Trasplante de Células Subretinal MACS purificada fotorreceptores precursores en el ratón adulto Retina

1CRTD / DFG-Research Center for Regenerative Therapies Dresden, Technische Universität Dresden
* These authors contributed equally
Published 2/22/2014
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Medicine

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Summary

Trasplante de la célula representa una estrategia para el tratamiento de la degeneración de la retina que se caracteriza por la pérdida de fotorreceptores. Aquí se describe un método para el enriquecimiento de los fotorreceptores trasplantables y su injerto subretiniano en ratones adultos.

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Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina. J. Vis. Exp. (84), e50932, doi:10.3791/50932 (2014).

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Abstract

La discapacidad visual y la ceguera debido a la pérdida de las células-sensible a la luz de la retina, es decir, los fotorreceptores, representa la razón principal de discapacidad en los países industrializados. Reemplazo de los fotorreceptores degenerados por el trasplante de células representa una opción de tratamiento posible en futuras aplicaciones clínicas. De hecho, los estudios preclínicos recientes demostraron que los fotorreceptores inmaduras, aisladas de la retina del ratón neonatal en el día postnatal 4, tienen el potencial de integrar en la retina de ratones adultos después de un trasplante subretiniano. Las células donantes generado una morfología madura fotorreceptor incluidos los segmentos interior y exterior, un cuerpo de células redondas situado en la capa nuclear externa, y terminales sinápticas en estrecha proximidad a las células bipolares endógenos. De hecho, los informes recientes demostraron que los fotorreceptores donantes funcionalmente a integrarse en los circuitos neurales de los ratones receptores. Para una aplicación clínica futura de dicho método de sustitución celular, suspensiones purificadasde las células de elección tiene que ser generada y se coloca en la posición correcta para la integración adecuada en el ojo. Para el enriquecimiento de precursores de fotorreceptores, la clasificación debe basarse en antígenos específicos de la superficie celular para evitar la modificación genética reportero de células del donante. Aquí se muestra de células-magnético asociado de clasificación (MACS) - enriquecimiento de precursores fotorreceptoras varilla trasplantables aisladas de la retina de los ratones neonatales reportero-fotorreceptoras específica basados ​​en el marcador CD73 de superficie celular. La incubación con anticuerpos anti-CD73 seguido de micro-talón anticuerpos secundarios conjugados permitido el enriquecimiento de precursores de fotorreceptores de varilla por MACS a aproximadamente 90%. En comparación con la citometría de flujo, MACS tiene la ventaja de que puede ser más fácil aplicada a las normas GMP y que altas cantidades de células se pueden clasificar en cortos períodos de tiempo relativos. La inyección de suspensiones de células enriquecidas en el espacio subretiniano de ratones de tipo salvaje adultos resultó en una compara la tasa de integración de 3 veces mayorcado a las suspensiones de células no ordenados.

Introduction

La visión es uno de los sentidos principales de los seres humanos. Deterioro del valor de este sentido y la ceguera son uno de los principales motivos de discapacidad en los países industrializados. La causa predominante de deterioro de la visión o ceguera es degeneración de la retina, que se caracteriza por la pérdida de células de fotorreceptores, como se puede observar en la degeneración macular, retinitis pigmentosa, distrofia de conos y bastones, y otras condiciones. Hasta la fecha, una terapia eficaz para restaurar la visión perdida no está disponible. En 2006 y 2008 dos laboratorios diferentes reportadas, independientemente el uno del otro, un éxito del trasplante de células precursoras de los fotorreceptores de varilla en ratones de tipo salvaje adultos retinas 1,2. Por lo tanto, surge la posibilidad de trasplante de células precursoras de los fotorreceptores también en una retina degenerada, para reemplazar fotorreceptores degenerados y restaurar la visión. De hecho, se ha demostrado recientemente, que tales células precursoras de los fotorreceptores trasplantados provocan criterios morfológicos de los fotorreceptores de tipo salvaje maduros, como properlY desarrolló segmentos exteriores 3, terminales sinápticas en estrecha proximidad a las células bipolares endógenos y un cuerpo de células redondas situado en la capa nuclear externa 2-4, así como la capacidad de integrar funcionalmente en los circuitos neurales anfitrión 5-7. Uno de los principios fundamentales de esta estrategia es el uso del día postnatal 4 (PN 4, PN0 se define como día de nacimiento) jóvenes retinas de los ratones, lo que resulta en una mezcla de diferentes tipos de células para trasplante. En el fondo de una futura aplicación terapéutica, esta mezcla tiene que ser purificado para las células precursoras de los fotorreceptores. CD73 ha sido descrito como el primer marcador de superficie celular específico para jóvenes fotorreceptores en la retina 8-10. Aquí, se demuestra un método de purificación de células precursoras fotorreceptor sobre la base de este marcador de superficie celular y con el uso de la célula-magnético asociado técnica de clasificación (MACS). MACS pueden tener ventajas en comparación con técnicas de clasificación de células fluorescentes activadas,debido a la clasificación rápida veces y el ajuste más fácil a las condiciones GMP. Hemos podido demostrar un enriquecimiento de ~ 90% y una tasa de integración de hasta 3 veces mayor cuando el trasplante de la población enriquecida al espacio subretiniano en las retinas de tipo salvaje adultos. Por lo tanto, el enriquecimiento de células precursoras de los fotorreceptores basado MACS-y el trasplante subretiniano, son técnicas fiables y prometedoras para el desarrollo de una estrategia terapéutica regenerativa para el tratamiento de la degeneración de la retina.

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Protocol

Uso ético y cuidado de animales de declaración:

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo en estricta conformidad con las leyes de la Unión Europea y de Alemania (Tierschutzgesetz) y se adhirieron a la Declaración de ARVO para el uso de animales en Oftálmica y Vision Research. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el comité de ética animal de la Universidad Técnica de Dresde y la Landesdirektion Dresden (número de autorización: 24D-9168.11-1/2008-33).

1. Antes de empezar la disociación celular y separación celular

  1. Etiqueta tres tubos de 15 ml de reacción con: Wash (W), la fracción positiva (+) y la fracción negativa (-).

2. Retina Disociación

  1. Decapitar a la PN 4 crías utilizando una tijera.
  2. Enjuague la cabeza de los cachorros en breve en etanol al 70% seguido de lavado en PBS.
  3. Transfiera la cabeza al frío HBSS y enucleación del ojo (repita este paso para todas las cabezas). Para enuclear, abra los párpados y fijar tque ojo con pinzas curvas en la región del nervio óptico. A continuación, tire el ojo con cuidado fuera de la órbita.
  4. Después de enucleación todos los ojos, aislar la retina: introducir una tijera cerrado en el nervio óptico y abrir las cuchillas. Peal RPE / chorid cabo. Retire los lentes y los vasos sanguíneos utilizando pinzas curvas.
  5. Transferir las retinas aisladas en un tubo de reacción de 1,5 ml que contiene la solución de papaína (proporcionado por el kit de disociación de papaína).
  6. Incubar las retinas en la solución de papaína durante 30-60 minutos en un baño de agua o agitador (400 rpm) a 37 ° C.
    1. Mientras que las retinas se incuban en la solución de papaína, una pipeta 1 ml de solución de ovomucoide a un tubo de reacción de 15 ml (etiqueta "1").
    2. Añadir 60 l de DNasa I (10 mg / ml) + 60 l de solución de ovomucoide (proporcionados por el kit) + 520 l de EBSS a un tubo de reacción de 15 ml (etiqueta "2").
  7. Después de la incubación papaína, transferir la solución de papaína que contiene las retinas parcialmente digeridos para rtubo eaction "2".
  8. Usando una pipeta pulida fuego, realizar disociación mecánica (10 veces arriba y abajo).
  9. Pipetear la suspensión de células individuales para tubo de reacción "1". Trate de generar 2 capas por capas suavemente la suspensión de células en la parte superior de la solución ovomucoide.
  10. Se centrifuga durante 5 minutos a 300 x g (aproximadamente 1300 rpm).
  11. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en 500 l de tampón de MACS.

3. Clasificación de células Usando magnética asociada a las células de clasificación (MACS)

  1. Añadir X l rata anticuerpo anti-CD73 a los 500 l con el fin de lograr una concentración final de 10 mg / ml.
  2. Incubar 5 minutos en hielo.
  3. Llenar los 15 ml tubo de reacción a 10 ml con tampón MACS y se centrifuga durante 5 min a una velocidad de 300 x g.
  4. Eliminar el sobrenadante.
  5. Resuspender el precipitado en 480 mu l MACS buffer y añadir 120 l de cabra anti-rata microperlas IgG.
  6. Incubar 15 minutos en hielo; hacer nagitar ot, agitar o mezclar.
  7. Llenar los 15 ml tubo de reacción a 5 ml con tampón MACS y se centrifuga durante 5 min a 300 x g.
  8. A medida que el tubo de reacción se ha centrifugado:
    1. Ajustar una columna LS en el soporte magnético.
    2. Ponga el filtro de separación previa en la parte superior de la columna de LS.
    3. Hidratar el filtro de separación previa y la Columna LS con tampón 3 ml MACS y recoger las MACS búfer en el lavado (W) tubo.
  9. Eliminar el sobrenadante.
  10. Resuspender el sedimento en tampón MACS 500 mL.
  11. Cargue la suspensión celular de 500 l para el filtro, a continuación, añadir 1 ml de tampón MACS al filtro y recoger la fracción negativa en la fracción negativa - tubo de reacción ().
  12. A continuación, agregue 3 x 3 ml de tampón MACS a la columna para lavar las células que no están vinculados a la columna
  13. Una vez que estos 9 ml son a través de la columna LS, quite la columna del soporte magnético e instalarlo en la parte superior de la fracción (+) reacción positivatubo ción.
  14. Cargar rápidamente 5 ml de tampón de MACS en la Columna LS y poner el émbolo en la Columna LS y presione hacia abajo hasta que toda la memoria intermedia es a través de la columna.
  15. Centrifugar el tubo de reacción que contiene la fracción positiva durante 5 min a 300 x g.
  16. Eliminar el sobrenadante, resuspender en 500 l de tampón de MACS y mantenga a 4 ° C.
  17. Cuente la cantidad total de células usando un dispositivo de recuento celular común.
  18. Preparar una suspensión de células de la fracción ordenados positivo que contiene 2 x 10 5 células / l en tampón MACS y mantenerse a 4 ° C

4. Trasplante de Weaver-MAC células fotorreceptoras precursor en la retina del ratón

  1. Asegúrese de tener todas las soluciones siguientes listas: 1 ml de PBS estéril o HBSS, 10 l de DNasa I, 1-2 H desionizada ml estéril 2 O, alícuotas de las fracciones de células en suspensión a 4 ° C.
  2. Anestesiar el ratón adulto (es decir, 2-4 meses de edad)con una inyección intraperitoneal de clorhidrato de medetomidina (0,01 mg/10 g de peso corporal), ketamina (0,75 mg/10 g de peso corporal). A continuación, realice una inyección subcutánea de la buprenorfina (0,05 mg / kg de peso corporal) para el alivio del dolor.
  3. Dilata los alumnos con una gota de fenilefrina al 2,5%-tropicamida 0,5%.
  4. Fijar ratón en el soporte de la cabeza del ratón y colocar bajo el microscopio estéreo.
  5. Aplique una gota de Visidic gel para prevenir la sequedad de los ojos.
  6. Haz un pequeño agujero en la frontera entre la esclerótica y la córnea (respectivamente ora serrata) utilizando una solución estéril de 30 G ½ en la aguja.
  7. Cortar una tapa deslizante común en pequeños trozos (aproximadamente 5 mm x 5 mm), utilizando una pluma de diamantes, colocar una de estas piezas en la parte superior de la córnea, lo que permite la visualización directa de la retina.
  8. Enjuague la jeringa microlitro preesterilizadas varias veces con agua desionizada.
  9. Cargue la jeringa microlitro con 1 l de suspensión celular, aguja directa tangencialmente a través de la conjuntivay la esclerótica y el lugar bajo control visual en el medio nasal de la retina.
  10. Perforar un agujero suavemente en la retina hasta alcanzar el espacio subretiniano, inyectar la suspensión de células en el espacio subretiniano.
  11. Observar el desprendimiento de retina bulloso, que debe ser uniforme, cubriendo aproximadamente ¼ del espacio retinal sin sangrado.
  12. Retirar la jeringa con suavidad, los sellos del agujero de la retina de forma automática.
  13. Enjuague la jeringa microlitro varias veces con agua desionizada.
  14. Suelte el ratón del soporte del cabezal.
  15. Despierta ratón mediante la inyección de clorhidrato atipamozole para la reversión del efecto de hidrocloruro de medetomidina.
  16. Coloque el ratón para despertar el tiempo en el warm cámara oscura (aproximadamente 25 ° C).
  17. Los siguientes 2 días después del trasplante, buprenorfina (0,05 mg / kg de peso corporal) debe ser administrado por inyección subcutánea en la mañana y en la tarde para el alivio del dolor.

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Representative Results

Con el fin de evaluar la capacidad de los fotorreceptores de los bastones de integrar en la retina del ratón, se utilizó una línea de ratón reportero, en el que la GFP es accionado por la cremallera de leucina retina neural (NRL, Nrl-GFP) promotor 11. Nrl es el marcador más precoz de los fotorreceptores de los bastones a partir de su expresión en E12.5 durante la edad adulta, lo que permite un etiquetado específico de las células fotorreceptoras de la barra de los donantes.

PN 4 cachorros Nrl-GFP fueron decapitados y los ojos fueron enucleados. Las retinas se aislaron y se disociaron usando el método descrito anteriormente. La suspensión celular resultante se ordena utilizando MACS basado en CD73 (Figuras 1 y 2). Siguiendo la clasificación de MAC, analizamos el enriquecimiento logrado durante este procedimiento.

Como se muestra en la Figura 3A, la suspensión celular inicial (de entrada) contenía 30,4% de células GFP-positivas, es decir. fotorreceptores de los bastones. Después de MAC-ordenación basada en CD73,un enriquecimiento de hasta el 86,9% en la fracción CD73-positivo (CD73 +) se observó por citometría de flujo. En la fracción-CD73 negativo (CD73-) sólo 9,9% de todas las células se detectaron positivamente para GFP (Figura 3A). El enriquecimiento de células positivas Nrl-GFP siguientes Macs basados ​​en CD73 se visualiza, además, después de la siembra in vitro (Figura 3B).

Después de MAC-clasificación, las células del donante en la fracción CD73-positivo se centrifugaron y se resuspendieron a una concentración final de 200.000 células / mL. Esta suspensión de células se utiliza, además, para el trasplante en el espacio subretiniano de las retinas de acogida de tipo salvaje (Figura 4). Tres o cuatro semanas después del trasplante, las retinas de acogida se fijaron, aislado y se seccionaron. Varias células donantes integrados en la capa nuclear externa de los anfitriones y adquieren la morfología de los fotorreceptores maduros con la localización del cuerpo celular en la capa nuclear externa y formatio n de esferas sinápticas y segmentos interiores (Figura 5). Imágenes detalladas han sido publicados anteriormente por nuestro grupo 3,8 mostrando un resultado comparable con las células del CAA-ordenados trasplantadas para acoger retinas por otros grupos 4,6,10. Consistente en todos estos estudios, es decir, que las células trasplantadas se quedan en el lugar de la inyección, que se define por la retina bulloso anfitrión individual, y no migran lejos. Algunos se integran en la retina de acogida (es decir, la capa nuclear externa), y algunos permanecen en el espacio subretiniano 3. Además, se ha demostrado, que la distribución de células de donante en el sitio de la integración depende del tipo de modelo de ratón utilizado 5. No se detectaron signos de rechazo anfitrión / injerto agudo en los trasplantes entre los ratones C57BL/6J.

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Figura 1. Esquema general del trasplante subretinal de MACS purificados precursores de fotorreceptores en la retina de ratones adultos. Las células del donante de PN 4 cachorros Nrl-GFP están aislados, seguidos por MAC-clasificación y trasplantado en el espacio subretiniano de retinas de ratones receptores basados ​​en CD73. Haga clic aquí para ver la cifra mayor .

Figura 2
Figura 2. Enriquecimiento de los fotorreceptores trasplantables por MACS. La suspensión de células generada a partir de todos retinas PN4 recogido se incuba con primarios de rata anticuerpos anti-CD73, seguido por lavado e incubación con anticuerpos anti-rata conjugados con microperlas. Los anticuerpos no ligados se eliminan por lavado. La suspensión de células se pasa througja LS-columna que está conectado con un soporte magnético. Las células que están obligados por anticuerpos permanecen unidos a la columna mientras que las células restantes se eluyen y se recogieron (fracción-CD73 negativo). Por último, LS-columna se retira del soporte magnético y las células restantes se eluyen y se recoge (fracción CD73-positivo). Haga clic aquí para ver la película completa .

Figura 3
Figura 3. Análisis de Nrl-GFP enriquecimiento de células positivas CD73 siguiente basada en MAC-clasificación. (A) Antes de la ordenación, la población inicial de células del donante contenía 30,4% de las células Nrl GFP-positivas. Después de MAC-clasificación, un enriquecimiento de células GFP-positivas podría ser detectada en la fracción CD73 + (86.9%) mientras que la CD73-fracción contenía sólo cantidades bajas de células GFP + (9,9%). (B) Representante imagen que demuestra el resultado de a base de CD73 MAC-clasificación de las células PN4 Nrl-GFP. 1 millón de células de cada fracción se sembraron en cubreobjetos recubiertos con laminina. Las células se fijaron 4 horas después de la siembra con 4% de PFA durante 10 min. Las células se tiñeron con DAPI (4 ',6-diamino-2-fenilindol, 1:20.000). Se observó un significativo enriquecimiento de las células GFP-positivas en la fracción CD73 + en comparación con la fracción de entrada o el CD73-fracción. Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Figura 4
Figura 4. Inyección subretiniana. Esquema del proceso de trasplante en el retin ratón adultouna. La aguja se inserta a través de un agujero en la ora serrata, navegado a través del espacio vítreo, evitando tocar la lente y se coloca en la retina bajo control visual. Por suave empujando, la aguja se perfora a través de la retina y se coloca en el espacio subretiniano. Finalmente, la suspensión celular se inyecta cuidadosamente bajo control visual, mediante la evaluación del proceso de desprendimiento.

La figura 5
Figura 5. Integración de las células fotorreceptoras trasplantadas. Imagen representativa que representa Macs basados ​​en CD73 integrados ordenados células PN4 Nrl-GFP después del trasplante en la retina de ratones adultos. Precursores de fotorreceptores trasplantados integrar correctamente en la capa nuclear externa (ONL) y generan la morfología de los fotorreceptores maduros.

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Discussion

El trasplante de células precursoras Subretinal fotorreceptoras representa una herramienta confiable para lograr la integración de estas células sensibles a la luz en las retinas de acogida en número significativo 1,2. Esto podría permitir el establecimiento de una terapia celular para el tratamiento de enfermedades degenerativas de la retina en el futuro 6. La población de donantes de células, actualmente aisladas de PN 4 retinas, es una mezcla de diferentes tipos de células, de las que sólo las células precursoras de los fotorreceptores se integran después de la inyección subretiniana. Mediante el uso basado-CD73 MAC-clasificación, la proporción de fotorreceptores dentro de la suspensión de células de donantes se puede aumentar a ≈ 90% que permite a un aproximadamente 3 veces mayor tasa de integración en las retinas de acogida de tipo salvaje en comparación con la población de células sin clasificar 8. En comparación con la citometría de flujo, MACS tiene la ventaja de un procedimiento de clasificación rápido y que puede ser aplicado relativamente fácil a las normas GMP. La purificación de los fotorreceptores trasplantables es de sinterés ESPECÍFICOS a la luz de las últimas ventajas para la generación in vitro de los fotorreceptores a partir de células madre pluripotentes 12-14. Los cultivos de células madre pluripotentes diferenciados se componen de diversos tipos de células que hacen la disponibilidad de procedimientos específicos de clasificación un pre-requisito esencial para su futuro uso en terapias de trasplante celular.

De acuerdo con el procedimiento MACS-purificación, varios puntos son dignos de mención, lo que garantiza un flujo de trabajo sin grandes alteraciones. Cuanto mayor sea el número de retinas que realizar la clasificación, se necesita más tiempo para su digestión. Después de la digestión, durante el procedimiento de clasificación, la agregación de las células tiene que ser evitado. Esto ocurre preferiblemente antes de la adición del anticuerpo secundario y durante su incubación. En este caso, el agregado tiene que ser eliminado de inmediato con una pipeta. Durante la elución de tampón MACS mientras que la recogida de la fracción MACS-negativas, es absolutamente necesario para no añadir más de 3 ml a la columna.La presión de la memoria intermedia a la columna será demasiado alta si se añade más de 3 ml de tampón. Esto perturbar la unión del anticuerpo a las células y disminuye la eficiencia de clasificación. Al quitar la columna del soporte magnético para comenzar a recoger la fracción MACS-positivos, este paso tiene que ser hecho rápidamente. Deben añadirse los 5 ml de tampón MACS a la columna lo más rápido posible. Además, el paso debe ser puesto y pulsa rápidamente hasta que todo el tampón es a través de la columna. No es necesario preocuparse por la presión aplicada. El tampón MACS es isotónica y se puede variar. Es posible utilizar tampón FACS, medio de cultivo celular, PBS, EBSS, o HBSS. La esterilidad de la memoria intermedia se puede lograr mediante la filtración a través de un filtro de membrana de 0,4 micras.

Después del enriquecimiento por MACS, un trasplante con éxito de células del donante al espacio subretiniano se puede lograr manteniendo los siguientes puntos en mente. Dado que las células fotorreceptoras parecen ser muy sensibles a tratamiento ex vivo,no es aconsejable mantenerlos en 4 ° C más de lo necesario. Proceda para el trasplante lo más rápido posible. Cuando se inserta la aguja de inyección en el globo ocular, es importante para evitar tocar la lente como la aguja de metal relativamente fuerte puede dañar la lente resultante en la inducción de la uveítis inducida por el cristalino. El último paso en el camino hacia el espacio subretiniano, la penetración de la retina, es crucial. Dado que no puede observarse visualmente si se alcanza el espacio subretinal es importante para desarrollar una sensación para la presión de empuje a la derecha y la resistencia del tejido. Para probar, si la cabeza de la aguja está colocada correctamente, un pequeño volumen podría aplicarse y el desprendimiento de la retina en la cabeza de la aguja debe ser observado cuidadosamente. Si una, desprendimiento bulloso ronda sin sangrado se está formando, la posición es correcta y el resto de la solución se puede aplicar cuidadosamente. Durante la inyección, la aguja debe permanecer en su posición para evitar un mayor daño a los tejidos. La creación agujero retinianoATED por la aguja de inyección se sellará por sí mismo si la aguja se retrae lentamente. Todo el procedimiento debe hacerse en la cantidad mínima de tiempo posible para evitar un mayor estrés y daño al animal. Durante el trasplante, la suspensión celular tiende a agruparse y bloquear la jeringa de microlitro. Si esto sucede, se sugiere una dilución de la suspensión de células usando PBS estéril o HBSS. Otra posibilidad para superar este problema es añadir 1 l de ADNasa I de la suspensión de células, para disolver grumos de ADN de las células muertas, que tienden a pegar las células vivas juntos.

Este protocolo se limita a la clasificación magnética de células. Por lo tanto, las células podrían ser ordenados para sólo un marcador de clasificación por ronda. En comparación con la citometría de flujo, donde las células podrían ser ordenados usando diferentes marcadores (incluyendo propiedades fisiológicas, así como diferentes marcadores de superficie celular), al mismo tiempo, esto es una desventaja importante de esta técnica. Siempre que la clasificación para diferentes marcadores ense necesita una ventana de tiempo corto, la citometría de flujo puede ser la mejor solución. Además, la clasificación de las propiedades fluorescentes de las células, como GFP expresado transgénicamente u otros marcadores de células vida no es posible con esta técnica. Se limita actualmente al uso de anticuerpos de la superficie celular que se pueden conjugar con perlas magnéticas. Sin embargo, esta técnica podría ser ampliado según el equipo técnico utilizado.

Desde Miltenyi Biotec es actualmente el único proveedor de herramientas de clasificación de células magnéticas, no hay otra alternativa disponible a la fecha. Para la disociación celular, se podrían utilizar otras enzimas que la papaína (es decir, tripsina). Es de destacar que nuestro laboratorio logra los mejores resultados con papaína, ya que esta parece ser la enzima de disociación más suave en nuestras manos. La ventana de tiempo de digestión con papaína (30-60 min) es variable. En esta ventana de tiempo se logró la digestión óptima en nuestro laboratorio. Podría ser necesario más corto o más largo tiempo de incubación, dependiendo del tamaño de la muestra, la calidad de la muestra unND enzima utilizada. Se sugiere la prueba individual.

Teniendo en cuenta que un solo paso MACS no alcanza los niveles de pureza de hasta citometría de flujo, una posible aplicación ulterior de esta técnica podría ser la clasificación negativa de las células perjudiciales no deseados y posibles. Allí, la fracción de células positivas para un marcador de superficie de célula dado, pero no de interés puede ser resuelto, dejando la fracción de interés aislado en el flujo a través. Esto podría hacerse por adelantado o después de una etapa de selección positiva y permite la discriminación adicional de las células utilizando diferentes marcadores de superficie celular, así como la eliminación de células no deseadas, como las células de capa de alimentación de células no diferenciadas o de cultivos de células madre pluripotentes con su potencial riesgo tumorgenic . Por lo tanto, MACS podría ser adecuado para la purificación de los fotorreceptores procedentes de cultivos de células ES o iPS en posibles aplicaciones terapéuticas futuras, ya que representa un tratamiento suave, rápido y simple para la purificación de grandes cantidades de células cultivadas. MACSpodría aplicarse fácilmente a GMP-condiciones ya que los detalles de los pasos de clasificación, es decir, la mecánica de fluidos, y procedimientos se reducen en comparación con la citometría de flujo. Es de destacar, que MACS ya se utiliza de forma rutinaria en los ensayos clínicos para el enriquecimiento de las células de la sangre o la médula ósea. Curiosamente, MACS puede incluso aplicarse en las células cuando no hay marcador de superficie celular adecuada está presente, mediante la introducción de un marcador de superficie genéticamente para producir células "competente" para la posterior clasificación celular magnética pasos 15.

En resumen, MACS representa una herramienta fiable y rápida para enriquecer las células precursoras de los fotorreceptores mediante marcadores de superficie celular para los estudios de trasplante. Además, es un método fácilmente empleables para aplicaciones clínicas futuras que requieren condiciones GMP.

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Disclosures

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

Acknowledgements

Nos gusta dar las gracias a Anand Swaroop para proporcionar ratones Nrl-GFP, Jochen Haas para el apoyo técnico, y Sindy Böhme y Emely Lessmann para la cría de animales.

Este trabajo fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG): FZT 111 - Centro de Terapias Regenerativa Dresde, la Semilla CRTD Programa de Subvenciones, el SFB 655, y la fundación ProRetina eV, las excavaciones-BB Graduate Program Dresden, y el para Fundação un Ciência e Tecnologia (SFRH/BD/60787/2009)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Papain Dissociation System Worthington Biochemical Corporation LK003150 supplied DNase I is not used in the method
Purified rat anti-mouse CD73, clone TY/23 BD Pharmingen 550738 Stock concentration 0.5 mg/ml
Goat Anti-Rat IgG MicroBeads Miltenyi 130-048-501 Total volume of 2 ml
PBS Gibco 10010-015 Used to count the total number of cells
DNase I Sigma D5025-150KU
HBSS Gibco 14025050 Used for dissociation of the retinas
Trypan blue Sigma Fluka93595 Used to count the total number of cells
Vidisic Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG
Domitor Pfizer 76579
Ketamine 10% Ratiopharm 7538843
Antisedan Pfizer 76590
Phenylephrin 2.5%-Tropicamid 0.5% University Clinics Dresden Pharmacy
Preseparation Filters Miltenyi 130-041-407
LS Columns Miltenyi 130-042-401
MACS MultiStand Miltenyi 130-042-303
QuadroMACS Separator Miltenyi 130-090-976
Fire polish glass Pasteur pipette Brand 74777 20 The pipette’s tips need to be fire-polished and autoclaved.
MACS 15 ml tube rack Miltenyi 130-091-052
Cell count chamber Carl Roth T728.1
Sterile 15 ml tubes Greiner Bio-One 188271
Leica M651 MSD Leica M651 MSD can be used instead of Olympus SZX10
Olympus SZX10 Olympus SZX10 can be used instead of Leica M651 MSD
Olympus inverted stereo microscope CKX41 Olympus CKX41
Cell culture hood Thermo Scientific MSC-Advance Thermo Scientific 51025411
1.5 ml Reaction tube Sarstedt 727706400
2 ml Reaction tube Sarstedt 72695
Eppendorf Centrifuge 5702 VWR (Eppendorf) 521-0733
Mouse head holder myNeurolab 471030
BD Microlance 3 30 G 1/2 in BD Pharmingen 304000
Hamilton microliter syringe 5 µl, 75RN Hamilton 065-7634-01 delivered without needles
Hamilton RN special needle 34 G Hamilton 065-207434 Blunt, 12 mm length
Vannas-Tübingen Spring Scissors - 5 mm Blades Straight Fine Science Tools 15003-08
Dumont #7 Forceps - Titanium Biologie Fine Science Tools 11272-40
Diamond pen Tools-tech
15 mm x 15 mm Cover slips Sparks MIC3366

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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