Author Produced

كله من جبل Immunolabeling الشم مستقبلات الخلايا العصبية في

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Karim, M. R., Endo, K., Moore, A. W., Taniguchi, H. Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna. J. Vis. Exp. (87), e51245, doi:10.3791/51245 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

جزيئات الرائحة ربط المستقبلات هدفهم بطريقة دقيقة ومنسقة. كل مستقبلات تعترف إشارة محددة والتبديلات هذه المعلومات إلى الدماغ. على هذا النحو، وتحديد كيفية نقل المعلومات الشمية إلى الدماغ، وتعديل كل من الإدراك والسلوك، والتحقيق الوقائع الموضوعية. ومن المثير للاهتمام، وهناك أدلة الناشئة التي تشارك تنبيغ الخلوية والنسخي العوامل في تنويع حاسة الشم مستقبلات الخلايا العصبية. هنا نقدم ككل قوية الأسلوب جبل الوسم المناعية لفحص حاسة الشم في الجسم الحي منظمة مستقبلات الخلايا العصبية. باستخدام هذا الأسلوب، حددنا جميع الخلايا العصبية مستقبلات حاسة الشم مع الأجسام المضادة لمكافحة ELAV، علامة عموم العصبية المعروفة وOr49a-mCD8 :: GFP، والخلايا العصبية مستقبلات الشمية أعرب تحديدا في الدوري الاميركي للمحترفين الخلايا العصبية باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة GFP.

Introduction

ويستخدم نظام حاسة الشم للتمييز بين مجموعة متنوعة وهائلة من جزيئات الرائحة، وبعد ذلك لإرسال المعلومات الناتجة إلى مراكز المخ العليا. يستخدم هذا المدخل إلى التحكم بدقة السلوكيات الحيوانية الأساسية، مثل التغذية والتزاوج 1-6. كما يرتبط كل نوع الخلايا العصبية الشمية مع مجموعة محددة من الروائح، وتنويع الخلايا العصبية مستقبلات الشم (ORN) و هو ضروري لالسليم وظيفة الجهاز الشمي 7.

علم الوراثة ذبابة الفاكهة تمكننا من إجراء تحقيق واحد على مستوى الخلية التي تنطوي على الآليات الجزيئية المرتبطة بالتنمية ORN وظيفة فسيولوجية 8-16. وقد مكنتنا كله المناعية جبل ذبابة الفاكهة هوائيات لفهم بمزيد من التفصيل الآليات الجزيئية المشاركة في تنويع الخلايا العصبية مستقبلات الشمية (ORN) ق 7. هنا نقدم وصفا شاملا لطريقة بسيطة لميلانhieve هذا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد لوحة التفاح

  1. مزيج 12.5 ز آغار، 125 مل 100٪ عصير التفاح المتاحة تجاريا، 12.5 غرام جلوكوز، و 375 مل H 2 O. الميكروويف الخليط لمدة 1-2 دقائق وتصب في صحن الثقافة 3 سم الخلية. تخزين عند 4 درجات مئوية.

2. عبر الوراثية

  1. استخدام الصليب الوراثية ممثل التالية:

Or49a-mCD8 :: GFP / CYO خ ث 1118

3. تشريح وتلطيخ بروتوكول

  1. تخدير الذبابة ثم قطع رأسه يطير عموديا من خلال عقد ذلك باستخدام ملقط.
  2. وضع بعناية الهوائيات التي تحتوي على جزء على صفيحة التفاح.
  3. قطع الجزء الثالث من الهوائي باستخدام مقص تشريح غرامة.
  4. وضع 90 ميكرولتر من الحل التثبيت (4٪ بارافورمالدهيد 0.1٪ في PBST (PBS مع 0.1٪ تريتون X-100)) إلى وسط الطبق الثقافة أسفل الزجاج.
  5. بلطف نقل antenn تشريحAE بإبرة حادة مباشرة إلى الحل التثبيت. إذا لزم الأمر، يغرق جسديا هوائيات في الحل باستخدام إبرة.
  6. احتضان لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT). غسل هوائيات 0.4٪ في PBST (PBS مع 0.4٪ تريتون X-100)، في كل 3X 10 دقيقة، وابقائها في نفس الطبق. استخدام نصائح الأصفر إلى إزالة وإضافة حل PBST. استخدام 90 ميكرولتر من محلول الغسيل في كل مرة.
    ملاحظة: لا تضع الطبق إلى شاكر خلال المناعية. قبل إزالة أو إضافة الحل في طبق، وجعل جميع الهوائيات في وسط الطبق باستخدام الإبرة وإضافة أو إزالة بعناية الحل من على حافة الطبق.
  7. منع هوائيات مع 90 ميكرولتر من 5٪ مصل الحصان العادي في 0.1٪ PBST لمدة 20 دقيقة في RT.
  8. بعد إزالة عرقلة الحل، واحتضان هوائيات مع 90μl من الأجسام المضادة الأولية 0.1٪ في PBST تحتوي على 5٪ مصل الحصان لمدة 48 ساعة في 4 درجات مئوية في وعاء مبلل كما هو موضح سابقا
  9. غسل هوائيات 6X 0.4٪ في PBST 10 دقيقة.
  10. احتضان هوائيات مع 90 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية في PBST 0.1٪ تحتوي على 5٪ مصل الحصان لمدة 48 ساعة في 4 درجات مئوية. غسل 6X 10 دقيقة باستخدام 0.4٪ PBST.
  11. لتركيب هوائيات، وإزالة PBST من الطبق ثقافة قدر الإمكان وإدخال تدريجيا اثنين من تركيزات مختلفة من الجلسرين للهوائيات. أولا إضافة 40٪ الجلسرين إلى الطبق ل1-2 دقائق؛ ثم إزالة هذا وإضافة 80٪ الجلسرين.
  12. استخراج بعناية هوائيات (بما في ذلك 80٪ الجلسرين) من الطبق الثقافة باستخدام غيض الأصفر ووضعها على شريحة. وضع بلطف ساترة على رأس وختم حواف ساترة مع طلاء الأظافر. هوائيات هي الآن جاهزة للتصوير بواسطة المجهر مضان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ضمان أن كلا من تشريح والتثبيت يتم تنفيذها بسرعة هي عامل رئيسي في تحقيق النجاح مع هذا البروتوكول. باستخدام مقص غرامة ملقط وحاسم أيضا. بعد المناعية، تم فحص الفلورسنت المسمى هوائيات تحت المجهر متحد البؤر. نحن عادة ما تأخذ أقسام 1μm باستخدام عدسة 20x و. نحن وصفت الدوري الاميركي للمحترفين 7 ORNs باستخدام Or49a-mCD8 :: GFP وعدها عدد من الدوري الاميركي للمحترفين ORNs في البرية من نوع الهوائي. المترجمة غشاء الخلية مراسل mCD8-GFP وهكذا ينظر إلى التعبير في الشكل 2 المعروضات غشاء الخلية من OR49a ORNs معربا عن GFP. في الشكل 2 يوضح التعبير الدوري الاميركي للمحترفين ORNs استخدام الألغام المضادة للأجسام المضادة ومكافحة GFP كان يستخدم كعلامة ELAV عموم العصبية. متوسط ​​عدد ORNs الدوري الاميركي للمحترفين في الهوائي 20 (ن = 8).

الشكل 1
الرقم 1: لمحة عامة عن dissectioالإجراء ن.

الرقم 2
الشكل 2: توقعات متحد البؤر Z-سلسلة من هوائي تشريح بنجاح. كان يستخدم للكشف عن الخلايا العصبية المضادة للELAV الضد كعلامة عموم العصبية (A) والأجسام المضادة لمكافحة GFP للكشف محددة التعبير مستقبلات الرائحة (B) واندمجت الصورة كما هو مبين في (C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تشريح الهوائي ذبابة الفاكهة وصفنا بسيطة وسهلة لأداء في بيئة المختبر. لضمان تشريح ناجحة، لا بد من استخدام مقص ذو حدين غرامة. بينما المناعية الهوائي تشريح، فمن المهم لاحتضان لهم في حاوية مملوءة رطوبة لتجنب التبخر من الحل الضد. الهوائي تشريح لديه ميل لتطفو في الحل. وسوف تستخدم 0.1٪ تريتون في برنامج تلفزيوني أثناء التثبيت وعرقلة خطوات تسهيل غمر الهوائي في الحل وضمان أفضل تلطيخ. يمكن استخدام "طبق ثقافة أسفل الزجاج" الحد من الخسائر في الهوائيات خلال المناعية وضمان كميات صغيرة (90 ميكرولتر) من محلول الأجسام المضادة المستخدمة في كل تجربة.

التنويع على مستوى الخلايا العصبية هو سمة أساسية من تكوين الخلايا العصبية. ويتمثل هذه العملية الفسيولوجية في نظام حاسة الشم، والتي تستخدم مجموعة كبيرة من الخلايا العصبية الشمية مستقبلات (ORN)الطبقات. جيل من مجموعة واسعة من ORNs مع الرائحة التعبير مستقبلات واستهداف محور عصبي أمر حاسم لتوليد تنوع العصبية اللازمة لنقل المعلومات من جزيئات الرائحة إلى مراكز المخ العليا. لدينا كله هوائي جبل المساعدات بروتوكول المناعية في تعزيز فهمنا للآليات الجزيئية الكامنة وراء التنويع ORN.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وأيد هذه الدراسة من قبل وزارة التربية المدعومة من برنامج لمؤسسة البحوث الاستراتيجية في الجامعات الخاصة ومنحة JSPS الشباب عالم B لحزب التحرير ونود أن نشكر Ohtake Norihito لتحرير مقاطع الفيديو.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stemi DV4 dissection microscope Zeiss Stemi DV4
Glass bottom culture dishes  MatTek corporation P35G-0-10-C
Dissection scissor Fine Science Tools 15000-08
Rat anti-ELAV Developmental Studies Hybridoma Bank 7E8A10 Dilution 1:200
Mouse anti-GFP Invitrogen A11122 Dilution 1:400
Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories 711-225-152 Dilution 1:200
Donkey Anti-Rat IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories 712-165-150 Dilution 1:200

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Christensen, T. A., White, J. Representation of olfactory information in the brain In The Neurobiology of Taste and Smell. New York. 201-232 (2000).
  2. Ache, B. W. Towards a common strategy for transducing olfactory information. Sem. Cell Biol. 5, 55-63 (1994).
  3. Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction. C. elegans. Cell. 13, 515-527 (1993).
  4. Barth, A. L., Justice, N. J., Ngai, J. Asynchronous onset of odorant receptor expression in the developing zebrafish olfactory system. Neuron. 16, 23-34 (1996).
  5. Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413, 211-218 (2001).
  6. Stockinger, P., et al. Neural circuitry that governs Drosophila male courtship behavior. Cell. 121, 795-807 (2005).
  7. Endo, K., et al. Chromatin modification of Notch targets in olfactory receptor neuron diversification. Nat Neurosci. 15, 224-233 (2011).
  8. Karim, M. R., Moore, A. W. Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics. J Vis Exp. (2011).
  9. Suh, G. S., et al. A single population of olfactory sensory neurons mediates an innate avoidance behaviour in Drosophila. Nature. 431, 854-859 (2004).
  10. Sachse, S., Galizia, C. G. Role of inhibition for temporal and spatial odor representation in olfactory output neurons: A calcium imaging study. J Neurophysiol. 87, 1106-1117 (2002).
  11. Hallem, E. A., Ho, M. G., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila antenna. Cell. 117, 965-979 (2004).
  12. Vosshall, L. B., Wong, A. M., Axel, R. An olfactory sensory map in the fly brain. Cell. 102, 147-159 (2000).
  13. Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. J. Molecular, anatomical and functional organization of the Drosophila olfactory system. Curr Biol. 15, 1535-1547 (2005).
  14. Clyne, P., et al. Odorant response of individual sensilla on the Drosophila antenna. Invert Neurosci. 3, 127-135 (1997).
  15. Vosshall, L. B., et al. A spatial map of olfactory receptor expression in the Drosophila antenna. Cell. 96, 725-736 (1999).
  16. Wang, J. W., et al. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112, 271-282 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics