العزلة من الدم والأوعية المشتقة متعددة القدرات السلائف من العضلات الهيكلية البشرية

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

الأوعية الدموية داخل الميناء الهيكل العظمي والعضلات العديد من السكان السلائف متعددة النسب البشرية التي هي مثالية لتطبيقات التجدد. هذه الطريقة العزلة يسمح تنقية وقت واحد من ثلاثة السكان الخلية متعددة القدرات السلائف على التوالي من ثلاث طبقات الهيكلية الأوعية الدموية: خلايا المنشأ العضلي من البطانية البطانية، pericytes من وسائل الإعلام، وخلايا الغلالة البرانية من البرانية.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Chen, W. C. W., Saparov, A., Corselli, M., Crisan, M., Zheng, B., Péault, B., Huard, J. Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (90), e51195, doi:10.3791/51195 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

منذ اكتشاف الوسيطة الجذعية / خلايا انسجة (اللجان الدائمة)، تم حجب هوية الأم وتوطين اللجان الدائمة بأثر رجعي من العزلة في الثقافة. في الآونة الأخيرة، وذلك باستخدام الفرز مضان تنشيط الخلايا (FACS)، ونحن وغيرهم من الباحثين تحديد مستقبلي وتنقيته ثلاث مجموعات سكانية فرعية من الخلايا متعددة القدرات السلائف المرتبطة الأوعية الدموية للعضلات الهيكل العظمي الإنسان. هؤلاء السكان ثلاث خلايا: الخلايا البطانية المنشأ العضلي (MECS)، pericytes (أجهزة الكمبيوتر)، وخلايا الغلالة البرانية (ACS)، يتم ترجمة على التوالي إلى ثلاث طبقات الهيكلية الأوعية الدموية: البطانية، وسائل الإعلام، والبرانية. كل هذه الأوعية الدموية المستمدة من الخلايا الجذعية البشرية (hBVSC) التعبير عن المجموعات السكانية ليس فقط علامات MSC الكلاسيكية ولكن أيضا تمتلك الإمكانات التنموية أرومية متوسطة مماثلة إلى اللجان الدائمة نموذجية. سابقا، وقد تم عزل MECS، وأجهزة الكمبيوتر، وأجهزة التكييف من خلال بروتوكولات واضحة وتتميز لاحقا في دراسات منفصلة. والبروتوكول الاضافي العزلة الحاليocol، من خلال تعديلات على عملية العزل وتعديلات في انتقائية علامات سطح الخلية، ويسمح لنا لتنقية وقت واحد كل ثلاثة مجموعات سكانية فرعية hBVSC بواسطة نظام مراقبة الأصول الميدانية من واحد خزعة العضلات البشري. وهذه الطريقة الجديدة لا تبسيط فقط عزل مجموعات سكانية فرعية BVSC متعددة ولكن أيضا تسهيل التطبيقات السريرية في المستقبل من hBVSCs لأغراض علاجية متميزة.

Introduction

وقد اعتبر العضلات والهيكل العظمي الإنسان مصدرا جذابا سريريا الخلايا الجذعية / السلف. يحتوي الهيكل العظمي والعضلات لا تلتزم فقط الأسلاف المنشأ العضلي، myoblasts الهيكل العظمي، ولكن أيضا خلايا جذعية بدائية المنشأ العضلي، بما في ذلك الخلايا الأقمار الصناعية والخلايا الجذعية المشتقة من العضلات (MDSCs) 1. وقد تم التحقيق في استخدام الخلايا البشرية مأخوذة من العضلات الجذعية / السلف، ذاتي أو خيفي، في الطب التجديدي على نطاق واسع في النماذج الحيوانية ما قبل السريرية والتجارب السريرية. تطبيقات التجدد من العضلات الخلايا الجذعية / السلف تتراوح بين تجديد عضلة التصنع في ضمور العضلات دوشين (DMD) من المرضى إلى إصلاح القلب بجروح في المرضى الذين يعانون من النوبات القلبية.

منذ اكتشاف الوسيطة الجذعية / خلايا انسجة (اللجان الدائمة) وغيرهم من السكان السلائف الخلية متعددة القدرات، بما في ذلك الخلايا المشتقة من نخاع العظام متعددة القدرات السلف الكبار (MAPCs) والخلايا الجذعية الدهنية المشتقة (ADSCs)، الجذعية البالغة /تم التحقيق الخلايا الاولية على نطاق واسع حتى الآن 1-9. ومع ذلك، فقد تم حجب هوية الأم والتعريب في الموقع من قبل وسائل العزل بأثر رجعي. في الآونة الأخيرة، وذلك باستخدام الخلايا مضان تنشيط الفرز (FACS)، ونحن وجماعات أخرى قد حددت مستقبلي وتنقيته ثلاث السكان الخلية السلائف متعددة القدرات من الأوعية الدموية داخل العضلات والهيكل العظمي الإنسان والعديد من الأجهزة الأخرى: الخلايا البطانية المنشأ العضلي (MECS)، pericytes (أجهزة الكمبيوتر)، وخلايا الغلالة البرانية (ACS) 10. هذه المجموعات السكانية الفرعية الثلاثة من الخلايا الجذعية الدموية والأوعية المشتقة الإنسان (hBVSCs) يمكن العثور على التوالي في ثلاث طبقات الهيكلية الأوعية الدموية: الغلالة البطانية، وسائل الإعلام الغلالة، والغلالة البرانية. بشكل أكثر تحديدا، تم الكشف عن MECS وأجهزة الكمبيوتر في microvessels والشعيرات الدموية في حين يتم ترجمة أجهزة التكييف في الطبقة البرانية الشرايين والأوردة الكبيرة. كل خلية فرعية تمهيدا تعبر عن مزيج فريد من مستضدات سطح الخلية: MECS (CD34 + / 56 + / + 144/45 -) وأجهزة الكمبيوتر (CD146 + / 34 - / 45 - / 56 -)، وأجهزة التكييف (CD34 + / 31 - / 45 - / 56 - / 146 -).

كشف مزيد من توصيف هذه مجموعات فرعية hBVSC أن جميع السكان الخلية السلائف ثلاثة امتلاك الإمكانات التنموية أرومية متوسطة مماثلة إلى اللجان الدائمة نموذجية، بما في ذلك الهيكل العظمي تكون العضل، تكون العظم، الغضروف، وتكون الشحم. جميع مجموعات فرعية hBVSC أيضا يحمل علامات MSC الكلاسيكية، بما في ذلك CD44، CD73، CD90، وCD105، طازجة والثقافة. بشكل جماعي هذه القطع من الأدلة تؤيد أصل الأوعية الدموية من اللجان الدائمة. وعلاوة على ذلك، تم مؤخرا أظهر قدرات علاجية من MECS، وأجهزة الكمبيوتر، وأجهزة التكييف في دراسات منفصلة. وقد أظهرت MECS فرزها من البالغين الخزعات العضلية الإنسان لتجديد العضلات المصابة والتصنع والهيكل العظمي وإصلاح عضلة القلب جرح أكثر كفاءة من myoblasts الهيكل العظمي والأوعية الدموية إندوخلايا thelial (ECS). وقد تبين أيضا أجهزة تنقية من مختلف الأعضاء البشرية لإصلاح / تجديد العضلات الهيكلية المصابة والتصنع والمساهمة في تجمع الخلايا الأقمار الصناعية 13-16. مؤخرا جدا، لقد أثبتنا أن أجهزة الكمبيوتر المستمدة من العضلات والهيكل العظمي الإنسان على نحو فعال إصلاح عضلة القلب محتشية من خلال تأثير غير مباشر نظير الصماوي والتفاعلات الخلوية مباشرة 17. أجهزة التكييف، من ناحية أخرى، كانت إما معزولة مباشرة من الأوعية الدموية explanted أو تنقيته بواسطة نظام مراقبة الأصول الميدانية من الأنسجة الدهنية لجسم الإنسان والعضلات والهيكل العظمي. وقد تجلى تأثير والمؤيدة للعائية ملحوظ من أجهزة التكييف في الماوس القائمة الخلفية نموذج نقص التروية 19. وعلاوة على ذلك، كما تم أظهرت أجهزة التكييف لإصلاح عضلة القلب محتشية أكثر كفاءة من اللجان الدائمة التقليدية، مما يدل على الإمكانات العلاجية قوية من أجهزة التكييف في إصلاح الأنسجة الدماغية 20.

المنح الحالية بروتوكول تنقية وقت واحد، وتنقية المحتملين من MECS، وأجهزة الكمبيوتر، وأجهزة التكييف من الأوعية الدموية من خزعة العضلات والهيكل العظمي البشري واحد. وهذا يسمح لنا لدراسة و / أو اختيار حيوانية hBVSC الأمثل لأغراض علاجية متميزة. بالإضافة إلى ذلك، توسع هذه التقنية الجديدة أيضا على ذخيرة من الخلايا الجذعية / السلف التي يمكن استخلاصها من عضلات الهيكل العظمي الإنسان، مما يجعلها مصدرا مثاليا للخلايا متعددة القدرات تمهيدا للطب التجديدي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. خزعة العضلات المعالجة

  1. الحفاظ على خزعة العضلات والهيكل العظمي البشري على الجليد في Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة (DMEM) تستكمل مع 5٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ البنسلين، الستربتوميسين (P / S) أثناء النقل.
  2. بعد استلام خزعة العضلات، وإزالة عينة من حاويات النقل، وأغسلها مرتين في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) تستكمل مع 2٪ حل المضادات الحيوية المضادة للفطريات (A / A) تحت ظروف معقمة.
  3. إزالة الدهنية المرفقة والنسيج الضام مع مقص وملقط معقم في DMEM تستكمل مع 2٪ A / A.
  4. إزالة الأوعية الدموية الكبيرة تحت المجهر تشريح وقطع احقا العينة العضلات الى قطع صغيرة (<1 سم 2 في الحجم).
  5. قطع قطع على الحفاظ على العضلات (<5 غرامات) في 20 مل الحفاظ المتوسطة (PM. DMEM تستكمل مع FBS 10٪ و 1٪ P / S) في 4 ℃ لمدة تصل إلى 5 أيام.

2. العضلات Dissociatايون وعزل خلية

  1. في يوم من العزلة الخلايا، وإزالة قطع من العضلات PM ويغسل مرتين في برنامج تلفزيوني تستكمل مع 2٪ P / S. لجعل الحل الهضم، إضافة النوع الأول، النوع الثاني، وcollagenases النوع الرابع (100 ملغ / مل) حديثا في PM.
  2. فرم اللحم المفروم ناعما وقطع العضلات ميكانيكيا مع مقص العقيمة وملقط في طبق بتري مع كمية صغيرة من مساء حتى يمر حل 10 مل ماصة المصلية مع عدم وجود تخثر. إزالة المتبقي الدهنية والأنسجة الضامة أثناء هذه العملية. استخدام ما لا يقل عن 8-10 غرام من العضلات البالغين أو 2 غرام من العضلات الجنين لكل العزلة الخلية.
  3. نقل 4-5 غرام من العضلات الكبار المفروم إلى 20 مل (أو 2 غرام من العضلات الجنين المفروم إلى 10 مل) أو إف تي إتش الحل الهضم مع 10 مل ماصة المصلية. هضم ل50 - 60 دقيقة في 37 ℃ على شاكر المداري في 70-80 دورة في الدقيقة. تحسين إنتاجية الخلايا والحفاظ على سطح المستضد عن طريق ضبط الوقت الهضم و / أو سرعة الانفعالات وفقا لذلك على أساس كميةمن الأنسجة. مراقبة الوضع الهضم كل 15-20 دقيقة حتى تعكر يزيل تقريبا.
  4. ماصة بقوة الأنسجة هضمها 3-5 مرات مع 10 مل ماصة المصلية. إضافة كمية مساوية من PM لوقف رد فعل ثم الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 4 دقائق.
  5. إزالة بعناية طاف. resuspend الكرية مع 10 مل PM أن يغسل، ثم يصفى خلال مصفاة خلية 100 ميكرون.
  6. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 4 دقائق وإزالة بعناية طاف. الكريات resuspend في تحلل كرات الدم الحمراء العازلة (155 ملي NH 4 الكلورين، 10MM KHCO 0،1mM EDTA)، تصفية من خلال مصفاة ميكرون 70 خلية للحصول على تعليق خلية واحدة، ثم احتضان لمدة 10 دقيقة في RT. تصفية من خلال مصفاة خلية 70 m مرة أخرى إذا لوحظ أي هطول الأمطار.
  7. الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 4 دقائق و resuspend بيليه خلية في 0.5 مل PBS. حساب عدد الخلايا. الحصول على ما مجموعه 5 ملايين على الأقل خلايا لفرز الخلايا. تمييع سينغلتعليق خلية ه إلى أقل من 5 مليون خلية لكل مل مع برنامج تلفزيوني للتلطيخ. إخراج 50-100 ميكرولتر من تعليق خلية وانقسم الى 11 أنابيب لstainings التحكم (السيطرة غير ملوثين، وضوابط السلبية، وأحادية اللون الضوابط الإيجابية).

3. صفها الخليوي والفرز

  1. احتضان تعليق خلية واحدة لمدة 10 دقيقة في 4 ℃ في مصل الفأر (01:10 المخفف في PBS) ليسد الغرض إذا لزم الأمر.
  2. إضافة CD34-APC، CD45-APC-Cy7، CD56-PE-Cy7، CD144-PE، وCD146-FITC (كل 1: 100) في تعليق خلية واحدة واحتضان لمدة 20 دقيقة في 4 ℃. من أجل السيطرة السلبية، إضافة تركيزات يعادل APC-، APC-Cy7-، PE-Cy7-، PE-، ونمط إسوي الأجسام المضادة مفتش الحكومة FITC، مترافق واحتضان لمدة 20 دقيقة في 4 ℃. لالضوابط الإيجابية أحادية اللون، إضافة تركيزات مماثلة من APC-CD34، CD45-APC-Cy7، CD56-PE-Cy7، CD144-PE، وCD146-FITC بشكل فردي في كل أنبوب واحتضان لمدة 20 دقيقة في 4 ℃.
  3. بعد مرور فترة الحضانة، الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 4 دقائق لغسل. resuspend الكرية خلية في 1 - 2 مل DMEM تستكمل مع FBS 5٪ و 1٪ P / S. تركيز النهائي من تعليق الخلية يجب أن يكون أقل من 5 مليون خلية لكل مل. إضافة 7-AAD (1: 100)، واحتضان لمدة 15 دقيقة في RT للاستبعاد خلية ميتة. من أجل السيطرة السلبية والضوابط الإيجابية أحادية اللون، والكريات الخلايا resuspend في 0.5 مل DMEM تستكمل مع FBS 5٪ و 1٪ P / S.
  4. نقل كل تعليق خلية لجولة القاع البوليسترين الخلوي تدفق الأنابيب. إعداد أنابيب جمع الخلية (كل أنبوب هو ما قبل مليئة 500 ميكرولتر من مستنبت المناسبة: MPM لMECS وغير العادية-2 لأجهزة الكمبيوتر الشخصية، المتوسطة AC لACS). تعليق خلية النقل على الجليد إلى فارز الخلية.
  5. تعليق خلية تعمل على فارز خلية في أمر من السيطرة غير ملوثين، وضوابط السلبية، الضوابط الإيجابية أحادية اللون، وتعليق خلية الرئيسي في حين ضبط كثافة الليزر، والتعويض القناة، والسكان الخلية النابضة صارم لتعظيم خلية صurity (يرجى الرجوع إلى المقالات المنشورة من قبل إن الرب والمجلات الأخرى للاطلاع على تفاصيل التدفق الخلوي).
  6. جمع السكان الخلية المطلوب في أنابيب جمع المناسبة. تخزين الخلايا التي تم جمعها في 4 ℃ إن لم يكن البذر على الفور.

4. بعد فرز خلية ثقافة

  1. البذور MECS فرزها حديثا (P0) في <10،000 خلية / سم 2 في MPM على لوحات المغلفة مسبقا مع النوع الأول الكولاجين. الركض لاحق من MECS، البذور 3،500 - 4،000 خلية / سم 2 في MPM على لوحات / قوارير المغلفة مسبقا مع النوع الأول الكولاجين.
  2. البذور أجهزة الكمبيوتر فرزها حديثا (P0) في <20،000 خلية / سم 2 في EGM-2 على لوحات مطلية حديثا مع 0.2٪ الجيلاتين. الركض لاحق من أجهزة الكمبيوتر، خلايا تقسيم في 1: 3 نسبة في PC المتوسطة (DMEM تستكمل مع FBS 20٪ و 1٪ P / S) على لوحات ثقافة البوليسترين العادية حتى P2. من P3 فصاعدا، وخلايا البذور عند 6،500 - 7،000 خلية / سم 2 في PC المتوسطة على دورية الثقافة البوليسترين لوحات / قوارير.
  3. البذور أجهزة التكييف فرزها حديثا (P0) في <20،000 خلية / سم 2 في AC المتوسطة (DMEM تستكمل مع FBS 20٪ و 1٪ P / S) على لوحات ثقافة البوليسترين العادية. الركض لاحق من أجهزة التكييف، وخلايا البذور عند 6،500 - 7،000 خلية / سم 2 في AC المتوسطة على دورية الثقافة البوليسترين لوحات / قوارير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يتم تصحيح المعلمات FACS أولا استنادا إلى البيانات التي تم الحصول عليها من سيطرة غير ملوثين، وضوابط السلبية، والضوابط الإيجابية أحادية اللون. بعد استبعاد الخلايا الميتة، تخضع الخلية تعليق المسمى مضان إلى سلسلة من الاختيارات السلبية والإيجابية علامة سطح الخلية. أولا، وبوابات خلايا CD45 + CD56 + من قبل وCD56 - يتم فصل الخلايا من CD45 - الكسر. يتعرض CD56 + CD34 جزء لمزيد من التحديد حيث CD144-CD34 + فقط / CD144 + وتتميز الخلايا (ثنائية إيجابية) كما MECS (CD34 + / 56 + / + 144/45 -) والتي تم جمعها بعد ذلك (الشكل 1). وبالمثل، فإن CD56 - يخضع جزء أيضا على CD34-CD146 التحديد حيث CD34 فقط - / + CD146 الخلايا يتم وضعت أجهزة الكمبيوتر (CD146 + / 34 - / 45 - / 56 -) وجمعها في وقت لاحق ( + / CD31 +)، والوحيد CD34 + / CD31 - - على CD34 + / CD146 يتم وضع علامة فرعية وأجهزة التكييف (CD34 + / 31 - / 45 - / 56 - / 146 -) لجمع (الشكل 1). لتبسيط هذه العملية، CD144 يمكن استخدامها لتحل محل CD31 للاستبعاد من ECS.

حديثا خلايا فرزها يمكن المصنفة في ظروف ثقافة المحددة في البروتوكول لمزيد من التوسع أو استخدامها على الفور لإجراء التجارب في الجسم الحي. ويمكن تحقيق التوسع النسيلي من مجموعات فرعية hBVSC من قبل النظام autoclone FACS الأغنية أو الحد من طريقة التخفيف 13، 21. على عكس اللجان الدائمة غير المتجانسة التقليدية، ثقافات فرعية hBVSC تظل متجانسة حتى بعد التوسع على المدى الطويل. مورفولوجيا التمثيلية مجموعات فرعية hBVSC مثقف، المنقى من الخزعات العضلية ومتبرع واحد، هو مبين في الشكل 2. وتتلخص مقارنات بين اللجان الدائمة النموذجية ومجموعات فرعية hBVSC المنقى في الجدول 1.

الشكل 1
تأكيد الرقم 1. الفرز ممثل فرعية ثلاثة من الخلايا الجذعية البشرية المستمدة من الأوعية الدموية (hBVSCs) خزعة من العضلات والهيكل العظمي البشري واحد. الطهارة من كل السكان الخلية فرزها مزيدا من التحليل بعد الفرز. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الرقم 2. مجموعات سكانية فرعية hBVSC ثلاثة وفرزها إلى التجانس، أظهرت مورفولوجيا واضح في جulture (من اليسار إلى اليمين): عضلي الخلايا البطانية (MEC)، خلية حوطية (PC)، وخلية الغلالة البرانية (AC) (عند مرور 4 والحانات نطاق = 100 مم). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

اللجان الدائمة MECS أجهزة الكمبيوتر أجهزة التكييف
نقاء غير متجانسة متجانسة متجانسة متجانسة
سطح الخلية الشخصية مستضد لتنقية N / A CD34 + CD56 + CD45- CD144 + CD31- CD34 + CD45- CD146-
ماجستير التعبير علامة في الثقافة CD29 + CD44 + CD73 + CD90 + + CD105 CD29 + CD44 + CD90 + + CD105 CD44 + CD73 + CD90 + + CD105 CD44 + CD73 + CD90 + + CD105
Multipotency تكون العضل (+) تكون الشحم (+) تكون العظم (+) تكون الغضروف (+) تكون العضل (+) تكون الشحم (+) تكون العظم (+) تكون الغضروف (+) تكون العضل (+) تكون الشحم (+) تكون العظم (+) تكون الغضروف (+) تكون العضل (N / A) تكون الشحم (+) تكون العظم (+) تكون الغضروف (+)
التطبيقات المحتملة Skeletomuscular إصلاح / تجديد: العظام والغضاريف والأوتار، الأربطة، والعضلات الهيكلية. إصلاح القلب. إصلاح الأوعية الدموية. التئام الجروح. يممونوريغولاتيون إصلاح القلب. إصلاح الهيكل العظمي والعضلات / تجديد. العظام / إصلاح الغضروف / تجديد إصلاح القلب. إصلاح الأوعية الدموية / تجديد. إصلاح الهيكل العظمي والعضلات / تجديد. تجديد العظام إصلاح القلب. إصلاح الأوعية الدموية / تجديد. تجديد العظام
توطين التشريحية في الموقع N / A الأوعية الدموية البطانية الأوعية الدموية وسائل الإعلام الأوعية الدموية البرانية

الجدول 1. مقارنة اللجان الدائمة النموذجية ومجموعات سكانية فرعية hBVSC متعددة القدرات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تحديد وتنقية المجموعات السكانية الفرعية hBVSC تمثل تقدما كبيرا في فهم تطور الجنين MSC. هناك أدلة متزايدة تشير إلى أصل ماحول الأوعية من اللجان الدائمة والارتباط بين خلايا السلائف الأنسجة محددة والأوعية الدموية 22-25. بالإضافة إلى ذلك، القدرة على عزل مجموعات سكانية فرعية متجانسة من hBVSCs يساعد أيضا على فهم MSC التجانس وبيولوجيا الخلايا الوعائية 26.

في السنوات القليلة الماضية، تم تحديدها بشكل فردي MECS، وأجهزة الكمبيوتر، وأجهزة التكييف وعزل من خلال بروتوكولات واضحة في دراسات منفصلة. ومع ذلك، فقد بذلت أي محاولة لتنقية جميع مجموعات فرعية hBVSC ثلاثة في وقت واحد من العضلات والهيكل العظمي الإنسان بسبب الصعوبات لتحسين الإجراء تفكك الأنسجة والجمع بين الانتقائية علامات تحديد النسب الخلية MECS، وأجهزة الكمبيوتر، وأجهزة التكييف تماما. نحن هنا وصف جديد بروتوكول العزلة الخلية التي تسمح purif المتزامنةication من MECS، وأجهزة الكمبيوتر، وأجهزة التكييف من الخزعة العضلية واحد البشري عن طريق تعديل عملية تفكك الأنسجة وتطبيق تركيبة جديدة من علامات سطح الخلية انتقائية (الشكل 1). للحصول على أفضل النتائج، والخطوات الحاسمة في البروتوكول الحالي والتي تتطلب المزيد من الاهتمام وتشمل: 1. نضارة والحفاظ على عينة الأنسجة. 2. الأمثل من العائد الخلية والحفاظ المستضد السطحي من خلال رصد دقيق لعملية الهضم وضبط الوقت تفكك الأنسجة. 3. معايرة دقيقة من اللون ستة التدفق الخلوي. هذه المعايير هي التي يحددها المختبر الفردية وفقا لمعين الإعداد العرض / معداتها.

من خلال تنفيذ هذا البروتوكول الجديد، لا يمكن تبسيط فقط العزلة متزامن المجموعات السكانية الفرعية hBVSC متعددة ولكن أيضا تسهيل استخدام hBVSCs للبحوث الأساسية وتطبيق متعدية، مثل المقارنة بين السلوكيات الخلوية التفاضلية بين hBVSمجموعات فرعية C والاستفادة المثلى من واحدة أو اندماجي فرعية hBVSC (ق) لمختلف التطبيقات العلاجية الشخصية. ومع ذلك، فإن العزلة المتزامنة من كل ثلاثة مجموعات فرعية hBVSC يقتصر حاليا على العضلات والهيكل العظمي يرجع ذلك إلى حقيقة التي لم يتم تحديدها MECS في الأنسجة البشرية الأخرى. الى جانب ذلك، فإنه هو أبعد من الحد من البروتوكول الحالي للتمييز التحول و / أو التسلسل الهرمي الخلوي بين هذه المجموعات السكانية الفرعية hBVSC الثلاثة.

توصيف المعزولة حديثا ومثقف MECS، وأجهزة الكمبيوتر، وأجهزة التكييف وقد أثبتت بشكل منفصل في الدراسات السابقة MECS في ثقافة الحفاظ على التعبير عن علامة CD56 عضلي ولكن تفقد تدريجيا التعبير عن علامات EC CD34 و CD144. على مستوى النسيلي، MECS تعبر عن علامات MSC، بما في ذلك CD29، CD44، CD90، وCD105، وعرض إمكانات التمايز الوسيطة مثل الغضروف، تكون العظم، تكون الشحم، وتكون العضل. بالإضافة إلى ذلك، MECS نسيلي تحتفظ بهم angiogenالقدرة جيم بعد الثقافة على المدى الطويل، وتشكيل شبكات تشبه الشعرية في الثقافة Matrigel والمشاركة في اتساع الأوعية الدموية في الجسم الحي 21.

أجهزة الكمبيوتر، طازجة أو مستنبت، وقد ثبت للتعبير ليس فقط علامات MSC، بما في ذلك CD44، CD73، CD90، وCD105، ولكن أيضا إظهار القدرات التنموية أرومية متوسطة، على سبيل المثال، تكون العضل الهيكل العظمي، وتكون العظم، الغضروف، وتكون الشحم 13. أجهزة الكمبيوتر تفرز بقوة عدد من العوامل الغذائية، حتى في ظل نقص الأكسجين، وبمثابة وحدات التجدد من خلال وظيفتها نظير الصماوي، والتمايز المباشر، والتفاعل الخلوي خلال إصلاح الأنسجة / عملية تجديد أجهزة التكييف، مماثلة لأجهزة الكمبيوتر، وعرضت للتعبير عن علامات MSC الكلاسيكية وتفرق في الخلايا الرئيسية الأنساب الوسيطة 18. جنبا إلى جنب مع أجهزة الكمبيوتر، كما تم اقترح أجهزة التكييف واحدا من أصول التنموية من اللجان الدائمة. ملخص مقارنة سطح الخلية علامة التعبير، والقدرة على التمايز، وصوقد تم ادراج التطبيقات متعدية ossible بين اللجان الدائمة النموذجية وhBVSCs في الجدول 1. مؤخرا، تانغ وآخرون. خلايا الأوعية الدموية الجذعية متعددة القدرات التي تم تحديدها (MVSCs) من وسائل الإعلام الغلالة من الأوعية الدموية الكبيرة في الفئران والإنسان 29. MVSCs لا تفرق فقط في خلايا العضلات الملساء ولكن تسهم أيضا في إعادة الأوعية الدموية وتضخم neointimal بعد إصابة الأوعية الدموية 29. سواء MVSCs مشاركة اتصالات التنموية مع BVSCs المقيمين في الأوعية الدموية الدقيقة والصغيرة السفن يتطلب مزيدا من التحقيق.

البروتوكول الحالي يتطلب عزل خلية في الوقت المناسب من الخزعة العضلية البشرية الطازجة، والتي، في بعض الأحيان، قد لا يكون متاحا في ضبط السريرية. بدلا من ذلك، استنادا إلى مجموعة معدلة من علامات سطح الخلية انتقائية، فمن الممكن لتنقية MECS وأجهزة الكمبيوتر من cryopreserved الثقافات الخلية العضلية الهيكلية الأولية الإنسان التدفق الخلوي 30. هذا الأسلوب يسمح purif المحتملينication اثنين من مجموعات فرعية من hBVSC ثقافة العضلات والهيكل العظمي راهن البشرية لأغراض علاجية. ومع ذلك، نظرا لعدم التعبير CD34 في الخلايا العضلية البشرية المستزرعة، فإنه من غير الممكن مواصلة فصل أجهزة التكييف مع هذا البروتوكول معين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

الكتاب أود أن أشكر أليسون وجار لها المساعدة التقنية ممتازة مع التدفق الخلوي. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من وزارة الدفاع (JH)، وهنري J. مانكين هبوا كرسي (JH)، ووزارة التعليم والعلوم في جمهورية كازاخستان (AS). وأيد اتفاقية حظر الأسلحة الكيميائية في جزء من الزمالة دكتوراه مسبقا جمعية القلب الأمريكية (11PRE7490001). وأيد M.Corselli بواسطة معهد كاليفورنيا للطب التجديدي منحة التدريب (TG2-01169).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase type 1 Sigma C5894 Sterile vial
Collagenase type 2 Sigma C1764 Sterile vial
Collagenase type 4 Sigma C1889 Sterile vial
Anti-human CD34 APC BD Pharmingen 555824 Keep sterile
Anti-human CD45 APC-Cy7 BD Pharmingen 557833 Keep sterile
Anti-human CD56 PE-Cy7 BD Pharmingen  557747 Keep sterile
Anti-human CD144 PE Beckman Coulter A07481 Keep sterile
Anti-human CD146 FITC AbD Serotec MCA2141F Keep sterile
FACS Aria II Flow Cytometer Becton-Dickinson
EGM-2 complete medium Lonza CC-3162 For culturing PCs (only P0)
DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate Invitrogen 11965 For culturing PCs
DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, with sodium pyruvate Invitrogen 11995 For culturing MECs and ACs
Fetal bovine serum Invitrogen 10437-028
Heat-inactivated horse serum Invitrogen 26050-088
Penicillin/streptomycin Invitrogen 15140-122
Antibiotic-antimycotic (100X) Invitrogen 15240-062
Trypsin-EDTA 0.5% (10X) Invitrogen 15400-054
Dulbecco’s PBS without calcium and magnesium Invitrogen 14190-250
Chick embryo extract Accurate Chemical CE650T-10 Filter before use

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peault, B., et al. Stem and Progenitor Cells in Skeletal Muscle Development. Maintenance, and Therapy. Mol Ther. 15, 867-877 (2007).
  2. Toma, J. G., et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat Cell Biol. 3, 778-784 (2001).
  3. Zuk, P. A., et al. Human Adipose Tissue Is a Source of Multipotent Stem Cells. Mol. Biol. Cell. 13, 4279-4295 (2002).
  4. Zimmerlin, L., et al. Stromal vascular progenitors in adult human adipose tissue. Cytometry. 77, 22-30 (2010).
  5. Reyes, M., et al. Origin of endothelial progenitors in human postnatal bone marrow. The Journal of Clinical Investigation. 109, 337-346 (2002).
  6. Choi, Y., Ta, M., Atouf, F., Lumelsky, N. Adult pancreas generates multipotent stem cells and pancreatic and nonpancreatic progeny. Stem Cells. 22, 1070-1084 (2004).
  7. Zengin, E., et al. Vascular wall resident progenitor cells: a source for postnatal vasculogenesis. Development. 133, 1543-1551 (2006).
  8. Corselli, M., Chen, C. W., Crisan, M., Lazzari, L., Peault, B. Perivascular ancestors of adult multipotent stem cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30, 1104-1109 (2010).
  9. Ballas, C. B., Zielske, S. P., Gerson, S. L. Adult bone marrow stem cells for cell and gene therapies: Implications for greater use. Journal of Cellular Biochemistry. 85, 20-28 (2002).
  10. Chen, C. -W., Corselli, M., Péault, B., Huard, J. Human Blood-Vessel-Derived Stem Cells for Tissue Repair and Regeneration. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 597439 (2012).
  11. Zheng, B., et al. Prospective identification of myogenic endothelial cells in human skeletal muscle. Nat Biotech. 25, 1025-1034 (2007).
  12. Okada, M., et al. Myogenic Endothelial Cells Purified From Human Skeletal Muscle Improve Cardiac Function After Transplantation Into Infarcted Myocardium. Journal of the American College of Cardiology. 52, 1869-1880 (2008).
  13. Crisan, M., et al. A Perivascular Origin for Mesenchymal Stem Cells in Multiple Human Organs. Cell Stem Cell. 3, 301-313 (2008).
  14. Park, T. S., et al. Placental Perivascular Cells for Human Muscle Regeneration. Stem Cells and Development. 20, 451-463 (2011).
  15. Dellavalle, A., et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat Cell Biol. 9, 255-267 (2007).
  16. Dellavalle, A., et al. Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat Commun. 2, 499 (2011).
  17. Chen, C. -W., et al. Human pericytes for ischemic heart repair. STEM CELLS. 31, (2), 305-316 (2012).
  18. Corselli, M., et al. The tunica adventitia of human arteries and veins as a source of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 21, 1299-1308 (2012).
  19. Campagnolo, P., et al. Human Adult Vena Saphena Contains Perivascular Progenitor Cells Endowed With Clonogenic and Proangiogenic Potential. Circulation. 121, 1735-1745 (2010).
  20. Katare, R., et al. Transplantation of Human Pericyte Progenitor Cells Improves the Repair of Infarcted Heart Through Activation of an Angiogenic Program Involving Micro-RNA-132 / Novelty and Significance. Circulation Research. 109, 894-906 (2011).
  21. Zheng, B., et al. Human myogenic endothelial cells exhibit chondrogenic and osteogenic potentials at the clonal level. Journal of Orthopaedic Research. 31, 1089-1095 (2013).
  22. Caplan, A. I. All MSCs Are Pericytes. Cell Stem Cell. 3, 229-230 (2008).
  23. Feng, J., Mantesso, A., Sharpe, P. T. Perivascular cells as mesenchymal stem cells. Expert Opinion on Biological Therapy. 10, 1441-1451 (2010).
  24. Tang, W., et al. White Fat Progenitor Cells Reside in the Adipose Vasculature. Science. 322, 583-586 (2008).
  25. Krautler, N. J., et al. Follicular Dendritic Cells Emerge from Ubiquitous Perivascular Precursors. Cell. 150, 194-206 (2012).
  26. Phinney, D. G. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells: Implications for cell therapy. Journal of Cellular Biochemistry.113. 113, 2806-2812 (2012).
  27. Chen, C. -W., et al. Perivascular multi-lineage progenitor cells in human organs: Regenerative units, cytokine sources or both. Cytokine and Growth Factor Reviews. 20, 429-434 (2009).
  28. Lin, C. -S., Lue, T. F. Defining Vascular Stem Cells. Stem Cells Dev. 22, 1018-1026 (2013).
  29. Tang, Z., et al. Differentiation of multipotent vascular stem cells contributes to vascular diseases. Nat Commun. 3, 875 (2012).
  30. Zheng, B., et al. Isolation of myogenic stem cells from cultures of cryopreserved human skeletal muscle. Cell Transplant. 21, 1087-1093 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics