماغ الحادة ماوس شرائح

* These authors contributed equally
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

الهجرة أرومة عصبية هو حدث أساسي في تكوين الخلايا العصبية بعد الولادة. نحن تصف البروتوكول لوضع العلامات كفاءة neuroblasts من قبل في الجسم الحي بعد الولادة التثقيب الكهربائي والتصور لاحقة من هجرتهم باستخدام الوقت الفاصل بين التصوير من شرائح الدماغ الحادة. نحن وتشمل وصفا للتحليل الكمي لديناميات أرومة عصبية من خلال تتبع الفيديو.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sonego, M., Zhou, Y., Oudin, M. J., Doherty, P., Lalli, G. In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices. J. Vis. Exp. (81), e50905, doi:10.3791/50905 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

منطقة subventricular (SVZ) هي واحدة من المنافذ الرئيسية العصبية في الدماغ بعد الولادة. هنا، الأسلاف العصبية تتكاثر وتؤدي إلى neuroblasts قادرة على التحرك على طول تيار المهاجرة منقاري (RMS) نحو البصلة الشمية (OB). مطلوب هذه الهجرة لمسافات طويلة للنضوج اللاحقة من الخلايا العصبية في الأطفال حديثي الولادة OB، ولكن الآليات الجزيئية التي تنظم هذه العملية لا تزال غير واضحة. التحقيق في مسارات إشارات التحكم أرومة عصبية حركية قد تساعد ليس فقط على فهم خطوة أساسية في تكوين الخلايا العصبية، ولكن أيضا لديها القدرة على التجدد العلاجية، نظرا لقدرة هذه neuroblasts لاستهداف مواقع الدماغ التي تأثرت الإصابة، السكتة الدماغية، أو الضمور.

في هذا المخطوط وصفنا بروتوكول مفصلة لفي الجسم الحي بعد الولادة التثقيب الكهربائي واللاحقة الوقت الفاصل بين التصوير الهجرة أرومة عصبية في RMS الماوس. التثقيب الكهربائي بعد الولادة يمكن بالنقل بكفاءة SVZ السلفالخلايا، والتي تولد بدورها neuroblasts المهاجرة على طول RMS. باستخدام متحد البؤر الغزل القرص الوقت الفاصل بين المجهري على الحادة الثقافات شريحة الدماغ، والهجرة أرومة عصبية يمكن رصدها في بيئة تشبه إلى حد كبير حالة في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، يمكن تتبع أرومة عصبية حركية وتحليلها كميا. كمثال على ذلك، ونحن تصف كيفية استخدام التثقيب الكهربائي في الجسم الحي بعد الولادة من البلازميد، معربا عن GFP لتسمية وتصور neuroblasts المهاجرة على طول RMS. ويمكن أيضا التثقيب الكهربائي من shRNA أو لجنة المساواة العرقية البلازميدات، معربا عن recombinase في الفئران خروج المغلوب الشرطي توظيف نظام LoxP أن تستخدم لاستهداف الجينات في المصالح. التلاعب الدوائي الحاد الثقافات شريحة الدماغ يمكن إجراء للتحقيق في دور جزيئات إشارات مختلفة في الهجرة أرومة عصبية. وذلك بربط في الجسم الحي electroporation مع الوقت الفاصل بين التصوير، ونحن نأمل أن فهم الآليات الجزيئية التي تتحكم في أرومة عصبية حركية والمساهمة في تطويرمنة رواية النهج لتعزيز إصلاح الدماغ.

Introduction

في أدمغة الثدييات، وتوليد خلايا عصبية جديدة (تكوين الخلايا العصبية) تحدث بعد الولادة بشكل رئيسي في منطقتين، منطقة subventricular (SVZ) من البطينين الوحشي والمنطقة جزئي التحبب في التلفيف المسنن من الحصين 1. أدلة كثيرة جمعت في السنوات الأخيرة تدعم دورا حاسما لتكوين الخلايا العصبية بعد الولادة في وظائف الذاكرة وحاسة الشم لمبة الحصين 1-3. الأهم من ذلك، تكوين الخلايا العصبية بعد الولادة يحمل أيضا الإمكانات العلاجية بسبب علاقته مع الاضطرابات العصبية التنكسية، وقدرة neuroblasts إلى الهجرة إلى المواقع المصابة في الدماغ 4-6.

وقد برزت منطقة subventricular (SVZ) مؤخرا في مكانة العصبية حاسمة. neuroblasts SVZ المستمدة من الهجرة نحو البصلة الشمية (OB) عبر تيار المهاجرة منقاري (RMS)، مما يجعل هذه العملية أطول الهجرة في 1،7،8 الدماغ بعد الولادة. أصبح SVZ / RMS / نظام OB الثدييات ونموذجا مفيدا لدراسة الخطوات المختلفة في تكوين الخلايا العصبية، مثل الانتشار والهجرة والتمايز 1،8. العديد من عوامل النمو والعظة خارج الخلية تنظيم الخلايا العصبية SVZ والهجرة على طول RMS، ولكن الآليات الجزيئية داخل الخلايا هي أبعد من أن تكون مفهومة تماما 1،9. الهجرة السليم على طول RMS هو أمر حاسم لنضوج الخلايا العصبية اللاحقة من الأطفال حديثي الولادة 10. بالإضافة إلى ذلك، فقد أظهرت بعض الدراسات أن neuroblasts SVZ مشتقة يمكن ترحيل من RMS إلى مواقع إصابات الدماغ 4-6،11-13. وبالتالي، والتحقيق في آليات تنظيم الإشارات أرومة عصبية الهجرة أمر أساسي ليس فقط لفهم تكوين الخلايا العصبية ولكن أيضا للتطبيقات العلاجية المحتملة.

هنا، نحن تصف بروتوكول مفصلة لتسمية الأسلاف العصبية SVZ من قبل في electroporation فيفو بعد الولادة ومراقبة الهجرة على طول RMS في الحادة الثقافات شريحة الدماغ باستخدام الوقت الفاصل بين متحد البؤر القرص الغزل microscoPY. ويستخدم على نطاق واسع في الدراسات التنموية التثقيب الكهربائي من المراحل الجنينية لالكبار 14-18. بل هو أداة قوية لاستهداف والتلاعب الأسلاف العصبية SVZ وتمثل بديلا أرخص وأسرع بكثير لحقن المجسم من ناقلات فيروسية أو جيل من النماذج المعدلة وراثيا 1،15،19،20. وهو إجراء بسيط نسبيا، والتي لا تحتاج لعملية جراحية ولديه معدلات البقاء على قيد الحياة عالية. التثقيب الكهربائي من shRNA أو لجنة المساواة العرقية البلازميدات، معربا عن recombinase في نماذج الماوس الوراثية توظيف نظام LoxP يمكن استخدامها لاستهداف الجينات في المصالح أو لتحقيق وضع العلامات الدائمة من الأسلاف SVZ، وبالتالي يمثل أداة مفيدة لدراسات تكوين الخلايا العصبية الكبار 21،22.

التصوير RMS أرومة عصبية الهجرة في الدماغ سليمة لا يزال تحديا بسبب القيود التقنية الحالية. ومع ذلك، يمكن رصد هذه العملية باستخدام القرص متحد البؤر الغزل الوقت الفاصل بين المجهري لشرائح الدماغ الحادة، والتي توفر SYST مناسبةم تشبه إلى حد كبير حالة في الجسم الحي قابلة أيضا للتلاعب الدوائية 23،24. سوف اقتران التثقيب الكهربائي في الجسم الحي بعد الولادة مع الوقت الفاصل بين التصوير تسهيل فهم الآليات الجزيئية التي تتحكم في أرومة عصبية حركية والمساهمة في وضع نهج جديدة لتعزيز إصلاح الدماغ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

هذا الإجراء هو وفقا للوائح وزارة الداخلية في المملكة المتحدة (قانون الإجراءات العلمية الحيوانية، 1986). ينبغي أن تتبع العلماء المبادئ التوجيهية الموضوعة والتي وافقت عليها الهيئات التنظيمية الحيوان المؤسسية والوطنية.

1. بعد الولادة التثقيب الكهربائي

1.1. إعداد الزجاج الشعيرات الدموية، والحل الحمض النووي Electroporator

  1. إعداد الشعيرات الدموية سحبت الزجاج (OD: 1.5 مم، الرقم: 0.86 مم) لحقن الحمض النووي. (إعدادات الإرشادية لساحبة الشعرية سوتر P-97 هي: حرارة 283؛ سحب 50؛ سرعة 90؛ التوقيت 50). جعل علامة على شعري المقابلة لحجم ما يقرب من 2 ميكرولتر.
  2. تعيين الجهد من electroporator إلى 5 نبضات مربع، 50 ميللي ثانية / نبض في 100 فولت، مع 850 ميللي ثانية فترات (100 V، 50 ميللي ثانية النبض ON، OFF 850 ​​ميللي ثانية النبض والنبض 5).
  3. تمييع عالية النقاء (OD 260/280> 1.80) خالية من الذيفان الداخلي البلازميد الحمض النووي لتركيز النهائي من 1-2 ميكروغرام / ميكرولترمع الذيفان الداخلي تحرير تريس، EDTA عازلة أو برنامج تلفزيوني. فمن المستحسن لإضافة 0.1٪ الأخضر السريع إلى الحل الحمض النووي (يجب أن تنتشر الصبغة في البطين عند حقنه بنجاح).
  4. إعداد 5-7 ملم الأقطاب، والقطب هلام والاحماء وسادة التدفئة.

1.2. التثقيب الكهربائي

  1. إزالة ما بعد الولادة يوم 2 الماوس الجرو من القفص وذلك تخدير عن طريق الاستنشاق isoflurane و(في تدفق ~ 0.6 لتر / دقيقة).
  2. بعد حوالي 1 دقيقة، وتحديد حالة التخدير باستخدام استجابة قرصة القدم. في حالة حدوث أي حركة، والمضي قدما مع حقن داخل البطيني.
  3. تحميل إبرة الشعرية مع 1-2 ميكرولتر من الحمض النووي باستخدام أنبوب الشافطة متصلا الشعرية.
  4. تحت مصدر ضوء بارد، عقد رئيس الجرو بين الإبهام والسبابة من اليد أقل هيمنة الخاص بك. قليلا سحب الجلد مرة أخرى على رأسه للمساعدة في تحديد نقطة الحقن الصحيح.
  5. النظر في الخط الظاهري بين العين ورانه قحفية امدا معلما (الشكل 1A). ادخال الإبرة الشعرية في حوالي ثلث طول هذا الخط من امدا (حوالي 1 ملم من منتصف خط) 15. إدراج الشعرية حوالي 2 مم عميق، مع التأكد من تجنب تغلغل في عمق الدماغ.
  6. حقن البلازميد التي تهب ببطء من خلال الفم (حقنة متصلة الشعرية يمكن أن تستخدم أيضا). خلال هذا الإجراء، تأكد من أصابعك لا يتم تطبيق الكثير من الضغط على الدماغ، وهذا يمكن أن يمنع حقن البلازميد ناجحة.
  7. وقف الحقن عندما يتم ترك كمية ضئيلة من الحمض النووي في حل الشعرية. فإنه من المستحسن لحقن أقل من 1 ميكرولتر لتجنب زيادة ضارة في الضغط داخل الجمجمة.
  8. معطف كل من الأقطاب الكهربائية مع هلام ووضعها مع الجانب الإيجابي على الجانب الوحشي من نصف الكرة الأرضية حيث تم حقن الحمض النووي (الشكل 1A). لإدراجها الحمض النووي في SVZ منقاري، أقطاب مكان منقاري قليلا إلىنقطة الحقن. يمكن متفاوتة موقف القطب تحقيق خصوصية الإقليمية من التثقيب الكهربائي في مناطق مختلفة من SVZ 22،25.
  9. بدء نقل الحالية عن طريق الضغط على دواسة نبض FOOTSWITCH. عندما التثقيب الكهربائي اكتمال التحقق من الجهد على الشاشة electroporator (لا ينبغي أن يكون الجهد القيم أقل من 90 V، منذ أقل الجهد القيم ترتبط مع الفقراء الكفاءة التثقيب الكهربائي).
  10. إعادة الحياة الجرو تحت الأوكسجين على وسادة التدفئة لبضع دقائق وإعادته إلى القفص، ووضعها بعيدا عن الأم. تأكد من أن الأم باسترداد الجرو ويوحد مع بقية القمامة. بعد التثقيب الكهربائي، وترك الجراء مع والدتهما ل4-7 أيام قبل الخطوة التالية.

2. إعداد الثقافات شريحة الدماغ الحادة

2.1. إعداد حلول وأدوات

  1. يطلب من الحلول التالية (فمن الممكن أيضا استخدام DMEM عالية الجلوكوز للتشريح والتصوير17):
    تشريح متوسطة (500 مل)
    وسائل الإعلام Gey المتوازن - 500ML
    45٪ جلوكوز - 5ML
    فيلم متوسطة (10 مل)
    45٪ جلوكوز - 0.110 مل
    HEPES 1 M - 0.100 مل
    القلم / بكتيريا - 0.100 مل
    FCS - 0.500 مل
    B27 - 0.100 مل
    الجلوتامين - 0.200 مل
    Dulbecco التعديل النسر متوسطة (الفينول الحمراء الخالية) - 8.89 مل
  2. الاحماء المتوسطة الفيلم في 37 درجة مئوية.
  3. وضع Millicell يدرج في طبق ثقافة السفلي 35 مم الزجاج يحتوي على 1 مل من الفيلم المتوسط ​​ومكان في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2.
  4. إعداد vibratome الملحقات (مفك، غرفة، شفرات الحلاقة، الغراء).
  5. إعداد أدوات تشريح: مقص، ملعقة صغيرة، ملقط على التوالي.
  6. إعداد أدوات للتعامل مع شرائح: الفرشاة الصغيرة أو بتلقيح حلقة لينة (الحجم: 10 ميكرولتر)، ماصات باستور البلاستيك، مربع الجليد والعديد من الأطباق البلاستيك 6 سم.
  7. Precool المتوسطة تشريحفي 2-4 درجة مئوية.

2.2. إعداد شرائح الدماغ

  1. ملء الطبق 6 سم مع precooled المتوسطة تشريح ووضعه على الجليد (للحفاظ على شرائح قطع طازجة).
  2. بعد خلع عنق الرحم، واستخدام مقص لقطع رأس الجرو الماوس. إزالة فروة الرأس مع مشرط، وقطع الجمجمة على طول الدرز منتصف السهمي من OB إلى المخيخ وبلطف إزالة اللوحات الجمجمة باستخدام ملقط. تأكد من يتعرض الدماغ بأكمله وبعناية تشريح بها باستخدام ملعقة، مع رعاية خاصة لا تتلف الأنسجة. تشريح الذي ينبغي القيام به بعناية ولكن في نفس الوقت بسرعة جدا (أقل من دقيقة إن أمكن). خلع عنق الرحم هو الأسلوب المفضل لدينا بسبب التخدير التخدير مع أدوية محطة / الغاز يمكن أن تؤثر على خصائص الهجرة من neuroblasts وحالة صحية الثقافات شريحة الدماغ، والتي تحتاج ليمكن تصوير بسرعة نسبيا التالية التضحية الحيوانية.
  3. Hemisect الدماغ مع رازأو شفرة (الشكل 2). تجاهل نصف الكرة uninjected أو استخدامها لتجارب أخرى.
  4. وضع قطعة صغيرة من الشريط على حامل vibratome واستخدام الحد الأدنى من المبلغ اللازم من الغراء لإرفاق المخ في نصف الكرة على أعلى من ذلك (الشكل 2). هذا يمنع الضارة من سطح حامل بسبب التطبيقات الغراء المتكررة.
  5. السماح للالغراء تجف لبضع ثوان.
  6. وضع حامل في علبة مليئة vibratome حل تشريح precooled. تشير البصلة الشمية نحو شفرة (الشكل 2).
  7. تبدأ خفض نصف الكرة المخ باستخدام الإعدادات المناسبة. ينصح المعلمات التالية: شريحة سمك 300 ميكرون، والسرعة ~ 3-5؛ تردد ~ 9. ينصح الترددات العالية وسرعة منخفضة لمنع الأضرار التي لحقت شريحة.
  8. جمع شرائح باستخدام الفرشاة الصغيرة أو بتلقيح حلقة لينة. تبقي فقط مع شرائح OB مرئية (عادة 2-3 شرائح / الدماغ). عادة، شريحة تحتوي على أكثر من RMS كاليفورنيان يمكن العثور عليها في ~ 300 ميكرون من السطح السفلي.
  9. تحقق شرائح تحت المجهر الفلورسنت القياسية لإشارة GFP (مع التأكد من الوجه لهم أكثر للتحقق مضان على كلا الجانبين)، واختيار تلك التي تظهر مضان مشرق طول معظم RMS.

2.3. زراعة شرائح الدماغ

  1. في غطاء خلية ثقافة، وقطع بعيدا ثالث أكثر الذيلية للشريحة الدماغ وإزالة أي آثار الغراء باستخدام الملقط غرامة مباشرة أو مشرط تسليخ مجهري.
  2. نضح بدقة شريحة باستخدام ماصة باستير البلاستيك (قطع غيض من ماصة لإنشاء افتتاح أكبر، وهذا سوف تجنب إتلاف شريحة) ووضعه على وسط Millicell prewarmed إدراج.
  3. تأكد من وضع جنب مع ألمع إشارة الفلورسنت في اتصال مع Millicell إدراج (للتصوير مع مجهر مقلوب).
  4. إزالة حل تشريح الزائد على رأس إدراج مع ماصة.
  5. ترك الثقافات شريحة لتسوية في 37 ° C / 5٪ CO 2 الحاضنة لمدة لا تقل عن 1 ساعة قبل التصوير.

3. التصوير الوقت الفاصل بين الهجرة أرومة عصبية

  1. على الأقل 2 ساعة قبل التصوير، وتشغيل نظام بيركن إلمر UltraViewVoX القرص متحد البؤر الغزل والمقلوب المجهر نيكون تي-E، هاماماتسو C10600-10B (ORCA-R2) تبريد كاميرا CCD الرقمية، ونظام التدفئة (سولنت العلمي) وضعت في ثابت درجة الحرارة من 37 درجة مئوية.
  2. فتح وحدة اقتناء البرمجيات Volocity وانقر على زر "بمعنى" وحدد ليزر (ق) للتصوير.
  3. في غضون 2 ساعة من إعداد شريحة الدماغ، ضع الطبق أسفل الزجاج الذي يحتوي على شريحة الدماغ في غرفة التصوير على المسرح المجهر.
  4. استخدام الهدف نيكون خطة CFI سوبر فلور ELWD 20X/0.45 تحت ضوء الفلورسنت المناسبة لتحديد والتركيز على منطقة من شريحة التي سيتم تصويرها (مثل أول تنازلي جزء من RMS فقط بعد الحقن، أو elboث منطقة RMS، أو بعد الكوع قبل دخول neuroblasts في OB).
  5. إعداد الوقت الفاصل بين التصوير مع الإجراءات التالية:
    1. على المجهر، انقر على زر L100 للسماح المسح الضوئي ليزر من العينة.
    2. في Volocity، فتح الليزر مبدل UltraVIEW عن طريق اختيار الليزر المناسب (على سبيل المثال 488 نانومتر ليزر لGFP).
    3. تعيين وقت التعرض (عادة ما بين 100-500 ميللي ثانية) وكثافة الليزر (عادة 20-30٪) اعتمادا على شدة إشارة الفلورسنت.
    4. ضبط الصورة الرقمية مكسب لتحسين التصور الخلية.
    5. حدد الفاصل ض المكدس لصورة داخل شريحة الدماغ (عادة أكثر من 100-120 ميكرون الفاصل). اختيار فاصل مع عدد مناسب من الخلايا معزولة لتجنب احتمال التداخل إلى أقصى حد ممكن (وهذا سوف يسهل تحليل تتبع لاحقة).
    6. حدد التباعد بين كل صورة ض المكدس (عادة 2-4 ميكرون).
    7. اختيار الباحث الوقتإرفال بين كل التقاط ض المكدس (على سبيل المثال 3 دقيقة) ومجموع مدة التصوير (على سبيل المثال 3 ساعة).
    8. انقر على أيقونة "حفظ" لحفظ التغييرات إلى معلمات التصوير.
    9. اضغط على زر تسجيل لبدء التصوير.
  6. التصوير بديلة لعينات السيطرة والتجريبية (على سبيل المثال السيارة / العلاج من تعاطي المخدرات أو البلازميدات electroporated مختلفة) طوال اليوم نفسه.

4. تحليل الهجرة أرومة عصبية

  1. في وحدة Volocity الكميات، افتح مكتبة المطلوب إنشاؤها بعد الانتهاء من التجربة مرور الزمن. حدد "التركيز الموسعة" من ​​المربع العلوي الأيسر (الشكل 4A، الخطوة 1).
  2. انقر على "القياسات" التبويب لعرض إطار القياس (الشكل 4A، الخطوة 2).
  3. قائمة المهام مرئيا في الجزء السفلي الأيسر من الشاشة. جر "المسار" (الحالي تحت عنوان "متفرقات" تتجه في الجزء السفلي منالقائمة) على مساحة أعلاه. وهذا يدفع افتتاح نافذة جديدة تسمى "المسار" في القسم الأيسر العلوي من الشاشة (4A الشكل، الخطوة 3).
  4. حدد "نقاط" من "المدخلات" التبويب في إطار المسار (الشكل 4A، الخطوة 4).
  5. انقر على أداة نقطة (4A الشكل، الخطوة 5).
  6. بدء تتبع أرومة عصبية المهاجرة عن طريق النقر بالماوس على المنطقة الوسطى من خلايا الجسم والحفاظ على تتبع حركة الخلية حتى النقطة الأخيرة من الوقت الفاصل بين الوقت وصلت (على سبيل المثال النقطة رقم 61 ل 3 لفيلم طويل ساعة) .
  7. للحصول على بيانات اختيار "جعل القياس السلعة" من ​​قائمة المقاييس (الشكل 4B، الخطوات 6-7). سوف تظهر نافذة في وسط الشاشة.
  8. في هذا الإطار، حدد "عنصر قياس جديدة تسمى:" واكتب اسما (الشكل 4C، الخطوة 8). تذكر لتحديد "جميع timepoints" الخيار قبل العلاقات العامةessing موافق (الشكل 4C، الخطوة 9). سيظهر ملف البند القياس تحت ملف الوقت الفاصل بين وسيحتوي المعلمات للتحليل الكمي (مثل مسافة الهجرة، والسرعة، والتشريد، ومعدل الإزاحة).
  9. انقر نقرا مزدوجا على ملف البند القياس لفتحه كنافذة (الشكل 4D، الخطوة 10).
  10. لتصور مسارات واحدة من الخلايا تحليلها، واختيار "نقطة مجنزرة" من ​​"عرض" خيارات (الشكل 4D، الخطوة 11).
  11. انقر بزر الماوس الأيمن على الملف قياس البند وتصديره كملف نصي، ومن ثم يمكن استيرادها في برامج مثل Excel لتحليل المعلمات الهجرة.
  12. لقياس الحركات بين إطارات متتالية وتوقف أدلى بها كل خلية أثناء فترة التصوير، في قياس ملف اختيار البند من "عرض" خيارات "نقطة" أو "السكان" وانقر على معرف (كل مسار وجود هوية فريدة من نوعها). تصدير الملف الناتج عن طريق المضي قدماجي كما هو موضح في الخطوة 4.10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويمكن ملاحظة وضع العلامات من neuroblasts المهاجرة SVZ مشتقة على طول RMS، عادة بعد 4-8 أيام في التثقيب الكهربائي الناجحة (الشكل 1B). ويمكن أيضا نقاط قتا أطول يتم اختياره، ولكن سيتم العثور على خلايا أقل في RMS منذ ودخلت معظم لهم OB. Neuroblasts بدء الحصول على التشكل والميزات نموذجية من الخلايا الحبيبية ناضجة في OB بعد حوالي 2-3 أسابيع التثقيب الكهربائي (لا يظهر). بعد زراعة ل~ 1 ساعة، شرائح المخ من الجراء الماوس electroporated يمكن تصويرها بشكل موثوق لمدة تصل إلى 3-4 ساعة. كما ذكرت سابقا 23،26، يمكن neuroblasts عرض ديناميات الهجرة معقدة (الشكل 3 و فيديو 1)، والتي يمكن تحليلها كميا باستخدام خلية تتبع (الشكل 4).

الشكل 1
الشكل 1. Postna التل في electroporation فيفو. (أ) رسم تخطيطي لفي electroporation فيفو ليوم ما بعد الولادة 2 الماوس الجرو. خط منقط (الأحمر) الذي يربط العين إلى المعالم السياحية امدا craniometrical بمثابة علامة الموضعية لالإدراج الشعرية. يشار إلى نقطة الحقن باعتبارها نقطة خضراء. الأشكال البيضاوي رمادي تشير إلى موقف القطب كما هو موضح في بوتان وآخرون 15 (B) الماوس سهمي شريحة الدماغ الأمامي immunostained عن GFP بعد 5 أيام من التثقيب الكهربائي البلازميد، معربا عن GFP. neuroblasts المهاجرة SVZ مشتقة مرئية على طول RMS وبعضها قد بدأت للوصول الى OB. CTX: القشرة؛ SVZ: المنطقة subventricular؛ RMS: تيار المهاجرة منقاري؛ OB: البصلة الشمية. بار، 400 ميكرومتر. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

ن "سرك =" / files/ftp_upload/50905/50905fig2.jpg "العرض =" 500px "/>

الشكل 2. الخطوات التخطيطي في إعداد الحادة الثقافات شريحة الدماغ للتصوير. ) أ (يتم تنفيذ الذيل وتخفيضات intrahemispheric (الخطوط المنقطة) على الدماغ تشريح طازجة. ب () يتم وضع نصف الكرة المخ electroporated على حامل vibratome. ج () ويتم الحصول على شرائح سهمي مع vibratome ووحظ في إطار المجهر الفلورسنت القياسية (D) شرائح مع أفضل إشارة GFP هي تربيتها لمدة 1 ساعة على الأقل على إدراج Millicell داخل صحن الزجاج السفلي، و (E) وضعت في وقت لاحق في غرفة البيئية للتصوير من قبل مبائر مقلوب الغزل نظام القرص. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

les/ftp_upload/50905/50905fig3.jpg "العرض =" 500px "/>
الرقم 3. الوقت الفاصل بين التصوير من neuroblasts المهاجرة. (أ) الوقت الفاصل بين الصور القرص غزل من neuroblasts مأخوذة من شريحة الدماغ السهمي الماوس بعد 5 أيام من التثقيب الكهربائي البلازميد، معربا عن GFP. الصور هي 1 ساعة بعيدا. كل لوحة هو إسقاط ض المكدس من 28 صور متتالية 4 ميكرومتر إربا. السهام تشير ممثل 4 neuroblasts المهاجرة على طول RMS نحو البصلة الشمية (تقع خارج الصورة في الركن السفلي الأيمن). (B) مسارات الهجرة الممثل الحصول عليها من الوقت الفاصل بين التصوير من 4 neuroblasts أبرزت في (A). (C) رسم بياني يبين المسافة هاجرت مع الوقت بنسبة 2 neuroblasts ممثل. عرض الخلايا سلوك متحركة قفزي نموذجية. بار، و 70 ميكرومتر. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

er.within صفحة = "دائما"> الرقم 4
الشكل 4. تحليل تتبع المهاجرة neuroblasts. خطوات متتابعة تستخدم لتعقب neuroblasts المهاجرة باستخدام البرمجيات Volocity. يرجى الاطلاع على النص لوصف مفصل. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الفيديو 1: الوقت الفاصل بين التصوير من neuroblasts المهاجرة ويبين الفيلم مقطع من RMS الفأر مع neuroblasts المهاجرة GFP المسمى حصلت 5 أيام بعد التثقيب الكهربائي من البلازميد، معربا عن GFP. يقع OB من عرض نحو الركن الأيمن السفلي. تم القبض متحد البؤر Z-المداخن على القرص الغزل مبائر مع الهدف 20X كل 3 دقائق لمدة 3 ساعة على مدى فترة ميكرومتر 120. تلعب سرعة: 10 لقطة / ثانية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الهجرة كفاءة من الأسلاف العصبية على طول RMS يضمن النضج في وقت لاحق إلى الخلايا العصبية الوظيفية 10. تيارات بارزة من الأسلاف العصبية الموجهة نحو OB واضحة في مرحلة الطفولة البشرية ويرجح أن تلعب دورا هاما في وقت مبكر بعد الولادة تطور الدماغ البشري 27. وعلاوة على ذلك، وهذه الخلايا هي قادرة على استهداف مواقع في الدماغ تتأثر الإصابة وتنكس عصبي 4،28. أن تكون قادرة على رصد في الوقت الحقيقي تأثير التلاعب الجيني على ديناميات أرومة عصبية يصبح من الضروري أن نفهم تماما كيف وتسترشد الحركة أرومة عصبية وتنظيمها.

هنا وصفناها بروتوكول لمراقبة SVZ المستمدة من الهجرة أرومة عصبية وذلك بربط في electroporation فيفو ما بعد الولادة مع مرور الزمن المجهري متحد البؤر الغزل القرص الحاد الثقافات شريحة الدماغ. على وجه التحديد، لقد أظهرنا كيف تهاجر الأسلاف العصبية يمكن أن توصف من قبل electroporating في SVZ على خرائط الملاحة الإلكترونية البلازميدoding GFP. اعتمادا على الغرض من هذه الدراسة، عدة أنواع من البلازميدات يمكن استخدامها (على سبيل المثال السماح للتعبير عن البروتينات الفلورية الأخرى أو المشاركة في التعبير عن نوع البرية / بروتينات متحولة من الفائدة، لجنة المساواة العرقية recombinase، أو shRNA جنبا إلى جنب مع البروتينات الفلورية). ونحن نوصي بشدة باستخدام البلازميدات تحتوي على الدجاج بيتا أكتين المروج CAG 29 لفي الجسم الحي التعبير. ويمكن أيضا التصوير من شرائح الدماغ يتم الحصول عليها من الحيوانات electroporated أن تستخدم لمراقبة الهجرة شعاعي من الأسلاف العصبية في OB في نقاط زمنية أطول (7-10 أيام) بعد التثقيب الكهربائي 30.

بعد فترة أولية من الممارسة، ويصبح في الجسم الحي بعد الولادة التثقيب الكهربائي وسيلة موثوق بها للغاية، مما يسمح وضع العلامات أرومة عصبية قوية لكلا الوقت الفاصل بين التصوير والتحليل المناعي. علاوة على ذلك، تقدم هذه التقنية ميزة أساسية على الفئران المعدلة وراثيا معربا عن البروتينات الفلورية تحت المروجين أرومة عصبية محددة،حيث وصفت غالبية neuroblasts. في الواقع، التثقيب الكهربائي يسمح وضع العلامات متفرق من neuroblasts، مما يسمح تحليل مفصل لمورفولوجيا والهجرة ديناميتها. مقارنة مع تسليم المجسم من النواقل الفيروسية 31، وهذا الأسلوب هو أرخص وأسرع وجيد التحمل جدا الجراء الماوس. يتكون العيب الرئيسي في حقيقة أنه يقتصر على مراحل ما بعد الولادة في وقت مبكر. في الواقع، ونحن نوصي بشدة باستخدام 2 يوم بعد الولادة الجراء الماوس، منذ لاحظنا انخفاضا كبيرا في كفاءة وضع العلامات في أوقات لاحقة، عندما تصبح طرق التسليم الفيروسية أكثر ملاءمة 31. ومع ذلك، استراتيجيات مثل التثقيب الكهربائي من البلازميدات، معربا عن لجنة المساواة العرقية في نماذج الماوس المناسبة الوراثية يمكن أن تستخدم لدراسة الخلايا العصبية في مراحل الكبار 22.

اثنين من الفوتون، متحد البؤر القياسية، متحد البؤر القرص الغزل، واسعة المجال المجهري مضان يمكن أن تستخدم كل لتصور الهجرة أرومة عصبية 17،23،24. الغزل يخدع القرصالمجهر البؤري هو بديل أرخص لاثنين من الفوتون المجهري. لأنها تتيح التصوير 3D في سرعة أعلى من خلال طائرات ض متعددة، مما يحد من photobleaching من مقارنة لمعيار متحد البؤر المجهر وتقدم دقة أعلى من واسعة المجال مضان التصوير 31-33. غالبية neuroblasts المهاجرة لديها سوما واضحة للعيان وعملية ديناميكية للغاية الرائدة يميل مع مخروط النمو.

كما هو موضح من قبل الآخرين 17، فإن وجود غرفة نضح تسمح لتقييم آثار مباشرة الرقابة والعلاجات المخدرات على شريحة الدماغ نفسه. في حين أننا نعتبر هذا ميزة هامة، وبروتوكول الموصوفة هنا يظهر أنه ليس من الضروري للغاية لبقاء الخلية ليروي شرائح مع الاوكسيجين السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF) أو ارتفاع نسبة الجلوكوز DMEM 17،33. وعلاوة على ذلك، وذلك باستخدام مجهر مقلوب يسمح أسهل التلاعب الهدف مقارنة المجاهر تستقيم مجهزة أهداف غمر المياه.وجدنا أن استخدام الهدف لمسافات طويلة 20X هو الحل الوسط الأمثل، مما يتيح تتبع عدد لا بأس به من الخلايا (عادة 25-40 لكل شريحة) وتنتج صورا قرار جيد (فيديو 1). التتبع التلقائي هو أيضا ممكن، ولكن ليس دائما يمكن الاعتماد عليها. لهذا السبب نحن نوصي البصرية و، إذا لزم الأمر، والتحقق اليدوي للبيانات التتبع التلقائي. أعلى التصوير التكبير من neuroblasts واحد لا يمكن أن يؤديها باستخدام الهدف نيكون فلور مدينة دبي للإنترنت M/N2 40X/0.80W. ومتاحة بحرية المساعد يماغيج يمكن أيضا MTrackJ أن تستخدم لقياس الإحصاءات المسار الأساسي 33، ولكن قد تكون بعض الملفات الحصول على البيانات الخام تتعارض مع هذا البرنامج وربما تحتاج إلى تحويلها إلى صيغ مناسبة للتحليل، والتي في بعض الحالات يمكن أن يكون مضيعة للوقت . مزيج من الحصول على الصور والتحليل التي تقدمها وحدات البرنامج Volocity يسمح التحول الفوري من التقاط الصور / التجهيز للتحليل الكمي للparame المهاجرةالنسب (السرعة، والتشريد، الخ)، والتي يمكن بسهولة تصور في مجموعة متنوعة من الرسوم البيانية (على سبيل المثال تظهر أنماط الهجرة / بعد / الاتجاهية / السرعة / استمرار / الوقت الذي يقضيه متحرك، الخ).

Neuroblasts عرض حركة قفزي، بالتناوب المهاجرة إلى مراحل ثابتة 34،35 (الشكل 3C). في ضوء حقيقة أن مراحل ثابتة يمكن أن تكون بين 4-10 دقيقة 32، ونحن نعتقد أن التقاط الصور كل 3 دقيقة يمثل حلا وسطا جيدا لمتابعة المهاجرة neuroblasts مع الحد الأدنى من الإضاءة وphotodamage. نحن نادرا ما نرى الخلايا وقف لأكثر من 6 دقائق، وجدت أن، على مدى فترة 3 ساعة، يقضون عادة ما معدله 30 دقيقة قادرة على الحركة. وفقا لتقارير سابقة، neuroblasts لديها متوسط ​​سرعة 60-100 ميكرون / ساعة وفهرس التعرجات المتوسط ​​(النزوح الفعلي على مسافة هاجر)، أعلى قليلا من 0.6 23،36، وهو ما يتفق مع ملاحظاتنا. Typicحليف، حوالي 60٪ من الخلايا تظهر السلوك "المهاجرة" (على سبيل المثال التالية مسارات الهجرة خطية تقريبا، مع مؤشر التعرجات بين 0،6-1) و 20-25٪ هي "استكشافية" (مع وجود مؤشر التعرجات بين 0-0،4)، في حين أن 20٪ المتبقية ~ يمكن أن تصنف على أنها "وسيط" (بالتناوب مراحل المهاجرة واستكشافية، مع مؤشر التعرجات بين 0.4-0.6).

ونحن ندرك أنه لا تزال هناك قيود على هذا الأسلوب، لأننا لا يمكن تصوير neuroblasts لأكثر من 3-4 ساعة دون مراعاة التعديلات الكبيرة في الحركة الخاصة بهم. ويمكن زيادة مدة التصوير عن طريق خفض وتيرة التصوير (ولكن هذا سوف يؤثر على دقة تحليل الهجرة) وكذلك من خلال تبني غرفة نضح لتحسين الظروف البيئية للتصوير. ومع ذلك، وصفت بروتوكول هنا بما في ذلك فترة 3-4 ساعة التصوير يمثل حلا وسطا مناسبة تمكن من جمع بيانات كافية للتحليل الكمي للالهجرة. في الواقع، لقد نجحت حتى الآن في الكشف عن الآثار تنتج عن الهجرة التي كتبها البروتين من overexpression / downregulation 37 أو عن طريق التلاعب الدوائية بعد المقارنة مع الضوابط المناسبة (Sonego وتشو، نتائج غير منشورة).

في الختام، فإن الجمع بين في الجسم الحي بعد الولادة التثقيب الكهربائي مع التصوير القرص الغزل الثقافات شريحة الدماغ يمثل أداة قوية لرصد ديناميات الهجرة أرومة عصبية في نظام تشبه إلى حد كبير البيئة في الجسم الحي، وتقدم إمكانية للتحقيق في عمق الآليات الجزيئية التي تتحكم في أرومة عصبية حركية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

معتمدة من قبل MS وYZ بوكل بوكل والصين دراسية لدرجة الدكتوراة. وقد تم تمويل MO بواسطة التكنولوجيا الحيوية والدكتوراه مجلس بحوث العلوم البيولوجية studentship. نشكر ماسارو أوكابي ويونيو إشي ميازاكي لالبلازميد PCX-EGFP وآلان Chedotal وأثينا إبسيلانتي للحصول على المشورة قيمة عن التثقيب الكهربائي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Millicell Millipore PICM0RG50
35 mm Glass bottom culture dish MatTek P35G-0-14-C
Gey's Balanced media Sigma G9779-500ML
Glucose, 45% Sigma G8769-100ML
HEPES Sigma H3375-25G
Pen/Strep GIBCO 15140-122
FCS GIBCO 10109-163
B27 supplement Invitrogen Life Technologies 17504044
L-Glutamine Invitrogen Life Technologies 25030-081
DMEM (phenol red-free) GIBCO 31053-028
Fast Green Sigma F7252-5G
Glass capillaries for injection Harvard Apparatus 30-0057
Aspirator tube Sigma A5177
Sutter P-97 capillary puller Sutter Instrument P-97
ECM830 Square Wave Electroporator Harvard Apparatus 45-0052
Platinum Tweezertrodes 7 mm Harvard Apparatus 45-0488
Footswitch Model 1250F Harvard Apparatus 45-0211
Gel for electrodes Cefar Compex 6602048
Isoflurane Merial AP/DRUGS/220/96
Vibratome Leica VT1000S
Glue Roti coll Roti coll 1
UltraViEW VoX spinning disk system Perkin Elmer Customized setup (multiple laser sources can be used) equipped with Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B CCD camera
Volocity software Perkin Elmer Acquisition, Quantitation, Visualization Modules
Environmental chamber for microscopy Solent Scientific Custom-made
Ti-E inverted microscope Nikon CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA objective is recommended for the application described in this paper

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
  2. Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and. 11, 339-350 (2010).
  3. Lazarini, F., Lledo, P. M. Is adult neurogenesis essential for olfaction? Trends Neurosci. 34, 20-30 (2011).
  4. Arvidsson, A., Collin, T., Kirik, D., Kokaia, Z., Lindvall, O. Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke. Nat. Med. 8, 963-970 (2002).
  5. Emsley, J. G., Hagg, T. alpha6beta1 integrin directs migration of neuronal precursors in adult mouse forebrain. Exp. Neurol. 183, 273-285 (2003).
  6. Sundholm-Peters, N. L., Yang, H. K., Goings, G. E., Walker, A. S., Szele, F. G. Subventricular zone neuroblasts emigrate toward cortical lesions. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 64, 1089-1100 (2005).
  7. Doetsch, F., Alvarez-Buylla, A. Network of tangential pathways for neuronal migration in adult mammalian brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 14895-14900 (1996).
  8. Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system. Annu. Rev. Neurosci. 28, 223-250 (2005).
  9. Pathania, M., Yan, L. D., Bordey, A. A symphony of signals conducts early and late stages of adult neurogenesis. Neuropharmacology. 58, 865-876 (2010).
  10. Belvindrah, R., Nissant, A., Lledo, P. M. Abnormal neuronal migration changes the fate of developing neurons in the postnatal olfactory bulb. J. Neurosci. 31, 7551-7562 (2011).
  11. Gotts, J. E., Chesselet, M. F. Mechanisms of subventricular zone expansion after focal cortical ischemic injury. J. Comp. Neurol. 488, 201-214 (2005).
  12. Goings, G. E., Sahni, V., Szele, F. G. Migration patterns of subventricular zone cells in adult mice change after cerebral cortex injury. Brain Res. 996, 213-226 (2004).
  13. Romanko, M. J., et al. Roles of the mammalian subventricular zone in cell replacement after brain injury. Prog. Neurobiol. 74, 77-99 (2004).
  14. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
  15. Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PloS One. 3, e1883 (2008).
  16. Barnabe-Heider, F., et al. Genetic manipulation of adult mouse neurogenic niches by in vivo electroporation. Nat. Methods. 5, 189-196 (2008).
  17. Platel, J. C., et al. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
  18. Pathania, M., et al. miR-132 enhances dendritic morphogenesis, spine density, synaptic integration, and survival of newborn olfactory bulb neurons. PloS One. 7, e38174 (2012).
  19. dal Maschio, M., M,, et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nat. Commun. 3, 960 (2012).
  20. Oudin, M. J., et al. Endocannabinoids regulate the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain. J. Neurosci. 31, 4000-4011 (2011).
  21. Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Front. Neurosci. 4, (2010).
  22. Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. Neonatal subventricular zone electroporation. J. Vis. Exp. (72), e50197 (2013).
  23. Nam, S. C., et al. Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study. J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).
  24. James, R., Kim, Y., Hockberger, P. E., Szele, F. G. Subventricular zone cell migration: lessons from quantitative two-photon microscopy. Front. Neurosci. 5, 30 (2011).
  25. Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis. Neural Dev. 6, 13 (2011).
  26. Saha, B., Ypsilanti, A. R., Boutin, C., Cremer, H., Chedotal, A. Plexin-b2 regulates the proliferation and migration of neuroblasts in the postnatal and adult subventricular zone. J. Neurosci. 32, 16892-16905 (2012).
  27. Sanai, N., et al. Corridors of migrating neurons in the human brain and their decline during infancy. Nature. 478, 382-386 (2011).
  28. Tattersfield, A. S., et al. Neurogenesis in the striatum of the quinolinic acid lesion model of Huntington's disease. Neuroscience. 127, 319-332 (2004).
  29. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
  30. Lledo, P. M., Alonso, M., Grubb, M. S. Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).
  31. Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Time-lapse imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain. J. Vis. Exp. (67), e4061 (2012).
  32. Snapyan, M., et al. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
  33. Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone. J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).
  34. Schaar, B. T., McConnell, S. K. Cytoskeletal coordination during neuronal migration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 13652-13657 (2005).
  35. Valiente, M., Marin, O. Neuronal migration mechanisms in development and disease. Curr.Opin. Neurobiol. 20, 68-78 (2010).
  36. Comte, I., et al. Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb. J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).
  37. Sonego, M., et al. Fascin regulates the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain. J. Neurosci. 33, 12171-12185 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics