Disminución de la concentración de itraconazol y Duración del éxito en el tratamiento de

Immunology and Infection

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Summary

Infección por Batrachochytrium dendrobatidis en los anfibios puede ser eliminado utilizando una concentración reducida (0,0025%) y menor duración (baños de cinco minutos durante seis días) de itraconazol que la que se utiliza generalmente. Se observaron menos mortalidad y menos efectos secundarios negativos utilizando este protocolo de tratamiento modificado.

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Brannelly, L. A. Reduced Itraconazole Concentration and Durations Are Successful in Treating Batrachochytrium dendrobatidis Infection in Amphibians. J. Vis. Exp. (85), e51166, doi:10.3791/51166 (2014).

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Abstract

Los anfibios están experimentando el mayor descenso de toda clase de vertebrados y la principal causa de este descenso es un hongo patógeno Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), que causa la enfermedad quitridiomicosis. Colonias de aseguramiento en cautiverio son importantes en todo el mundo para las especies de anfibios amenazadas y pueden ser la única tabla de salvación para los de amenaza crítica de extinción. El mantenimiento de colonias gratuitas de enfermedades es una prioridad de los directivos en cautividad, no se han identificado aún los tratamientos seguros y eficaces para todas las especies y entre las etapas de vida. El tratamiento quimioterapéutico más utilizado es el itraconazol, aunque la dosis utilizada puede ser perjudicial para algunos individuos y especies. Se realizó un ensayo de tratamiento clínico para evaluar si una dosis más baja y más seguro, pero eficaz de itraconazol se pudo encontrar para curar infecciones de BD. Hemos encontrado que mediante la reducción de la concentración de tratamiento desde 0,01 hasta 0,0025% y la reducción de la duración del tratamiento de 11-6 Días de 5 mínimo baños, ranas podrían curarse de la infección Bd con menos efectos secundarios y menos mortalidad asociada al tratamiento.

Introduction

Los anfibios están actualmente experimentando el mayor declive de la biodiversidad de todos los taxones de vertebrados 1. La quitridiomicosis, una enfermedad de la piel causada por los patógenos fúngicos Batrachochytrium dendrobatidis (Bd chytrid), es una de las principales causas de estos descensos dramáticos 2 Bd es el peor patógeno en el expediente para causar la pérdida de biodiversidad:. Infecta a más de 600 especies de anfibios y tiene causado la disminución de más de 300 especies, de las cuales por lo menos 200 especies se han convertido en grave peligro de extinción o extintas 2,3. El hongo quítrido no es sede específica y no está claro cuáles son las cualidades de la máquina permite la infección Bd progresar causando una enfermedad grave. La quitridiomicosis causa la muerte mediante la interrupción de los canales iónicos en la piel, dando como resultado la pérdida de electrolitos e insuficiencia cardíaca 4. También, Bd. sobrenadante (que no contiene zoosporas Bd) provoca una respuesta inmune en renacuajos 5 leading investigadores creen Bd produce un subproducto tóxico 6.

Debido a que muchas especies están disminuyendo rápidamente, las colonias de aseguramiento de la cautividad y los programas de cría son importantes medidas de conservación, y pueden ser la única tabla de salvación para algunas especies. El establecimiento y mantenimiento de la enfermedad colonias libres es un reto para las instalaciones de gestión de anfibios. Los métodos quimioterapéuticos actuales para el tratamiento de infecciones Bd, aunque es eficaz, pueden ser perjudiciales para los animales que son tratados, y ningún método de tratamiento único ha sido un éxito en todas estas especies y clases de edad de anfibios 7.

Se han realizado pocos ensayos clínicos de tratamientos para la infección Bd. 7. Los tres métodos más utilizados del tratamiento son la terapia de calor, el cloranfenicol y el itraconazol. La terapia de calor es una opción de tratamiento nonchemotherapeutic que parece tener pocos efectos secundarios, pueden ser utilizados en múltiples etapas de la vida, y es generalmentealiado eficaz. En un ensayo de tratamiento, Chatfield y Richards-Zawacki 8 encontraron que el 96% de los animales tratados se había despejado las infecciones después de ser alojados a 30 ° C durante 10 días. Aunque este ensayo no fue del 100% de éxito, proporciona una línea de base para que otros puedan evaluar la terapia de calor para su propia especie. La terapia de calor, aunque es eficaz para muchas especies, es poco práctico para muchas especies alpinas que no puede permanecer a altas temperaturas durante un período prolongado de tiempo. Cloranfenicol, un antibacteriano, se ha utilizado con éxito para tratar Bd en muchas especies, e inhibe el crecimiento de hongos in vitro. Como un antibacteriano, el cloranfenicol no ataca el hongo específicamente, pero se ha sabido para causar la apoptosis en células eucariotas 9. Se ha especulado que la terapia de cloranfenicol provoca la apoptosis en la piel, causando la muerte de esporangios intracelular, aunque el mecanismo de acción exacto es desconocido. Aunque ningún estudio clínico ha sido realizado, y por lo tantola dosis y el tiempo de tratamiento no han sido evaluados, los protocolos de tratamiento actuales suelen requerir la inmersión de dos a cuatro semanas 10,11, por lo que este tratamiento poco práctico para los anfibios terrestres. El cloranfenicol también ha sido restringido en algunos países para uso veterinario, ya que la exposición humana se ha asociado con una forma rara de anemia aplásica 12.

El itraconazol, un antifúngico azol, es el más utilizado para el tratamiento de la infección Bd en anfibios en cautiverio. El protocolo más utilizado es el animal de baño en una solución de itraconazol 0,01% durante cinco minutos al día durante 11 días consecutivos. Este protocolo se deriva de las normas utilizadas para la administración de los mamíferos, y, si bien es efectivo para los anfibios, que no se basa en los ensayos clínicos en los anfibios 11,13. Este protocolo puede causar efectos secundarios negativos en ciertas especies, especialmente en el género Rana y en renacuajos y metamorfos últimos 11.Renacuajo tratamiento ha sido exitoso el uso de una concentración mucho más baja (0,0005%) de itraconazol, pero se asoció con despigmentación 14. Esta misma concentración se probó en metamorfos recientes y se encontró que no tener éxito en el tratamiento de la infección 15. Debido a que existe el riesgo de efectos secundarios negativos con el tratamiento itraconazol, algunos médicos han utilizado la mitad de la concentración habitual (0,005%) durante 11 días consecutivos, y se encontró que esto tenga éxito en la curación de las infecciones Bd 16.

El presente estudio es un resumen de un ensayo de tratamiento clínico utilizando itraconazol para tratar la infección Bd. 15. El protocolo describe un intento de encontrar la dosis y tiempo de tratamiento más bajo que es seguro y efectivo para el tratamiento de animales infectados con Bd itraconazol. Los animales utilizados en este estudio fueron los últimos metamorfos de sapos costa del golfo, Incilius nebulifer.

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Protocol

Aprobación ética: Este estudio y sus métodos fueron aprobadas por Animal uso y cuidado Comité de la Universidad de Tulane (Protocolo n º 0.407.).

1. Las pruebas para detectar la infección por Bd

  1. Hisopado para Bd
    1. Animales hisopos con un hisopo de algodón estéril en cinco ocasiones en la zona ventral, cinco veces en cada muslo, cada lado, y cada extremidad por un total de 45 golpes. Swabbing es un método no invasivo de muestreo para Bd en la piel de los anfibios.
    2. Gire suavemente el hisopo durante y entre golpes para asegurar la mayor cantidad de ADN se recoge en el bastoncillo.
    3. Hisopos tienda en 1,5 ml microtubos a -20 ° C.
  2. Extracción de ADN y el ensayo qPCR
    1. Extraer el ADN genómico a partir de los hisopos utilizando un kit de aislamiento de ADN disponibles comercialmente, de acuerdo con las instrucciones para el tejido animal.
    2. Analizar el ADN extraído utilizando cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR) después Boyle 17, con las siguientes modificaciones.:
    3. Diluir las muestras de extracción de ADN a 1:10 con agua doblemente desionizada.
    4. Añadir 0,7 l de albúmina de suero bovino (BSA) para evitar la inhibición de la PCR.
    5. Incluir un control positivo interno en cada muestra para asegurar inhibición de la PCR no estaba afectando los resultados.
    6. Corra las muestras con un control positivo y negativo y una serie de normas de dilución para estimar zoosporas (infección) de carga.

2. Inoculación

  1. Cultura Bd
    1. Preparar caldo de triptona mediante la adición de 10 g de triptona al 1 L de ósmosis inversa o agua desionizada, en autoclave (121 ° C durante 40 min) y se dejó enfriar. Una vez enfriado a 23 ° C, añadir 1 ml de penicilina-estreptomicina.
    2. Crece la tensión Bd (JEL411 de J. Longcore, aislado de Guabal, Panamá de un Phyllomedusa lemur) en un caldo triptona durante siete días a 23 ° C.
  2. Transfiera la broth cultura de triptona y placas de agar.
    1. Para hacer las placas, añadir 10 g de triptona y 10 g de agar a 1 L de ósmosis inversa o agua desionizada y se autoclave (121 ° C durante 40 min).
    2. Una vez que la mezcla en autoclave se enfríe lo suficiente para tocar, pero antes de que se congela, verter en placas de Petri, 1/4-1/3 completo, en una campana de flujo laminar.
    3. Cuando el agar se ha solidificado y enfriado completamente, añadir 0,5 ml de caldo Bd a cada placa y se extendió uniformemente alrededor de la placa. Deje que se seque.
    4. Una vez que las placas se inoculan con zoosporas Bd, placas de sellado con Parafilm.
    5. Permitir placas se incuban a 23 ° C durante cinco a siete días. Compruebe zoosporas movimiento para asegurar la viabilidad antes de la inoculación.
  3. Placas de inundación para la solución de la inoculación de zoosporas
    1. Después de los cinco a siete días de incubación y crecimiento Bd, inundar cada placa con 5 ml de agua del grifo de edad y permitir que las zoosporas entren los medios de comunicación durante 10 minutos.
    2. Vierta la suspe zoosporasnsion en un recipiente portátil.
    3. Calcule la concentración de zoosporas con un hemocitómetro.
    4. Diluir la mezcla a una concentración de 1 x 10 6 por 3 ml con agua del grifo edad.
  4. Se inoculan los animales
    1. En individuales 50 ml contenedores, inocular cada animal mediante el vertido de 3 ml de mezcla de inóculo sobre la zona ventral. Permita inóculo adicional gotee en la base del recipiente de la inoculación.
    2. Cada animal se mantendrá en el recipiente de la inoculación durante 24 horas para asegurar la infección.
    3. Después de 24 horas de la inoculación, los animales volver a terrarios desinfectados individuales.
    4. Permitir la infección para construir durante dos semanas. Confirme la infección con hisopo y qPCR resultados, y comenzar el tratamiento.
    5. Para los controles Bd-negativas, inundaciones Bd-libre de las placas de agar con 5 ml de edades comprendidas agua del grifo, y la inoculación simulada a los animales con los mismos métodos que el anterior.

3. Régimen de tratamiento

  1. Prepare baño de tratamiento
    1. Añadir 2,50 ml itraconazol acuosa (1% solución oral de Sporanox) a 1 Solución de L Anfibios Ringer (0.0025% itraconazol - la concentración de tratamiento eficaz más baja).
      1. Anfibio de solución de Ringer receta: 1 L de ósmosis inversa o agua desionizada, 6,6 g de cloruro de sodio, 0,15 g de cloruro de potasio, 0,15 g de cloruro de calcio, y 0,2 g de bicarbonato de sodio. Solución autoclave (121 ° C durante 40 min) y dejar enfriar a temperatura ambiente.
      2. Por concentración de tratamiento itraconazol 0,01%, añadir itraconazol acuosa 10,00 ml (1% Sporanox Solución oral) a la Solución 1 L Anfibios de Ringer
      3. Por concentración de tratamiento itraconazol 0,005%, añadir 5,00 ml itraconazol acuosa (1% Sporanox Solución oral) a la Solución 1 L Anfibios de Ringer.
    2. Para los controles Bd-positivos y negativos-Bd, bañar animales en solución de Ringer Anfibios sin itraconazol.
  2. Tratamiento <ol>
  3. Coloque anfibios individuales en desinfectados 50 ml de contenedores con 35 ml de la solución de tratamiento.
  4. Asegurarse de animales están totalmente cubiertos por cinco minutos por mover el recipiente.
  5. Animales Retorno a terrarios desinfectados. Repita durante seis días.
  • Asegurar el éxito del tratamiento
    1. Animales de ensayo para la infección Bd en el tratamiento de día comience.
    2. Animales de ensayo para la infección Bd una semana después de acabados de tratamiento, y una vez a la semana durante cuatro semanas para asegurar que la infección haya desaparecido.
  • 4. Bd como Biohazard

    1. Desinfectar semanal terrarios individual.
      1. Bañe los contenedores terrarios y tratamiento en un 10% de lejía baño solución.
      2. Enjuague cada contenedor blanqueado dos veces con agua corriente.
      3. Permitir a los contenedores que se seque durante 24 horas antes de la reutilización.
    2. Use guantes de nitrilo limpios al manipular animales para evitar la contaminación cruzadade Bd patógeno. Cambie los guantes entre el manejo de cada animal.
    3. Desinfecte todos los residuos líquidos antes de su eliminación por lo que la solución al 10% de lejía.
    4. Autoclave todos los residuos sólidos que se puedan estar expuestos a BD antes de su eliminación.

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    Representative Results

    Tratamiento itraconazol fue considerada exitosa si todos los animales estaban Bd-negativo cuatro semanas después de finalizado el tratamiento. Antes del tratamiento se inició, dos semanas después de la inoculación, los animales inoculados con Bd fueron infectadas, con una carga de zoosporas media de 1,121.7 (± 17,34), mientras que cuatro semanas después de finalizado el tratamiento, los animales de control Bd-positivos tenían una media de carga de zoosporas de 16,765.12 ( ± 14643.08).

    Tratamiento de Incilius nebulifer (n = 15) tuvo éxito usando los baños de la concentración de itraconazol 0.0025% durante cinco minutos al día durante seis días. Esta dosis baja concentración de itraconazol tratamiento no difirió significativamente de la mortalidad en comparación con los controles Bd-positivos (regresión de Cox: χ 2,1 = 2,17, exp (b) = 20.500, p = 0,339) (Figura 1B), muchos de los quien sobrevivió hasta el final de la prueba con la infección Bd.

    Baños de 0,0025% itraconazole durante 11 días, y ambos 0,005% y 0,0025% itraconazol durante seis días fueron encontrados para ser opciones de tratamiento seguras y eficaces (Figuras 1A y 1B). La concentración de tratamiento recomendado y media que la concentración para una duración del tratamiento de 11 días aumentado significativamente la mortalidad en comparación con los controles Bd-positivos (regresión de Cox: 0,01% itraconazol χ 2,1 = 35,68, EXP (B) = 307,54, p <0,01; 0,005% itraconazol χ 2,1 = 16,17, EXP (B) = 9.40 , p <0,01) (Figura 1A). El tratamiento itraconazol 0,01% durante 11 días causó una mortalidad del 100% en I. nebulifer, y que la concentración media (0,005% itraconazol durante 11 días) causó mortalidad 60% (Figura 1A). Se llevaron a cabo la necropsia y la histopatología para un pequeño subgrupo de animales que murieron durante el tratamiento. Ningún animal en este estudio murió de la quitridiomicosis.


    Figura 1. Las diferencias en la supervivencia a través de tratamientos itraconazol 15 (A) Incilius nebulifer: 11. Tratamiento D (n = 15 para cada concentración de itraconazol de 0,01, 0,005, y 0,0025%, n = 17 para el grupo de control Bd-positivo y n = 9 para el grupo de control Bd-negativo). (B) I. nebulifer: 6 tratamiento D (n = 15 para cada concentración de itraconazol de 0,01, 0,005 y 0,0025%, n = 17 para el grupo de control Bd-positivo y n = 9 para el grupo de control Bd-negativo). Las flechas negras indican el último día de tratamiento. Las líneas continuas indican la supervivencia de los grupos de control (negro = Bd-positivo, gris = Bd-negativo). Las líneas discontinuas indican la supervivencia de los grupos de tratamiento con itraconazol (puntos de color gris claro = 0,01%, Puntos grises medianas = 0,005%, puntos negros = 0,0025% itraconazol). (Esta cifra se ha modificado desde Brannelly et al. 15, Figura 1B y 1C). Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

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    Discussion

    El uso de este protocolo hemos sido capaces de reducir la dosis de tratamiento y el tiempo de tratamiento itraconazol para Bd en anfibios con seguridad y eficacia. La dosis de tratamiento más bajo y el tiempo (0.0025% por seis días) fue de un tratamiento exitoso para I. infección subclínica nebulifer. La eficacia de administrar una dosis más baja y el tiempo de tratamiento demuestran la necesidad de ensayos clínicos de tratamiento para tratamientos de la infección de Bd, como actualmente no hay tratamientos seguros y eficaces para ser utilizados para todas las especies y clases de edad de los anfibios.

    La causa de la muerte como resultado de un tratamiento itraconazol es desconocida en este momento 11. La necropsia y la histopatología se llevaron a cabo en un pequeño subgrupo de personas que murieron durante o poco después del período de tratamiento en el estudio Brannelly et al. 15. Los resultados de estos análisis no fueron concluyentes en cuanto a la causa de la muerte, aunque está claro que ningún animal murióde la quitridiomicosis. Autolisis moderada ocurrió entre la muerte y la preservación de muestras, lo que puede haber afectado a nuestra capacidad para detectar diferencias sutiles entre los grupos de tratamiento.

    Aunque este protocolo es compatible con la existencia de un régimen de tratamiento seguro y efectivo, más ensayos como éste deben estar en marcha. Un segundo tratamiento de azol, voriconazol, se ha demostrado ser eficaz en al menos una especie 18. El voriconazol es más estable en una solución de agua que el itraconazol y ha demostrado ser seguro para el uso renacuajo 18. Aunque una dosis única y de itraconazol y voriconazol son similares en los precios, el voriconazol es mucho más caro para la compra de itraconazol, llevando a los investigadores y gestores en cautividad para elegir itraconazol con más regularidad. En este momento, sólo un estudio publicado ha demostrado la eficaz de voriconazol 18. Para demostrar la eficacia, más especies necesitan ser ensayado.

    <antifúngicos p class = "jove_content"> azoles representan un tipo de quimioterapia antifúngico que inhibe el crecimiento de hongos 13. Hay otros métodos de tratamiento que tienen como objetivo matar al hongo patógeno en lugar de simplemente reducir el crecimiento. Bd es asesinado in vitro a temperaturas superiores a 28 ° C y la terapia de calor tiene como objetivo matar a Bd en la epidermis. Clorhidrato de terbinafina, un antifúngico alternativo que ha tenido éxito en el tratamiento de la infección por Bd de alguna especies 19, actúa haciendo que la lisis de las células fúngicas. Antifúngicos que atacan directamente al patógeno podrían ser tratamientos más exitosos y más trabajo que hay que hacer para poner a prueba las opciones de tratamiento para la infección por Bd prometedores.

    Itraconazol tratamiento ha demostrado ser eficaz en animales con infección subclínica, pero el tratamiento de la quitridiomicosis clínica ha sido en gran parte infructuosos. Sólo un estudio al día 20 ha tratado con éxito terminal i anfibios ll, y el tratamiento utilizando una combinación agresiva de la terapia de electrolitos y la quimioterapia. Se necesitan opciones de tratamiento eficaces para los animales con enfermedades terminales, sobre todo para los animales en peligro crítico en colonias cautivas en las que es esencial para la conservación de las especies de protección de todas las personas.

    Aunque la reducción de la dosis y tiempo de tratamiento fue un éxito para I. nebulifer, el tratamiento no ha sido ensayado en otras especies o animales con infecciones clínicas. Algunas especies y etapas de la vida son intolerantes tratamiento itraconazol, así que antes de la aplicación de un régimen de tratamiento a gran escala, los gerentes de cautivas deberían tratamiento del ensayo en un pequeño subconjunto de los individuos para determinar la seguridad y eficacia. Prueba de los animales tratados durante al menos cuatro semanas después de la finalización del tratamiento es necesario para garantizar la erradicación de la infección por el bajo nivel 7, y debe aplicarse después de cada régimen de tratamiento.

    tienda "> Establecer opciones de tratamiento seguras y eficaces para las infecciones de Bd en prioridad cautivo área colonias de aseguramiento para los esfuerzos de conservación de anfibios. Mantener Bd colonias libres es esencial para el éxito de los esfuerzos de conservación y colonias en cautividad puede ser la única tabla de salvación para las especies en peligro de extinción .

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    Disclosures

    El autor declara no los intereses financieros de la competencia.

    Acknowledgments

    Me gustaría dar las gracias a CL Richards-Zawacki ayuda conceptualizar el diseño experimental y la asistencia con materiales, A. Pessier ayuda el establecimiento de un régimen de tratamiento y análisis de la necropsia, MWH Chatfield, MJ Robak, K. Tasker y D. Lenger ayuda en el laboratorio y apoyo y M. McFadden y P. Harlow en el Zoológico de Taronga para el uso de su espacio durante el rodaje. El proyecto fue financiado en parte por el Departamento de Vida Silvestre y Pesca de Louisiana a través de la subvención de la Comisión de Educación Ambiental de Luisiana otorgado a LA Brannelly y por Life Technologies.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    0.1% Aqueous Itraconazole, Sporonox Janssen Pharmaceutica Inc.
    NaCl Fisher Scientific S640-500
    KCl Fisher Scientific BP366-1
    CaCl2 Fisher Scientific BP510-100
    NaHCO3 Fisher Scientific BP328-500
    Sterile cotton swabs Medical and Wire Equipment MW113
    1.5 ml Microtubes Sarstedt 73.703.217
    Qiagen DNEasy Blood and Tissue Kit Qiagen 69581
    7500 Real-time PCR Applied Biosystems 4351104
    VIC IPC Applied Biosystems 4308323
    BSA Applied Biosystems AM2618
    Agar Invitrogen 30391023
    Tryptone Invitrogen Q10029
    Penicillin-streptomycin Invitrogen 15070-063
    Petri Dish Sigma Aldrich CLS430589

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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