MACS纯化感光前体细胞的视网膜移植到成年小鼠视网膜

1CRTD / DFG-Research Center for Regenerative Therapies Dresden, Technische Universität Dresden
* These authors contributed equally
Published 2/22/2014
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Medicine

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Summary

细胞移植代表一个策略视网膜变性的治疗特点是感光损失。在这里,我们描述了移植的感光细胞的富集和他们的视网膜下移植到成年小鼠的方法。

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Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina. J. Vis. Exp. (84), e50932, doi:10.3791/50932 (2014).

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Abstract

视力障碍和失明是由于视网膜上, 光感受器,对感光细胞的亏损指的主要原因残疾工业化国家。更换感光细胞退化细胞移植的代表在今后的临床应用提供可能的治疗选择。事实上,最近的临床前研究表明,未成熟的光感受器,从新生小鼠视网膜在4日龄隔离,有下列视网膜下移植到融入成年小鼠视网膜的潜力。供体细胞产生成熟的感光体的形态,包括内,外段,位于外核层的圆形池体,并在接近内源性双极细胞突触末端。事实上,最近的报告显示,供体光感受器功能整合到宿主小鼠​​的神经回路。对于这样的细胞替代方法,纯化悬浮未来的临床应用所选择的细胞必须生成并放置在适当的融入眼睛的正确位置。对感光体前体的富集,分选,应根据特定的细胞表面抗原,以避免供体细胞的遗传记者修饰。这里,我们表明磁性相关的细胞分选(MACS) - 的可移植的视杆的前体从基于细胞表面标记物CD73的光感受器特异性报道基因小鼠的新生儿视网膜中分离富集。培养具有抗CD73抗体后允许的视杆前体富集MACS至约90%微珠标记的二抗。相比于流式细胞术,MACS具有的优点是它可以更容易施加到GMP标准和高量的细胞可以在相对短的时间段进行排序。注射富集的细胞悬浮到成年野生型小鼠的视网膜下间隙导致了3倍的高集成率COMPAR教育署无序细胞悬液。

Introduction

视觉是人类的主要感觉之一。这种感觉和失明减值的残疾在工业化国家的主要原因之一。主要的原因为视力受损或失明是视网膜变性,其特征在于,感光细胞的损失,因为它可以在黄斑变性,色素性视网膜炎,视锥 - 视杆营养不良,和其它条件进行观察。至目前为止,有效的治疗,以恢复丢失的视力无法使用。在2006年和2008年报告的两个不同的实验室,相互独立,成功的移植杆状光感受器前体细胞分化为成年野生型小鼠视网膜1,2。因此,所产生的光感受器前体细胞移植的可能性也成视网膜退化,更换感光退化和恢复视力。事实上,最近已表明,这种感光体移植前体细胞引起的成熟野生型感光体的形态学标准,如properlŸ开发外段3,在接近内源性双极细胞和位于外核层2-4,以及在功能整合到宿主的神经回路5-7的能力有圆形细胞体突触末端。其中这一战略的主要原则是采用4产后当天(PN 4,PN0被定义为出生一天)年轻小鼠视网膜,导致移植不同细胞类型的混合物。在一个未来的治疗应用的背景下,该混合物已被纯化为感光体的前体细胞。 CD73已经被描述为特定的第一细胞表面标记为年轻的光感受器在视网膜8-10。在这里,我们证明在此基础上细胞表面标志物,并与使用磁性相关的细胞分选(MACS)技术的感光体前体细胞的纯化方法。 MACS可能具有的优点相比,荧光激活细胞分选技术,由于快速排序的时间和更容易调整到符合GMP的条件。我们可以证明一个〜90%的浓缩和移栽富集的人口在成年野生型视网膜视网膜下腔时高达3倍高集成度。因此,MACS型感光体的前体细胞的富集及视网膜下移植,是可靠的和有前途的技术的再生治疗策略视网膜变性的治疗的发展。

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Protocol

道德地使用动物表及护理:

所有动物实验均严格按照欧盟和德国法律(Tierschutzgesetz),并坚持以ARVO声明在眼科和视觉研究用动物。所有的动物实验已获德累斯顿和Landesdirektion德累斯顿(批准文号:24D-9168.11-1/2008-33)的动物伦理委员会。

1。开始之前细胞分离和细胞分选

  1. 标签三15毫升反应管中:洗净(W),阳性率(+)和负分数( - )。

2。视网膜离解

  1. 用剪刀斩首的PN 4幼崽。
  2. 冲洗幼仔的头部很快在70%乙醇中,然后通过PBS洗涤。
  3. 头部转移到冷的HBSS和去核的眼睛(重复所有的磁头此步骤)。到去核,打开眼睑和注视吨他眼睛弯钳在视神经区域。然后将眼睛仔细地出了轨道。
  4. 去核眼前的一切后,分离出视网膜:引入一个封闭的剪刀到视神经,打开刀片。珍珠的RPE / chorid出来。除去用弯钳透镜和血管。
  5. 传输的分离的视网膜到含有木瓜蛋白酶溶液(木瓜蛋白酶解离试剂盒中提供),1.5ml的反应管中。
  6. 在37℃下孵育在30-60分钟的木瓜蛋白酶溶液中的视网膜在水浴或摇床(400转)
    1. 而视网膜孵育在木瓜蛋白酶溶液中,移液管将1ml卵类粘蛋白溶液到15ml反应管(标号“1”)。
    2. 加60微升DNA酶I(10毫克/毫升)+ 60微升卵类粘蛋白溶液(由试剂盒提供)+ 520微升的EBSS到15ml反应管(标记为“2”)。
  7. 木瓜蛋白酶孵育后,转移木瓜蛋白酶溶液中的部分消化视网膜对r反应的影响管“2”。
  8. 用火抛光的吸管,进行机械分离(10倍上下)。
  9. 移液器的单细胞悬液,以反应管中“1”。尝试通过轻轻地分层上的卵类粘蛋白溶液上方的细胞悬浮液,以产生2层。
  10. 离心5分钟,在300 XG(约1300转)。
  11. 弃上清,重悬细胞于500μlMACS缓冲液。

3。细胞分选利用磁性相关的细胞分选(MACS)

  1. 微升大鼠抗CD73抗体添加的X向500微升,以达到10微克/毫升的最终浓度。
  2. 孵育5分钟,置于冰上。
  3. 填充15毫升的反应管至10ml用MACS缓冲液和离心机它5分钟,以300×g的速度。
  4. 除去上清液。
  5. 重悬浮颗粒在480μLMACS缓冲液,并加入120微升的羊抗鼠IgG微珠。
  6. 冰上孵育15分钟;做NOT激荡,摇晃或混合。
  7. 填充15毫升的反应管至5ml用MACS缓冲液和离心机它5分钟,在300×g下。
  8. 作为反应管被离心分离:
    1. 调整一个LS列到磁性底座。
    2. 把预分离过滤器上的LS柱的顶部。
    3. 滋润预分离过滤器和LS柱用3毫升MACS缓冲液和收集MACS缓冲液入洗(W)管。
  9. 除去上清液。
  10. 重悬沉淀于500μlMACS缓冲液。
  11. 载入500μl的细胞悬浮液至过滤器,然后加入1 ml的MACS缓冲液至过滤器和收集阴性部分成为负分数( - )的反应管。
  12. 接着,添加3×3毫升的MACS缓冲液的柱,以洗掉未绑定到该列中的单元格
  13. 一旦这些9毫升是通过LS列,从磁架取下色谱柱和正分数(+)反应的顶部安装料管。
  14. 快速负载5毫升MACS缓冲液进入LS列,并把柱塞在LS列,然后向下按,直到整个缓冲区是通过色谱柱。
  15. 离心含有阳性馏分5分钟,在300×g下将反应管。
  16. 去除上清,重悬在500μl的MACS缓冲液,并保持在4℃下
  17. 使用通用细胞计数装置计数的细胞的总量。
  18. 从含有2×10 5个细胞/微升在MACS缓冲液的阳性排序馏分制备细胞悬浮液,并保持在4℃下

4。 MAC地址排序的感光前体细胞到小鼠视网膜移植

  1. 确保有下列所有解决方案的准备:1毫升无菌PBS或HBSS,10微升的DNase I,1〜2毫升无菌去离子H 2 O,细胞悬液分数在4°C等分
  2. 麻醉成年小鼠( 2-4个月)与腹腔注射盐酸美托咪啶(0.01 mg/10 g体重)的,氯胺酮(0.75 mg/10 g体重)。然后做皮下注射丁丙诺啡(0.05毫克/千克体重)来缓解疼痛。
  3. 扩张小学生用一滴Phenylephrin 2.5%Tropicamid 0.5%。
  4. 修正了鼠标在鼠标头部固定器和立体显微镜下进行。
  5. 滴一滴Visidic凝胶,以防止眼睛干燥。
  6. 使用无菌30 G½在针做一个小孔巩膜和角膜(分别为锯齿缘 )之间的边界。
  7. 剪下一个共同的盖滑入使用金刚石笔小(大约5毫米x 5毫米)件,将这些作品在角膜上方之一,让视网膜的直接可视化。
  8. 冲洗预消毒微升注射器多次去离子水。
  9. 加载微升注射器1微升细胞悬液,直接切圆针通过结膜和视觉控制在鼻腔视网膜下半巩膜和地点。
  10. 轻轻一拳一个洞进入视网膜,直至到达视网膜下腔,细胞悬液注入视网膜下腔。
  11. 观察视网膜的大疱性脱离,这应该是统一的,覆盖约视网膜空间的四分之一,没有任何出血。
  12. 拔出注射器轻轻地,视网膜裂孔密封自动。
  13. 冲洗微升注射器多次去离子水。
  14. 从头部固定器释放鼠标。
  15. 醒来鼠标注入atipamozole盐酸逆转的盐酸美托咪啶效果。
  16. 将鼠标唤醒时间在温暖的暗室(约25℃)。
  17. 移植后接下来的2天,丁丙诺啡(0.05毫克/公斤体重),应通过皮下注射在上午和下午的止痛给药。

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Representative Results

为了评估杆光感受器的整合到小鼠视网膜的能力,鼠标记者行被使用,其中绿色荧光蛋白是由视网膜神经氨酸拉链(NRL,NRL-GFP)的启动子11驱动。 NRL是视杆光感受器开始它的表达在E12.5整个成年期,允许供体视杆细胞的特异性标记的最早标记物。

PN 4 NRL-GFP的幼崽断头,眼睛被摘除。视网膜,然后分离并用上述方法分离。将所得细胞悬浮液,然后使用排序CD73基于MACS( 图12)。下面的MAC地址排序,我们分析了在此过程中所取得的富集。

如图3A所示 ,在初始细胞悬浮液(输入)包含30.4%的GFP阳性细胞, 即得 。视杆细胞。继CD73型MAC-分拣,高达86.9%的CD73阳性的比例(CD73 +)的富集观察,流式细胞仪。在CD73-阴性级分(CD73-)只有9.9%的细胞为GFP( 图3A)成正检测到。以下CD73基于MACS NRL-GFP阳性细胞的富集电镀在体外图3B)之后被附加可视化。

后的MAC-分拣,供体细胞中的CD73阳性分数进行离心,重新悬浮至200,000个细胞/微升的最终浓度。此细胞悬浮液进一步用于移植到野生型宿主视网膜的视网膜下腔( 图4)。三至四个星期移植后,宿主视网膜是固定的,分离的和切片。几个供体细胞整合到宿主的外核层和获得成熟的光感受器的形态与所述单元主体的定位在所述外核层和形成图书 Ñ ​​突触小球和内段( 图5)。详细的图片已经被公布之前,我们小组3,8显示的结果与通过移植其他组4,6,10主办视网膜FAC-排序细胞相媲美。在所有这些研究结果是一致的,即移植的细胞留在注射部位,由大疱性分离主机视网膜定义,并且不迁移走。一些整合到宿主视网膜( 外核层),以及一些残留在视网膜下腔3。此外,已经表明,该供体细胞中的整合位点的分布取决于所用的5小鼠模型的类型。在C57BL/6J小鼠间移植未检测出急性主机/移植排斥的迹象。

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图1。 MACS纯化的光感受器前体成从PN 4 NRL-GFP的幼仔分离成年小鼠视网膜。供体细胞,其次为视网膜下移植的总体方案 CD73为基础的MAC分拣和移植到小鼠宿主视网膜视网膜下腔。 点击这里查看更大的数字

图2
图2。富集移植的光感受器通过MACS的。从所有收集的PN4视网膜产生的细胞悬浮物与原代大鼠接着洗涤和孵化与缀合的微珠抗鼠抗体的抗CD73抗体。未结合的抗体被冲走。将细胞悬浮液通过throug公顷所用的磁力架连接LS-柱。是由抗体结合的细胞保持附着到柱而其余的细胞被洗脱并收集(CD73-阴性级分)。最后,LS-列从磁力架拆除,其余的细胞被洗脱并收集(CD73阳性的分数)。 点击这里查看完整的电影

图3
图3。的NRL-GFP阳性细胞富集以下CD73为基础的MAC地址排序分析(A)排序之前,供体细胞的初始种群含有NRL-GFP阳性细胞的30.4%。以下的MAC-分拣,GFP阳性细胞的富集可能在CD73 +馏分(86.9%)被检测而CD73-部分仅含有少量的GFP +细胞(9.9%)。 (B)代表图像展示PN4 NRL-GFP细胞的CD73型MAC-分选的结果。百万细胞每级分铺板于层粘连蛋白包被的盖玻片上。细胞用4%PFA中电镀10分钟后固定4小时。细胞用DAPI(4',6 - 二脒基-2 - 苯基吲哚,1:20,000)。当与输入分数或CD73-比例GFP阳性细胞在CD73 +馏分A显著富集进行了观察。 点击这里查看大图

图4
图4。移植过程中进入成年小鼠雷廷的视网膜下注射。示意图一个。针通过孔中的锯齿缘 ,通过玻璃体的空间,避免接触透镜导航和放置在视觉控制下的视网膜插入。通过轻轻按压,针穿过视网膜打孔,并放置在视网膜下腔。最后,将细胞悬浮液小心地视觉控制下通过评估该拆卸过程注入。

图5
图5。整合移植的感光细胞。代表性的一幅幅CD73结合基于MACS分类下移植到成年小鼠视网膜PN4 NRL-GFP细胞。移植的感光体前体的正确整合入外核层(ONL)和生成成熟感光体的形态。

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Discussion

感光前体细胞视网膜下移植代表一个可靠的工具来实现这些整合感光细胞的成显著数字1,2宿主视网膜。这可能允许成立细胞治疗视网膜变性疾病的未来6治疗。细胞,目前从PN 4的视网膜分离出的供体人群,是不同类型的细胞,从其中视网膜下注射后仅在感光体前体细胞结合的混合物。通过使用CD73基于MAC的排序中,供体细胞悬浮液中的光感受器的比例可以提高到≈90%,允许约3倍更高的集成度在野生型宿主视网膜相比,未分类的细胞群8。相比于流式细胞术,MACS具有快速排序程序的优点,并且它可以相对容易应用到GMP标准。移植的感光体的纯化是第根据最近的优势,为在体外产生的多能干细胞12-14感光pecific兴趣。分化的多能干细胞的培养是由不同细胞类型进行具体的分类程序,在细胞移植疗法的未来使用的必要先决条件的可用性。

按照MACS纯化过程中,有几点值得注意,确保工作流程没有发生重大干扰。视网膜进行排序的数字越高,需要更多的时间用于其消化。消化后,分选过程中,细胞的聚集,必须避免。发生这种情况时优选之前加入第二抗体和其孵育期间。在这种情况下,聚合,必须用吸液管立即删除。在MACS缓冲液洗脱,同时收集了MACS-阴性部分,它是绝对必要不要将列添加超过3毫升缓冲区到塔中的压力将会太高,如果超过3毫升更多缓冲溶液。这将干扰该抗体的细胞中,并降低分拣效率的结合。当从磁力架柱开始收集的MACS阳性分数,这个步骤必须尽快完成。 5毫升MACS缓冲液应加入到柱尽可能快。此外,暴跌应该付诸表决,并迅速按下,直到整个缓冲区通过色谱柱。这是没有必要担心所施加的压力。在MACS缓冲液是等渗的,并且可以被改变。它可以使用FACS缓冲液,细胞培养液,PBS,EBSS,或HBSS中。缓冲器的不育性可通过一个0.4微米的过滤膜过​​滤来实现。

富集MACS后,供体细胞成功移植到视网膜下腔可以通过保持以下几点来实现。因为感光细胞似乎是治疗体外非常敏感,这是不可取的,让他们在4℃长于必要的。进行移植尽可能快。当插入注射针插入眼球,它避免触摸镜头的比较尖锐的金属针可能会损坏从而产生感应镜头引起的葡萄膜炎的镜头是很重要的。道路上的视网膜下腔中的最后一步,在视网膜的渗透,是至关重要的。因为它不能在视觉上观察到的视网膜下间隙是否达到制定合适的推压力和组织电阻的感觉是非常重要的。为了测试,如果针头正确放置,小体积可应用于与视网膜的针头支队应仔细观察。如果没有出血了一轮,大疱性支队正在形成,该位置是正确的解决方案的其他部分可以仔细地被应用。在注射时,针头应保持在其位置上,以避免进一步的组织损伤。视网膜裂孔CRE由注射针ATED将被自己如果针慢慢缩回密封。整个过程应该在时间可能的最小量来完成,以避免进一步的应力和损坏的动物。在移植,细胞悬液趋于聚集和阻止微升注射器。如果发生这种情况,一稀释用无菌PBS或HBSS中的细胞悬浮液被建议。克服该问题的另一种可能性是添加1微升DNA酶I,以细胞悬浮液,以溶解从死细胞的DNA团块,这往往胶水活细胞一起。

这个协议是有限的细胞的磁分选。因此,细胞可以被排序,每一轮只选一个标记。相比于流式细胞术,其中细胞可以使用不同的标记物(包括生理特性以及不同的细胞表面标记)在同一时间进行排序,这是该技术的一个主要缺点。每当在不同标记物的分选需要很短的时间窗口中,流式细胞术可能是更好的解决方案。另外,对于细胞的荧光特性,像转基因表达绿色荧光蛋白或其他生活细胞标记排序是不可能使用这种技术。它目前仅限于利用细胞表面的抗体,可与磁珠偶联。不过,根据所用的技术装备这种技术可以扩大。

由于美天旎是目前磁性细胞分选工具的唯一提供者,没有可用的最新替代品。用于细胞分离,其它酶比木瓜蛋白酶( 胰蛋白酶)也可以使用。值得注意的是,我们的实验室实现了与木瓜蛋白酶的最佳效果,因为这似乎是在我们手中最温柔的解离酶。木瓜蛋白酶消化(30-60分钟)的时间窗口是可变的。在这个时间窗口的最佳消化在我们的实验室中实现。或长或短的孵育时间可能需要根据样品的大小,样品质量ND酶使用。单独测试建议。

鉴于单步MACS未达到纯度水平高达流式细胞术,该技术的一个可能的进一步应用可能是不希望的和潜在有害的细胞的阴性分选。在那里,细胞碎片对于给定的细胞表面标志物阳性不感兴趣,但可以整理出来,留下的权益乃透过隔离在流动的比例。这可以提前或正分拣步骤之后进行,并允许使用不同的细胞表面标记物,以及除去不需要的细胞,如来自多能干细胞培养与潜在风险tumorgenic饲养层细胞或未分化的细胞的细胞的进一步鉴别。因此,MACS可能适用于从未来可能的治疗应用的ES或iPS细胞培养的光感受器的净化,因为它代表一个温柔,快速,简单的治疗对于大量的培养细胞的纯化。 MACS可以自排序步骤的细节很容易地应用到GMP的条件, 机械,流体和程序进行比较,以流式细胞术减少。值得注意的是,该MACS已常规用于临床试验中用于从血液或骨髓细胞的富集。有趣的是,MACS甚至可以应用于细胞时,没有合适的细胞表面标志物的存在,通过基因引入表面标志物,使细胞“主管”后续磁性细胞分选步骤15。

综上所述,MACS代表一个可靠和快速的工具,利用细胞表面标志物用于移植的研究,以丰富感光前体细胞。此外,它是为需要GMP的条件未来临床应用的轻松可采用的方法。

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Disclosures

作者宣称没有竞争的财务权益。

Acknowledgements

我们要感谢阿南德Swaroop提供NRL-GFP的小鼠,约亨·哈斯的技术支持,以及辛迪伯梅和EMELY Lessmann畜牧业。

- 的再生治疗德累斯顿,在CRTD种子助学计划,则SFB 655和ProRetina eV的基础上,直销倍增-BB研究生德累斯顿,以及FUNDAÇÃO第一个中心FZT 111:这项工作是由德意志研究联合会(DFG)的支持CIENCIAËTECNOLOGIA(SFRH/BD/60787/2009)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Papain Dissociation System Worthington Biochemical Corporation LK003150 supplied DNase I is not used in the method
Purified rat anti-mouse CD73, clone TY/23 BD Pharmingen 550738 Stock concentration 0.5 mg/ml
Goat Anti-Rat IgG MicroBeads Miltenyi 130-048-501 Total volume of 2 ml
PBS Gibco 10010-015 Used to count the total number of cells
DNase I Sigma D5025-150KU
HBSS Gibco 14025050 Used for dissociation of the retinas
Trypan blue Sigma Fluka93595 Used to count the total number of cells
Vidisic Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG
Domitor Pfizer 76579
Ketamine 10% Ratiopharm 7538843
Antisedan Pfizer 76590
Phenylephrin 2.5%-Tropicamid 0.5% University Clinics Dresden Pharmacy
Preseparation Filters Miltenyi 130-041-407
LS Columns Miltenyi 130-042-401
MACS MultiStand Miltenyi 130-042-303
QuadroMACS Separator Miltenyi 130-090-976
Fire polish glass Pasteur pipette Brand 74777 20 The pipette’s tips need to be fire-polished and autoclaved.
MACS 15 ml tube rack Miltenyi 130-091-052
Cell count chamber Carl Roth T728.1
Sterile 15 ml tubes Greiner Bio-One 188271
Leica M651 MSD Leica M651 MSD can be used instead of Olympus SZX10
Olympus SZX10 Olympus SZX10 can be used instead of Leica M651 MSD
Olympus inverted stereo microscope CKX41 Olympus CKX41
Cell culture hood Thermo Scientific MSC-Advance Thermo Scientific 51025411
1.5 ml Reaction tube Sarstedt 727706400
2 ml Reaction tube Sarstedt 72695
Eppendorf Centrifuge 5702 VWR (Eppendorf) 521-0733
Mouse head holder myNeurolab 471030
BD Microlance 3 30 G 1/2 in BD Pharmingen 304000
Hamilton microliter syringe 5 µl, 75RN Hamilton 065-7634-01 delivered without needles
Hamilton RN special needle 34 G Hamilton 065-207434 Blunt, 12 mm length
Vannas-Tübingen Spring Scissors - 5 mm Blades Straight Fine Science Tools 15003-08
Dumont #7 Forceps - Titanium Biologie Fine Science Tools 11272-40
Diamond pen Tools-tech
15 mm x 15 mm Cover slips Sparks MIC3366

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References

  1. Bartsch, U., et al. Retinal cells integrate into the outer nuclear layer and differentiate into mature photoreceptors after subretinal transplantation into adult mice. Exp. Eye Res. 86, 691-700 (2008).
  2. MacLaren, R. E., et al. Retinal repair by transplantation of photoreceptor precursors. Nature. 444, 203-207 (2006).
  3. Eberle, D., et al. Outer segment formation of transplanted photoreceptor precursor cells. PLoS One. 7, (2012).
  4. Lakowski, J., et al. Cone and rod photoreceptor transplantation in models of the childhood retinopathy Leber congenital amaurosis using flow-sorted Crx-positive donor cells. Hum. Mol. Genet. 19, 4545-4559 (2010).
  5. Barber, A. C., et al. Repair of the degenerate retina by photoreceptor transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 354-359 (2013).
  6. Pearson, R. A., et al. Restoration of vision after transplantation of photoreceptors. Nature. (2012).
  7. Singh, M. S., et al. Reversal of end-stage retinal degeneration and restoration of visual function by photoreceptor transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, (2013).
  8. Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 6462-6471 (2011).
  9. Koso, H., et al. CD73, a novel cell surface antigen that characterizes retinal photoreceptor precursor cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 5411-5418 (2009).
  10. Lakowski, J., et al. Effective transplantation of photoreceptor precursor cells selected via cell surface antigen expression. Stem Cells. 29, 1391-1404 (2011).
  11. Akimoto, M., et al. Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3890-3895 (2006).
  12. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
  13. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
  14. Osakada, F., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 26, 215-224 (2008).
  15. Lee, M. Y., Lufkin, T. Development of the "Three-step MACS": a novel strategy for isolating rare cell populations in the absence of known cell surface markers from complex animal tissue. J. Biomol. Tech. 23, 69-77 (2012).

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