Reduzierte Itraconazol Konzentration und Dauer sind erfolgreich in der Behandlung von

Immunology and Infection

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Summary

Batrachochytrium dendrobatidis Infektion bei Amphibien können mit einer reduzierten Konzentration (0,0025%) und kürzere Laufzeit (5 Minuten Bäder für sechs Tage) von Itraconazol als allgemein verwendet, beseitigt werden. Weniger Sterblichkeit und weniger negative Nebenwirkungen wurden unter Verwendung dieser modifizierten Behandlungsprotokoll beobachtet.

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Brannelly, L. A. Reduced Itraconazole Concentration and Durations Are Successful in Treating Batrachochytrium dendrobatidis Infection in Amphibians. J. Vis. Exp. (85), e51166, doi:10.3791/51166 (2014).

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Abstract

Amphibien sind die mit den größten Rückgang aller Wirbeltierklasse und eine führende Ursache für diesen Rückgang ist eine Pilzerreger, Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), die die Krankheit verursacht chytridiomycosis. Captive Sicherung Kolonien sind wichtig, weltweit für bedrohte Amphibienarten und möglicherweise die einzige Lebensader für die in kritischen vom Aussterben bedroht sein. Die Aufrechterhaltung Krankheit frei Kolonien ist eine Priorität der Gefangenschaft Manager, noch sichere und wirksame Behandlungen für alle Arten und über Lebensphasen nicht identifiziert worden. Die am häufigsten verwendeten chemotherapeutischen Behandlung ist Itraconazol, obwohl die Dosierung üblicherweise verwendeten schädlich für einige Individuen und Arten sein. Wir führten eine Behandlung klinische Studie zu beurteilen, ob eine untere und sicherer, aber effektive Dosis von Itraconazol gefunden werden konnte Bd-Infektionen zu heilen. Wir fanden, dass durch die Reduzierung der Behandlungskonzentration von 0,01 bis 0,0025%, und die Verringerung der Behandlungsdauer von 11-6 Tage von 5 min Bäder, könnten Frösche von Bd-Infektion mit weniger Nebenwirkungen und weniger therapieassoziierte Mortalität geheilt werden.

Introduction

Amphibien erleben derzeit den größten Rückgang der biologischen Vielfalt aller Wirbeltier-Taxa ein. Chytridiomykose, eine Hautkrankheit, die durch den chytrid Pilzpathogen Batrachochytrium dendrobatidis (Bd) verursacht wird, ist eine der Hauptursachen für diesen dramatischen Rückgang Bd 2 ist der schlimmste Erreger auf Rekord für verursachen Verlust der biologischen Vielfalt:. Infiziert es über 600 Arten von Amphibien und hat verursachten Rückgänge in über 300 Arten, von denen mehr als 200 Arten sind vom Aussterben bedrohte oder ausgestorbene 2,3. Die Amphibien-Chytridpilz nicht wirtsspezifisch und es ist unklar, welche Eigenschaften des Host ermöglichen Bd-Infektion, um die Fortschritte zu schweren Krankheit. Chytridiomykose Tod verursacht durch Störung Ionenkanäle in der Haut, was zu Elektrolytverlust und Herzversagen 4. Auch Bd Überstand (enthaltend keine Bd Zoosporen) eine Immunantwort bei Kaulquappen 5-Zuführungsg Forscher glauben, Bd erzeugt eine giftige Nebenprodukt 6.

Da viele Arten sind stark rückläufig, in Gefangenschaft Sicherung Kolonien und Zuchtprogramme sind wichtige Schutzmaßnahmen, und die einzige Lebensader für einige Arten sein. Aufbau und Pflege frei von Krankheiten Kolonien ist eine Herausforderung für Amphibien-Management-Einrichtungen. Die aktuellen chemotherapeutischen Methoden zur Behandlung von Bd-Infektionen, obwohl effektiv ist, kann für die Tiere, die behandelt werden, und keine einzige Behandlungsmethode erfolgreich über Arten und Altersklassen von Amphibien 7 gewesen.

Nur wenige klinische Studien von Behandlungen für Bd-Infektion durchgeführt worden sind 7. Die drei am häufigsten verwendeten Methoden der Behandlung sind Wärmetherapie, Chloramphenicol und Itraconazol. Wärmetherapie ist eine Behandlungsoption, die nonchemotherapeutic haben wenige Nebenwirkungen können auf mehrere Lebensphasen verwendet werden wird, und ist GenerVerbündeter wirksam. In einer Therapiestudie, Chatfield und Richards-Zawacki 8 festgestellt, dass 96% der behandelten Tiere waren Infektionen, nachdem sie bei 30 ° C für 10 Tage untergebracht gelöscht. Obwohl dieser Versuch war nicht 100% erfolgreich, bietet es eine Grundlinie für andere Wärmetherapie für die eigene Spezies zu beurteilen. Wärmetherapie, obwohl effektiv für viele Arten ist unpraktisch für viele alpine Arten, die nicht bei hohen Temperaturen für eine längere Zeit verbleiben kann. Chloramphenicol, ein antibakterielles, wurde erfolgreich verwendet, um Bd in vielen Arten zu behandeln, und hemmt das Pilzwachstum in vitro. Als antibakterielles, die Chloramphenicol nicht den Pilz befallen besonders aber ist bekannt, dass die Apoptose in eukaryotischen Zellen 9 zu bewirken. Es wurde spekuliert, daß Chloramphenicol-Therapie verursacht Apoptose in der Haut, die intrazelluläre Abtöten Sporangien, obwohl der genaue Wirkmechanismus ist unbekannt. Obwohl keine klinischen Studien durchgeführt worden, und deshalbDosis und Behandlungszeit wurden nicht bewertet, aktuelle Behandlungsprotokolle erfordern in der Regel Untertauchen für zwei bis vier Wochen 10,11, so dass diese Behandlung unpraktisch für terrestrischen Amphibien. Chloramphenicol wurde auch in einigen Ländern für den tierärztlichen Gebrauch beschränkt worden, weil die Exposition des Menschen mit einer seltenen Form von aplastischer Anämie 12 in Verbindung gebracht.

Itraconazol, ein Azol-Antimykotika, ist das am häufigsten für die Behandlung der Bd-Infektion bei Amphibien in Gefangenschaft eingesetzt. Das am häufigsten verwendete Protokoll ist Bade Tieren in einer 0,01% igen Lösung von Itraconazol fünf Minuten pro Tag für 11 aufeinanderfolgende Tage. Dieses Protokoll wurde von Standards für Säugetier Verabreichung verwendet abgeleitet, und während effektiv für Amphibien, ist es nicht auf klinische Studien in Amphibien 11,13 berechnet. Dieses Protokoll kann negative Nebenwirkungen bei bestimmten Arten verursachen, besonders in der Gattung Rana und Kaulquappen und in den letzten 11 Metamorphe.Tadpole Behandlung erfolgreich war mit einer viel niedrigeren Konzentration (0,0005%) von Itraconazol, wurde aber mit Depigmentierung 14 zugeordnet. Die gleiche Konzentration wurde auf den letzten Metamorphe erprobt und festgestellt, die auf die Behandlung erfolglos Infektion 15 zu sein. Denn es besteht die Gefahr von negativen Nebenwirkungen der Behandlung mit Itraconazol, haben einige Praktiker die Hälfte der üblichen Konzentration (0,005%) für 11 aufeinanderfolgende Tage verwendet und fanden, dass bei der Heilung von Infektionen Bd 16 erfolgreich.

Die vorliegende Studie ist eine Zusammenfassung einer klinischen Studie mit Itraconazol-Behandlung zu Bd-Infektion 15 zu behandeln. Das Protokoll beschreibt einen Versuch, die niedrigste Dosis und Behandlungszeit, die sowohl sicher und wirksam für die Behandlung von infizierten Tieren mit Bd Itraconazol finden. Tiere in dieser Studie verwendet wurden, waren letzten Metamorphe der Golfküste Kröten, Incilius nebulifer.

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Protocol

Ethik-Zulassung: Diese Studie und ihre Methoden wurden von Tier Benutzung und Pflege Ausschuss Tulane University (. Protokoll nicht 0407) zugelassen.

1. Testen für Bd-Infektion

  1. Abtupfen für Bd
    1. Tupfer Tiere mit einem sterilen Wattestäbchen fünfmal am ventrum fünfmal auf jedem Schenkel, jeder Seite, und jedes Glied für insgesamt 45 Hüben. Swabbing ist eine nichtinvasive Methode der Probenahme für Bd auf Amphibienhaut.
    2. Den Tupfer während und zwischen den Hüben drehen vorsichtig, um die größte Menge an DNA wird auf dem Tupfer gesammelt.
    3. Shop Tupfer in 1,5-ml-Röhrchen bei -20 ° C
  2. DNA-Extraktion und qPCR-Assays
    1. Auszug genomische DNA aus den Tupfer mit einem handelsüblichen DNA-Isolation-Kit, in Übereinstimmung mit den Anweisungen für die Tiergewebe.
    2. Analysieren Sie den extrahierten DNA mittels quantitativer Echtzeit-PCR (qPCR) nach Boyle 17, mit den folgenden Modifikationen.:
    3. Verdünnen Sie die DNA-Extraktion Proben 1:10 mit Doppel VE-Wasser.
    4. Hinzufügen von 0,7 &mgr; l Rinderserumalbumin (BSA), um PCR-Hemmung zu verhindern.
    5. Fügen Sie eine interne positive Kontrolle in jeder Probe, um sicherzustellen, PCR-Hemmung wurde nicht Ergebnisse zu beeinflussen.
    6. Führen Proben mit einem positiven und negativen Steuer und eine Reihe von Standards, um Verdünnungszoosporen (Infektion) Last zu schätzen.

2. Impfung

  1. Kultur Bd
    1. Vorbereitung Trypton-Brühe durch Zugabe von 10 g auf 1 l Trypton Umkehrosmose oder entionisiertes Wasser, autoklaviert (121 ° C für 40 min) und abgekühlt. Einmal auf 23 ° C abgekühlt, 1 ml Penicillin-Streptomycin.
    2. Wachsen Bd Stamm (JEL411 von J. Longcore, isoliert von Guabal, Panama von einem Phyllomedusa Lemur) in einer Trypton-Brühe für sieben Tage bei 23 ° C
  2. Übertragen Sie die broth Kultur Trypton und Agar-Platten.
    1. Um Platten machen, fügen Sie 10 g Trypton und 10 g Agar auf 1 L Umkehrosmose oder VE-Wasser und Autoklaven (121 ° C für 40 min).
    2. Sobald die autoklaviert Mischung ist cool genug, um zu berühren, aber bevor es gerinnt, in Petrischalen gießen, 1/4-1/3 voll, in einer Steril.
    3. Wenn Agar erstarrt und abgekühlt ist komplett, 0,5 ml Brühe Bd zu ​​jeder Platte und gleichmäßig verteilt auf der ganzen Platte. Trocknen lassen.
    4. Sobald die Platten mit Bd Zoosporen, Dichtungsplatten mit Parafilm eingeimpft.
    5. Ermöglichen Platten bei 23 ° C für fünf bis sieben Tage inkubiert. Überprüfen Zoosporen Bewegung, um die Lebensfähigkeit vor der Impfung zu gewährleisten.
  3. Flood Platten für Zoosporen Impflösung
    1. Nach fünf bis sieben Tagen der Inkubation Bd und Wachstum, Flut jede Platte mit 5 ml im Alter von Leitungswasser und lassen Zoosporen, die Medien für 10 Minuten geben.
    2. Gießen Sie die Zoosporen UntBrnsion in einen tragbaren Behälter.
    3. Schätzen Sie Zoosporen Konzentration mit einer Zählkammer.
    4. Verdünnte Gemisch in einer Konzentration von 1 x 10 &sup6; pro 3 ml mit Leitungswasser gealtert.
  4. Impfen Tiere
    1. In einzelnen 50-ml-Behälter, impfen jedes Tier durch Gießen 3 ml Inokulum Mischung über seine ventrum. Bemessen Inokulum in die Basis der Impfung Behälter tropfen.
    2. Jedes Tier wird in der Inokulation Behälter für 24 Stunden bleiben, um eine Infektion zu gewährleisten.
    3. Nach 24 Stunden der Impfung zurück, um einzelne Tiere desinfiziert Terrarien.
    4. Lassen Infektion für zwei Wochen bauen. Infektion Bestätigen Sie mit Tupfer und qPCR-Ergebnisse und die Behandlung beginnen.
    5. Für BD-Negativkontrollen, Hochwasser Bd freien Agar-Platten mit 5 ml im Alter von Leitungswasser und spotten impfen die Tiere mit den gleichen Methoden wie oben.

3. Behandlungsschema

  1. Prepare Behandlungsbades
    1. In 2,50 ml wässrige Itraconazol (1% Sporanox Oral Solution) auf 1 L Amphibien Ringer-Lösung (0,0025% Itraconazol - die niedrigste wirksame Behandlung Konzentration).
      1. Amphibien-Ringer-Lösung Rezeptur: 1 L Umkehrosmose oder entionisiertes Wasser, 6,6 g Natriumchlorid, 0,15 g Kaliumchlorid, 0,15 g Calciumchlorid und 0,2 g Natriumhydrogencarbonat. Autoklaven-Lösung (121 ° C für 40 min) und auf Raumtemperatur abkühlen.
      2. Für 0,01% Itraconazol Behandlungskonzentration, fügen 10,00 ml wässrige Itraconazol (1% Sporanox Oral Solution) auf 1 L Amphibien Ringer-Lösung
      3. Für 0,005% Itraconazol Behandlungskonzentration, fügen 5.00 ml wässrige Itraconazol (1% Sporanox Oral Solution) auf 1 L Amphibien Ringer-Lösung.
    2. Für Bd-positiven und-negativen Kontrollen Bd, baden Tiere Amphibien in Ringer-Lösung ohne Itraconazol.
  2. Behandlung <ol>
  3. Zeigen einzelnen Amphibien in 50 ml desinfiziert Behälter mit 35 ml der Behandlungslösung.
  4. Stellen Sie sicher, Tiere sind komplett für fünf Minuten abgedeckt durch leichtes Schütteln des Behälters.
  5. Zurück Tiere desinfiziert Terrarien. Wiederholen Sie für sechs Tage.
  • Stellen Sie sicher, Behandlungserfolg
    1. Testtiere für Bd-Infektion am Tag der Behandlung beginnt.
    2. Testtiere für Bd-Infektion eine Woche nach der Behandlung abgeschlossen ist, und einmal in der Woche für vier Wochen, um sicherzustellen, Infektion verschwunden ist.
  • 4. Bd als Biohazard

    1. Desinfizieren einzelnen Terrarien wöchentlich.
      1. Baden Sie die Terrarien und Behandlung Behältern in einem 10% Bleichmittel-Lösung Badewanne.
      2. Jedes gebleicht Behälter zweimal Spülung mit fließendem Wasser.
      3. Erlauben Behälter für 24 Stunden trocknen, bevor Wiederverwendung.
    2. Tragen Sie saubere Nitril Handschuhe beim Umgang mit Tieren um eine Kreuzkontamination zu verhindernBd Erregers. Handschuhe zwischen der Behandlung jedes Tier zu ändern.
    3. Desinfizieren Sie alle flüssigen Abfällen vor der Beseitigung, indem die Lösung auf 10% Bleichmittel.
    4. Autoklav alle festen Abfälle, die möglicherweise zu Bd vor der Entsorgung ausgesetzt ist.

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    Representative Results

    Itraconazol-Behandlung wurde als erfolgreich, wenn alle Tiere waren vier Wochen nach Ende der Behandlung Bd-negativ. Vor der Behandlung begonnen, zwei Wochen nach der Impfung alle Bd-geimpften Tiere infiziert waren, mit einer mittleren Belastung von 1.121,7 Zoosporen (± 17,34), während vier Wochen nach Ende der Behandlung eine mittlere Belastung von Zoosporen 16,765.12 hatten die Bd-positiven Kontrolltiere ( ± 14.643,08).

    Die Behandlung von Incilius nebulifer (n = 15) war mit Bäder in 0,0025% Itraconazol-Konzentration für fünf Minuten pro Tag für sechs Tage erfolgreich. Diese geringe Konzentration Dosierung von Itraconazol-Behandlung nicht signifikant in der Sterblichkeit im Vergleich zu den Bd-positiven Kontrollen (Cox-Regression: χ 2,1 = 2,17, exp (b) = 20.500, p = 0,339) (Abbildung 1B), viele von denen bis zum Ende der Studie mit Bd-Infektion überlebt.

    Bäder von 0,0025% itraconazole für 11 Tage, und beide 0,005% und 0,0025% Itraconazol sechs Tage wurden alle als wirksame und sichere Behandlungsmöglichkeiten (1A und 1B). Die empfohlene Behandlungskonzentration und die Hälfte Konzentration für eine Behandlungsdauer von 11 Tagen signifikant erhöht werden Mortalität im Vergleich zu den Bd-positiven Kontrollen (Cox-Regression: 0,01% Itraconazol χ 2,1 = 35,68, exp (b) = 307,54, p <0,01; 0,005% Itraconazol χ 2,1 = 16.17, exp (b) = 9,40 , p <0,01) (Fig. 1A). Die 0,01% Itraconazol-Behandlung für 11 Tage verursacht 100% Sterblichkeit in I. nebulifer, und die Hälfte Konzentration (0,005% Itraconazol für 11 Tage) verursacht 60% Mortalität (Fig. 1A). Nekropsie und Histopathologie für eine kleine Untergruppe von Tieren, die während der Behandlung starben, wurden ausgeführt. Kein Tier in dieser Studie starben chytridiomycosis.


    Fig. 1 ist. Unterschiede in der Überlebensrate über Itraconazol Behandlungen 15 (A) Incilius nebulifer:. D 11-Behandlung (n = 15 für jede Itraconazol Konzentration von 0,01, 0,005 und 0,0025%, n = 17 für die Bd-positiven Kontrollgruppe und n = 9 für die Bd-negativen Kontrollgruppe). (B) I. nebulifer: 6 D-Behandlung (n = 15 für jeden Itraconazol Konzentration von 0,01, 0,005 und 0,0025%, n = 17 für die BD-positive Kontrollgruppe und n = 9 für die BD-negative Kontrollgruppe). Schwarze Pfeile zeigen den letzten Tag der Behandlung. Gezogenen Linien zeigen Überleben der Kontrollgruppen (schwarz = Bd-positiven, grau = Bd-negativ). Gestrichelten Linien Überleben von Itraconazol Behandlungsgruppen (hellgrau Punkte = 0,01%, Mittlere graue Punkte = 0,005%, schwarze Punkte = 0,0025% Itraconazol). (Diese Zahl hat sich von Brannelly et al. 15 geändert wurde, 1B und 1C). Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

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    Discussion

    Über dieses Protokoll konnten wir sicher und effektiv reduzieren die Behandlungsdosis und Zeit von Itraconazol-Behandlung für Bd bei Amphibien. Die niedrigste Behandlungsdosis und Zeit (0,0025% für sechs Tage) war eine erfolgreiche Behandlung für subklinisch infiziert I. nebulifer. Die Wirksamkeit von sowohl einer niedrigeren Dosis und Behandlungsdauer zeigen die Notwendigkeit für klinische Therapiestudien für Bd-Infektion Behandlungen, da gibt es noch keine sichere und wirksame Behandlungen für alle Arten und Altersklassen von Amphibien verwendet werden.

    Die Ursache des Todes von Itraconazol-Behandlung resultiert, ist an dieser Stelle 11 unbekannt. Nekropsie und Histopathologie wurden auf einer kleinen Untergruppe von Individuen, die während oder kurz nach der Behandlungsperiode in der Brannelly et al. Studie starben 15 durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Analysen waren nicht schlüssig über die Ursache des Todes, obwohl klar ist, dass kein Tier gestorbenvon chytridiomycosis. Moderate Autolyse aufgetreten zwischen Tod und Probenkonservierung, die unsere Fähigkeit, feine Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen beeinflusst haben.

    Obwohl dieses Protokoll unterstützt die Existenz eines sicheren und wirksamen Behandlungsschema, mehr Studien wie diese müssen im Gange zu sein. Eine zweite Azol-Behandlung, Voriconazol, wurde gezeigt, wirksam bei mindestens einer Spezies 18 sein. Voriconazol ist in einer Wasserlösung stabiler als Itraconazol und hat sich gezeigt, sicher für die Verwendung Kaulquappe 18 zu sein. Obwohl eine einzige Behandlungsdosis von Itraconazol und Voriconazol in der Preisgestaltung, ist Voriconazol viel teurer für den Kauf als Itraconazol, führenden Forschern und Managern, gefangen Itraconazol mehr regelmäßig zu wählen. Zu dieser Zeit wurde nur eine Studie veröffentlicht die effektiv von Voriconazol 18 demonstriert. Um Wirksamkeit zu demonstrieren, brauchen mehr Arten erprobt werden.

    <p class = "jove_content"> Azol-Antimykotika stellen eine Art von antimykotische Chemotherapie, die das Pilzwachstum hemmen 13. Es gibt andere Methoden, um die Behandlung, die Pilz-Erreger töten, anstatt nur das Wachstum reduzieren wollen. Bd wird in vitro bei Temperaturen über 28 ° C-und Wärmetherapie zielt darauf ab, getötet Bd in der Epidermis zu töten. Terbinafin Hydrochlorid, als Alternative, die bei der Behandlung von Antipilzinfektion Bd in irgendeiner Art 19 erfolgreich gewesen ist, wirkt, indem er die Lyse der Pilzzellen. Antipilzmittel, die direkt den Erreger angreifen könnten erfolgreicher Behandlungen und mehr Arbeit getan werden muss, um vielversprechende Behandlungsmöglichkeiten für Bd-Infektion zu testen.

    Itraconazol Behandlung hat sich als wirksam in subklinisch infizierten Tieren sein, aber die Behandlung von klinischen chytridiomycosis weitgehend erfolglos. Nur eine Studie bisher 20 erfolgreich behandelt terminal i ll Amphibien, und die Behandlung auf eine aggressive Kombination von Elektrolyten und Chemotherapie. Erfolgreiche Behandlungsmöglichkeiten für unheilbar kranke Tiere sind notwendig, vor allem für vom Aussterben bedrohte Tiere in Gefangenschaft gehalten wurden, wo der Schutz des Einzelnen ist wichtig für die Erhaltung der Arten.

    Obwohl die Verringerung der Dosis und Behandlungsdauer war erfolgreich für I. nebulifer, die Behandlung nicht auf andere Tierarten oder Tiere mit klinischen Infektionen erprobt worden. Einige Arten und Lebensabschnitte sind intolerant von Itraconazol-Behandlung, so, bevor eine große Behandlungsregime, in Gefangenschaft Manager sollten Probebehandlung auf einer kleinen Untergruppe von Personen, die Sicherheit und Wirksamkeit zu bestimmen. Prüfung der behandelten Tiere für mindestens vier Wochen nach Beendigung der Behandlung notwendig ist, Eradikation von niedrigem Niveau Infektion 7 zu gewährleisten, und sollten nach jedem Behandlungsschema implementiert werden.

    Zelt "> Etablierung sichere und wirksame Behandlungsmöglichkeiten für Bd-Infektionen in Gefangenschaft Sicherung Kolonien Bereich Priorität für Amphibienschutzbemühungen. Pflege Bd freien Völkern ist unerlässlich, um den Erfolg der Schutzbemühungen und in Gefangenschaft gehalten wurden möglicherweise die einzige Lebensader für Arten an den Rand des Aussterbens .

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    Disclosures

    Der Autor erklärt keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

    Acknowledgments

    Ich möchte CL-Richards Zawacki für Hilfe danken Konzeption der Versuchsplanung und die Unterstützung mit Materialien, A. Pessier Hilfe Festlegung eines Behandlungsschema und die Sektionsanalysen, MWH Chatfield, MJ Robak, K. und D. Tasker Lenger für die Hilfe in der Labor-und Support und McFadden M. und P. Harlow am Taronga Zoo für die Nutzung ihrer Speicher während der Dreharbeiten. Das Projekt wurde teilweise durch Louisiana Department of Wildlife and Fisheries durch die Louisiana Environmental Education Zuschuss der Kommission nach LA Brannelly ausgezeichnet und von Life Technologies finanziert.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    0.1% Aqueous Itraconazole, Sporonox Janssen Pharmaceutica Inc.
    NaCl Fisher Scientific S640-500
    KCl Fisher Scientific BP366-1
    CaCl2 Fisher Scientific BP510-100
    NaHCO3 Fisher Scientific BP328-500
    Sterile cotton swabs Medical and Wire Equipment MW113
    1.5 ml Microtubes Sarstedt 73.703.217
    Qiagen DNEasy Blood and Tissue Kit Qiagen 69581
    7500 Real-time PCR Applied Biosystems 4351104
    VIC IPC Applied Biosystems 4308323
    BSA Applied Biosystems AM2618
    Agar Invitrogen 30391023
    Tryptone Invitrogen Q10029
    Penicillin-streptomycin Invitrogen 15070-063
    Petri Dish Sigma Aldrich CLS430589

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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