एक के रूप में मस्तिष्क Microslices की excitotoxic उत्तेजना

Medicine

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Summary

हम excitotoxicity की मध्यस्थता मस्तिष्क की चोट में शामिल आणविक तंत्र की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जो एक मस्तिष्क टुकड़ा मॉडल विकसित किया है. इस तकनीक व्यवहार्य परिपक्व मस्तिष्क ऊतक उत्पन्न करता है और आंशिक रूप से बरकरार neuronal circuitry, सेलुलर बातचीत, और postsynaptic डिब्बों रखने whilst, प्रयोग के लिए आवश्यक पशु संख्या कम कर देता है.

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Skelding, K. A., Arellano, J. M., Powis, D. A., Rostas, J. A. Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke. J. Vis. Exp. (84), e51291, doi:10.3791/51291 (2014).

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Abstract

पूरे पशु प्रणालियों का उपयोग करते समय ऐसे इस्कीमिक स्ट्रोक के रूप में नयूरोपथोलोगिकल शर्तों में शामिल आणविक तंत्र, जांच करना, मुश्किल हो सकता है. इस तरह, प्राथमिक या 'neuronal की तरह' सेल संस्कृति प्रणालियों आमतौर पर उपयोग कर रहे हैं. इन प्रणालियों के साथ काम करने के लिए अपेक्षाकृत आसान कर रहे हैं, और (जैसे कोशिका मृत्यु) के रूप में विभिन्न कार्यात्मक परिणामों आसानी मात्रा निर्धारित किया जा सकता है, जिसमें उपयोगी मॉडल प्रणाली, (जैसे excitotoxicity की मध्यस्थता कोशिका मृत्यु रास्ते के रूप में) सुसंस्कृत अपरिपक्व न्यूरॉन्स में जांच के परिणामों और रास्ते हैं, जबकि जरूरी परिपक्व मस्तिष्क में मनाया उन लोगों के रूप में ही, या बरकरार ऊतक में नहीं हैं. इसलिए, परिपक्व तंत्रिका ऊतकों में सेलुलर तंत्र की जांच की जा सकती है जिसमें मॉडल विकसित करने की जरूरत नहीं है. हम बरकरार तंत्रिका ऊतक में आणविक मार्ग की एक किस्म की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि इन विट्रो में एक तकनीक विकसित की है. वर्णित तकनीक के साथ साथ चूहे cortical ऊतक का इस्तेमाल करता है, लेकिन इस तकनीक के ऊतकों का उपयोग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता हैया मस्तिष्क क्षेत्रों (उदाहरण के लिए, हिप्पोकैम्पस, striatum, आदि) (जैसे माउस, खरगोश, गिनी पिग, और चिकन के रूप में) प्रजाति की एक किस्म से. इसके अतिरिक्त, stimulations / उपचार की एक किस्म (उदाहरण के लिए, excitotoxic, inhibitors के प्रशासन, आदि) का उपयोग किया जा सकता है. अंत में, यहाँ बताया मस्तिष्क टुकड़ा मॉडल excitotoxicity की मध्यस्थता मस्तिष्क की चोट में शामिल आणविक तंत्र की एक किस्म की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Introduction

स्ट्रोक का सबसे आम रूप एक मस्तिष्क रक्त वाहिका अवरोधित हो जाता है तब होता है जब जो इस्कीमिक स्ट्रोक, है. रक्त प्रवाह की समाप्ति से जो परिणाम ऊतक ischemia झिल्ली के व्यापक विध्रुवण, उत्तेजक न्यूरोट्रांसमीटर की रिहाई का कारण बनता है, और कोशिका मृत्यु का सक्रियण की ओर जाता है जो intracellular कैल्शियम की निरंतर ऊंचाई 1 रास्ते. इस प्रक्रिया को 'excitotoxicity' करार दिया, और स्ट्रोक 2 सहित विकृतियों की एक किस्म के द्वारा उत्पादित neuronal मौत में शामिल एक आम मार्ग है किया गया है. Excitotoxicity और अन्य neuronal सेल मौत Cascades में शामिल संकेत दे रास्ते के अवरोध स्ट्रोक के बाद neuronal नुकसान को सीमित करने के लिए एक आकर्षक दृष्टिकोण है.

पूरे पशु प्रणालियों का उपयोग करते समय excitotoxicity और इस्कीमिक स्ट्रोक में शामिल सटीक आणविक तंत्र की पहचान मुश्किल हो सकता है. इस तरह, प्राथमिक भ्रूण और 'neuronal की तरह' (जैसे neuroblasto रूपएमए और ग्रंथिकर्कटता अमर लाइनों) सेल संस्कृति प्रणालियों अक्सर इस्तेमाल किया जाता है. इन मॉडलों का मुख्य लाभ वे अपेक्षाकृत लागत प्रभावी हेरफेर करने के लिए आसान कर रहे हैं, और कोशिका मृत्यु आसानी से मापा और quantitated किया जा सकता है कि कर रहे हैं. हालांकि, संकेत दे रास्ते संवर्धन 3,4 इस्तेमाल किया शर्तों, और अपरिपक्व न्यूरॉन्स द्वारा बदल दिया है और लाइनों अलग रिसेप्टर्स व्यक्त और मस्तिष्क 5-8 परिपक्व तुलना जब संकेतन अणुओं सकते हैं अमर हो सकता है. (एक coculture प्रणाली का इस्तेमाल किया है, तो या दो) बरकरार मस्तिष्क के ऊतकों को एक दूसरे के साथ बातचीत है कि सेल प्रकार की एक किस्म युक्त, विषम है जबकि इसके अलावा, सभ्य न्यूरॉन्स केवल एक कोशिका प्रकार की परीक्षा देते हैं. Organotypic टुकड़ा संस्कृति प्रणाली (मस्तिष्क के ऊतकों की पतली explants) भी उपयोग किया जाता है, और वे विवो में पाए जाते हैं के रूप में इन मॉडलों की कोशिकाओं की विषम आबादी के अध्ययन की अनुमति. इस तकनीक का उपयोग करते हैं, तथापि, ऊतक का केवल एक सीमित मात्रा में स्लाइस, प्रत्येक जानवर से कर सकते हैं प्राप्त किया जा सकता हैके रूप में लंबे समय तक अमर सेल लाइनों के रूप में के लिए संवर्धित किया जा, और लंबे समय तक संस्कृति के लिए मध्यम स्लाइस में रास्ते और रिसेप्टर्स संकेत में परिवर्तन कर सकते हैं परिणाम नहीं. परिपक्व मस्तिष्क organotypic स्लाइस उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, whilst अपरिपक्व मस्तिष्क से स्लाइस संस्कृति को अधिक उत्तरदायी हैं, और अधिक सामान्यतः उपयोग किया जाता है. Neuronal संकेत दे रास्ते की जांच की जा सकती है, जिसमें आसानी से उपयोग कर रहे हैं कि अक्षुण्ण परिपक्व मस्तिष्क, नकल या का प्रतिनिधित्व करते हैं जो मॉडल विकसित करने के लिए बहुत आवश्यक है.

इस के साथ साथ, एक excitotoxic या इस्कीमिक अपमान निम्नलिखित कोशिका मृत्यु में शामिल आणविक तंत्र को स्पष्ट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है बरकरार तंत्रिका ऊतकों को शामिल इन विट्रो तकनीक का वर्णन किया है. इस तकनीक, एक प्रयोग करने की आवश्यकता पशुओं की संख्या कम कर देता है प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, और बड़ा organotypic स्लाइस को एक पाचन इसी तरह फैशन में व्यवहार करती है कि व्यवहार्य ऊतक उत्पन्न करता है. इसके अतिरिक्त, neuronal circuitry, सेलुलर बातचीत, और postsynaptic सहmpartment आंशिक रूप से बरकरार है. इस्तेमाल किया शारीरिक बफर सेल 'रीसील' के लिए झिल्ली, और सक्षम बनाता है कोशिकाओं को उनके मूल झिल्ली प्रतिरोध 9 ठीक करने के लिए अनुमति देता है. यह मस्तिष्क टुकड़ा मॉडल ईमानदारी excitotoxicity मध्यस्थता मस्तिष्क की चोटों 10 निम्नलिखित मनाया प्रतिक्रियाओं की नकल करने में सक्षम है, और स्ट्रोक में शामिल आणविक तंत्र की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Protocol

सभी प्रक्रियाओं एनएसडब्ल्यू पशु अनुसंधान अधिनियम, एनएसडब्ल्यू पशु अनुसंधान विनियमन, और के लिए अभ्यास के ऑस्ट्रेलियाई कोड सहित संबंधित दिशा निर्देशों और नियमों के अनुसार के साथ ही न्यूकासल विश्वविद्यालय पशु देखभाल और आचार समिति से अनुमोदन के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं देखभाल और वैज्ञानिक उद्देश्यों के लिए जानवरों का इस्तेमाल.

1. मस्तिष्क के ऊतकों के विच्छेदन

  1. कत्ल से बारह सप्ताह पुराने नर चूहों बलिदान. चूहे या तो आश्चर्यजनक और कत्ल करके बलिदान किया जा सकता है, या पहले isoflurane (5% प्रेरण, 1.5-2% अनुरक्षण) 70% एन 2 में और 30% 2 हे के साथ anesthetized किया जा सकता है, और फिर decapitated.
  2. जितनी तेजी खोपड़ी से मस्तिष्क निकालें (आदर्श रूप में, यह कम से कम 2 मिनट में किया जाना चाहिए).
  3. मुक्त हाथ विच्छेदन द्वारा प्रांतस्था निकालें. माई करने के लिए इतनी के रूप में विच्छेदन संभव के रूप में मस्तिष्क के रूप में छोटे नुकसान के साथ, संभव कम से कम समय में किया जाना चाहिएस्लाइस की अखंडता ntain.
  4. किसी भी अवशिष्ट त्वचा को दूर करने के लिए, आदि फर, रक्त,,, 37 डिग्री सेल्सियस क्रेब्स बफर (118 मिमी सोडियम क्लोराइड, 4.7 मिमी पोटेशियम क्लोराइड, 1.3 मिमी कैल्शियम क्लोराइड की एक छोटी राशि (3-5 एमएल) में मस्तिष्क विसर्जित 1.2 मिमी पोटेशियम dihydrogen फॉस्फेट, 1.2 मिमी मैग्नीशियम सल्फेट, 25 मिमी सोडियम हाइड्रोजन कार्बोनेट, 11.7 मिमी ग्लूकोज, 0.03 मिमी disodium ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA), 95% ऑक्सीजन / 5% कार्बन डाइऑक्साइड (carbogen), 7.4 पीएच) के साथ equilibrated.

2. Microslices की तैयारी

  1. फिल्टर पेपर के दो स्लाइस रखा और गर्म क्रेब्स बफर के साथ सिक्त किया गया है जिस पर एक McIlwain हेलिकॉप्टर के मंच पर मस्तिष्क रखें. मस्तिष्क और गर्म क्रेब्स बफर के साथ सिक्त फिल्टर पेपर रखें, लेकिन इतना गीला नहीं मस्तिष्क के आसपास स्लाइड करने के लिए पैदा कर सकता है कि कागज की सतह पर मुक्त तरल है कि वहाँ.
  2. 250 माइक्रोन राज्याभिषेक वर्गों में मस्तिष्क टुकड़ा. पोषक तत्वों, ऑक्सीजन, और अपशिष्ट पदार्थों वें के रूप मेंसामान्य रूप से रक्त की आपूर्ति अलग तंत्रिका ऊतक में ऊतक के चारों ओर जो एक तरल पदार्थ के साथ विमर्श कर रहे हैं के साथ विमर्श कर रहे हैं पर, स्लाइस के आकार पर्याप्त ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की विनिमय घटित करने के लिए अनुमति देने के लिए मोटाई में 400 से अधिक माइक्रोन नहीं होना चाहिए.
  3. McIlwain चरण 90 °.
  4. 250 माइक्रोन बाण के समान स्लाइस में दिमाग स्लाइस. इस के साथ साथ, इन मस्तिष्क वर्गों (चर लंबाई की 250 माइक्रोन x 250 माइक्रोन स्लाइस ऊतक की मोटाई पर निर्भर करता है) microslices के रूप में भेजा जाता है.
  5. (प्रयुक्त क्रेब्स बफर की राशि ऊतक की मात्रा पर निर्भर करेगा) 10-15 मिलीलीटर 37 डिग्री सेल्सियस क्रेब्स बफर के साथ एक दौर नीचे ट्यूब में microslices रखें.

3. Microslices का संतुलन

  1. धीरे व्यक्ति microslices निलंबित कर रहे हैं जब तक आंदोलन, और फिर उन्हें गुरुत्वाकर्षण के तहत व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं.
  2. ध्यान की वजह से निलंबित सेल मलबे को बादलमय हो जाएगा, जो सतह पर तैरनेवाला हटाने, और ताजा 37 डिग्री सेल्सियस 10 एमएल जोड़ेंक्रेब्स ट्यूब के लिए बफर.
  3. मलबे के बहुमत को हटाने में जो परिणाम होगा, इस धोने प्रक्रिया चार बार दोहराएँ.
  4. इस के बाद, कोमल झटकों / उलटा के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर microslices संतुलित करना, और क्रेब्स कुल में 1 घंटे के लिए हर 15 मिनट बफर बदल जाते हैं.
  5. इस समय, 2 मिलीलीटर ताजा 37 डिग्री सेल्सियस क्रेब्स बफर जोड़ने, और फ्लैट नीचे polystyrene को 15-20 microslices (microslice निलंबन की 150 μl) हस्तांतरण द्वारा बनाया जा सकता है जो smoothed किनारों (साथ एक अतिरिक्त व्यापक बोर विंदुक टिप का उपयोग 5 मिलीलीटर ट्यूबों एक P1000 टिप के अंत से ~ 2 मिमी काटने). प्रत्येक microslice ऑक्सीजन वातावरण से कुछ मिलीमीटर की तुलना में आगे नहीं है, इसलिए है कि एक परत में ट्यूब के आधार पर समान रूप से microslices बिखरा हुआ है.

4. Excitotoxic उत्तेजना

  1. 37 डिग्री सेल्सियस पर microslices सेते हैं, और लगातार स्थिति है कि एक गैस लाइन का उपयोग कर, 150 μl microslice निलंबन की सतह पर carbogen पारितबस microslice निलंबन (मैकेनिकल व्यवधान से बचने के लिए) की सतह से ऊपर एड.
  2. (: अंतिम एकाग्रता 2.5 मिमी ग्लूटामेट + 50 माइक्रोन ग्लाइसिन excitotoxic प्रोत्साहन) या अकेले 150 μl क्रेब्स बफर (nonstimulated नियंत्रित) 150 μl 5 मिमी ग्लूटामेट + 100 क्रेब्स बफर में माइक्रोन ग्लाइसिन के साथ या तो microslices समझो. उत्तेजनाओं की एक किस्म के इस कदम पर इस्तेमाल किया जा सकता है (सहित, लेकिन सीमित नहीं है, AMPA, NMDA + ग्लाइसिन, KCl विध्रुवण, और ऑक्सीजन / ग्लूकोज अभाव).
  3. विभिन्न समय के बाद उत्तेजना (0, 30, 60, 90, 120, और 300 सेकंड) पर ऊष्मायन समाधान निकालें, और ठंडा homogenization बफर (30 मिमी Tris, 7.4 पीएच, 1 मिमी इथाइलीन ग्लाइकॉल की 300 μl के साथ बदलें tetraacetic एसिड, 4 मिमी EDTA, 100 माइक्रोन अमोनियम molybdate, 5 मिमी सोडियम पाइरोफॉस्फेट, 25 मिमी सोडियम फ्लोराइड, 1 मिमी सोडियम orthovanadate, 1 मिमी phenylmethanesulfonylfluoride, पूरा protease अवरोध कॉकटेल).
  4. एक गिलास Teflon Dounce homogenizer का उपयोग कर, बर्फ पर microslices homogenize(20 स्ट्रोक, 700 आरपीएम).
  5. आदि -80 डिग्री सेल्सियस, और विभिन्न संकेतन अणुओं, मौत अणुओं, पर स्टोर homogenates वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा मापा जा सकता है.

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Representative Results

इस प्रक्रिया का उपयोग कर उत्पन्न Microslices व्यवहार्य हैं, और प्रजातियों में से एक किस्म (उदाहरण के लिए, चूहे, माउस, और चिकन) microslices निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. व्यवहार्यता के तीन स्वतंत्र उपायों का उपयोग किया गया है: श्वसन दर (चित्रा 1), adenine न्यूक्लियोटाइड अनुपात (चित्रा 2), और ऊतक पोटेशियम सामग्री (चित्रा 3). इन उपायों का प्रयोग, यह microslices कम से कम 2 घंटे के बाद की पीढ़ी के लिए सक्षम रहते हैं कि प्रदर्शन किया गया है.

ब्रेन microslices उत्तेजनाओं की एक किस्म के बाद, विभिन्न संकेतन अणुओं की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (जैसे KCl विध्रुवण [चित्रा 4], AMPA, NMDA ग्लूटामेट उत्तेजना 10), और भी कई मस्तिष्क क्षेत्रों के बीच सेल संकेतन अणुओं की प्रतिक्रियाओं की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (चित्रा 4). इसके अतिरिक्त, इन अणुओं पर विभिन्न inhibitors / दवा उपचार के प्रभाव को भी इस तरह के kinase के रूप में (जांच की जा सकती inhibitors 10, ग्लूटामेट रिसेप्टर agonists 11, quisqualic एसिड 12).

चित्रा 1
चित्रा 1. चिकन अग्रमस्तिष्क से microslices की श्वसन दर रूप में इस प्रकार मस्तिष्क के ऊतकों की श्वसन दर की गणना की गई. समाधान में ऑक्सीजन के moles से गुणा (प्रयोग की शुरुआत और अंत में ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड रीडिंग के बीच अंतर) भस्म ऑक्सीजन की मात्रा, विभाजित ऊष्मायन समय से (घंटे) और प्रोटीन की मात्रा (एमजी). पृथक स्तनधारी मस्तिष्क प्रांतस्था की विशिष्ट श्वसन दर साधारण परिस्थितियों 9 के तहत 55-80 μmol ओ 2 / ग्राम ताजा WT / घंटा के बीच हैं. एन = 9.

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.. चित्रा 2 चिकन अग्रमस्तिष्क से microslices में adenine nucleotides की उपस्थिति एटीपी मापने प्रतिनिधि HPLC ट्रेस: ​​के रूप में प्रदर्शन ADP अनुपात, जो पहले 13 में वर्णित है. एटीपी के स्तर और एडीपी के स्तर में वृद्धि apoptotic और परिगलित कोशिकाओं 14 के लिए विशेषता है की कमी हुई जबकि उच्च एटीपी और कम ADP स्तर आमतौर पर, व्यवहार्य कोशिकाओं में पाए जाते हैं. विशिष्ट एटीपी: microslices की ADP अनुपात 3:01-6:01 विविध, और अधिक से अधिक 2 घंटे के लिए इन स्तरों पर बनाए रखा गया.

चित्रा 3
चित्रा 3. ऊतक + K अपरिपक्व चिकन अग्रमस्तिष्क से मस्तिष्क microslices की सामग्री. ऊतक पोटेशियम का निर्धारण एक हमें हैव्यवहार्यता के eful उपाय के रूप में एक ऊतक के रासायनिक और शारीरिक गतिविधियों के कई एक सामान्य intracellular पोटेशियम सामग्री 9 की आवश्यकता है जो झिल्ली क्षमता पर निर्भर हैं. Microslices तुरंत काट के बाद कश्मीर + मुक्त बफर में धोया गया, जब ऊतक + K सिर्फ पृष्ठभूमि (समय 0) ऊपर थे जो स्तर को समाप्त हो गया था. हालांकि, क्रेब्स बफर के साथ बाद ऊष्मायन पर, microslices तेजी से आसपास के माध्यम से कश्मीर + संचित, और 5 मिनट के भीतर वे अनुपचारित microslices के लिए है कि इसी तरह एक स्थिर राज्य स्तर (यानी microslices धोया और सामान्य बफर में incubated) पहुंच गया था. 20 मिनट ऊष्मायन के बाद ouabain (0.2 मिमी) और EGTA (2 मिमी) के अलावा ऊतक + K सामग्री 8 मिनट के भीतर 0 से इंकार करने के कारण होता है. इस microslices सामान्य रूप से सक्रिय रूप से कश्मीर + पंप दर्शाता है कि, और ऊतक कश्मीर + स्तर मृत ऊतक या बीचवाला रिक्त स्थान में फंस + K की वजह से नहीं कर रहे हैं कि. एन = 4.

चित्रा 4
चित्रा 4. KCl साथ विध्रुवण निम्नलिखित GluN2B और GluA1 phosphorylation के समय के पाठ्यक्रम. Microslices नर चूहों के striatum और संवेदी प्रांतस्था से उत्पन्न किया गया (एन = 8), उच्च + K homogenized क्रेब्स बफर, का उपयोग depolarized, और (ए) GluN2B के लिए जांच phosphorylation (Ser1303 पर) और विभिन्न समय के बाद उत्तेजना (0-300 सेकंड) पर पश्चिमी सोख्ता द्वारा (बी) GluA1 phosphorylation (Ser845 पर). Phosphorylation स्तरों कुल GluN2B और GluA1 अभिव्यक्ति (यानी phosphorylation / कुल अभिव्यक्ति) के लिए सामान्यीकृत कर रहे हैं. * मस्तिष्क क्षेत्रों (पी <0.05) के बीच सांख्यिकीय महत्व को दर्शाता है. KCl साथ विध्रुवण S1303 पर GluN2B और GluA1 रिसेप्टर्स की phosphorylation में हुई औरक्रमश: S845,. S845 पर GluA1 phosphorylation की दर प्रांतस्था और striatum में ही था जबकि S1303 पर GluN2B phosphorylation की दर, प्रांतस्था और striatum के बीच विविध. बाद के प्रयोगों में, हम इस multifunctional kinase के विनियमन के लिए अंतर की वजह से पता चला है कि, कैल्शियम / प्रोटीन S1303 पर GluN2B phosphorylates जो kinase द्वितीय (CaMKII),, लेकिन S845 10 में नहीं GluA1 calmodulin उत्तेजित. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

इस के साथ साथ, अक्षत परिपक्व मस्तिष्क के ऊतकों में excitotoxicity और ischemia की मध्यस्थता कोशिका मृत्यु में शामिल आणविक तंत्र की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि microslices की पीढ़ी के लिए इन विट्रो तकनीक का वर्णन किया है. इस तकनीक व्यवहार्य ऊतक (1-3 आंकड़े), कि बड़ा organotypic स्लाइस से 15 metabolically समान है पैदा करता है. इसके अलावा, इस microslice मॉडल निकट विवो 10 में excitotoxicity मध्यस्थता मस्तिष्क चोटों के बाद मनाया प्रतिक्रिया से मेल खाती है. AMPA, NMDA, या ग्लूटामेट साथ मस्तिष्क microslices की इन विट्रो उत्तेजना में एक 90 सेकंड विवो 10 में रोड़ा के एक 90 सेकंड की अवधि के रूप में अणुओं की एक किस्म में एक ही प्रतिक्रियाओं (जैसे CaMKII, GluN2B, और GluA1) लाती है. इस के साथ साथ वर्णित microslice मॉडल ischemia और excitotoxic में शामिल आणविक तंत्र की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक वैध तरीका है कि आगे की मान्यता प्रदान करता हैकोशिका मृत्यु अल्पसंख्यक मध्यस्थता.

किसी भी प्रयोगात्मक तकनीक के साथ के रूप में, इस प्रक्रिया अलग किया जा सकता है, और इन बदलावों या प्रयोगात्मक परिणाम को प्रभावित कर सकता है और नहीं. अनुभव के आधार पर, इस के साथ साथ विस्तृत प्रोटोकॉल उच्चतम ऊतक उपज और microslice व्यवहार्यता पैदा करने के लिए इष्टतम स्थितियों का प्रतिनिधित्व करता है. इस प्रोटोकॉल प्रजातियों (चूहों, चूहों, और मुर्गियों से microslices पहले सफलतापूर्वक उत्पन्न किया गया है) की एक किस्म में इस्तेमाल के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, और किसी भी मस्तिष्क क्षेत्र से (आंकड़े 1-3 पूरे अग्रमस्तिष्क से व्युत्पन्न microslices को दर्शाती, चित्रा 4 व्युत्पन्न microslices दर्शाया गया है प्रांतस्था और striatum से). इसके अतिरिक्त, microslice मोटाई स्लाइस की व्यवहार्यता में किसी भी सराहनीय हानि के बिना, 150-350 माइक्रोन से बदला जा सकता है. इस बड़े स्लाइस के लिए की तुलना में ऊतक के उच्चतम उपज, और अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य नमूने का उत्पादन के रूप में इष्टतम टुकड़ा मोटाई, 250 मीटर है. द्वारा उत्पादित मस्तिष्क के ऊतकों का सांख्यिकीय नमूनाmicroslices की aliquots स्लाइस तैयार की गई है जिसमें से ऊतक का प्रतिनिधि होने की जरूरत है. ऐसा करने के लिए, हम ऊतक का एक प्रतिनिधि नमूने सुनिश्चित करने के लिए विभाज्य प्रति सबसे छोटे आकार के स्लाइस का उपयोग करने की आवश्यकता है. इस के लिए इष्टतम स्थितियों 250 माइक्रोन मोटाई हो पाया, और करने के लिए ~ 15-20 स्लाइस / विभाज्य मेल खाती है ऊतक प्रोटीन, 1 मिलीग्राम गया. microslices कटा हुआ और धोया जाना चाहिए, जिस पर तापमान के साथ उत्पन्न microslices की श्वसन दर की तुलना करके और 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा बिना जांच की गई ऊतक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया है जब एसिडोसिस और अनॉक्सिता के प्रभाव को कम किया जा सकता है, microtubule दुबारा जोड़ना ऊतक ठंडा है, तो बदल दिया और फिर 16 rewarmed किया जा सकता है. Cytoskeleton के इस पुनर्गठन वार्मिंग के बाद कुछ अवधि के लिए कोशिकाओं के कार्यात्मक गतिविधि को प्रभावित कर सकता है. ठंडा स्लाइस की तुलना में जब Noncooled microslices एक उच्च व्यवहार्यता और सांस की दर है. इसके अलावा, तीन washes (3.1-3.3 कदम) suffi हैंcient मलबे से अधिकांश को दूर करने के लिए. बफर में आवधिक परिवर्तन के साथ संतुलन अवधि (3.4 कदम) microslices काट से 'ठीक' करने के लिए अनुमति देता है, और (जैसे कैल्शियम संचय के रूप में) विभिन्न कार्यात्मक assays में reproducibility में सुधार.

विधि उत्तेजनाओं की एक किस्म निम्नलिखित प्रभाव की जांच करने के लिए उपयुक्त है, और दवाओं / inhibitors के साथ इलाज के बाद. झिल्ली पारगम्य है कि किसी भी दवा / अवरोध करनेवाला इस तकनीक, और वेस्टर्न ब्लॉट (या समान) के माध्यम से पता लगाया जा सकता है कि किसी भी अणु की जांच की जा सकती है के माध्यम से जांच की जा करने की क्षमता है.

संक्षेप में, excitotoxicity और ischemia की मध्यस्थता कोशिका मृत्यु में शामिल Cascades संकेत के हेरफेर स्ट्रोक के बाद neuronal सेल मौत की सीमा है कि दवाओं के विकास के लिए एक आकर्षक दृष्टिकोण प्रदान करते हैं. वर्णित microslice विधि बरकरार परिपक्व मस्तिष्क में इन cascades संकेत की जांच की अनुमति देता है कि एक आसानी से लागू मॉडल हैऊतक. इस तकनीक स्ट्रोक के बाद neuronal सेल मौत को सीमित कि नए उपचार की पहचान में मदद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों वे इस पांडुलिपि के भीतर आयोजित काम के किसी भी बारे में ब्याज की कोई विवाद नहीं है कि घोषणा.

Acknowledgments

इस काम के लिए ऑस्ट्रेलिया की राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद, हंटर चिकित्सा अनुसंधान संस्थान, और न्यूकैसल विश्वविद्यालय से अनुसंधान कोष द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Guillotine Used to decapitate animal
Surgical equipment Forceps, scissors, tweezers, etc., for brain removal and dissection
McIlwain chopper McIlwain choppers are manufactured/distributed by a range of companies including Mickle Engineering, Harvard Apparatus, Campden Instruments and Ted Pella. Used to generate 100-400 µm brain sections.
Round bottom plastic tubes Greiner
Water bath For keeping tissue at 37 °C
Humidifier/aerating apparatus Used to keep microslices in a humidified, oxygenated environment
Flat bottomed polystyrene tubes Nunc
Dounce Homogenizer

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References

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