Активация и Измерение NLRP3 Inflammasome деятельности Использование IL-1β в человека моноцитов дендритные клетки

1Department of Pathology, New York University School of Medicine, 2Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Mount Sinai Medical Center, 3Division of Hematology and Oncology, Hess Center for Science and Medicine, Mount Sinai Medical Center
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Дендритные клетки (ДК) секретируют IL-1β в ответ на распознавание TLR8 синтетического пурин, R848, с последующей активацией inflammasome NLRP3 с нигерицина, следовательно, IL-1β может быть использован для измерения активности inflammasome NLRP3. Внутриклеточного цитокина окрашивание, иммуноблотинга и ИФА используются для точного измерения NLRP3 inflammasome грунтования и активация через выражение ИЛ-1β.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Fernandez, M. V., Miller, E. A., Bhardwaj, N. Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1β in Human Monocyte-derived Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (87), e51284, doi:10.3791/51284 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Воспалительные процессы, возникающие в результате секреции интерлейкина (IL) -1 семьи цитокины иммунными клетками привести к локальной или системного воспаления, ремоделирования ткани и ремонта, а также контроля вирусологического 1, 2. Интерлейкина-1β является важным элементом врожденного иммунного ответа и способствует устранению вторжение болезнетворных микроорганизмов, предотвращая создание хронической инфекции 1-5.

Inflammasomes являются ключом сигнализации платформа для активации интерлейкина 1 превращающего фермента (ICE или каспазы-1). Nlrp3 inflammasome требуется не менее двух сигналов в ДК, чтобы вызвать Ил-1β секрецию 6. Экспрессия белка Pro-IL-1β ограничен в покоящихся клеток; поэтому сигнал грунтовки требуется для IL-1β транскрипции и экспрессии белка. Второй сигнал считывается результатов NLRP3 в формировании нескольких белков NLRP3 inflammasome. Способность дендритных клеток в респонденD на сигналы, необходимые для секреции IL-1β может быть проверена с использованием синтетического пурин, R848, который воспринимается TLR8 в человеческой моноцитов дендритных клеток (moDCs) в первичных клетках, а затем активацией inflammasome NLRP3 с бактериальным токсином и ионофор калия, нигерицин.

Моноцитов, полученные ДК легко получены в культуре и обеспечивают значительно больше клеток, чем очищенных человеческих миелоидных ДК. Метод, представленный здесь отличается от других анализов inflammasome в том, что он использует в пробирке человека, а мыши, полученной, таким образом позволяя ДК для изучения inflammasome в человеческой болезни и инфекции.

Introduction

Активация иммунной системы требуется, чтобы направить адаптивного иммунного ответа во время инфекции, болезней и вакцинации 7. Дендритные клетки являются наиболее мощным антиген представляющих клеток врожденной иммунной системы; они специализируются на поглощение антигенов, миграции в лимфатические узлы, и активации наивного CD4 + и цитолитический CD8 + Т-клеток 8-10. Чтобы включить быстрое обнаружение патогена врожденной иммунной системы использует многочисленные зародышевые кодируется рецепторы распознавания образов (ПРР), которые признают консервативный патогенных полученные мотивы или хост получены маркеры стресса и повреждения клеток. Toll подобные рецепторы (TLR,) являются мембранные связаны рецепторы распознавания образов, которые признают определенную внеклеточный фагоцитируются патоген, связанные молекулярные паттерны (PAMPs) и опасность, связанная молекулярные паттерны (DAMPS). В отличие от кивком, как рецепторов (NLRS) являются цитозольный и отвечать разнообразных PAMPs и DAMPS. Nod подобные рецепторы повторнопредставить вторую линию обороны против патогенов, которые уклоняются поверхность клеток и эндоцитотических PRRS. Взаимодействие возбудителя, полученных или «опасности» ассоциируется, факторы с TLR и РНБ лигандов приводит к состоянию постоянного созревания в результате усиления взаимодействия постоянного тока с другими иммунными клетками и продвижения Т-клеток и активации естественных клеток-киллеров 11.

Интерлейкина-1β является одним из важнейших компонентов в защите организма против инфекции. После признания микроорганизма, высоко провоспалительных цитокинов IL-1β, секретируется и функционирует как химио аттрактанта и активатора врожденной и адаптивной иммунных клеток. В естественных условиях ИЛ-1β в значительной степени ответственна за ответ острой фазы в том числе лихорадки и цитокина Синтез 12.

Большинство NLRS содержать C терминал лейцин богатый домен повтора, как полагают, функционируют в лиганда зондирования, центральной нуклеотидной связывающего домена (Nacht), который ИМПОrtant для NLRP3 олигомеризации, и N концевого домена эффекторной (PYD в NLRP3), который опосредует передачу сигнала в нижестоящих мишеней через белковые белковых взаимодействий. Белок Nlrp3 определяет наиболее интенсивно изучал inflammasome комплекс. Этот белок является членом семьи NLR и имеет возможность сформировать мульти молекулярного комплекса белка, состоящего из NLRP3, в PYCARD адаптер белка (также известный как ASC) и ICE. По inflammasome активации PYCARD связывается с Nlrp3 N терминальных доменов и нанимает ICE посредством активации каспазы и области найма (CARD) областей. Интерлейкин-1-превращающего фермента первоначально генерируется как зимогена, содержащей карту мотив на его N-конце. Inflammasome результаты формирования в результате чего две молекулы ICE достаточно близко, чтобы побудить их автокаталитическую активации. Inflammasome комплекс необходим для активации ICE что позволяет ему конвертировать цитоплазматический про-IL-1β, чтобы созреть цитокин.

Успешное выделение IL-1β в РС требуется зондирование двух разных и независимых сигналов опасности. Во-первых, TLR зондирование PAMPs, DAMPS или сигнализации цитокинов (ФНО или IL-1β) вызывает позитивную регуляцию цитоплазматической экспрессии про-IL-1β белка. Второй, часто отличаются, сигнал необходим для inflammasome комплексообразования вверх по течению от ICE созревания. Несколько inflammasome стимулирования сигналы включают образующие токсины бактерий мембрана пор (например, нигерицина), лизосомальные нарушения кристаллы (например, мононатрия уратов кристаллов, МГУ), и внеклеточный АТФ. Вверх по течению механизм, приводящий к NLRP3 inflammasome активацию этих разнообразных возбудителей непонятно. Исследования следственные сигнализации вверх по течению inflammasome образования предлагает, чтобы внутриклеточные события, такие как индукции гипокалиемии или активных форм кислорода (АФК) косвенно активировать inflammasome 13-28.

Среди различных вирусных возбудителей в inflammasome NLRP3 является гриппа, который обеспечивает бВ противном первичный и вторичный сигнал, необходимый для Ил-1β секреции 3, 29-33. Использование модели мыши с нокаутом NLRP3 было обнаружено, что IL-1β в ДК секреции является NLRP3 зависит 32. Кроме того, мышей нокаутом NLRP3 привлекает меньше лейкоцитов в очаге инфекции и наблюдается повышение смертности 2, 5. Два недавних работах предложить механизм для активации inflammasome NLRP3 во время гриппа вирусной инфекции; Сначала грунт через признание вирусной РНК с помощью TLR7 или TLR8 (в зависимости от экспрессии TLR отвечающего клетки), либо через зондирования синантропных бактерий другими TLRs индуцировать цитоплазматическую про-IL-1β экспрессию, с последующим вторым сигналом активации, NLRP3 inflammasome образование по вирусного белка ионного канала М2 на транс Гольджи сети 33, 34. В последнем шаге, срабатывание inflammasome NLRP3 осуществляется нарушения внутриклеточного ионного <EM> среда приводит к продукции АФК, который является, просто, воспринимается NLPR3 как сигнал, чтобы сформировать inflammasome. Тем не менее, точный механизм inflammasome активации верховьях ICE деятельности в течение гриппа инфекции все еще остается неясным.

Эта работа описывает технику ценную для изучения NLRP3 inflammasome в человеческих moDCs который может быть использован в качестве основы для дальнейшего изучения пути, лежащей в основе DC основе секреции ИЛ-1β в ответ на TLR8 перевязки с R848 с последующим активации inflammasome по хорошо Известно, активатор NLRP3, нигерицин. Вариации этого метода могут быть использованы с другими типами клеток, включая, но не ограничиваясь ими: моноциты, макрофаги, других подмножеств постоянного тока и эпителиальных клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Заявление по этике: образцы исследований получены и сохранены для исследования с согласия донора. Все образцы должны быть закодированы или анонимными перед использованием. Этот протокол следует руководству нашей Institutional Review Board.

1. Дифференциация периферической крови человека моноцитов в моноцитов дендритных клеток.

Примечание: человека Баффи пальто служат источником человеческих клеток периферической крови (РВМС) и были получены из Центра крови Нью-Йорк (Нью-Йорк, Нью-Йорк). Доноры крови выступают здоровые добровольцы. Процедура 5 день начинается с обшивкой человеческих мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) на культуре ткани колбы 35,36. Известные отличия от опубликованных протоколов являются:

  1. Используйте 225 см 2, не пирогенные полистирола флаконах для культуры ткани с крышки фильтра придерживаться в общей сложности 2x10 8 МНПК на колбу вместо 10 см полистирола планшета для культуры тканис (58 см 2) (этап 1).
  2. Подготовка среды с 5% объединенной человеческой сыворотки (PHS; 30 мл) в 500 мл RPMI-1640 + L-глутамина, 5 мл 1 М HEPES буфера и 1,4 мл 50 мг / мл гентамицина (5% PHS носитель) с последующим фильтрованием через 20 мкМ фильтр. Добавить в общей сложности 50 мл 5% PHS СМИ на 225 см 2 культуре ткани колбу.
  3. Промыть прикрепленных клеток в три раза с 25 мл свежего RPMI-1640. Встряхивать в течение 5 сек во время каждого мытья и аспирации, не являющиеся прилипшие клетки (этап 4).
  4. Добавить 190 мкл 400 МЕ / мкл IL-4 и 380 мкл 100 МЕ / мкл GM-CSF в колбе (шаг 3) в день 0, 2 и 4. Day 0 определяется как день МНПК первоначально покрытием в шаге 1 (стадия 8).
  5. Урожай день 5 moDCs в концентрации 1x10 6 клеток / мл (шаг 15).
  6. Немедленно Используйте moDCs в их состоянии покоя. Шаги 17-22 никогда не выполняется. Примечание: Образцы должны быть обработаны как можно скорее после сбора для достижения наилучших результатов.
  7. Алиготе moDCs на концентрации 2x10 5 клеток / лунка (200 мкл / лунку в 1x10 6 клеток / мл) в 96-луночный с круглым дном пластина (вестерн-блот, ELISA, FACS) или на поли-L-лизин обрабатывали chamberslide (микроскопия) для экспериментов . Примечание: Есть по крайней мере 4 условия: Полностью нестимулированных (отрицательный контроль), грунтовка только, только активацию и грунтовки с последующим активации. Условия могут быть расширена за счет включения элементов управления разбавителя для R848 и нигерицин если это необходимо. Если вниз анализ является ICS, дубликаты необходимы для управления изотипных.

. 2 Грунтовка Inflammasome - Сигнал 1

  1. Развести лиофилизированный R848 в ДМСО в соответствии с инструкциями изготовителя. Развести рабочий запас при комнатной температуре с RPMI-1640.
  2. Добавить R848 при 10 мкМ конечной концентрации в соответствующие лунки в течение 18 часов. Место 5% СО 2. Клеток в инкубаторе при температуре 37 ° С и

3 Активация NLRP3 Inflammasome -. Сигнала2

  1. Развести лиофилизированный нигерицин в этаноле в соответствии с инструкциями изготовителя. Развести рабочий шток при комнатной температуре с RPMI-1640 перед добавлением в соответствующих условиях.
  2. Добавить нигерицин при 20 мкМ конечной концентрации и возвращают в инкубатор при 37 ° С и 5% СО 2 в течение 6 часов. Нет стиральные шаги не происходят между грунтовки и во время активации. Примечание: Секреция IL-1β увеличивается в присутствии ионофоров кальция, брефельдин A, монензина, динитрофенол или карбонил цианида хлорфенилгидразона 37, 38. Таким образом, добавление этих секреторных ингибиторов не рекомендуется при анализе inflammasome грунтовки или деятельности, так как это приведет к изменению секреции IL-1β.

4. Ил-1ß сбора проб

  1. Центрифуга тарелку с клетками и супернатантами в 974 мкг в течение 3 мин.
  2. Не нарушая осадок клеток, аспирации супернатант и трансфер в качествеeparate круглым дном тарелку, чтобы измерить секрецию цитокинов из супернатантов. Примечание: Супернатанты может быть временно хранить при -20 ° С или -80 ° С для длительного хранения.
  3. Промыть клеточном Шарики, три раза 200 мкл 1х PBS при 974 х г в течение 3 мин, чтобы удалить любой внеклеточный IL-1β из клеточных образцов. Примечание: При мытье ячейки гранул из 96-луночный планшет, удалите мытье стремительным инверсии пластины в коллекции бен таким образом, чтобы не беспокоить образца.

5. Измерение IL-1SS из ячеистого и супернатант образцов

  1. Внутриклеточного окрашивание цитокинов (ICS): Протокол ICS описан ниже 39, 40. Примечание: не приостановить клетки, если ниже по течению анализ является микроскопия. Все моет и стремления должно быть сделано, не нарушая слой клеток / гранулу (в зависимости от нисходящего анализа).
    1. Добавить 100 мкл 5% PHS СМИ в соответствующие лунки. ДобавлятьСоответствующий объем (примерно 1 μl/2x10 5 клеток, или 1 мкл / лунку) из флуоресцентно меченных α-CD11c и CD14 α-(фенотип маркеры; клон B-ly6 и MφP9, соответственно) или контроль изотипа к клеткам в течение 10 мин при RT в темноте.
    2. Промыть три раза 1x PBS при 974 х г в течение 3 мин.
    3. Fix клетки путем добавления 100 мкл 4% PFA в течение 20 мин при комнатной температуре в темноте.
    4. Пауза точку: Промыть 100 мкл 1x PBS при 974 мкг в течение 3 мин, и хранят при температуре 4 ° CO / N в 1x PBS.
    5. Добавьте 100 мкл буфера пермеабилизации к клеткам в течение 30 мин. Примечание: пермеабилизации буфер состоит из 1x PBS с 0,3% Triton X-100, и 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в течение проницаемости. Не беспокоить прилипшие клетки, когда вниз по течению анализ является микроскопия.
    6. Добавить соответствующий объем (около 62 нг antibody/2x10 5 клеток, приблизительно или 2,5 мкл / лунку) из α-IL-1β-FITC (клон 8516) или контроль изотипа для2 час в инкубаторе при 37 ° С
    7. Промывают клетки три раза 200 мкл буфера при пермеабилизации 974 мкг в течение 3 мин в темноте.
    8. Дополнительно: Пятно с DAPI, добавить mountant, и поместите покровное мягко сверху предметное стекло. Разрешить mountant вылечить O / N перед съемкой микроскопии изображений.
    9. Приобретать данные по ПТ или микроскопии. Примечание: Сравнение изотип для каждого условия в соответствующий окрашивания при анализе по ПТ или микроскопии.
      1. Facs: Приобретать один образец одновременно. Установите FSC / SSC ворота на живых клеток, а затем стробирования на CD11c + CD14 - клеток, прежде чем анализировать окрашивание про-IL-1β населения MoDC.
      2. Микроскопия: Установите время экспозиции с помощью положительный образец окрашивания - R848 лечить. Используйте DAPI + про-IL-1β + и DAPI + про-IL-1β - определить процент про-IL-1β + выражающие moDCs.
  2. Южная ДакотаS-страница: Иммуноблоттинг выполняется для обнаружения про-IL-1β. Примечание: Техника, описанная ниже сочетает стандартную технику иммуноблоттинга, градиент 4-20% полиакриламидном геле и флуоресцентной или хемилюминесцентной детекции 41, 42.
    1. Клетки лизируют непосредственно в 10 мкл денатурирующих буфера для лизиса (5 мкл β-mercaptoethanol/950 мкл Laemmli буфера образца с последующим разбавлением 1:1 буфера для лизиса клеток). Передача лизата в 1,5 мл пробирки Эппендорфа.
    2. Тепло лизат на сухой пластины течение 10 мин при 100 ° С.
    3. Спин лизата на 20 800 мкг на minicentrifuge в течение 1 мин, чтобы сконцентрироваться объема жидкости. Пауза точку: образцы могут быть заморожены при температуре -20 ° С в течение краткосрочного хранения.
    4. Загрузка общий объем на полиакриламидном геле. Запуск 140 V через коробку гель в течение приблизительно 1 ч, или до тех пор, передний краситель не работает со дна геля.
    5. Передача белка из полиакриламидном геле на membr PVDF Immobilon-FLАНЭ в течение 90 мин при 100 В. Блок мембраны с 5% БСА в забуференным трис физиологическим раствором / 0,1% Твин-20 (TBS-T) в течение 1 часа. Примечание: ПВДФ Immobilon-ФЗ Лучше для использования с флуоресцентной детекции. Мембрана с различным составом рекомендуется для другие методы обнаружения, чтобы увеличить соотношение сигнал фона.
    6. Развести первичных и вторичных антител в 10 мл 5% BSA / TBS-T. Выполните инкубации первичного антитела при 4 ° CO / N при встряхивании и вторичного антитела при комнатной температуре в течение 1 часа при встряхивании.
    7. Вымойте мембраны 3 раза TBS-T в течение 5 мин при встряхивании между инкубации первичных и вторичных антител и снова между вторичными инкубации и визуализации. Примечание: Полосы могут быть обнаружены с помощью флуоресцентной или хемилюминесцентной детекции. Следуйте инструкциям производителя для обнаружения.
  3. ИФА: Образцы, которые заморожены для хранения нужно, чтобы уравновесить до комнатной температуры перед анализом. Спином вниз образцы в центрифуге консолидировать супернатант CondensAtion. Следуйте инструкциям производителя для измерения IL-1β. Примечание: В этом протоколе Ил-1β специально измеряется; Однако одновременное измерение ФНО, ИЛ-6, и иммуномодулирующее цитокинов IL-10 обеспечивают соответствующие условия были загрунтованы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Эти методы измерения TLR8 заливке с R848. Внутриклеточного цитокина окрашивание на про-IL-1β позволяет микроскопии и Facs показаний от CD14 - CD11c + moDCs. Оба метода могут быть количественно относительно к не загрунтованных или отдыха, контроль клеточного, а в качестве контрольного изотипа (рис. 1 и 2). Процент про-IL-1β + окрашивания клеток умножается на геометрической медианы этой популяции, чтобы обеспечить средний интенсивность флуоресценции (MFI). MFI сравнимо с количеством про-IL-1β, присутствующего в положительное окрашивание клеток.

Иммуноблоттинга меры про-IL-1β от клеточного лизата, который затем количественно по отношению к внутренней клеточного контроля, такие как β-тубулина или β-актина (рис. 3). Иммуноблоттинг для про-IL-1β в нигерицин обработанных клетках должны выявить снижение про-IL-1β. Все это дополняетсяодновременно увеличение IL-1β в супернатантах, измеренное по ELISA, только в R848 затем нигерицин условиях (фиг. 3 и 4). Все остальные условия должны привести к отсутствию внеклеточной Ил-1β настоящее время. Одновременное измерение других воспалительных цитокинов, таких как ФНО, ИЛ-10 и ИЛ-6, убедитесь, что нигерицин специфичен в результате чего секрецию IL-1β. Уровень грунтования время (рис. 3) и дозы (рис. 4) зависит, в ответ свое отражение в степени внутриклеточного про-IL-1β в R848 загрунтованную и внеклеточной IL-1β (а также ФНО, ИЛ-10, и ИЛ-6) секреции во всех R848 рассматриваться условия (рис. 4).

Рисунок 1
Рисунок 1. Цитоплазматической про-IL-1β обнаруживается е низкий цитометрии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2. Цитоплазма про-IL-1β обнаруживается микроскопии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Цитоплазматической про-IL-1β обнаруживается SDS-PAGE.res.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4. Секретируемый Ил-1β обнаруживается ELISA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Воспалительные цитокины являются неотъемлемой в рулевое врожденную и адаптивный иммунный ответ, чтобы бороться вирусную инфекцию. Выделяется Ил-1β было показано, что увеличение во время гриппа инфекции 3, 43, 44. Точные механизмы, с помощью которых эти цитокины, обработанные в ответ на вирусную признания в дендритных клеток человека полностью не поняты. Миелоидные комплекты изоляции DC стоят дорого и отнимает много времени. Изоляция наборы и КФА сортировка может непреднамеренно стресс или активировать клетки. Кроме того, существует часто недостаточное количество изолированных клеток для экспериментов. К счастью, биологии человека moDCs тесно модели, которые первичных миелоидных ДК человека в пробирке 45, 46. Оба типа клеток требуют два сигнала, TLR грунтовки и NLRP3 активирующий, для достижения зрелого секрецию IL-1β. Поэтому moDCs обеспечить и тип доступным и простым модель DC клеток для изучения и ставкутер понять актуальность и роль inflammasome NLRP3 в норме и патологии человека.

Обнаружение Ил-1β используя методы, описанные здесь предоставляет различные простые и эффективные иммунологических изучать болезни с воспалительным связанного патологий, в том числе вирусной РНК-инфекции; В частности, как измерить IL-1β в различными способами в ответ на R848 и нигерицин стимуляции. Другие агонисты TLR (например, Poly (I: C) и ЛПС) и NLRP3 inflammasome активаторов (например, АТФ и MSU) может быть использован для измерения эту активность при стимуляции в контексте других патологий заболеваний; Однако, раз стимуляции и условия могут нуждаться в корректировке. Время экспозиции Реагент и концентрации также должны быть скорректированы при изменении этот протокол для использования в других типах клеток и видов.

Все условия должны быть запущены в трех экземплярах и ответ тщательно взвесить в целях контроля качества; он является общим длябольшая изменчивость существовать донором. Моноцитов, полученные ДК представляют собой тип клеток, а не линия клеток, и неоднородность существует в культуре MoDC.

Грунтовка может быть подтверждена с ICS для про-IL-1β и сравнивая отдыхая moDCs к R848-загрунтованную состоянии. Отдыхать moDCs не должно привести к положительным окрашиванием. Грунтовка может быть подтверждено с помощью иммуноблоттинга для экспрессии про-IL-1β. Успешные результаты R848 грунтовки в секреции провоспалительных цитокинов ФНО, ИЛ-6, и иммуномодулирующего цитокина IL-10 с минимальным секреции IL-1β. Inflammasome активированные клетки не должны показывать дальнейшее увеличение TNF-, IL-6 и IL-10 секрецию, но будет иметь увеличение секретируемых IL-1β по сравнению с концентрацией неактивированных клеток.

Pro-IL-1β может быть пассивно выделяется при некротической гибели клеток поэтому биодоступность анализы могли бы представлять интерес. Кроме того, иммуноблоттинга может быть выполнена на supernatanTS для определения молекулярной массы секретируемого IL-1β, чтобы обеспечить активный ИЛ-1β является формой цитокина секретируемого; зрелый IL-1β является 17 кДа в то время как предшественник 31 кДа. Для измерения IL-1β из супернатантов, концентрация клеток должны быть скорректированы для достижения положительного сигнала выше предела обнаружения. Каспазы-1 активации также могут быть измерены с помощью различных методов, чтобы определить, inflammasome активации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют конфликта интересов раскрывать.

Acknowledgements

Авторы хотели бы выразить признательность Оливье Manches, доктор философии, Давор Frleta, доктор философии, и Меган О'Брайен, MD за их поддержку и обратную связь. Это исследование было поддержано Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний и завершил с финансированием от NIH предоставляет Рут L. Kirschstein Национальный исследовательский Сервис наград для отдельных Predoctoral стипендий (F31) поощрять разнообразие в связанных со здоровьем исследований (AI089030) и RO1 (AI081848 ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IL-4 R&D
GM-CSF Genzyme NDC 58468-0180-2 We acquire this item through our local pharmacy with a prescription
RPMI 1640 with L-glutamine Cellgro 10-040-CV
Peripheral blood mononuclear cells New York Blood Center PBMCs were isolated from the blood of healthy donors
12 well tissue culture plates Sigma-Aldrich 3516
96 well round bottom tissue culture plates Sigma-Aldrich 3799
α-IL-1β-FITC R&D IC201F
FITC isotype control Miltenyi Biotec 130-092-213
α-β-Tubulin Santa Cruz SC-9014
α-IL-1β R&D mab201
PVDF Immobilon-FL membrane Millipore IPFL00010
gradient 4-12% polycrylamide gel Bio Rad 161-1159
Laemmli sample buffer Bio Rad 161-0737
BSA Equitech Bio Inc 30% solution sterile/filtered
PFA Electron Microscopy Sciences 15710 16% solution
Human inflammatory cytokine bead array kit BD 551811
Nigericin Invivogen tlrl-nig
R848 3M Corp.
α-CD14 BD 340436
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-10ML
TBS On site stock room
Tween-20 Sigma-Aldrich P2287-100mL
Nunc EasYFlask 225 cm2, Filter Cap, 70 ml working volume, 30/Cs Thermo Scientific 159933
20 μM Sterile Disposable Filter Units Thermo Scientific 569-0020
HEPES Invitrogen 15630080
Goat α-mouse IRDye 800CW Licor 926-32210
Donkey α-rabbit IRDye 680RD Licor 926-68073
Spectra multicolor broad range protein ladder Thermo Scientific 26634
Tris Glycine SDS 10x Bio Rad 1610732
Tris Glycine 10x Bio Rad 161-0734
Methanol - 4 L Fisher Scientific A433P-4
8 chamber polystyrene vessel tissue culture treated glass slide BD Falcon 354108
Poly-L-Lysine Sigma P4707

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Durrant, D. M., Robinette, M. L., Klein, R. S. IL-1R1 is required for dendritic cell-mediated T cell reactivation within the CNS during West Nile virus encephalitis. The Journal of Experimental Medicine. 210, 503-516 (2013).
  2. Thomas, P. G., et al. The intracellular sensor NLRP3 mediates key innate and healing responses to influenza A virus via the regulation of caspase-1. Immunity. 30, 566-575 (2009).
  3. Schmitz, N., Kurrer, M., Bachmann, M. F., Kopf, M. Interleukin-1 is responsible for acute lung immunopathology but increases survival of respiratory influenza virus infection. Journal of Virology. 79, 6441-6448 (2005).
  4. Pang, I. K., Ichinohe, T., Iwasaki, A. IL-1R signaling in dendritic cells replaces pattern-recognition receptors in promoting CD8(+) T cell responses to influenza A virus. Nat Immunol. 14, 246-253 (2013).
  5. Allen, I. C., et al. The NLRP3 inflammasome mediates in vivo innate immunity to influenza A virus through recognition of viral RNA. Immunity. 30, 556-565 (2009).
  6. Bauernfeind, F. G., et al. Cutting edge: NF-kappaB activating pattern recognition and cytokine receptors license NLRP3 inflammasome activation by regulating NLRP3 expression. J Immunol. 183, 787-791 (2009).
  7. Zabel, F., Kundig, T. M., Bachmann, M. F. Virus-induced humoral immunity: on how B cell responses are initiated. Current Opinion in Virology. (2013).
  8. Steinman, R. M. Lasker Basic Medical Research Award. Dendritic cells: versatile controllers of the immune system. Nature Medicine. 13, 1155-1159 (2007).
  9. Bhardwaj, N., et al. Influenza virus-infected dendritic cells stimulate strong proliferative and cytolytic responses from human CD8+ T cells. The Journal of Clinical Investigation. 94, 797-807 (1994).
  10. Sheng, K. C., Day, S., Wright, M. D., Stojanovska, L., Apostolopoulos, V. Enhanced Dendritic Cell-Mediated Antigen-Specific CD4+ T Cell Responses: IFN-Gamma Aids TLR Stimulation. Journal of Drug Delivery. 2013, (2013).
  11. Pohl, C., Shishkova, J., Schneider-Schaulies, S. Viruses and dendritic cells: enemy mine. Cellular Microbiology. 9, 279-289 (2007).
  12. Dinarello, C. A. Cytokines as mediators in the pathogenesis of septic shock. Curr Top Microbiol Immunol. 216, 133-165 (1996).
  13. Petrilli, V., et al. Activation of the NALP3 inflammasome is triggered by low intracellular potassium concentration. Cell Death and Differentiation. 14, 1583-1589 (2007).
  14. Hussen, J., Duvel, A., Koy, M., Schuberth, H. J. Inflammasome activation in bovine monocytes by extracellular ATP does not require the purinergic receptor P2X7. Developmental and Comparative Immunology. 38, 312-320 (2012).
  15. Rajamaki, K., et al. Extracellular Acidosis Is a Novel Danger Signal Alerting Innate Immunity via the NLRP3 Inflammasome. The Journal of Biological Chemistry. 288, 13410-13419 (2013).
  16. Ayna, G., et al. ATP release from dying autophagic cells and their phagocytosis are crucial for inflammasome activation in macrophages. PLoS One. (2012).
  17. Vyleta, M. L., Wong, J., Magun, B. E. Suppression of ribosomal function triggers innate immune signaling through activation of the NLRP3 inflammasome. PLoS One. 7, (2012).
  18. Lacroix-Lamande, S., et al. Downregulation of the Na/K-ATPase pump by leptospiral glycolipoprotein activates the NLRP3 inflammasome. J Immunol. 188, 2805-2814 (2012).
  19. Segovia, J., et al. TLR2/MyD88/NF-kappaB pathway, reactive oxygen species, potassium efflux activates NLRP3/ASC inflammasome during respiratory syncytial virus infection. PLoS One. 7, (2012).
  20. Hamon, M. A., Cossart, P. K. K+ efflux is required for histone H3 dephosphorylation by Listeria monocytogenes listeriolysin O and other pore-forming toxins. Infection and Immunity. 79, 2839-2846 (2011).
  21. Schorn, C., et al. Sodium overload and water influx activate the NALP3 inflammasome. The Journal of Biological Chemistry. 286, 35-41 (2011).
  22. Said-Sadier, N., Padilla, E., Langsley, G., Ojcius, D. M. Aspergillus fumigatus stimulates the NLRP3 inflammasome through a pathway requiring ROS production and the Syk tyrosine kinase. PLoS One. 5, (2010).
  23. Arlehamn, C. S., Petrilli, V., Gross, O., Tschopp, J., Evans, T. J. The role of potassium in inflammasome activation by bacteria. The Journal of Biological Chemistry. 285, 10508-10518 (2010).
  24. Chu, J., et al. Cholesterol-dependent cytolysins induce rapid release of mature IL-1beta from murine macrophages in a NLRP3 inflammasome and cathepsin B-dependent manner. Journal of Leukocyte Biology. 86, 1227-1238 (2009).
  25. Silverman, W. R., et al. The pannexin 1 channel activates the inflammasome in neurons and astrocytes. The Journal of Biological Chemistry. 284, 18143-18151 (2009).
  26. Piccini, A., et al. ATP is released by monocytes stimulated with pathogen-sensing receptor ligands and induces IL-1beta and IL-18 secretion in an autocrine way. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 8067-8072 (2008).
  27. Wickliffe, K. E., Leppla, S. H., Moayeri, M. Anthrax lethal toxin-induced inflammasome formation and caspase-1 activation are late events dependent on ion fluxes and the proteasome. Cellular Microbiology. 10, 332-343 (2008).
  28. Franchi, L., Kanneganti, T. D., Dubyak, G. R., Nunez, G. Differential requirement of P2X7 receptor and intracellular K+ for caspase-1 activation induced by intracellular and extracellular bacteria. The Journal of Biological Chemistry. 282, 18810-18818 (2007).
  29. Owen, D. M., Gale, M. Fighting the flu with inflammasome signaling. Immunity. 30, 476-478 (2009).
  30. Pang, I. K., Iwasaki, A. Inflammasomes as mediators of immunity against influenza virus. Trends in Immunology. 32, 34-41 (2011).
  31. Kanneganti, T. D., et al. Critical role for Cryopyrin/Nalp3 in activation of caspase-1 in response to viral infection and double-stranded RNA. The Journal of Biological Chemistry. 281, 36560-36568 (2006).
  32. Ichinohe, T., Lee, H. K., Ogura, Y., Flavell, R., Iwasaki, A. Inflammasome recognition of influenza virus is essential for adaptive immune responses. The Journal of Experimental Medicine. 206, 79-87 (2009).
  33. Ichinohe, T., Pang, I. K., Iwasaki, A. Influenza virus activates inflammasomes via its intracellular M2 ion channel. Nat Immunol. 11, 404-410 (2010).
  34. Ichinohe, T., et al. Microbiota regulates immune defense against respiratory tract influenza A virus infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5354-5359 (2011).
  35. O'Neill, D. W., Bhardwaj, N. Differentiation of peripheral blood monocytes into dendritic cells. Current Protocols in Immunology. 22, (2005).
  36. Sabado, R. L., Miller, E., Spadaccia, M., Vengco, I., Hasan, F., Bhardwaj, N. Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy. J. Vis. Exp. (78), (2013).
  37. Rubartelli, A., Cozzolino, F., Talio, M., Sitia, R. A novel secretory pathway for interleukin-1 beta, a protein lacking a signal sequence. The EMBO Journal. 9, 1503-1510 (1990).
  38. Ritchie, H., Booth, N. A. Secretion of plasminogen activator inhibitor 2 by human peripheral blood monocytes occurs via an endoplasmic reticulum-golgi-independent pathway. Experimental Cell Research. 242, 439-450 (1998).
  39. Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure. Nature Protocols. 1, 1507-1516 (2006).
  40. He, H., Courtney, A. N., Wieder, E., Sastry, K. J. Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques. J Vis Exp. 38, (2010).
  41. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American journal of Medical Sciences. 4, 429-434 (2012).
  42. Alegria-Schaffer, A., Lodge, A., Vattem, K. Performing and optimizing Western blots with an emphasis on chemiluminescent detection. Methods in Enzymology. 463, 573-599 (2009).
  43. Hennet, T., Ziltener, H. J., Frei, K., Peterhans, E. A kinetic study of immune mediators in the lungs of mice infected with influenza A virus. J Immunol. 149, 932-939 (1992).
  44. Pirhonen, J., Sareneva, T., Kurimoto, M., Julkunen, I., Matikainen, S. Virus infection activates IL-1 beta and IL-18 production in human macrophages by a caspase-1-dependent pathway. J Immunol. 162, 7322-7329 (1999).
  45. Anderson, J., Gustafsson, K., Himoudi, N. Licensing of killer dendritic cells in mouse and humans: functional similarities between IKDC and human blood gammadelta T-lymphocytes. Journal of Immunotoxicology. 9, 259-266 (2012).
  46. Waithman, J., Mintern, J. D. Dendritic cells and influenza A virus infection. Virulence. 3, 603-608 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics