Author Produced

Hela Mount immunomärkning av luktreceptor nervceller i

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Karim, M. R., Endo, K., Moore, A. W., Taniguchi, H. Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna. J. Vis. Exp. (87), e51245, doi:10.3791/51245 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Doftämnen binder till sina mål-receptorer i en exakt och samordnat sätt. Varje receptor känner igen en specifik signal och vidarebefordrar denna information till hjärnan. Som sådan, att bestämma hur lukt information överförs till hjärnan, modifiera både perception och beteende, meriter utredning. Intressant nog finns det nya bevis för att cellöverföring och transkriptionsfaktorer är inblandade i diversifieringen av luktreceptor neuron. Här ger vi en robust hela montera immunologisk märkningsmetod för analys in vivo luktreceptor neuron organisation. Med denna metod, identifierade vi alla luktreceptor nervceller med anti-elav antikropp, en känd pan-neurala markören och Or49a-mCD8 :: GFP, en luktreceptor neuron specifikt uttryckt i NBA neuron med hjälp av anti-GFP antikropp.

Introduction

Luktsinnet används för att skilja mellan en enorm variation av luktmolekyler och därefter skicka den resulte information till högre hjärncentra. Denna ingång används för att exakt kontrollera grundläggande djurbeteenden, till exempel utfodring och parning 1-6. Eftersom varje lukt neuron typ är associerad med en specifik uppsättning av lukter, diversifiering av luktreceptor neuroner (ORN) s är nödvändig för korrekt luktsinne fungerar 7.

Drosophila genetik gör att vi kan utföra en enda cell nivå utredning som omfattar molekylära mekanismer i samband med Örn utveckling och fysiologisk funktion 8-16. Hela berget immunfärgning av Drosophila antenner har gjort det möjligt för oss att förstå mer i detalj de molekylära mekanismer som är inblandade i diversifieringen av luktreceptor neuroner (ORN) s 7. Häri vi ge en heltäckande beskrivning av en enkel metod för att achieve detta.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Förbered äpple platta

  1. Blanda 12,5 g agar, 125 ml 100% kommersiellt tillgänglig äppeljuice, 12,5 g glukos, och 375 ml H2O Micro blandningen under 1 till 2 minuter och häll till 3 cm cellodlingsskål. Förvaras vid 4 ° C.

2. Genetisk kors

  1. Använd följande representativa genetiska inlägg:

Or49a-mCD8 :: GFP / CYO x w 1118

3. Dissektion och färgningsprotokollet

  1. Söva farten och sedan klippa flugan huvudet vertikalt genom att hålla den med hjälp av en tång.
  2. Placera försiktigt antenner som innehåller delen på ett äpple platta.
  3. Skär den tredje segmentet av antennen med fina dissektion sax.
  4. Placera 90 ul av fixeringslösning (4% paraformaldehyd i 0,1% PBST (PBS med 0,1% Triton X-100)) till en mitt av en glasbottnad odlingsskål.
  5. Försiktigt överföra dissekerade antennae med en vass nål direkt till fixeringslösningen. Om nödvändigt fysiskt dränka antennerna in i lösningen med hjälp av nålen.
  6. Inkubera under 40 minuter vid rumstemperatur (RT). Tvätta antenner på 0,4% PBST (PBS med 0,4% Triton X-100), 3x 10 minuter i varje, hålla dem i samma skål. Använd gula tips för att ta bort och lägga till PBST lösning. Använd 90 ul av tvättlösningen varje gång.
    OBS: Placera skålen i en shaker under immunohistokemi. Innan du tar bort eller lägga lösningen i skålen, ta med alla antennerna i mitten av skålen med hjälp av nål och försiktigt lägga till eller ta bort lösningen från kanten av skålen.
  7. Blockera antenner med 90 pl av 5% normalt hästserum i 0,1% PBST under 20 minuter vid RT.
  8. Efter avlägsnande av blockeringslösningen, inkubera antennerna med 90μl av primära antikroppar i 0,1% PBST innehållande 5% hästserum under 48 timmar vid 4 ° C i en fuktig behållare såsom beskrivits tidigare
  9. Tvätta antennerna 6x 10 minuter i 0,4% PBST.
  10. Inkubera antenner med 90 ul av sekundära antikroppar i 0,1% PBST innehållande 5% hästserum under 48 timmar vid 4 ° C. Tvätta 6x 10 minuter med hjälp av 0,4% PBST.
  11. För att montera antenner, ta bort PBST från odlingsskålen så mycket som möjligt och så småningom införa två olika koncentrationer av glycerol till antennerna. Först lägger 40% glycerol till skålen i 1 till 2 minuter; sedan ta bort det och lägga 80% glycerol.
  12. Försiktigt ut antennerna (inklusive 80% glycerol) från odlingsskålen med hjälp av gul spets och placera dem på en bild. Placera försiktigt ett täckglas ovanpå och försegla täckglas kanterna med nagellack. Antennerna är nu redo att avbildas med fluorescensmikroskopi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Att se till att både dissektion och fixering sker snabbt är en viktig faktor för att nå framgång med detta protokoll. Med fin sax och pincett är också avgörande. Efter immunfärgning, var fluorescerande märkta antenner undersöks under ett konfokalmikroskop. Vi tar normalt 1 | im sektioner med hjälp av ett 20x objektiv. Vi märkt NBA 7 Orns använder Or49a-mCD8 :: GFP och räknade antalet NBA Orns i vildtyp-antenn. Den mCD8-GFP reporter är cellmembranet lokaliserade och så uttrycket framgår av fig. 2 uppvisar cellmembranet hos OR49a Orns uttrycker GFP. I fig. 2 visar NBA Orns expression med användning av anti GFP-antikropp och anti elav användes som en pan-neurala markören. Medeltalet NBA Orns per antenn är 20 (n = 8).

Figur 1
Figur 1: Allmän översikt över dissection förfarande.

Figur 2
Figur 2: Projektion av konfokala Z-serien av ett framgångsrikt dissekeras antenn. För att detektera neuroner anti elav antikropp användes som en pan-neurala markören (A) och anti-GFP-antikropp för att detektera specifika luktreceptorexpression (B) och sammanslagna bild, såsom visas i (C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den dissekering av Drosophila antenn vi beskriver är enkel och lätt att utföra i en laboratoriemiljö. För att säkerställa en lyckad dissektion är det väsentligt att utnyttja fina kanter sax. Medan immunofärgning dissekerade antenn, är det viktigt att inkubera dem i en fuktfylld behållare för att undvika avdunstning av antikroppslösningen. Den dissekerade antenn har en tendens att flyta i lösningen. Användning av 0,1% Triton i PBS under fixering och blockering steg underlättar nedsänkning av antennen i lösningen och för att säkerställa bättre färgning. Med hjälp av "glas botten kultur skålen" kan minska förlusten av antenner under immunfärgning och se till de små mängder (90 l) av antikroppslösning som används i varje experiment.

Neuronal-klass diversifiering är en central del av neurogenes. Denna fysiologisk process exemplifieras i luktsinnet, som utnyttjar ett stort utbud av luktreceptor neuron (ORN)klasser. Generering av ett brett utbud av Örns med luktreceptor uttryck och axonal inriktning är avgörande för att generera den neuronala mångfald som krävs för att överföra information från luktmolekyler till högre hjärncentra. Våra hela montera antennimmunfärgning protokoll stöd i att främja vår förståelse av de molekylära mekanismerna bakom ORN diversifiering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Denna studie stöddes av MEXT-stödda programmet för Stiftelsen för Strategisk Forskning vid privata universitet och JSPS Young Scientist B bidrag för HT Vi vill tacka Ohtake Norihito att redigera videoklipp.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stemi DV4 dissection microscope Zeiss Stemi DV4
Glass bottom culture dishes  MatTek corporation P35G-0-10-C
Dissection scissor Fine Science Tools 15000-08
Rat anti-ELAV Developmental Studies Hybridoma Bank 7E8A10 Dilution 1:200
Mouse anti-GFP Invitrogen A11122 Dilution 1:400
Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories 711-225-152 Dilution 1:200
Donkey Anti-Rat IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories 712-165-150 Dilution 1:200

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Christensen, T. A., White, J. Representation of olfactory information in the brain In The Neurobiology of Taste and Smell. New York. 201-232 (2000).
  2. Ache, B. W. Towards a common strategy for transducing olfactory information. Sem. Cell Biol. 5, 55-63 (1994).
  3. Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction. C. elegans. Cell. 13, 515-527 (1993).
  4. Barth, A. L., Justice, N. J., Ngai, J. Asynchronous onset of odorant receptor expression in the developing zebrafish olfactory system. Neuron. 16, 23-34 (1996).
  5. Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413, 211-218 (2001).
  6. Stockinger, P., et al. Neural circuitry that governs Drosophila male courtship behavior. Cell. 121, 795-807 (2005).
  7. Endo, K., et al. Chromatin modification of Notch targets in olfactory receptor neuron diversification. Nat Neurosci. 15, 224-233 (2011).
  8. Karim, M. R., Moore, A. W. Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics. J Vis Exp. (2011).
  9. Suh, G. S., et al. A single population of olfactory sensory neurons mediates an innate avoidance behaviour in Drosophila. Nature. 431, 854-859 (2004).
  10. Sachse, S., Galizia, C. G. Role of inhibition for temporal and spatial odor representation in olfactory output neurons: A calcium imaging study. J Neurophysiol. 87, 1106-1117 (2002).
  11. Hallem, E. A., Ho, M. G., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila antenna. Cell. 117, 965-979 (2004).
  12. Vosshall, L. B., Wong, A. M., Axel, R. An olfactory sensory map in the fly brain. Cell. 102, 147-159 (2000).
  13. Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. J. Molecular, anatomical and functional organization of the Drosophila olfactory system. Curr Biol. 15, 1535-1547 (2005).
  14. Clyne, P., et al. Odorant response of individual sensilla on the Drosophila antenna. Invert Neurosci. 3, 127-135 (1997).
  15. Vosshall, L. B., et al. A spatial map of olfactory receptor expression in the Drosophila antenna. Cell. 96, 725-736 (1999).
  16. Wang, J. W., et al. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112, 271-282 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics