Transplante de sub-retiniana de MACS purificada fotorreceptoras células precursoras no Adulto Rato Retina

1CRTD / DFG-Research Center for Regenerative Therapies Dresden, Technische Universität Dresden
* These authors contributed equally
Published 2/22/2014
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Medicine

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Summary

O transplante de células representa uma estratégia para o tratamento de degeneração da retina caracterizada por perda de fotorreceptores. Aqui nós descrevemos um método para o enriquecimento de fotorreceptores transplantados e sua enxertia sub-retiniana em camundongos adultos.

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Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina. J. Vis. Exp. (84), e50932, doi:10.3791/50932 (2014).

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Abstract

Deficiência visual e cegueira devido à perda das células fotossensíveis da retina, ou seja, fotorreceptores, representa a principal razão para a deficiência nos países industrializados. Substituição de fotorreceptores degenerados por transplante de células representa uma possível opção de tratamento em futuras aplicações clínicas. De fato, estudos pré-clínicos recentes demonstraram que fotorreceptores imaturos, isoladas da retina neonatal mouse no dia pós-natal 4, têm o potencial para se integrar na retina do rato adulto após transplante de sub-retiniana. Células doadoras gerada uma morfologia de fotorreceptores madura incluindo os segmentos interior e exterior, um corpo da célula redonda localizada na camada nuclear externa, e terminais sinápticos em estreita proximidade com as células bipolares endógenos. De fato, estudos recentes demonstraram que os fotorreceptores doadores funcionalmente integrar os circuitos neurais de ratos hospedeiros. Para uma futura aplicação clínica de tal abordagem de substituição de células, as suspensões purificadasdas células de escolha tem que ser gerado e colocado na posição correta para uma integração adequada no olho. Para o enriquecimento de precursores de fotorreceptores, a separação deve ser baseada em antigénios da superfície celular específicos para evitar a modificação genética de células repórter doadores. Aqui nós mostramos célula magnética associada a triagem (MACS) - enriquecimento de transplantable precursores haste fotorreceptoras isoladas da retina de ratos neonatal repórter específicas de fotorreceptoras com base no marcador CD73 na superfície celular. A incubação com os anticorpos anti-CD73 seguido por micro-grânulos anticorpos secundários conjugados permitiram o enriquecimento de precursores de fotorreceptores bastonete por MACS para aproximadamente 90%. Em comparação com a citometria de fluxo, MACS tem a vantagem de que ele pode ser aplicado mais fácil para padrões de GMP e que grandes quantidades de células podem ser classificados em períodos de tempo relativamente curto. A injecção de suspensões de células enriquecidas para o espaço sub-retiniano de ratos adultos de tipo selvagem resultou numa taxa comparável integração de 3 vezes maiored para suspensões celulares indiferenciados.

Introduction

A visão é um dos sentidos principais dos seres humanos. Imparidade de neste sentido e cegueira são uma das principais razões para a incapacidade dos países industrializados. A causa predominante para a deficiência de visão ou cegueira é a degeneração da retina, caracterizada por perda de células fotorreceptoras, como pode ser observado na degeneração macular, retinite pigmentosa, cones e distrofia, e outras condições. Até à data, uma terapia eficaz para restaurar a perda de visão não está disponível. Em 2006 e 2008 dois laboratórios diferentes relatados, independente um do outro, um transplante com êxito de células precursoras de fotorreceptores bastonete em ratinhos de tipo selvagem retinas adultas 1,2. Assim, surgindo a possibilidade de transplante de células fotorreceptoras precursor também em uma retina degenerado, para substituir fotorreceptores degenerados e restaurar a visão. De facto, demonstrou-se recentemente, que as referidas células precursoras de fotorreceptores transplantados provocar critérios morfológicos de maduros fotorreceptores do tipo selvagem, como properly desenvolveram segmentos externos 3, terminais sinápticos em estreita proximidade com as células bipolares endógenos e um corpo da célula redonda localizada na camada nuclear externa 2-4, bem como a capacidade de se integrar funcionalmente para o circuito neural hospedeiro 5-7. Um dos principais princípios desta estratégia é o uso do dia pós-natal 4 (PN 4, pN0 é definido como o dia de nascimento) jovens retinas ratos, resultando em uma mistura de diferentes tipos de células para transplante. No fundo de uma futura aplicação terapêutica, essa mistura tem que ser purificado para as células fotorreceptoras precursoras. CD73 tem sido descrita como o primeiro marcador de superfície celular específico para jovens fotorreceptores na retina 8-10. Aqui, demonstramos um método de purificação de células fotorreceptoras precursor com base nesta marcador da superfície das células e com o uso da célula magnética associada a triagem (MACS) técnica. MACS podem ter vantagens em relação às técnicas de triagem de células fluorescentes activadas,devido à rápida triagem tempos ea adaptação mais fácil às condições GMP. Nós conseguimos demonstrar um enriquecimento de ~ 90% e uma taxa de integração até 3 vezes superior quando o transplante da população enriquecida para o espaço sub-retinal na retina de tipo selvagem adultos. Assim, baseado no MACS enriquecimento de células fotorreceptoras precursor e transplante sub-retiniano, são técnicas fiáveis ​​e promissores para o desenvolvimento de uma estratégia terapêutica para o tratamento regenerativo de degeneração da retina.

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Protocol

Uso ético e cuidados de animais declaração:

Todos os experimentos com animais foram realizados em estrita conformidade com as leis da União Europeia e os alemães (Tierschutzgesetz) e aderiu à Declaração de ARVO para o uso de animais em Ophthalmic and Vision Research. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo comitê de ética animal da TU Dresden eo Landesdirektion Dresden (número de aprovação: 24D-9168.11-1/2008-33).

1. Antes de iniciar a dissociação celular e classificação celular

  1. Etiqueta três tubos de 15 ml reacção com: Wash (W), fração de positivo (+) e fração negativa (-).

2. Retina dissociação

  1. Decapitar o PN 4 filhotes usando uma tesoura.
  2. Lavar a cabeça dos filhotes logo em etanol 70%, seguido por lavagem em PBS.
  3. Transfira a cabeça para HBSS frio e enuclear olho (repita essa etapa para todos os chefes). Para enuclear, abra as pálpebras e fixar tele olho com uma pinça curva na região do nervo óptico. Em seguida, puxe o olho com cuidado para fora da órbita.
  4. Após enuclear todos os olhos, isolar a retina: introduzir uma tesoura fechada para o nervo óptico e abrir as lâminas. Peal o RPE / chorid fora. Retire as lentes e os vasos sanguíneos usando uma pinça curva.
  5. Transferir as retinas isoladas a um tubo de reacção de 1,5 ml contendo a solução de papaína (fornecido com o kit de dissociação de papaína).
  6. Incubar as retinas na solução de papaína por 30-60 min em banho-maria ou agitador (400 rpm) a 37 ° C.
    1. Enquanto retinas incubar em solução de papaína, pipeta de 1 ml de solução de ovomucóide a um tubo de reacção de 15 ml (etiqueta "1").
    2. Adicionar 60 ul de DNase I (10 mg / mL) + 60 mL de solução de ovomucóide (fornecidas com o kit) + 520 ul de EBSS a um tubo de reacção de 15 ml (rótulo de "2").
  7. Depois de papaína incubação, transferir a solução de papaína que contém as retinas parcialmente digeridos para rtubo eaction "2".
  8. Com uma pipeta polido fogo, executar dissociação mecânica (10x para cima e para baixo).
  9. Pipetar a suspensão de células única de tubo de reacção de "1". Tente gerar 2 camadas por camadas suavemente a suspensão de células no topo da solução ovomucóide.
  10. Centrifugar durante 5 minutos a 300 xg (aproximadamente 1.300 rpm).
  11. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 500 ul de tampão de MACS.

3. Usando células de triagem magnética célula associada Classificando (MACS)

  1. Adicionar X ul rato de anticorpo anti-CD73 para os 500 ul, de modo a atingir uma concentração final de 10 ug / ml.
  2. Incubar 5 min em gelo.
  3. Encha as 15 ml tubo de reacção para 10 ml com tampão de MACS e centrifugar durante 5 min a uma velocidade de 300 x g.
  4. Remover o sobrenadante.
  5. Ressuspender o sedimento em 480 mL de buffer MACS e adicionar 120 mL de cabra microbeads IgG anti-ratos.
  6. Incubar 15 min no gelo; fazer nagitar ot, agite ou misture.
  7. Encha as 15 ml tubo de reacção a 5 ml com tampão MACS e centrifugar durante 5 min a 300 x g.
  8. Como o tubo de reacção foi centrifugada:
    1. Ajuste uma coluna LS no suporte magnético.
    2. Colocar o filtro de pré-separação no topo da coluna LS.
    3. Hidratar o filtro de pré-separação e da coluna LS com tampão MACS 3 ml e recolher os MACS tampão para a lavagem (W) do tubo.
  9. Remover o sobrenadante.
  10. Ressuspender o sedimento em 500 ul de tampão MACS.
  11. Carregar a suspensão de células de 500 ul para o filtro, em seguida adicionar 1 ml de tampão MACS para o filtro e recolher a fracção negativa na fracção negativa (-) do tubo de reacção.
  12. Em seguida, adicione 3 x 3 ml de tampão MACS para a coluna para lavar as células que não estão ligados à coluna
  13. Uma vez que estes 9 ml são através da coluna LS, remova a coluna do suporte magnético e instalá-lo no topo da fração (+) reação positivatubo ção.
  14. Carregar rapidamente 5 ml de tampão MACS na coluna LS e colocar o êmbolo na coluna LS e pressione-o para baixo até que todo o buffer é através da coluna.
  15. Centrifuga-se o tubo de reacção contendo a fracção positiva durante 5 min a 300 x g.
  16. Retirar o sobrenadante, ressuspender em 500 ul de tampão de MACS e manter a 4 ° C.
  17. Conte o número total de células usando um dispositivo de contagem de células comuns.
  18. Prepara-se uma suspensão de células a partir da fracção classificada positiva contendo 2 x 10 5 células / mL em tampão de MACS e manter a 4 ° C

4. Transplante de MAC-ordenados células fotorreceptoras Precursor no mouse Retina

  1. Certifique-se de ter todas as soluções seguintes pronto: 1 ml de PBS estéril ou HBSS, 10 mL de DNAse I, 1-2 ml estéril H 2 O deionizada, alíquotas das frações de suspensão de células a 4 ° C.
  2. Anestesiar o rato adulto (ou seja, 2-4 meses de idade)com uma injecção intraperitoneal de cloridrato de medetomidina (0,01 mg/10 g de peso corporal), cetamina (0,75 mg/10 g de peso corporal). Em seguida, fazer uma injecção subcutânea de buprenorfina (0,05 mg / kg de peso corporal) para o alívio da dor.
  3. Dilatar as pupilas com uma queda de 2,5% phenylephrin-Tropicamid 0,5%.
  4. Fix rato no suporte da cabeça do rato e coloque sob o microscópio estéreo.
  5. Aplicar uma gota de gel Visidic para evitar a secagem do olho.
  6. Faça um pequeno furo na fronteira entre a esclera e córnea (respectivamente ora serrata) usando um estéril 30 G ½ na agulha.
  7. Corte uma tampa deslizante comum em pequenos (aproximadamente 5 mm x 5 mm) em pedaços usando uma caneta de diamante, coloque uma dessas peças em cima da córnea, permitindo a visualização direta da retina.
  8. Lave a seringa pré-esterilizado microlitro várias vezes com água deionizada.
  9. Coloque a seringa microlitro com 1 ml de suspensão de células, agulha direto tangencialmente através da conjuntivae esclera e coloca-se sob o controle visual na metade nasal da retina.
  10. Perfurador suavemente um buraco na retina até alcançar o espaço sub-retiniano, injectar a suspensão de células para o espaço sub-retiniano.
  11. Observe o desprendimento de retina bolhosa, que deve ser uniforme, cobrindo aproximadamente ¼ do espaço da retina, sem qualquer sangramento.
  12. Retire a seringa suavemente, os selos buraco da retina automaticamente.
  13. Lave a seringa microlitro várias vezes com água deionizada.
  14. Solte o mouse de cabeça titular.
  15. Acorde rato pela injeção de cloridrato de atipamozole para a reversão do efeito de cloridrato de medetomidina.
  16. Coloque o mouse para acordar em tempo quente câmara escura (cerca de 25 ° C).
  17. Os próximos 2 dias após o transplante, buprenorfina (0,05 mg / kg de peso corporal) deve ser administrada por injecção subcutânea na parte da manhã e na parte da tarde para o alívio da dor.

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Representative Results

A fim de avaliar a capacidade de bastonetes para se integrar na retina do rato, foi utilizada uma linha de repórter do rato, em que a GFP é impulsionado pela retina neural de fecho de leucina (Nrl, Nrl-GFP), o promotor 11. NRL é o primeiro marcador de bastonetes de iniciar a sua expressão em E12.5 toda a vida adulta, permitindo a rotulagem específica de células fotorreceptoras haste doadores.

PN 4 filhotes Nrl-GFP foram decapitados e os olhos foram enucleados. Retinas foram, em seguida, isolado e dissociadas utilizando o método descrito acima. A suspensão de células resultante foi então classificados usando Macs CD73 (Figuras 1 e 2). Após MAC triagem, analisamos o enriquecimento alcançado durante este procedimento.

Como mostrado na Figura 3A, a suspensão de células inicial (de entrada) continham 30,4% de células GFP positivas, ou seja. bastonetes. Seguindo MAC-ordenação com base em CD73,um enriquecimento de até 86,9% na fracção de CD73-positivas (CD73 +) foi observada por citometria de fluxo. Na fracção CD73-negativas (CD73-), apenas 9,9% de todas as células foram detectadas positivamente para GFP (Figura 3A). O enriquecimento de células positivas para GFP-Nrl seguintes MACS CD73-base é adicionalmente visualizados após a sementeira in vitro (Figura 3B).

Depois de MAC-triagem, as células dadoras na fracção de CD73-positivas foram centrifugadas e ressuspensas para uma concentração final de 200.000 células / mL. Esta suspensão de células foi também utilizada para o transplante para o espaço sub-retiniano de retinas hospedeiras de tipo selvagem (Figura 4). Três a quatro semanas após o transplante, as retinas foram fixadas hospedeiro, isolado e seccionados. Várias células do doador integrado na camada nuclear exterior dos anfitriões e adquiriu a morfologia dos fotorreceptores maduros com a localização do corpo de células na camada nuclear exterior e Formações n de esférulas sinápticas e segmentos interiores (Figura 5). Imagens detalhadas foram publicadas antes pelo nosso grupo de 3,8 mostrando um resultado comparável com células classificadas-FAC transplantadas para sediar retinae por outros grupos 4,6,10. Consistente em todos estes estudos é que as células transplantadas permanecer no local de injecção, definida pela retina hospedeira isolada bolhosa, e não migrar. Alguns integrar na retina do hospedeiro (isto é, camada nuclear externa), e alguns permanecem no espaço sub-retiniano 3. Além disso, demonstrou-se, que a distribuição de células dadoras no local de integração depende do tipo de modelo de rato usado 5. Sem sinais agudos de rejeição host / enxerto foram detectados em transplantes entre camundongos C57BL/6J.

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Figura 1. Esquema geral do transplante sub-retiniana de MACS purificados precursores fotorreceptoras em rato adulto retina. Células doadoras de PN 4 filhotes Nrl-GFP são isolados, seguidos por MAC-ordenação e transplantadas para o espaço sub-retiniano de retinas de acolhimento do rato baseado em CD73. Clique aqui para ver figura maior .

Figura 2
Figura 2. Enriquecimento de fotorreceptores transplantáveis ​​por MACS. A suspensão de células geradas a partir de todos recolhidos retinas PN4 é incubada com anticorpos anti-CD73 de rato primária seguida de lavagem e incubação com anticorpos anti-rato conjugado com microesferas. Os anticorpos não ligados são lavados. A suspensão de células é passada througha LS-coluna que está conectado com um suporte magnético. As células que estão vinculados por anticorpos ficar ligado à coluna, enquanto as células restantes são eluídos e recolhidos (fração CD73-negativo). Finalmente, a LS-coluna é removido a partir do suporte magnético e as células restantes são eluídas e recolhido (fracção CD73-positivo). clique aqui para ver filme completo .

Figura 3
Figura 3. Análise de Nrl-GFP enriquecimento celular positiva seguinte baseado em CD73 MAC-ordenação. (A) Antes de classificação, a população inicial de células do doador continha 30,4% de células positivas Nrl-GFP. Seguindo MAC-triagem, um enriquecimento de células GFP positivas poderia ser detectado na fracção de CD73 + (86,9%), enquanto o CD73-fração continha apenas pequenas quantidades de células GFP + (9,9%). (B) Imagem representativa demonstrando o resultado de baseado em CD73 MAC-ordenação de células PN4 Nrl-GFP. 1 milhão de células a partir de cada fracção foram plaqueadas em lamelas revestidas com laminina. As células foram fixadas quatro horas após o plaqueamento com PFA a 4% durante 10 min. As células foram coradas com DAPI (4 ',6-diamidino-2-phenylindole, 1:20.000). Um enriquecimento significativo de células GFP positivas na fracção de CD73 + foi observada quando em comparação com a fracção de entrada ou a CD73-fracção. clique aqui para ampliar figura .

Figura 4
Figura 4. Injeção sub-retiniana. Desenho esquemático do processo de transplantação no retin rato adultoa. A agulha é inserida através de um buraco na ora serrata, navegado através do espaço vítreo, evitando tocar nas lentes e colocado na retina sob controle visual. Por gentil empurrando, a agulha é perfurada através da retina e colocada no espaço sub-retiniano. Eventualmente, a suspensão celular é injectado cuidadosamente sob controle visual por meio da avaliação do processo de desprendimento.

Figura 5
Figura 5. Integração de células fotorreceptoras transplantadas. Imagem Representante retratando MACS baseada CD73 integrados classificadas células PN4 Nrl-GFP após o transplante na retina do rato adulto. Precursores fotorreceptoras transplantadas integrar corretamente na camada nuclear externa (ONL) e gerar maduro morfologia fotorreceptor.

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Discussion

O transplante de células precursoras Subretinal fotorreceptoras representa uma ferramenta confiável para conseguir a integração dessas células sensíveis à luz na retina de acolhimento em números significativos 1,2. Isto pode permitir o estabelecimento de uma terapia celular para o tratamento de doenças degenerativas da retina, no futuro, 6. A população de dadores de células isoladas a partir de, actualmente PN 4 retinas, é uma mistura de diferentes tipos de células, a partir da qual apenas as células fotorreceptoras precursoras integram após a injecção sub-retiniana. Ao utilizar-base CD73 de MAC-ordenação, a proporção de fotorreceptores na suspensão de células do doador pode ser aumentada para 90% ≈ que permite uma taxa de integração de cerca de 3 vezes superior em retinas hospedeiras de tipo selvagem quando em comparação com a população de células não separadas 8. Em comparação com a citometria de fluxo, MACS tem a vantagem de um rápido procedimento de triagem e que pode ser relativamente fácil de aplicar padrões de GMP. A purificação de fotorreceptores transplantáveis ​​é de sESPECÍFICAS interesse em função das vantagens recentes para a geração in vitro de fotorreceptores provenientes de células estaminais pluripotentes 12-14. As culturas de células-tronco pluripotentes diferenciados são compostos de diversos tipos de células-fazendo a disponibilidade de procedimentos de classificação específicas de um pré-requisito essencial para a sua futura utilização em terapias de transplante celular.

De acordo com o procedimento de purificação da MACS, vários pontos são dignos de nota, assegurar um fluxo de trabalho sem grandes distúrbios. Quanto maior for o número de retinas a ser classificados, é necessário mais tempo para a sua digestão. Após a digestão, durante o procedimento de classificação, a agregação de células tem de ser evitada. Isto ocorre, de preferência, antes da adição do anticorpo secundário e durante a sua incubação. Neste caso, o agregado deve ser removido imediatamente com uma pipeta. Durante a eluição de tampão MACS ao coletar a fração MACS-negativas, é absolutamente necessário para não adicionar mais de 3 ml para a coluna.A pressão do tampão que a coluna será demasiado elevada, se mais do que 3 ml de tampão é adicionada. Isto irá perturbar a ligação do anticorpo às células e reduz a eficiência de triagem. Ao remover a coluna do suporte magnético para começar a coletar a fração MACS-positivos, este passo tem de ser feito rapidamente. Os 5 ml de tampão MACS deve ser adicionado à coluna tão rápido quanto possível. Além disso, a imersão deve ser colocado e pressionado rapidamente, até que todo o tampão é através da coluna. Não é necessário se preocupar com a pressão aplicada. O tampão MACS é isotónica e pode ser variada. É possível a utilização de tampão de FACS, o meio de cultura de células, PBS, de EBSS, ou HBSS. A esterilidade do tampão pode ser conseguido por filtração através de um filtro de membrana de 0,4 um.

Depois de enriquecimento por MACS, um transplante bem sucedido de células doadoras para o espaço sub-retiniano pode ser alcançado por manter os seguintes pontos em mente. Uma vez que as células fotorreceptoras parecem ser muito sensíveis a um tratamento ex vivo,não é aconselhável mantê-los em 4 ° C mais do que o necessário. Prosseguir para o transplante tão rápido quanto possível. Quando da inserção da agulha de injecção dentro do globo ocular, é importante para evitar tocar na lente quando a agulha de metal relativamente afiada pode danificar a lente, resultando em indução de uveite induzida por lentes. O último passo no caminho para o espaço sub-retinal, a penetração da retina, é crucial. Uma vez que não é possível observar visualmente se o espaço sub-retiniano seja alcançada, é importante desenvolver uma sensação para o empurrar direito pressão e da resistência do tecido. Para testar, se a cabeça da agulha é colocada corretamente, um pequeno volume pode ser aplicada eo descolamento da retina na cabeça da agulha deve ser cuidadosamente observado. Se, um destacamento bolhosa rodada sem sangramento está se formando, a posição está correta e no resto da solução pode ser aplicada com cuidado. Durante a injecção, a agulha deve permanecer na sua posição para evitar danos adicionais ao tecido. A CRE buraco da retinaciado pela agulha de injeção irá selar, por si só, se a agulha é retirada lentamente. Todo o procedimento deve ser feito no menor tempo possível, para evitar uma maior tensão e dano para o animal. Durante o transplante, a suspensão de células tende a aglutinar-se e bloquear a seringa microlitro. Se isso acontecer, é sugerida uma diluição da suspensão de células utilizando PBS esterilizado ou HBSS. Outra possibilidade para superar este problema é adicionar 1 ml de DNAse I à suspensão de células, para dissolver aglomerados de DNA a partir de células mortas, que tendem a colar as células vivas em conjunto.

Este protocolo é limitado à separação magnética de células. Portanto, as células poderiam ser ordenados por apenas um marcador por triagem rodada. Em comparação com a citometria de fluxo, onde as células podem ser separadas utilizando diferentes marcadores (incluindo as propriedades fisiológicas, bem como diferentes marcadores de superfície celular), ao mesmo tempo, isto é uma grande desvantagem desta técnica. Sempre que a triagem para marcadores diferentesuma janela de tempo curto é necessária, por citometria de fluxo pode ser a melhor solução. Além disso, a triagem para as propriedades fluorescentes das células, como a GFP expressa transgenicamente ou outros marcadores de células a vida não é possível com esta técnica. Ele está restrita à utilização de anticorpos da superfície celular que podem ser conjugados com pérolas magnéticas. No entanto, esta técnica pode ser ampliada com base no equipamento técnico utilizado.

Desde Miltenyi Biotec é atualmente a única fornecedora de ferramentas de classificação de células magnéticas, não há alternativa disponível até o momento. Para a dissociação celular, outras enzimas do que a papaína (por exemplo, tripsina) pode ser utilizado. Digno de nota, o nosso laboratório obteve os melhores resultados com a papaína, uma vez que esta parece ser a enzima dissociação mais suave em nossas mãos. A janela de tempo de digestão de papaína (30-60 min), é variável. Nesta janela de tempo de digestão óptima foi alcançada no nosso laboratório. Mais curto ou mais longo do tempo de incubação pode ser necessária, dependendo do tamanho da amostra, a qualidade da amostra de umª enzima utilizada. Sugere-se o teste individual.

Dado que a única etapa MACS não atingir níveis de pureza tão elevadas como citometria de fluxo, uma possível continuação da aplicação desta técnica pode ser a classificação negativa de células nocivas indesejadas e potenciais. Ali, a fracção de células positivas para um determinado marcador de superfície celular, mas não é de interesse pode ser resolvido, deixando a fracção de interesse isolado do fluxo através. Isto pode ser feito antes ou depois de um passo de triagem positivo e permite uma maior discriminação de células utilizando diferentes marcadores da superfície das células, bem como a remoção de células indesejadas, como as células da camada de alimentador ou células indiferenciadas a partir de culturas de células estaminais pluripotentes com o seu potencial de risco tumorgenic . Portanto, MACS pode ser adequado para a purificação de fotorreceptores de ES ou iPS culturas de células em possíveis futuras aplicações terapêuticas, uma vez que representa um tratamento suave, rápido e simples para purificação de grandes quantidades de células cultivadas. MACSpode ser facilmente aplicado a GMP-condições dado que os pormenores de passos de triagem, ou seja, a mecânica de fluidos e os procedimentos são reduzidos em comparação com a citometria de fluxo. É de salientar, que MACS já é utilizado rotineiramente em ensaios clínicos para o enriquecimento de células de sangue ou medula óssea. Curiosamente, MACS pode ser aplicada até mesmo em células quando nenhum marcador da superfície celular apropriada está presente, por geneticamente introdução de um marcador de superfície para produzir células "competente" para posterior separação de células magnéticas as etapas 15.

Em resumo, o MACS representa uma ferramenta confiável e rápido para enriquecer células precursoras fotorreceptoras usando marcadores de superfície celular para estudos de transplante. Além disso, é um método facilmente utilizável para aplicações clínicas futuras que requerem condições de BPF.

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Disclosures

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgements

Nós gostamos de agradecer Anand Swaroop para fornecer camundongos Nrl-GFP, Jochen Haas para o suporte técnico, e Sindy Böhme e Emely Lessmann para criação de animais.

Este trabalho foi apoiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG): FZT 111 - Centro de Terapias Regenerativa Dresden, a Semente CRTD Grant Programa, o SFB 655, ea fundação ProRetina eV, o CAVE-BB de Pós-Graduação Programa de Dresden, ea Fundação para a Ciência e Tecnologia (SFRH/BD/60787/2009)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Papain Dissociation System Worthington Biochemical Corporation LK003150 supplied DNase I is not used in the method
Purified rat anti-mouse CD73, clone TY/23 BD Pharmingen 550738 Stock concentration 0.5 mg/ml
Goat Anti-Rat IgG MicroBeads Miltenyi 130-048-501 Total volume of 2 ml
PBS Gibco 10010-015 Used to count the total number of cells
DNase I Sigma D5025-150KU
HBSS Gibco 14025050 Used for dissociation of the retinas
Trypan blue Sigma Fluka93595 Used to count the total number of cells
Vidisic Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG
Domitor Pfizer 76579
Ketamine 10% Ratiopharm 7538843
Antisedan Pfizer 76590
Phenylephrin 2.5%-Tropicamid 0.5% University Clinics Dresden Pharmacy
Preseparation Filters Miltenyi 130-041-407
LS Columns Miltenyi 130-042-401
MACS MultiStand Miltenyi 130-042-303
QuadroMACS Separator Miltenyi 130-090-976
Fire polish glass Pasteur pipette Brand 74777 20 The pipette’s tips need to be fire-polished and autoclaved.
MACS 15 ml tube rack Miltenyi 130-091-052
Cell count chamber Carl Roth T728.1
Sterile 15 ml tubes Greiner Bio-One 188271
Leica M651 MSD Leica M651 MSD can be used instead of Olympus SZX10
Olympus SZX10 Olympus SZX10 can be used instead of Leica M651 MSD
Olympus inverted stereo microscope CKX41 Olympus CKX41
Cell culture hood Thermo Scientific MSC-Advance Thermo Scientific 51025411
1.5 ml Reaction tube Sarstedt 727706400
2 ml Reaction tube Sarstedt 72695
Eppendorf Centrifuge 5702 VWR (Eppendorf) 521-0733
Mouse head holder myNeurolab 471030
BD Microlance 3 30 G 1/2 in BD Pharmingen 304000
Hamilton microliter syringe 5 µl, 75RN Hamilton 065-7634-01 delivered without needles
Hamilton RN special needle 34 G Hamilton 065-207434 Blunt, 12 mm length
Vannas-Tübingen Spring Scissors - 5 mm Blades Straight Fine Science Tools 15003-08
Dumont #7 Forceps - Titanium Biologie Fine Science Tools 11272-40
Diamond pen Tools-tech
15 mm x 15 mm Cover slips Sparks MIC3366

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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