Criação de um
1VECT-HORUS SAS, 2Aix-Marseille Université, CNRS, NICN UMR 7259

Medicine
 

Summary

O objetivo do presente estudo foi validar a reprodutibilidade de um modelo in vitro BBB envolvendo um singênico rato co-cultura de células endoteliais e astrócitos. A monocamada de células endoteliais apresentaram alta TEER e baixa permeabilidade LY. Expressão de proteínas TJ específicos, foram avaliadas as respostas funcionais a inflamação e a funcionalidade de transportadores e receptores.

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Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. J. Vis. Exp. (88), e51278, doi:10.3791/51278 (2014).

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Abstract

A barreira hemato-encefálica (BHE) regula especificamente fluxo molecular e celular, entre o sangue e o tecido nervoso. O nosso objectivo foi desenvolver e caracterizar um singeneico de rato altamente reprodutível modelo in vitro da certificação utilizando co-culturas de células endoteliais primárias de cérebro de rato (RBEC) e astrócitos para estudar os receptores envolvidos na transcitose através da monocamada de células endoteliais. Os astrócitos foram isoladas por dissecção mecânica a seguir à digestão de tripsina e foram congeladas para a co-cultura posterior. RBEC foram isoladas a partir de córtices de ratos com 5 semanas de idade. Os cérebros foram limpos de meninges e substância branca, e dissociado mecanicamente após digestão enzimática. Depois disso, o tecido homogeneizado foi centrifugado em albumina de soro de bovino para separar fragmentos de vasos a partir de tecido nervoso. Os fragmentos dos vasos foram submetidos a uma segunda digestão enzimática de células endoteliais livres da sua matriz extracelular. As restantes células contaminantes, tais como pericitos foram fUTRAS eliminado por plaqueamento dos fragmentos dos microvasos em meio contendo puromicina. Eles foram então passadas para filtros de co-cultura com os astrócitos cultivados no fundo dos poços. RBEC expressa altos níveis de junção apertado proteínas (TJ), como occludin, claudin-5 e ZO-1, com uma localização típico nas bordas da célula. A resistência eléctrica transendotelial (TEER) das monocamadas endoteliais cerebrais, o que indica a tensão de TJs atingiu 300 ohm · cm 2, em média. Os coeficientes de permeabilidade endotelial (PE) para lucifer amarelo (LY) foi altamente reprodutível com uma média de 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min. Células endoteliais do cérebro organizados em monocamadas expressou o transportador de efluxo glicoproteína-P (P-gp), mostrou um transporte polarizado de rodamina 123, um ligante para a P-gp, e mostrou transporte específico de transferrina-Cy3 e DiILDL através da monocamada de células endoteliais. Em conclusão, nós fornecemos um protocolo para a criação de um in vitroBBB modelo que é altamente reprodutível devido aos métodos de garantia de qualidade, e que é adequado para a pesquisa sobre os transportadores e receptores de BBB.

Introduction

Muitos medicamentos desenvolvidos para tratar do Sistema Nervoso Central (SNC) são incapazes de atingir o parênquima cerebral em concentrações terapeuticamente relevantes. A certificação protege o tecido nervoso do cérebro a partir da flutuação da composição do plasma, a partir de agentes patogénicos, e mantém a homeostase do parênquima do cérebro, restringindo o fluxo de não-específico de iões, péptidos, proteínas e até mesmo células para dentro e para fora do cérebro 1.

Características de BBB são induzidos e mantidos pela proximidade íntima e cross-talk entre as células endoteliais microvasos cérebro classe especializada e elementos vizinhos da unidade de neuro-glia-vascular (NGVU), tais como os neurônios, células da glia (astrócitos, mais precisamente o final de pés), e pericitos ensheathed na membrana basal, que consiste principalmente de colágeno tipo IV, fibronectina, laminina e proteoglicanos 2,3. Pericitos cobrem aproximadamente 22 - 32% do endotélio ao nível capilar e desempenham um importantepapel na regulação da proliferação endotelial, angiogênese e processos inflamatórios. As células endoteliais formam uma folha contínua que cobre a superfície interna dos vasos capilares. Eles são ligados entre si por TJs, que formam uma estrutura de correia como a região apical, e que contribuem para a célula de polarização. Os astrócitos regulam as propriedades de BBB e são fontes de factores regulatórios importantes, tais como TGF-β, GDNF, bFGF, e IL-6. Os astrócitos deficientes em GFAP com funcionalidade incompleta não são capazes de regular de BBB propriedades 4. Os neurónios não são directamente envolvidas estruturalmente na formação da certificação, mas também regulam aspectos importantes da expressão da proteína e BBB funções 5.

Para estudar ainda mais a estrutura, fisiologia e patologia do BBB, modelos in vitro da certificação foram desenvolvidos como ferramentas de pesquisa. As células endoteliais do cérebro foram extraídos a partir de várias espécies para implementar em modelos in vitro de BBB baseadocom baixos passagem principais culturas provenientes de bovinos, suínos 6,7 8,9, 10,11,12 rato, rato 13 e também humano 14,15. Estes modelos são conhecidos para imitar in vivo certificação, especialmente quando co-cultivadas com células gliais de rato ou murina e / ou pericitos, 16,12 e / ou progenitoras derivadas de células de astrócitos neurais 17 e / ou 18 de neurónios. Os modelos "em laboratório" são muitas vezes produzidos a partir de roedores porque eles permitem in vitro / in vivo, ensaios e comparações e / ou o estudo de células endoteliais cerebrais produzidos a partir de modelos transgénicos 19.

Recentemente desenvolvido em modelos in vitro de BBB também foram projetados para ajudar a prever a captação cerebral de potenciais SNC drogas candidatos antes de ensaios in vivo 15,20,21,3,6,22,11,23. Modelos in vitro de BBB são normalmente utilizados para comparar o transporte de drogas com: i) conhecido penetração no SNC ou com low permeabilidade através da certificação e sem efeitos centrais, e ii) a aparente Pe de os mesmos medicamentos medidos em modelos animais da mesma espécie. As drogas que facilmente passam a certificação são principalmente lipofílico e atravessar as membranas das células endoteliais do cérebro por mediada por lípidos difusão livre (cafeína, carbamazepina, etc.) As drogas transportadas negativamente, tais como a digoxina, verapamil ou ciclosporina A são activamente extrudido por endoteliais cerebrais transportadores de efluxo tais como a P-gp. No entanto, muitas das moléculas terapêuticas recentemente desenvolvidos são produtos biofarmacêuticos, tais como proteínas recombinantes, siRNAs ou anticorpos monoclonais. A maioria deles não atravesse a certificação devido a: i) a ausência de transportadores específicos, e ii) a camada apertada de células endoteliais, que impedem que as moléculas de alto peso molecular de sofrer passagem paracelular. Com esses limites, as estratégias de "Cavalo de Tróia" foram implementadas usando vetores (anticorpos, peptídeos) contra os receptores conhecidos no BBB, envolveu in mediada pelo receptor de transporte ou transcitose (RMT), tais como o receptor de transferrina (Tf) (TfR), o receptor de insulina (RI), ou os membros do receptor de LDL (LDLR) relacionados com a família de receptores (LDLR, LRP1). Tais receptores têm sido encontrados em isolados capilares cerebrais e na certificação in vivo 24,25. Perfis de transcrição para estes receptores, em particular os da família LDLR, foram analisados ​​e comparados entre as células endoteliais do cérebro e células endoteliais do cérebro em co-cultura com astrócitos ou nos capilares cerebrais logo após sua extração do cérebro 26. Pardridge 24 abriu o campo com o anticorpo OX-26 contra o receptor de transferrina (TfR), seguido de anticorpos contra o receptor de insulina e o receptor do factor de crescimento semelhante à insulina 27,28. Com estes vectores de anticorpos baseada, ArmaGen Technologies desenvolveu um Trojan molecular plataforma cavalo tecnologia certificação para entregar drogas, incluindo proteínas, através da certificação 29. Oliteratura é rica em dados que mostram expressão LRP1 nas células endoteliais do cérebro e do seu papel como um poderoso receptor endocítico / limpador. A análise Western blot sugerido que LRP1 é expresso em fracções enriquecidas em capilares de cérebro de rato e em células endoteliais capilares do cérebro 30. Empresas como a Angiochem alvo LRP1 com vetores de peptídeos derivados de aprotinina que promovem o influxo de drogas eficiente em todo o BBB 31. No entanto, LRP1 também está envolvido no transporte ativo de Aâ e seu efluxo / autorização do parênquima cerebral de sangue 32. Estes dados implicam LRP1 num transporte bidireccional através da certificação de acordo com os seus ligandos. biOasis desenvolve a tecnologia transcendem usando um melanotransferrina proteína para o transporte de produtos biológicos, tais como enzimas lisossomais e anticorpos através da certificação 33 enquanto VECT-horus desenvolve vectores de peptídeos que têm como alvo o LDLR 34. Há dados que sugerem que a PRL e LDLR pode ser utilizado para o transporte de diferent moléculas, tais como enzimas lisossomais 35,36 ou complexos de nanopartículas em todo o BBB 37.

O campo de interesse é a entrega da droga para o sistema nervoso central utilizando moléculas de vector e vetorizadas droga-candidatos para o tratamento de doenças do SNC. Em particular, a entrega da droga através da certificação tem de ser considerada no contexto de neuroinflammation, um processo que pode variar na sua extensão, mas que provavelmente é comum a todas as lesões e doenças do SNC, incluindo a encefalite, a esclerose múltipla, a doença de Alzheimer, etc Neuroinflammation está associada com a certificação inflamação e potencialmente com alterações na fisiologia certificação e considerando que a permeabilidade paracelular e transporte intracelular pode ser amplificado em condições patológicas 38,39,40,41,42,43. Por exemplo, o TNF-α, TWEAK, e outras citocinas modular a inflamação, e as experiências com modelos in vitro de BBB demonstraram que podem alterar as propriedades de paracelulares the em monocamada de células endoteliais 38,39,40 e que o TNF-α também conduz a um aumento do transporte transcelular de LDL 41, holotransferrina 42 e 43 da lactoferrina.

Nosso objetivo foi desenvolver e caracterizar um otimizado e altamente reprodutível singênico rato modelo BBB usando co-culturas de células endoteliais cerebrais primários e astrócitos. Foram utilizados ratos Wistar cinco semanas de idade e neonatais para a produção de células endoteliais do cérebro e na produção de astrócitos, respectivamente. Um desafio foi estabelecer um protocolo que permite a produção de "semanal reprodutíveis" modelos de BBB. Para alcançar este objetivo, a cada passo do protocolo de produção foi realizada em dias fixos da semana, a partir da produção de microvasos cérebro na quarta-feira da primeira semana. As dissecções foram feitas quase todas as semanas, durante os últimos 3 anos. Para melhorar ainda mais a reprodutibilidade das culturas, um sistema de garantia de qualidade foi estabelecido. Todos Reagents e produtos químicos foram referenciados em um banco de dados (data de entrada, estoque, prazo de validade, etc.)

O modelo foi caracterizado a seguir um certo número de critérios, tais como a organização das células endoteliais e pureza, TEER, LY permeabilidade, resposta à exposição a agentes pró-inflamatórios, a expressão qualitativa e quantitativa das proteínas TJ, a funcionalidade de transportadores de efluxo tais como a P-gp, e receptores envolvido na transcitose através da monocamada de células endoteliais, tais como o TfR ou o LDLR.

Protocol

1. Produção de Rato Os astrócitos

Para cada preparação de utilizar 10 ratos Wistar neonatais de ambos os sexos.

  1. Sacrificar os ratos, cortando cabeças com um par de tesouras e transferi-los imediatamente em uma placa de Petri seca sob uma capela de fluxo laminar. Remover o cérebro do crânio, sem o cerebelo e transferi-los imediatamente numa placa de Petri contendo tampão de dissecção gelado: HBSS suplementado com 1% de albumina de soro bovino (de baixo nível de endotoxinas BSA), penicilina 100 unidades / ml e estreptomicina 100 ug / ml.
  2. Cortar os cérebros em metade, para separar os dois hemisférios cerebrais e transferi-los para uma placa de Petri limpa com tampão de dissecção em gelo. Corte o nervo óptico e remover as meninges sob microscópio estereoscópico.
  3. Lavar as peças corticais extensivamente em 50 ml de tampão de dissecção gelado.
  4. Coloque os pedaços de corticais a partir de 3 cérebros em um tubo Falcon de 15 ml e dissociar pipetando cima e para baixo um golpe de Estadole de vezes com uma pipeta descartável de 10 ml equipado com uma ponta de azul em 6 ml de tripsina a 0,05% - EDTA a 0,02% durante 5 min a 37 ° C.
  5. Adicionar 24 ml de DMEM suplementado com FBS a 10% e os seguintes antibióticos, penicilina 100 unidades / ml e estreptomicina 100 ug / ml, uma mídia chamado meio de células da glia (MGC) e centrifugar a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Lotes FBS foram selecionados e validados para o crescimento e sobrevivência de cutures astrócitos.
  6. Ressuspender o sedimento contendo as células dissociadas em 10 ml MGC e placa em uns 75 cm 2 t-se o frasco (T75). Troca da mídia no dia seguinte para remover os restos celulares e DNA. Substituir o meio de cultura duas vezes por semana.
  7. Após 1 semana de proliferação, agitar suavemente as células da glia com um agitador orbital a 60 rpm durante 24 horas a 37 ° C no MGC. Se o T75 não pode ser colocado em uma incubadora com 5% de CO 2/95% de ar a 37 ° C, atmosfera húmida, suplementar os meios com HEPES a 5 mM. Lave as células duas vezes com retirar as células microgliais não aderentes.
  8. Três semanas após a sementeira, lavar as células duas vezes com DPBS sem cálcio e magnésio. Adicionar 3 ml de tripsina quente 0,05%-EDTA a 0,02%, incubar a 37 ° C e esperar até que a camada de células é disperso (geralmente 5 min). Inibir a actividade da tripsina por adição de 10 ml de MGC, transferir a suspensão de células para um tubo Falcon de 15 ml e centrifugar a 120 xg durante 8 minutos.
  9. Ressuspender o sedimento astrócitos em 90% FBS - 10% DMSO, transferi-los para criotubos (2 x 10 6 células por cryovial) e loja em nitrogênio líquido.

2. Isolamento de rato Microvasos Cérebro

Nossos procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê da Faculdade de Medicina de Marselha de Ética e em conformidade com os regulamentos nacionais e europeus (directiva da UE N. º 86/609). Foram feitos todos os esforços para minimizar o sofrimento dos animais e reduzir o número de animais utilizados.

  1. Para cada preparação e para uma experimental utilizador, usar 3 cinco semanas de idade os ratos Wistar.
  2. Segunda-feira da primeira semana, dois frascos T75 preparar o revestimento com colagénio de tipo IV e a fibronectina, tanto a 1 ug / cm 2 em cultura água estéril (10 ml por T75). Permitir a aderir a 37 ° C até microvasos semeadura.
  3. Quarta-feira da primeira semana, a eutanásia os ratos sob um fluxo crescente de CO 2 para induzir sonolência, perda de postura e respiração interrupção, seguida por uma luxação cervical. Pulverizar as cabeças com etanol 70%. Corte as cabeças com um par de tesouras e transferi-los para uma placa de Petri, seco, sob uma câmara de fluxo laminar.
  4. Remover o cérebro do crânio, sem o cerebelo e os nervos ópticos, em seguida, transferi-los para uma placa de Petri arrefecida em gelo e encheu-se com tampão de dissecção gelado (HBSS suplementado com BSA a 1%, penicilina 100 unidades / ml e estreptomicina 100 ug / ml) .
  5. Corte o cérebro ao meio para separar os dois hemisférios cerebrais e mesencéfalo separada da deebrain. Transfira os forebrains em uma placa de Petri limpa no gelo com tampão de dissecação.
  6. Pegue um par de hemisférios de uma nova placa de Petri com tampão dissecção fria para remover cuidadosamente as meninges dos forebrains sob um microscópio estereoscópico com N ° 5 fórceps curvos. Em seguida, limpar o interior do cérebro para remover o acolchoado de mielina e obter uma concha de córtex. Estes passos não deve demorar mais do que 2 horas para a preservação do tecido e célula de sobrevivência.
  7. Dissociar o córtex do cérebro em 3 6 ml de tampão de dissecção gelado em 7 ml de um homogeneizador Dounce de 10 movimentos abaixo e acima com cada um dos dois pilões de folgas diferentes, 71 mM, seguido por 20 um.
  8. Dividir a suspensão para obter o equivalente de um córtex em 1 ml de um tubo Falcon de 50 ml e centrifugar a 1000 g durante 5 min à temperatura ambiente. Desprezar o sobrenadante.
  9. Digerir a suspensão a partir de um córtex com 1 ml de uma solução enzimática contendo uma mistura de colagenase / dispase (60 ug / ml I11; 0,3 U / ml), ADNase tipo I (35 ug / ml - 20 K unidades / ml) e gentamicina (50 ug / ml) num agitador durante 30 minutos a 37 ° C.
  10. Misture a 1 ml de uma digest córtex com 10 ml de 25% de BSA / HBSS 1X e separado por centrifugação de densidade dependente de 3.600 xg durante 15 min à temperatura ambiente. Transferir cuidadosamente o disco superior (mielina e parênquima cerebral) e o sobrenadante para um tubo Falcon de 50 ml limpos e repetir a centrifugação. Manter o sedimento resultante contendo os microvasos cerebrais, a 4 ° C.
  11. Cuidadosamente descarte do disco superior e o sobrenadante. Ressuspender ambos os sedimentos resultantes contendo os microvasos cerebrais com 1 ml de HBSS frio 1X e transferir para um tubo Falcon de 50 ml limpo.
  12. Lave os microvasos por adição de 20 ml de HBSS frio 1X e centrifugar a 1000 g durante 5 min. Desprezar o sobrenadante.
  13. Além disso digerir os microvasos a partir de um córtex com 1 ml da mesma solução enzimática, tal como descrito na etapa 2.9, durante uma hora a 37 ° C em um shAker.
  14. Em seguida, misturar os microvasos digeridos de cada um dos três córtices em um tubo e ainda separar-se em dois tubos Falcon de 50 ml para se obter os microvasos extraídos a partir do equivalente de uma vez e meia (1,5) córtex por tubo. Adicionar 30 ml de tampão de dissecção gelado e centrifugação a 1000 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
  15. Ressuspender o sedimento de microvasos em 10 ml de DMEM/F12 suplementado com 20% de plasma pobre em plaquetas bovino soro derivado, o factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF, 2 ng / ml), heparina (100 ug / ml), gentamicina (50 ug / ml) e HEPES (2,5 mM), chamado meio de células endoteliais (ECM) suplementado com puromicina a 4 ug / ml.
  16. Pegue os dois frascos T75 revestidos da incubadora, aspirar o excesso de revestimento e placa microvasos de cada tubo em um frasco T75 (microvasos extraídos de 1,5 córtex por frasco T75).

3. Purificação e Proliferação de RBEC Primocultures

  1. Purificação: quarta-feira a sexta-feira, adicionar puromycin a 4 ug / ml para o meio de cultura. Troca da mídia na quinta-feira. Na sexta-feira, lavar as células e adicionar puromycin a 2 mg / ml, até segunda-feira.
  2. Proliferação: na segunda-feira da segunda semana, lavar as células e adicionar insulina, transferrina e suplemento de selenito de sódio ao meio de cultura até as culturas chegar a 90% de confluência na quarta-feira da segunda semana.

. 4 Diferenciação: Configurar o modelo in vitro BBB

  1. Segunda-feira da segunda semana, prepare filtros (polietileno, 12 poços, dos poros de tamanho 1,0 mm) através do revestimento com uma mistura de colágeno tipo IV e fibronectina tanto no 0.5μg/cm 2 em água cultura estéril (500 mL de mistura no compartimento superior e 1,5 ml de água estéril de cultura no compartimento inferior). Permitir a aderir a 37 ° C até RBEC semeadura.
  2. Segunda-feira da segunda semana, cinco dias antes do estabelecimento da co-cultura, descongelar os astrócitos de criotubos a 37 ° C e transferêncianum Falcon de 15 ml com 10 ml MGC. Centrifugar a suspensão a 120 xg durante 8 minutos à temperatura ambiente.
  3. Ressuspender o sedimento em astrócitos MGC e placa a uma densidade de 30 x 10 3 culas por cm 2 em placas de 12 poços.
  4. Quarta-feira da segunda semana, imediatamente antes de dissociação com tripsina RBEC, lavar duas vezes o filtro pré-revestido com meio DMEM/F12. Pré-encher as câmaras com ECM: 1,5 ml no compartimento inferior e 0,5 ml no compartimento superior.
  5. Quarta-feira da segunda semana, lavar duas vezes o RBEC com DPBS sem cálcio e magnésio. Adicionar 4 ml de tripsina quente 0,05% - EDTA a 0,02% a 37 ° C por frasco T75 durante exactamente 30 segundos. Em seguida, remover 3,5 ml de solução de tripsina e observar ao microscópio. Quando a camada de células começa a separar a partir da matriz, ajuda-los batendo suavemente a ponta do frasco T75 até que todas as células estão a flutuar.
  6. Adicionar 9 ml de ECM por frasco T75 e transferir para um tubo Falcon de 15 ml. Muito dissociar suavemente o celularsuspensão por pipetagem para cima e para baixo, 4 vezes com uma pipeta de 10 mL, equipado com uma ponta amarela (evitar a produção de bolhas na solução). Contar as células em suspensão (a aproximadamente 3 x 10 6 cells/T75) e a placa imediatamente em filtros de pré-revestido e pré-cheios a uma elevada densidade (160 x 10 3 células / filtro, portanto, aproximadamente 18 filters/T75) (Figura 8 ). O dia seguinte (quinta-feira), mudar o meio de duas vezes o compartimento superior para remover os detritos celulares.
  7. Quinta-feira da segunda semana, um dia antes do estabelecimento do processo de co-cultura, substituir o meio de cultura dos astrócitos por 1,5 ml de meio de diferenciação (ECM com hidrocortisona em 500 nM), que pode ser suplementado com 1/3 de meio condicionado a partir do compartimento basal de um co-cultura anterior (3 dias de contacto entre as células endoteliais e astrócitos).
  8. Sexta-feira da segunda semana é definido como o dia 0 de diferenciação; substituir o meio de cultura a partir da Conta filtrosining o RBEC com a mídia diferenciação. Transferir os filtros RBEC nas cavidades que contêm os astrócitos. Sob estas condições, em modelos in vitro e diferenciar expressam proteínas relacionadas com a junção dentro de 3 dias.
  9. Os modelos de manter sua diferenciação ideal durante mais de 3 dias, entre segunda e quarta-feira da terceira semana.

Representative Results

Protocolo de Produção
O protocolo pode ser dividida em três fases que correspondem a grandes alterações na composição do meio de cultura: (a) purificação de células endoteliais de microvasos, (b) proliferação, e (c) diferenciação em filtros (placas de polietileno de 12 poços com uma porosidade de 1 mM), em co-cultura com os astrócitos. As diferentes etapas do protocolo de produção foram atribuídos aos dias da semana específicos, a fim de aumentar a reprodutibilidade das culturas celulares primárias (Figura 1). Na quarta-feira da primeira semana, portanto, nove dias antes do estabelecimento do sistema de co-cultura, os microvasos foram isolados (Figura 2A). Para purificar as células endoteliais, as culturas foram mantidas na presença de concentrações decrescentes de puromicina, durante 5 dias. A maioria das células contaminantes (principalmente os pericitos) foram eliminados e o crescimento das células endoteliais foi mais lenta, sem modificação do seu fenótipo. Spindle-shaped células crescem para fora dos capilares fragmentos isolados a partir de cérebro de rato matéria cinzenta (Figura 2B). Na segunda-feira da segunda semana, os astrócitos do rato foram plaqueados no fundo de placas de 12 poços. Quarta-feira, RBEC foram adicionados ao compartimento luminal dos filtros. Semeadura alta densidade a 160 x 10 3 células / cm 2 (Figura 2C) ajuda a evitar falhas na periferia do filtro (Figura 2D) e gera uma diferenciação homogénea da monocamada de células endoteliais. As células apresentam a morfologia típica fusiforme alongada, alinhar-se longitudinalmente, e formam uma monocamada uniforme. Quinta-feira, astrócitos meio de cultura foi mudado para o meio de diferenciação condicionado com a mídia co-cultura anterior (Figura 2E). Sexta RBEC em filtros foram cultivadas em meio de cultura contendo 500 nM de hidrocortisona e os filtros foram transferidos para placas de 12 poços contendo os astrócitos. Na terceira semana, os experimentos were realizada entre segunda e quarta-feira.

RBEC Caracterização e identificação dos elementos de monocamada Permeabilidade
O RBEC foram caracterizados por imunocoloração de células endoteliais e marcadores de BBB, bem como por meio de medições de TEER, permeabilidade de LY e funcionalidade de transportadores de efluxo tais como a P-gp.

RBEC obtido pelo método de purificação de puromicina (Figura 1 e 2) cresceram em monocamadas contínuas que não se sobrepõem, que exibiram inibição do crescimento em confluência e exibido firmemente aposto, fusiformes e morfologia em forma de fuso. Culturas RBEC expressa marcadores típicos de células endoteliais: eles apresentaram imunocoloração positiva por molécula de adesão celular endotelial plaquetária (Figura 3A; CD31/PECAM) e expressão do factor de von Willebrand (Figura 3B). Sem tratamento puromicina, RBECs são rapidamente invadido por pericitos detectados por immunos desminataining (Figura 3C). Proteína glial fibrilar ácida (GFAP), expresso pelos astrócitos (Figura 3D) é um importante marcador de diferenciação de astrócitos. Com o número de alta passagem, astrócitos perdem a sua capacidade para induzir a diferenciação das células endoteliais. Por esta razão, as culturas de astrócitos foram padronizadas para o seu tempo da cultura e só sofreu uma passagem.

Cultivar RBEC com meio suplementado com hidrocortisona, seguido por co-cultura com os astrócitos e com o meio condicionado a partir do compartimento inferior de co-culturas anteriores conduziu a uma forte indução de interendoteliais TJs em comparação com RBEC cultivados sozinhos. As células expressaram claudina-5, ZO-1 e occludin proteínas, que foram localizadas na junção célula-célula, como demonstrado por imunofluorescência (Figura 4B-D) e reveladas por análise de Western blot de ZO-1 e occludin proteínas (Figura 4E ). A distribuição morfológica em cell-célula contactos numa configuração tipo cremalheira reflete (a), a estanqueidade da monocamada, (b) a origem cerebral das células endoteliais dos capilares, e (c) é característico de células endoteliais cerebrais altamente diferenciados. Permeabilidade paracelular da camada endotelial foi monitorizada através da medição da TEER e a taxa de influxo de LY (457 Da) a partir da parte superior para o compartimento inferior dos filtros. TEER foi medida usando um ENDOHM-12 para copos de cultura de 12 milímetros ligados a um voltohmmeter EVOM. O TEER de monocamadas endoteliais cerebrais, o que indica a tensão de TJs atingiu 300 ohm · cm 2, em média (filtros de placas de 12 poços, dados não mostrados). A Pe para LY (Pe (LY), usado como um controlo da integridade da barreira e co-incubados com os compostos testados) atingiu uma média de 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min (Figura 4F) ao longo de um período de 1 ano.

A fim de induzir uma inflamação de RBEC foi utilizado o pro-de citocinas inflamatórias TNF-α a 5 ng / ml durante 24 horas, e seguido da resposta inflamatória pela medição CCL2 (MCP-1) por secreção RBEC no compartimento superior do sistema de cultura que duplicou desde 120 ng / ml (não- Controlo tratado) a 250 ng / ml (Figura 5A). Tratamento TNF-α a 5 ng / ml ou 50 ng / ml durante 24 horas, também aberta a certificação como revelado por Pe (LY) de medição (Figura 5B).

P-gp foi visualizada em RBEC diferenciada por imunocitoquímica (Figura 6A). P-gp localização é conhecida por ser altamente polarizada e expresso essencialmente na membrana apical das células endoteliais 44 enquanto o transportador de glutamato-1 (GLT-1) é encontrado principalmente na fracção basolateral 45. Para avaliar o grau de polarização da nossa RBEC cultivadas, proteínas apical e basolateral foram separadas a partir de preparações de membranas de plasma utilizando gradientes de densidade de sacarose 46. A análise Western blot foirealizada para avaliar os níveis de expressão da P-gp e GLT-1 no plasma, apicais e preparações de membrana basal. Microvasos recentemente extraídos a partir de cérebro de rato foram utilizados como controlos positivos mais próximos para a distribuição in vivo destas proteínas (Figura 6B). Em ambos os microvasos e preparações de membrana RBEC diferenciadas, P-gp foi expressa como uma banda de 170 kDa, principalmente localizada na fracção de membrana apical F1 (Figura 6B, C). GLT-1 expressão foi efectivamente expressos na fracção de membrana basal F3 de microvasos como uma banda de 65-70 kDa, mas não foi detectada na RBEC cultivadas.

Em experiências paralelas, a actividade funcional de P-gp na monocamada de células endoteliais foi testada usando rodamina 123 (R123) como um ligando. O abluminal para luminal (B para A) efluxo de R123 era 1,7 vezes maior do que na direcção oposta (Figura 6D). Para provar o envolvimento P-gp, usamos os inibidores da gp-P específicas, verapamil (25 uM, 30 min de pré-incubação) e ciclosporina A (1 uM, 30 min de pré-incubação). Com verapamil e tratamento ciclosporina, a acumulação de R123 em RBEC foi aumentada 1,6 vezes e 2 vezes, respectivamente, em comparação com os controles (Figura 6E).

Receptores envolvidos na Receptor Mediated Transcitose (RMT) Mecanismos
O modelo foi ainda caracterizada para a expressão de diferentes receptores potencialmente envolvidas em mecanismos de transcitose na certificação, tais como o LRP1, LDLR ou TfR (Figura 7A).

Estudos de transporte funcionais foram realizados com os ligandos para o TfR e LDLR. Vive RBEC foram incubadas com transferrina de rato marcado com Cy3 (Tf-Cy3) durante 180 minutos a 37 ° C (Figura 7B, C). Quantificação da incorporação de Tf-Cy3 e transporte no rato no modelo certificação vitro mostraram que a inclinação das curvas diminuiu ligeiramente para além 2,400 picomoless (Figura 7b), sugerindo que a ligação / captação era saturável. Por outro lado, a saturação da ligação / incorporação foi correlacionada com a acumulação de Tf no compartimento inferior. Para confirmar esta observação, Tf-Cy3 foi incubado a 1200 picomoles (ascendente parte da curva) com um excesso de Tf não fluorescente em 4800 picomoles (planalto / saturação) (Figura 7C). Estas experiências mostraram uma diminuição da acumulação de Tf-Cy3 no compartimento inferior e confirmou um mecanismo saturável típico da interacção ligando-receptor no nosso modelo in vitro de certificação.

Da mesma forma, a funcionalidade do LDLR foi demonstrada pela absorção e transporte da sua DiILDL ligando através da monocamada de células endoteliais (Figura 7D, E). Vivo RBEC foram incubadas com DiILDL durante 30 min a 37 ° C. A ligação / absorção não foi correlacionada com o acúmulo de DiILDL no compartimento inferior (Figura 7D). Quantificação de DIILTransporte DL mostrou que o declive das curvas diminuiu para além de 2 ug, o que sugere que o transporte era saturável e relacionados com o receptor no nosso modelo. Azida de sódio foi adicionada a 0,05%, 15 min antes da DiILDL incubação (Figura 7E). A ausência de toxicidade de azida de sódio a 0,05% de incubação foi avaliada por Pe (LY) medição (dados não mostrados). Estas experiências mostraram diminuição da acumulação DiILDL no compartimento inferior. No geral, nossos resultados sugerem RMT para DiILDL em nosso modelo in vitro BBB.

Outros modelos in vitro de BBB baseados em células endoteliais de rato da medula espinhal ou cérebro do rato
A digestão enzimática com uma mistura de colagenase / dispase é um dos principais parâmetros para controlar em termos de viabilidade celular e rendimento de produção de microvasos cerebrais. A concentração de enzima e mais importante a relação entre a quantidade de enzima em relação ao tecido, needs ser calibrado precisamente entre cérebro de rato, rato medula espinhal e do cérebro camundongos. Microvasos densidade de semeadura eo número de células endoteliais para atingir 90% de confluência (9 dias após a semeadura microvasos) estavam ligados e são parâmetros importantes para melhorar o crescimento celular, limitam o número de duplicação da população ea qualidade dos modelos. Rat microvasos da medula espinhal foram produzidas com o mesmo protocolo que o descrito aqui para microvasos de cérebro de rato (em termos de quantidade de tecido, 2 medulas correspondente aproximadamente a 1 cerebral) para se obter a mesma quantidade de células por frasco T75 dentro da mesma escala de tempo . Meninges de 5 semanas de idade C57Bl6 camundongos cérebro foram difíceis de eliminar porque ficar com o córtex. Uma breve tratamento do cérebro com dispase parece facilitar a remoção das meninges. Os parâmetros importantes que contribuem para a produção de monocamadas de células endoteliais reprodutíveis a partir de cérebro de rato, medula espinal e do cérebro do rato são destacadas e resumidos naFigura 8.

Figura 1
Figura 1. Fluxograma que sintetiza as principais etapas da preparação in vitro certificação modelo. As diferentes etapas do protocolo de produção foram atribuídos aos dias da semana específicos, a fim de aumentar a reprodutibilidade das culturas de células endoteliais primárias. O protocolo começa na quarta-feira da primeira semana, com a produção de microvasos a partir de ratos Wistar com 5 semanas de idade.

Figura 2
Figura 2. Microfotografias de contraste de fase de RBEC, astrócitos e o sistema de co-cultura. (A) 5-semanas de idade fragmentos microvasos rato Wistar no momento do plaqueamento.(B) As culturas RBEC Três dias de idade tratados durante 2 dias com o substrato puromicina P-gp em 4 ug / ml. (C) As monocamadas endoteliais confluentes Pure no dia 1 após o plaqueamento em filtros Millipore de uma placa de 12 poço revestido com colagénio de tipo IV e fibronectina. (D) Homogeneidade da monocamada de células na periferia do filtro de inserção. (E) confluente cultura de astrócitos no dia do estabelecimento da co-cultura, mostrando a morfologia do favo de mel caracterizados. (F) Esquema que representa a co-cultura sistema de localização das fotomicrografias em C, D e E.

Figura 3
Figura 3. Caracterização de RBEC culturas por microscopia de imunofluorescência. (A) células endoteliais do cérebro expressar células endoteliais de plaquetasmolécula de adesão PECAM/CD31 na borda da célula, (B), o factor de von Willebrand (VWF) mostra uma coloração relativamente punctata, mais brilhante e mais agregado em algumas células do que os outros, e concentrou-se na zona perinuclear. (C) Sem tratamento puromicina de RBEC culturas, pericitos são detectados com uma imunomarcação positiva para desmina (em verde) e têm características núcleos redonda pequena. (D) Os astrócitos expressam proteína ácida fibrilar glial (GFAP). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. Caracterização imunocitoquímica de rato em modelo de certificação vitro e da permeabilidade paracelular deLY através da monocamada endotelial. A monocamada de células foi imunocorada com (A) vimentina para revelar uma monocamada confluente de células endoteliais do cérebro com a não-sobreposição morfologia e células fusiformes típico com morfologia endotelial e a expressão de proteínas de junção apertadas (B) claudina-5 , (C) ZO-1 e (D) ocludina, também detectado por Western blot para ZO-1 e occludin proteínas (E). (F) de monocamada de aperto no modelo de 12 poços a certificação foi avaliada através da medição do transporte de Lucifer Yellow (LY-CH, sal dilitium), uma pequena molécula hidrofílica (MW 457 Da) conhecido por ser retida pelo BBB. Resumidamente, LY foi incubada no compartimento superior do sistema de cultura em contacto com as células endoteliais cerebrais durante 60 min a 37 ° C. Após este tempo, o meio do compartimento inferior foi recolhida e a fluorescência foi quantificada por análise fluorimétrico com um spectrofluorimeter com excitação a 430 nm e emissão a 535 nm. Os resultados são expressos na permeabilidade ou Pe em 10 -3 cm / min. A barreira é considerada permeável ou aberta quando o Pe de LY é acima 0.6x10 -3 cm / min. Durante cada experiência 1 hr, o volume médio foi apagada graficamente em função do tempo e a inclinação estimada por análise de regressão linear. A inclinação da curva de depuração para filtros de controlo, com revestimento de colagénio do tipo IV, fibronectina foi denotado PSF e a inclinação da curva de depuração para os filtros com as monocamadas de células endoteliais do cérebro foi denotado PST. O valor PS para a monocamada endotelial (PSE) foi calculado a partir de: Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Equação 1

Os valores de PSE foram dividida pela área do PORmembrana ous (1,1 cm 2 para filtros Millipore de placas de 12 poços) e o resultado foi o coeficiente de permeabilidade (Pe), com uma média de 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min. Os resultados são apresentados com uma representação gráfico de dispersão vertical, para n = 90 ensaios (média de n = 3 para n = 6 monocamadas por ensaio).

Figura 5
Figura 5. In vitro certificação modelo de resposta ao tratamento com o TNF-α pró-inflamatória. Os meios de cultura a partir do sistema de cultura foi substituído apenas antes do tratamento TNF-α a 5 ng / ml no compartimento superior de 6 h, 12 h e 24 h. Libertação CCL2 por RBEC foi quantificada no compartimento superior por ensaio de ELISA, em comparação com o controlo não-tratado. Note-se que a MCP-1 aumenta os níveis ligeiramente como uma função de tempo, Mesmo nos poços não tratados. A integridade da barreira de células endoteliais medido por Pe endotelial para LY Pe (LY) revelou um aumento na permeabilidade da monocamada de 24 horas de tratamento com o TNF-α a 5 ng / ml ou 50 ng / ml no intervalo de 0,62 ± 0,02 x 10 - 3 cm / min e 0,7 ± 0,01 x 10 -3 cm / min, respectivamente, em relação ao controle de 0,33 ± 0,03 x 10 -3 cm / min (teste t de Student, p <0,05).

Figura 6
Figura 6. Funcionalidade do transportador de efluxo de P-gp e RBEC polarização. Expressão de o transportador de efluxo de P-gp em células endoteliais cerebrais co-cultivadas com os astrócitos por imunocitoquímica (A) e Western blot (B & C). Proteínas da membrana de células foram extraídas com um fraccionamento da proteína celularkit ção. Membranas de plasma foram obtidas por lise hipotónico e centrifugações diferenciais para eliminar organelas e núcleos. Separação de proteínas de apicais e basolaterais a partir de membranas de plasma foram obtidas por gradiente de densidade de sacarose. P-gp foi principalmente localizada na fracção de apicais (F1), enquanto glutamato transportador-1 (GLT-1) foi principalmente localizada na fracção basolateral (F3). Microvasos purificadas antes do plaqueamento foram utilizadas como controlo para a localização in vivo de tais proteínas. Actividade de P-gp foi determinada através da medição do transporte de polaridade R123, um ligando de P-gp. O fluxo de 1 uM R123 foi medido durante 1 hora a 37 ° C no lúmen para abluminal (A e B) e nas direcções abluminais-a-luminal (B para A) opostas. O mesmo experimento foi realizado sem RBEC para avaliar difusão passiva através do filtro de inserção e os dados foram normalizados em relação a este valor para o Pe (R123) cálculo (veja a Figura 5 (R123) (A para B). Verapamil (25 uM, 30 min de pré-incubação) e ciclosporina A (1 uM, 30 min de pré-incubação) foram usados ​​como inibidores de referência P-gp. Acumulação R123 em RBEC foi medida após 2 horas com ou sem pré-incubação com os inibidores da gp-P (teste t de Student, p <0,05). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7
Figura 7. Caracterização dos receptores envolvidos na Receptor Mediated Transcytosis (RMT). (A) A monocamada RBEC diferenciado foi histoquímica com anticorpos contra a baixa densidade da lipoproteína relacionados receptor 1 (LRP1) e do receptor de lipoproteína de baixa densidade (LDLR). Imagem confocal de RBEC sondado para a absorção de DiILDL, um ligante fluorescente do LDLR e para a absorção de rato transferrina-Cy3, um ligante fluorescente do TfR espetáculo pontuada coloração sobre a superfície da célula, com alguma aglomeração na região perinuclear. (B) Rato Tf-Cy3 foi adicionado ao compartimento superior contendo a monocamada RBEC diferenciada a 75, 150, 300, 600, 1.200, 2.400 e 4.800 picomoles / inserção durante 180 minutos a 37 ° C (200 mL no compartimento superior e 1,200 mL de o compartimento inferior). Após este tempo, Cy3 de fluorescência foi quantificada no ligado de células (200 uL de PBS, 0,1% de Triton X100) e no compartimento inferior através da análise com um espectrof fluorimétrico com excitação a 550 nm e emissão a 570 nm. Unidades de fluorescência foram transformados em picomoles utilizando uma gama de trabalho linear. (C) Para as experiências de saturação, Tf-rato Cy3 foi adicionado ao compartimento superior contendo a monocamada RBEC diferenciada em 1200 picomoles / inserção durante 180 minutos a 37 ° C com ou sem 15 min de pré-incubação com 4.800 picomoles / inserção de Tf não fluorescente. O transporte, no compartimento inferior foi quantificado como em (B) (teste t de Student, p <0.05) (D). DiILDL foi adicionado ao compartimento superior contendo a monocamada RBEC diferenciada em 1, 2, 4 e 8 filtros ug / inserção durante 30 min a 37 ° C (200 ul do compartimento superior e 1200 ul no compartimento inferior). Após este tempo, DII fluorescência foi quantificada no ligado celular (200 ul de PBS, 0,1% de Triton X100) e no compartimento inferior através da análise com um espectrof fluorimétrico com excitação a 554 nm e emissão a 571 nm. Fluorescentecência unidades foram transformadas em ug usando uma gama de trabalho linear. (E) Para o transporte as experiências de bloqueio, a azida de sódio foi adicionada a 0,05% 15 minutos antes da incubação de DiILDL a 2 ug / inserção, durante 30 min a 37 ° C. O transporte, no compartimento inferior foi quantificado como em (D) (teste t de Student, p <0,05). A ausência de toxicidade de azida de sódio incubação a 0,05% foi avaliada por Pe (LY) medida (dados não mostrados). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8
Figura 8. Modelos in vitro de BBB a partir de células endoteliais da medula espinhal de ratos ou de rato cérebro. A mesa altaacende parâmetros importantes para a extração de microvasos de cérebro de rato, rato medula espinhal e do cérebro do rato. Fotomicrografias mostrar imunocoloração para ZO1 e occludin em monocamadas de células endoteliais preparados a partir de cérebro de rato, rato medula espinhal e do cérebro do rato.

Discussion

Nós descrevemos a implementação de um protocolo reprodutível semanal para o isolamento e revestimento de microvasos cerebrais, após purificação e cultura de RBEC e mais criação de co-culturas com astrócitos primários de rato para gerar um modelo in vitro BBB com propriedades características de BBB.

Estabelecer com sucesso padronizados em culturas in vitro de BBB exige condições ideais nas várias etapas seqüenciais do processo. O modelo foi (a) optimizada para obter a permeabilidade paracelular menor, o que continua a ser o "Santo Graal" de modelos in vitro de BBB, e (b) validado por efluxo e mecanismos RMT.

Produção, purificação e Proliferação de RBEC

O maior desafio quando o cultivo RBEC é conseguir a reprodutibilidade entre diferentes culturas. Padronização do protocolo exige ferramentas de alta qualidade para disseção, reagentes de alta qualidade e respeito das datas de validade de reagentes. O experimentador deve ser hábil em micro-dissecção sob microscópio estereoscópico para a remoção rápida de meninges e grandes vasos da superfície do córtex. Uma vez que os cérebros são isolados e mecanicamente dissociados, um dos principais desafios é a digestão enzimática óptima dos microvasos do cérebro isoladas de fresco. O tipo e qualidade das enzimas utilizadas é crítica. Foi utilizada uma mistura de tipo colagenases I e II e dispase em alta concentração, com baixa variabilidade entre lotes. Também importante é a duração da digestão enzimática e da razão entre o peso de concentração de enzima / tecido / volume de digestão. O melhor rendimento de produção microvascular cerebral foi obtido com o equivalente de córtex cerebral de 1 em 1 ml de colagenase / dispase misturar a 60 ug / ml durante as duas digestões, respectivamente, 30 minutos e 1 hora.

Também importante é a eliminação de contaminação de célulass (astrócitos e principalmente pericitos). Essas células proliferam a taxa mais elevada do que as células endoteliais e não estabelecem junções apertadas com o último, impedindo, assim, o estabelecimento de uma monocamada de células homogêneas com boa restritividade paracelular. Considerando-se que as células endoteliais do cérebro expressaram níveis muito mais elevados de bombas de efluxo, especialmente P-gp, em comparação com os outros tipos de células encontradas no microvasos, que tolera melhor as concentrações de outro modo tóxicos de drogas do ligando de P-gp, enquanto que as células endoteliais não são eliminados. Tratamento puromicina a 4 ug / ml para os dois primeiros dias foi seguido de mais dois dias de 2 ug / ml para se obter uma boa pureza de células endoteliais. Esta seleção também pode favorecer células endoteliais capilares contra os de vênulas, arteríolas pré-capilares ou microvasos maiores, e levar a monocamadas mais apertados. Além disso, a utilização de soro bovino derivada de plasma pobre é um imperativo para obter culturas puras de células endoteliais 47,48. A-der plasmasoro IVED carece de factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), o qual é mitogénica para fibroblastos, para as células musculares lisas e, por conseguinte, pericitos.

Observou-se que o tratamento de plástico e filtros com uma mistura de colagénio do tipo IV a partir de ratos e de fibronectina humana resulta uma vantagem significativa, com um aumento de 2 vezes do rendimento de proliferação em comparação com o colagénio do tipo I, a partir tradicionalmente recomendada da cauda de rato. Sinais importantes para a proliferação celular são fornecidos pela matriz extracelular, tais como a integrina e o factor de crescimento (bFGF) de activação 49. Concentração do tampão e pH dos meios de cultura têm sido descritos para impactar positivamente em paracelular aperto 50 e observou-se uma melhor reprodutibilidade entre as culturas, com a adição de tampão HEPES a 5 mM.

Diferenciação de RBEC: Co-cultura Estabelecimento em Inserir Filtros

Uma vez que as células endoteliais do cérebro têm been purificado e proliferaram durante 6 dias, podem ser semeadas em filtros. Plaqueamento de células a uma densidade elevada é importante para se obter uma monocamada perfeito. A densidade de sementeira de 160x10 3 células por 12 filtros de placas assim era necessária e suficiente para se obter uma monocamada confluente de 24 horas após a sementeira. No entanto, o isolamento de células endoteliais de capilares cerebrais primários a partir de seu ambiente é um paradoxo na construção de um modelo de certificação in vitro, pois sabe-se que as células primárias e as células endoteliais capilares do cérebro, nomeadamente, são fortemente regulados pelo ambiente e fatores indutores produzidos pela os diferentes tipos de células vizinhas. Células endoteliais capilares do cérebro cultivadas sozinho rapidamente de-diferenciar e perder alguns marcadores endoteliais cerebrais específicas. Assim, as células endoteliais primárias devem ser usadas em baixa passagem (P1) e re-ligado, pelo menos em parte, com o ambiente através de co-cultura com os astrócitos ou meio condicionado por astrócitos 47,51. Isto éverdadeiro para a diferenciação de astrócitos como as células endoteliais e astrócitos do cérebro estão envolvidas na indução de duas vias. Cultivar RBEC com astrócitos levou a uma forte indução do TJ interendoteliais 52,23. Os mecanismos moleculares de re-indução são ainda desconhecidas, ea pesquisa está em curso em vários laboratórios para identificar os fatores de modulação específicas secretadas pelos astrócitos, o que poderia promover a diferenciação de células endoteliais ideal 53,54. Factores segregados pelas células endoteliais do cérebro, como o factor de inibição de leucemia (LIF) foram mostrados para induzir a diferenciação de astrócitos 55,56. Antes de estabelecimento de co-cultura, os astrócitos foram expostas a meio de diferenciação contendo o glicocorticóide hidrocortisona agonista do receptor, e a co-cultura em meio condicionado. A hidrocortisona é conhecido para melhorar a estanqueidade de células endoteliais cerebrais e é utilizado em modelos de BBB especialmente de rato 57 e do rato 58,59 células endoteliais. A medi condicionadohum é coletado do compartimento inferior da célula / astrócitos sistema de co-cultura endotelial após 3 dias e congelado para uso posterior. O uso de meio de co-cultura condicionado reduziu o tempo de diferenciação de células endoteliais de 3 dias, com a permeabilidade paracelular óptima durante mais 2 dias e também melhorou a reprodutibilidade entre as culturas.

Em geral, o protocolo que descreva produz um TEER reprodutível mais de 300 ohm · cm 2 e um coeficiente de permeabilidade paracelular média Pe (LY) de 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min, semelhante ao dos melhores modelos baseados em células primárias de BBB 22, 12. O protocolo que descrevemos na presente manuscrito com a modulação proposta de digestão enzimática de microvasos pode ser estendido para as células endoteliais a partir da medula espinal de rato e a partir de 60 ratos cérebro.

Caracterização Molecular e Funcional

Aléma indução TJ, astrócitos também contribuir para a expressão de transportadores de efluxo tais como a P-gp em células endoteliais do cérebro 61. Nós, de facto mostrar a expressão do transportador de efluxo de P-gp na modelo certificação e que demonstram a polaridade da bomba de efluxo de P-gp localização utilizando abordagens bioquímicas e de actividade de P-gp, utilizando um ensaio funcional. GLT-1 expressão foi detectada na fracção de membrana basal de microvasos, mas não foi detectada em RBEC cultivadas. Nossa hipótese é que GLT-1 foi regulada para baixo em nossa cultura RBEC em comparação com as condições in vivo e, conseqüentemente, não detectável por western blot. O excesso de glutamato é neurotóxica e in vivo, da GLT-1 é responsável por glutamato efluxo do compartimento basal (parênquima) para o compartimento apical (a circulação sanguínea). Em culturas de astrócitos, GLT-1 expressão permanece muito baixo e é induzido pela adição de glutamato no meio de 62,63.

Também confIRM a expressão de transportadores de influxo na membrana apical tal como LRP1, LDLR e TfR. Funcionalidade de TfR e LDLR foi demonstrado com a ligação e transporte experimentos de Tf-Cy3 e DiLDL do luminal para o lado abluminal da monocamada como previamente mostrado com um bovino em modelo BBB vitro 64. Curiosamente, tem sido demonstrado que a exigência de lípidos de astrócitos aumenta a expressão de LDLR em células endoteliais dos capilares do cérebro 65,66 confirmar ainda mais a diafonia entre fisiológico astrócitos e as células endoteliais do cérebro, incluindo in vitro. Escolhemos para exemplificar o transporte com as tinturas fluorescentes tais como Cy3 e DII considerando que a análise de fluorescência está disponível na maioria dos laboratórios, e pode ser útil para validar em modelos in vitro de BBB. Contudo, a quantificação da fluorescência é muito menos sensível do que a radioactividade e requer um aumento do número de experiências para obter dados importantes.Idealmente, Tf e LDL são geralmente radioativo (iodo 125) para tais experimentos obrigatório / absorção e transporte.

Também mostramos que a monocamada de células endoteliais diferenciadas obtidas com o protocolo proposto responde à inflamação induzida por TNF-α, como revelado pela libertação CCL2 abertura e certificação. CCL2 (MCP-1) e o seu receptor CCR2 estão envolvidos em patologias do SNC tais como esclerose múltipla, encefalomielite auto-imune experimental (EAE), 67, 68 trauma do SNC e são conhecidos como mediadores da migração de leucócitos para o sistema nervoso central sob condições neuroinflamatórias 69,70. Com o protocolo testado, não se pode concluir em uma secreção polarizada de CCL2 porque abertura certificação permite que a concentração CCL2 equilibrar entre os dois (basal) compartimentos superiores (apical) e inferiores. Consequentemente, nós subestimar claramente a quantidade de CCL2 produzido pela RBEC no compartimento apical de 24 hr (Figura 5A).

Visão Geral e Limitações do BBB modelos in vitro: Eu n Vivo contra In Vitro e Rodent contra Comparações Humanos

Muitas drogas promissoras do SNC que se mostrou eficaz no BBB passagem in vitro falhou em ensaios clínicos, devido à falta de previsibilidade de em modelos in vitro de BBB muitas vezes baseadas em células isoladas de outras espécies que não humano. Ao melhor de nosso conhecimento, os modelos in vitro de BBB são provavelmente mais preditivo quando se trata de estudar os aspectos mecanicistas de redes de proteínas, transdução de sinal, transportadores e receptores. Cada mecanismo, caminho ou alvo a ser estudada in vitro deve ser caracterizada pela sua regulação por estímulos ambientais complementares (outros tipos de células, produtos químicos, proteínas) e combinados para estudos in situ com as mesmas espécies animaisE, quando possível, com microvasos e células endoteliais isoladas de seres humanos, com as restrições e cautela evocado abaixo.

In vitro modelos de BBB tem que ser vistos como sistemas autônomos, isolados de regulação do corpo, mas ainda dotado de grandes in vivo propriedades e um potencial para a regulação por estímulos ambientais. N "ideal" modelo in vitro de certificação tem sido proposto ainda 71,72,73 porque as monocamadas de células endoteliais não têm um número de componentes importantes da unidade vascular neuro-glia (NGVU) e são isolados a partir de sangue e de regulação do corpo. A falta de pericitos 74,16 ou 17,18 neurónios ou os diferentes constituintes da matriz extracelular utilizados para o revestimento de plástico ou o meio de cultura e soro utilizado para o crescimento das células em mais comum e mais fácil "efectuadas" in vitro modelos de BBB baseado em endotelial células diferenciadas com astrócitos pode modular a expressão da proteína in comparação com a situação in vivo 75. Estes modelos podem expressar muitos transportadores exibidas in vivo, mas não todos. Em alguns casos, os parâmetros de transporte foram verificadas pela primeira vez em microvasos isolados (mais próximas da situação in vivo em), e, em seguida, estudado em sistemas de cultura de células 76,61.

Investigação em biologia molecular permitiu a caracterização da expressão do gene e proteína em microvasos isolados e passagem endoteliais culturas baixas de células da mesma espécie e entre espécies diferentes, na maioria das vezes a partir de pequenos animais, como roedores (ratos e ratos) ou de vaca e porco em comparação com os seres humanos 77,78,75,15. Comparação entre transcriptomic in vivo e em células endoteliais microvasculares cerebrais in vitro mostraram numerosos transcritos de genes que foram diferencialmente expressos e mais frequentemente significativamente regulada negativamente in vitro. Transcrições que codificam transportadores de influxo como TfR e proteins implicados no tráfico de vesículas são principalmente downregulated em células endoteliais cultivadas cérebro, sugerindo uma diminuição geral na endocitose e transporte vesicular em tais células. Manipulação Cultura em termos de pureza (tratamento puromycin) e tratamento com hidrocortisona pode ajudar a restaurar a "in vivo-como" perfil mais a expressão do gene 77. Estudos transcriptomic também revelou diferenças importantes entre as espécies que complicam ainda mais previsões sobre a absorção da droga em humanos com base em roedores em modelos in vitro de BBB 75. Modelos in vitro de BBB que envolvem co-cultura de células endoteliais humanas e astrócitos foram descritas 15. Embora relevante, estes modelos são mais difíceis de implementar em uma base regular como eles exigem acesso regulado ao tecido humano post-mortem e há heterogeneidade na qualidade / propriedades das células endoteliais do cérebro humano, dependendo da idade, doenças, e possivelmente médica tratamentt de doadores. Os esforços têm de ser feitos para desenvolver novos sistemas in vitro que reproduzem melhor a fisiológicas, anatómicas e as características funcionais do in vivo a certificação. Co-culturas envolvendo três tipos de células são altamente restritiva e parecem difíceis de implementar de forma rotineira. Até à data, os modelos in vitro de BBB mais complexos são os modelos in vitro (DIV dinâmicas-BBB), que incluem organização navio semelhante com astrócitos e incluem um fluxo de meio que simula o fluxo sanguíneo 75,79,80,81,82, 83,84,85. Quando as células endoteliais cerebrais são expostos a um fluxo, a tensão de cisalhamento gerada mechanotransducers activa na superfície da célula, que modulam a expressão dos diferentes genes envolvidos na fisiologia da célula endotelial tais como a divisão celular, diferenciação, migração e apoptose 80. In vivo, a tensão de cisalhamento gerado pelo fluxo de sangue é responsável pela paragem da mitose com o contato de células, o que permite o estabelecimento de ummonocamada de células endoteliais nos vasos sanguíneos 80. Análise genômica e proteômica de células normais microvascular cérebro humano endoteliais mostraram o impacto da tensão de cisalhamento em BBB fisiologia endotelial 84. A tensão de cisalhamento é responsável para a sobrevivência da célula, um maior grau de adesão de células endoteliais, indução da bomba de efluxo e melhor polarização dos transportadores 75, a regulação do metabolismo da glicose 75,86, oxidação mediada por enzimas CYP450 75 e a regulação da permeabilidade paracelular através do aumento da expressão de genes que codificam para os elementos de junção intercelular, como ocludina e ZO-1 e, consequentemente, 87,75,80 alta TEER cerca de 1500 - 2000 ohm · cm 2, a mais próxima conhecida in vivo parâmetros 79,80

Na indústria de biotecnologia e farmacêutica, a triagem de rotina de drogas ou até mesmo alto throughput screening (HTS) e os esforços para reduzir a experimentação animal, levoupara o desenvolvimento de linhas de células diferentes a serem utilizadas em substituição da cultura primária de células endoteliais cerebrais, que permanecem mais difícil de definir-se de forma rotineira. Na maioria dos casos, as culturas primárias de células endoteliais cerebrais foram transduzidas com um gene de imortalização (SV40 ou vírus do polioma grande antigénio T ou E1A do adenovírus), ou por transfecção de DNA de plasmídeo ou por uma infecção utilizando vectores retrovirais 88,89,75. Várias linhas de células endoteliais de origem cerebral foram desenvolvidos, tais como o RBE4, GP8/3.9, GPNT, RBEC1, TR-BBBs rBCEC4 ou linhas de células de rato 88,75, a linha de células de rato b.End3 90,75, o PBMEC/C1 - 2 porcino linha celular de 87,75, e a linha celular humana hCMEC/D3 89,75. Outros modelos baseiam-se em células de origem não-cerebral, tais como o rim canino Madin-Darby (MDCK) ou linhas de células Caco2 12,75. Entre as diferentes linhas de células endoteliais cerebrais humanos, o hCMEC/D3 tem sido amplamente citard e melhorada como um modelo de certificação desde a sua criação, em 2005, 91,92. Como culturas primárias, as linhas de células possuem vantagens e limitações. Eles são mais fáceis de lidar do que culturas primárias, têm um tempo de vida prolongado, estão bem caracterizados e de permitir a reprodutibilidade entre experimentos de grande escala. No entanto, as linhas celulares podem perder as funções específicas do tecido, perder regulação ambiental e adquirir um fenótipo molecular bastante diferente de células in vivo 75, 89. Em particular, monocamadas gerados a partir de linhas de células presente aperto reduzido, baixa Teer e variação Perfil do show de transportador 75,89. Assim, experimentos com animais e estudos em células primárias são muitas vezes preferido, apesar de sua complexidade.

Acknowledgments

O apoio financeiro para VECT-HORUS é reconhecido a partir do Fonds Único Interministerial (projeto FUI / MEDUL) e VECT-HORUS eo laboratório UMR7259 da Agence Nationale de la Recherche (ANR, TIMPAD, VECtoBrain, VEC2Brain, ADHOC e PREVENTAD projetos colaborativos) . O laboratório UMR7259 reconhece também o apoio financeiro do CNRS e de Aix-Marseille Université.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BSA fraction V low endotoxin PAA K45-011-500g 4 °C 
Penicillin-streptomycin Invitrogen 15140-122 -20 °C
0.05% Trypsin-EDTA (1X) Invitrogen 25300-054 -20 °C
DMEM high glucose Invitrogen 61965-026 4 °C 
Fetal bovine serum Invitrogen 10270-098 -20 °C / 1 year
T75 flasks Becton Dickinson Falcon 353135
HEPES buffer (1 M) Invitrogen 15630-056 4 °C / 1 year
Collagen type IV mouse (10 x 1 mg) Becton Dickinson 356233 -20 °C / 1 month
Fibronectin humain plasma (5 mg) Becton Dickinson 356008 -20 °C / 1 month
Vannas spring scissors, straight (9 cm) Fine Science Tools 91500-09
Scissors, straight (9 cm) Fine Science Tools 14568-09
Forceps Dumont #5/45 (11 cm) Fine Science Tools 11251-35
Graefe Forceps, tip width 0.8 mm Fine Science Tools 11050-10
Graefe Forceps, curve tip width 0.8 mm Fine Science Tools 11051-10
Collagenases / dispase mix (2 x 5 mg) Roche Diagnostics 05 401 054 001 -20 °C / 3 months
DNase I (100 mg / 569 KU / mg) Sigma Aldrich DN25-100 mg -20 °C / 1 year
Gentamicin (10 mg/ml) Invitrogen 15710-049 4 °C / 1 year
DMEM/F12 Invitrogen 31331-028 4 °C 
Bovine serum from platelet poor plasma (500 ml) Clinisciences BT-214-100 -20 °C / 1 year
bFGF (10 µg) Invitrogen 13256-029 -20 °C / 6 months
Heparine Na salt from porcine mucosa Grade I Sigma Aldrich H3149-100KU 4 °C / 1 year
Puromycin Sigma Aldrich P8833-10 mg -20 °C / 6 months
ITSX Invitrogen 51500-056 4 °C / 1 year
Polyethylene hanging cell insert for 12-well plates Millipore PIRP15R48 Porosity: 1 µm
Surface: 1.1 cm2
Hydrocortisone Sigma Aldrich H0888-1 g -20 °C / 1 year
Mouse anti-CD31 / PECAM  Chemicon MAB1393, clone TLD-3A12 (1 mg/mL) 1/200 - fixation PFA 4%
Rabbit anti-Von Willebrand Chemicon AB7356 1/200 - fixation PFA 4%
Mouse anti-Desmine Chemicon MAB3430 1/200 - fixation PFA 4%
Mouse anti-Vimentine Invitrogen, Zymed 08-0052 clone V9, (58 µg/ml)  1/50 - fixation PFA 4%
Mouse anti-Claudin-5 Invitrogen, Zymed 35-2500, (500 µg/ml) 1/200 - fixation PFA 4%
Rabbit anti-ZO-1 Invitrogen, Zymed 61-7300 (250 µg/ml) 1/200 - fixation PFA 4%
Rabbit anti-Occludine  Invitrogen, Zymed 71-1500 (250 µg/ml) 1/200 - fixation PFA 4%
Alexa Fluor 488, 594 conjugated secondary antibodies Invitrogen 1/800
Lucifer Yellow CH, dilithium salt Sigma Aldrich L0259 -20 °C
TNF-alpha human PeproTech 300-01A -20 °C
Rat MCP-1 ELISA Kit PeproTech 900-K59 4 °C / -20 °C
Mouse anti-P-glycoprotein Covance, Eurogentec SIG-38710-1000, clone C219 (1mg/mL) 1/400 - fixation PFA 4%
1/200 (western blot)
Rabbit anti-GLT-1 Abcam ab41621 1/1,000 (western blot)
Rhodamine 123 Sigma Aldrich 83702 4 °C
Verapamil hydrochloride Sigma Aldrich V4629 4 °C
Cyclosporine A Sigma Aldrich 30024 4 °C
Monoclonal anti-a2 Macroglobulin Receptor (CD91, LRP1) against b-chain of amino acid 4291-4344 within an EGF repeat American Diagnostica 3501 (100 µg/ml) 1/5 - fixation PFA 4%
Mouse anti-LDLR R&D systems AF2255 (200 µg/ml) 1/50 - fixation PFA 4%
Rat transferrin-Cy3 Gentaur JOR160050 4 °C
DiILDL Invitrogen L-3482 4 °C

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References

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